特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌系统免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证
阅读：124发布：2020-05-11
专利汇可以提供特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌系统免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一类特异性结合 铜 绿假单胞菌六型分泌系统免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证。本发明首先保护一种多肽，为 序列表 的序列3所示的多肽或序列表的序列4所示的多肽。编码所述多肽的基因也属于本发明的保护范围。本发明还保护所述多肽的应用：结合细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白；富集细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白；检测细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白。本发明提供的功能短肽可以与效应蛋白竞争性结合免疫蛋白，从而破坏TplE‑TplEi互作，从而促使效应蛋白裂解细菌自身的的细胞膜引发细菌自我死亡，这将是一个最有 力 的以T6SS效应蛋白为靶点的新型抗菌策略，为临床耐药菌株的 治疗 提供新方向。，下面是特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌系统免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证专利的具体信息内容。
1.一种多肽，为如下(a1)、(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a7)或(a8)：
(a1)序列表的序列3所示的多肽；
(a3)序列表的序列4所示的多肽；
(a4)在(a1)或(a3)的N端或/和C端连接标签得到的多肽；
(a5)在(a1)或(a3)的N端连接信号肽得到的多肽；
(a6)序列表的序列11第1至57位氨基酸残基组成的多肽；
(a7)在(a1)或(a3)的N端连接信号肽且C端连接标签得到的多肽；
(a8)序列表的序列11所示的多肽。
2.编码权利要求1所述多肽的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)编码区如序列表的序列10第70-171位核苷酸所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表的序列10第70-159位核苷酸所示的DNA分子；
(b3)编码区如序列表的序列10第1-171位核苷酸所示的DNA分子；
(b4)编码区如序列表的序列10所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述多肽的应用，为如下(c2)或(c4)或(c6)：
(c2)制备用于结合细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白的产品；
(c4)制备用于富集细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白的产品；
(c6)制备用于检测细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白的产品。
6.权利要求1所述多肽的应用，为如下：制备用于与细菌Ⅵ型分泌系统中的毒素蛋白竞争性结合免疫蛋白的产品。
7.权利要求1所述多肽的应用，为如下：制备用于解除细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白对毒素蛋白诱发的细菌死亡的抑制作用的产品。
8.权利要求1所述多肽的应用，为如下：制备用于促进具有细菌Ⅵ型分泌系统的细菌的死亡的产品。
特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌系统免疫蛋白的多肽的设
计及其抗菌活性的验证
技术领域
[0001] 本发明涉及特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌系统免疫蛋白(TplEi)的多肽的设计及其抗菌活性的验证，具体来说，本发明基于蛋白质三维结构设计靶向细菌六型分泌系统效应蛋白-免疫蛋白(TplE-TplEi)相互作用的多肽，发现其具有抗菌活性，具有抗感染药物研发前景。
背景技术
[0002] 二十世纪以来，致病细菌引发的传染病仍然是全球公共卫生的重大威胁。抗生素的滥用不断加剧着多耐药和泛耐药菌株的出现，尤其近些年来发现对多粘菌素产生抗性基因MCR-1的发现，更为致病细菌的防治带来了前所未有的挑战。铜绿假单胞菌是临床耐药菌中最为典型的代表，其广泛存在于自然界中，可通过环境污染、交叉感染、内源性感染和医源性感染等途径传播，是引发肺炎和手术感染的重要院内感染菌，特别是免疫功能低下患者和ICU病人。此外，铜绿假单胞菌也是囊性纤维化(cystic fibrosis)病人呼吸道感染和慢性阻塞性病人的诱。目前铜绿假单胞菌已经成为医院感染的重要条件致病菌，约占我国医院感染病例数的11.1％-24.5％，居第2-3位。而在全球范围内，铜绿假单胞菌感染已经跃为首位。而这些感染病例中绝大数是由多耐药(MDR)和泛耐药(XDR)铜绿假单胞菌引起,多耐药(MDR)和泛耐药(XDR)铜绿假单胞菌已经对抗生素最后一道防线-多粘菌素产生耐药。因此，设计和研发新型抗感染药物迫在眉睫。
[0003] 目前，多种新型的抗生素替代物正在研发中，比如，Kenneth Shatzkes和其同事在老鼠动物模型中利用捕食细菌来杀死肺炎球菌。噬菌体治疗因其高度的特异性也备受关注，针对铜绿假单胞菌的噬菌体已被鉴定并应用。此外，抗菌肽(AMP)和金属离子也在研发中。治疗铜绿假单胞菌感染的最常用的方法是抗生素和噬菌体治疗。然而，噬菌体抗体的出现和药物抗性等加剧使这些治疗手段的失效。抗毒力的策略(Antivirulence strategies)是最近提出的抗感染药物研发新思路。通过干扰细菌分泌系统，抑制细菌毒力能够解除致病细菌的“武装”使其丧失毒力同时又不直接杀死细菌。由于这种抑菌策略不直接危及细菌生存，因而具有较小的选择压力，能够延缓耐药突变的出现，引发国际相关领域极大关注。
[0004] 细菌的分泌系统是一类能够帮助细菌向宿主细胞或异己细菌输送毒力效应蛋白的一种高度特异化、横跨多层细菌被膜的生物大分子复合体。目前在细菌中已经发现7种分泌系统(T1SS-T7SS)。细菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)是最近才被发现和描述的一种细菌分泌系统，广泛存在于致病性革兰氏阴性菌中，通过分泌效应毒素蛋白介导了细菌间、细菌与宿主间的相互作用，在细菌的存活以及致病中发挥着重要作用。T6SS通常包括13-25个蛋白构成的核心组件或若干个辅助组件，这些蛋白按功能可分为结构蛋白、效应蛋白、调节蛋白和分子伴侣蛋白。效应蛋白作为T6SS发挥功能的终端产物，直接参与了细菌间的竞争和宿主的致病性。因此，T6SS及其效应蛋白是药物设计的理想靶标。在过去的几年中，T6SS分泌系统的效应蛋白陆续被鉴定出来。最早被发现分泌到细胞外的是T6SS的结构组件VgrG和Hcp，VgrG通过交联真核宿主的肌动蛋白引发感染。随后，降解细菌细胞壁的效应蛋白(Tae/Tge)、降解细胞膜的效应蛋白(Tle)、降解核酸的效应蛋白等陆续被报道出来。有趣的是，为了使自身细胞免受这些效应蛋白的毒害，T6SS+细菌同时表达与各种效应分子相对应的同种免疫蛋白或抗毒蛋白(cognate immunity protein)来中和毒素效应蛋白的作用，这种毒力效应蛋白和免疫蛋白对(E-I pair)使得拥有T6SS的细菌在与其他细菌竞争中保持了优势。研究发现，铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统毒力效应蛋白TplE作为跨界毒力因子直接参与了细菌种间的竞争和宿主ER装置的自噬作用，其自身通过表达免疫蛋白(抗毒蛋白)TplEi中和TplE毒性从而阻止自杀行为。
发明内容
[0005] 本发明的目的是设计一种与六型分泌系统免疫蛋白TplEi蛋白特异结合的、具有抗菌活性的多肽。
[0006] 本发明首先保护一类多肽，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a7)或(a8)：
[0008] (a2)将(a1)进行1-5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与其具有相同功能的由其衍生的多肽；
[0009] (a3)序列表的序列4所示的多肽；
[0010] (a4)在(a1)或(a3)的N端或/和C端连接标签得到的多肽；
[0012] (a6)序列表的序列11第1至57位氨基酸残基组成的多肽；
[0013] (a7)在(a1)或(a3)的N端连接信号肽且C端连接标签得到的多肽；
[0014] (a8)序列表的序列11所示的多肽。
[0015] 编码所述多肽的基因也属于本发明的保护范围。
[0016] 所述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)：
[0017] (b1)编码区如序列表的序列10第70-171位核苷酸所示的DNA分子；
[0018] (b2)编码区如序列表的序列10第70-159位核苷酸所示的DNA分子；
[0019] (b3)编码区如序列表的序列10第1-171位核苷酸所示的DNA分子；
[0020] (b4)编码区如序列表的序列10所示的DNA分子；
[0021] (b5)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列杂交且编所述多肽的DNA分子；
[0022] (b6)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述多肽的DNA分子。
[0023] 含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0024] 本发明还保护所述多肽的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)或(c5)或(c6)：
[0025] (c1)结合细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白；
[0026] (c2)制备用于结合细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白的产品；
[0027] (c3)富集细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白；
[0028] (c4)制备用于富集细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白的产品；
[0029] (c5)检测细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白；
[0030] (c6)制备用于检测细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白的产品。
[0031] 本发明还保护所述多肽的应用，为如下(d1)或(d2)：
[0032] (d1)与细菌Ⅵ型分泌系统中的毒素蛋白竞争性结合免疫蛋白；
[0033] (d2)制备用于与细菌Ⅵ型分泌系统中的毒素蛋白竞争性结合免疫蛋白的产品。
[0034] 本发明还保护所述多肽的应用，为如下(f1)或(f2)：
[0035] (f1)解除细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白对毒素蛋白诱发的细菌死亡的抑制作用；
[0036] (f1)制备用于解除细菌Ⅵ型分泌系统中的免疫蛋白对毒素蛋白诱发的细菌死亡的抑制作用的产品。
[0037] 本发明还保护所述多肽的应用，为如下(g1)或(g2)：
[0038] (g1)促进具有细菌Ⅵ型分泌系统的细菌的死亡；
[0039] (g1)制备用于促进具有细菌Ⅵ型分泌系统的细菌的死亡的产品。
[0040] 所述具有细菌Ⅵ型分泌系统的细菌具体可为铜绿假单胞菌。
[0041] 以上任一所述毒素蛋白为TplE蛋白，具体为如下(h1)、(h2)、(h3)、(h4)、(h5)或(h6)：
[0042] (h1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0043] (h2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；
[0044] (h3)来源于铜绿假单胞菌且与序列1所示蛋白质具有90％以上同一性的蛋白质；
[0045] (h4)在(h1)的N端或/和C端连接标签得到的多肽；
[0046] (h5)在(h1)的N端连接信号肽得到的多肽；
[0047] (h6)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0048] 以上任一所述免疫蛋白为TplEi蛋白，具体为如下(j1)、(j2)、(j3)、(j4)、(j5)或(j6)：
[0049] (j1)由序列表中序列2第26-380位氨基酸残基组成的蛋白质；
[0050] (j2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0051] (j3)将(j1)或(j2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；
[0052] (j4)来源于铜绿假单胞菌且与(j1)或(j2)具有90％以上同一性的蛋白质；
[0053] (j5)在(j1)或(j2)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质；
[0054] (j6)在(j1)或(j2)的N端连接信号肽得到的蛋白质。
[0055] 随着细菌耐药性的逐渐增强，发展新型抗感染药物迫在眉睫。六型分泌系统(T6SS)其通过分泌毒力蛋白参与了原核细胞和真核细胞的感染，在生态系统平衡和人类健康方面起着重要作用。铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统的效应蛋白TplE通过靶向竞争者细菌细胞膜引发其死亡，而其自身通过表达抗毒蛋白TplEi中和TplE毒性从而阻止自杀行为。
[0056] 本发明提供的功能短肽可以与效应蛋白(TplE蛋白)竞争性结合免疫蛋白(TplEi蛋白)，从而破坏TplE-TplEi互作，从而促使效应蛋白裂解细菌自身的的细胞膜引发细菌自我死亡，这将是一个最有力的以T6SS效应蛋白为靶点的新型抗菌策略，将为设计新型抗感染药物提供最为直接的药物筛选平台和后期药物应用开发提供强有力科技支撑，为临床耐药菌株的治疗提供新方向。附图说明
[0057] 图1为A肽与His6-TplEi的亲和力检测结果。
[0058] 图2为B肽与His6-TplEi的亲和力检测结果。
[0059] 图3为实施例3的结果。
具体实施方式
[0060] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0061] TplE蛋白即效应蛋白，又称毒素蛋白。铜绿假单胞菌来源的TplE蛋白如序列表的序列1所示。TplEi蛋白即免疫蛋白，又称抗毒蛋白。铜绿假单胞菌来源的TplEi蛋白如序列表的序列2所示，其信号肽为第1至25位，成熟肽为第26至380位。
[0062] petDUET-1载体：Novagen公司。大肠杆菌Rosetta(DE3)：Novagen公司。pET-28a(+)载体：Novagen公司。pET-26b(+)载体：Novagen公司。大肠杆菌BL21：Novagen公司。
[0063] 实施例1、功能短肽的发现
[0064] 1、采用petDUET-1载体为出发质粒构建重组质粒。重组质粒中，第一个开放阅读框表达N端具有His6标签的TplEi成熟肽，第二个开放阅读框表达TplE蛋白。
[0065] 2、将步骤1构建的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌。
[0066] 3、培养步骤2得到的重组菌，培养过程中进行IPTG诱导，然后依次进行如下步骤：菌体破碎取上清、镍柱纯化、离子交换层析、Superose 6分子筛层析，得到TplE-TplEi复合物。
[0067] 4、取步骤3得到的TplE-TplEi复合物，加入枯草杆菌蛋白酶进行原位酶解消化结晶，然后获取晶体并进行结构解析。
[0068] 5、根据结构解析的结果制备多肽并进行功能验证，最终发现了两个功能短肽，分别命名为A肽和B肽。
[0069] A肽的氨基酸序列(序列表的序列3)：DDLFASIGALWTWAWRGPKARQELLKAEQVEVDD。
[0070] B肽的氨基酸序列(序列表的序列4)：DDLFASIGALWTWAWRGPKARQELLKAEQ。
[0071] 实施例2、功能短肽对TplEi蛋白的亲和力
[0072] 功能短肽与TplEi蛋白进行体外结合实验，确定功能短肽的亲和力。功能短肽的高亲和力是用于开发新型抗感染药物的第一步。
[0073] 一、制备功能短肽
[0074] 人工合成A肽。
[0075] 人工合成B肽。
[0076] 二、制备TplEi蛋白
[0077] 1、将序列表的序列5第64-1131位核苷酸所示的双链DNA分子插入pET-28a(+)载体的NdeI和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒。经测序验证，重组质粒中具有序列表的序列5所示的开放阅读框，表达N端具有His6标签的TplEi成熟肽。
[0078] 2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌。
[0079] 3、将步骤2得到的重组菌接种至含50mg/L卡那霉素和50mg/L氯霉素的液体LB培养基，37℃、180rpm振荡培养至OD600nm值约为1.2。
[0080] 4、完成步骤3后，将整个培养体系冰浴放置半小时，然后加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.5mmol/L，然后18℃、180rpm振荡培养18小时。
[0081] 5、完成步骤4后，4000rpm离心15min，收集菌体，用裂解液悬浮后在冰上进行超声破碎(功率600W，每工作5s停5s，99次)，然后15000rpm离心30min，收集上清液，将上清液进行0.45微米滤膜过滤，收集滤液。
[0082] 裂解液：含2M NaCl、12mM imidazole、0.1％β-巯基乙醇、1mM PMSF，余量为pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液。
[0083] 6、Ni柱纯化
[0084] 3ml镍离子亲和层析柱：QIAGEN。
[0085] 纯化过程：①用10倍柱体积的平衡液平衡柱子；②上样步骤5得到的滤液；③用10倍柱体积的洗涤液洗涤柱子，以去除杂蛋白；④用15ml洗脱液洗脱柱子，收集过柱后溶液。
[0086] 平衡液：含2M NaCl、12mM imidazole，余量为pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液。
[0087] 洗涤液(pH7.5)：含150mMNaCl、50mM Tris、12mM咪唑，余量为水。
[0088] 洗脱液(pH7.5)：含75mM NaCl、50mM Tris、250mM咪唑、0.1％β-巯基乙醇，余量为水。
[0089] 将过柱后溶液进行0.45微米滤膜过滤，收集滤液。
[0090] 7、阳离子交换层析纯化
[0091] AKTA explore系统。
[0092] 5ml Hitrap SP HP层析柱：GE HEALTHCARE。
[0093] 纯化过程：①用5个柱体积的buffer A平衡柱子；②上样步骤6得到的滤液；③用buffer A和buffer B进行线性梯度洗脱，实时监测280nm的紫外值，收集洗脱峰(整个洗脱过程，仅出现一个明显的洗脱峰)对应的过柱后溶液。
[0094] buffer A(pH7.5)：含50mM Tris、75mM NaCl、1mM DTT，余量为水。
[0095] buffer B(pH7.5)：含50mM Tris、1M NaCl、1mM DTT，余量为水。
[0096] 将过柱后溶液采用截留分子量为10KD的超滤浓缩管进行超滤浓缩，得到蛋白浓缩液。
[0097] 8、分子筛层析纯化
[0098] 24ml Superose 6柱层析柱：GE HEALTHCARE。
[0099] 纯化过程：①用1个柱体积的分子筛缓冲液平衡柱子；②上样步骤7得到蛋白浓缩液；③用分子筛缓冲液进行洗脱，实时监测280nm的紫外值，收集洗脱峰(整个洗脱过程，仅出现一个明显的洗脱峰)对应的过柱后溶液。
[0100] 分子筛缓冲液(pH7.0)：含150mMNaCl、20mMTris，余量为水。
[0101] 将过柱后溶液采用截留分子量为10KD的超滤浓缩管进行超滤浓缩，得到蛋白浓缩液，即为含有N端具有His6标签的TplEi成熟肽的溶液，命名为His6-TplEi溶液。N端具有His6标签的TplEi成熟肽用His6-TplEi表示。
[0102] His6-TplEi溶液中，His6-TplEi的浓度为10mg/ml(以总蛋白浓度计)。
[0103] 三、亲和力检测
[0104] 采用MicroCal iTC200微量热等温滴定量热仪进行体外ITC实验。制备A肽溶液，A肽浓度为1-2mM。制备B肽溶液，B肽浓度为1-2mM。制备His6-TplEi溶液的稀释液，稀释液的蛋白浓度为0.03-0.04mM。制备各个溶液和稀释液采用的溶剂均为如下：含20mM Tris-HCl、100mM NaCl，余量为水，pH＝8.0。使用18针连续进样，每针2微升。间隔120秒，数据最后使用ORGIIN进行处理。
[0105] A肽与His6-TplEi的亲和力检测结果见图1。kd＝125nM。
[0106] B肽与His6-TplEi的亲和力检测结果见图2。kd＝478nM。
[0107] 实施例3、功能短肽通过激活TplE蛋白引发细菌的自我死亡
[0108] 一、构建重组质粒
[0109] 1、将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-TplE。经测序验证，重组质粒pET26b-TplE中具有序列表的序列6所示的开放阅读框。序列表的序列6所示的DNA分子编码序列表的序列7所示的蛋白质。序列表的序列7中，第1-23位氨基酸残基组成信号肽(促使蛋白分泌到周质空间)，第24-592位氨基酸残基组成TplE蛋白。
[0110] 2、将序列表的序列8所示的双链DNA分子插入pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-TplE-TplEi。经测序验证，重组质粒pET26b-TplE-TplEi中具有序列表的序列8所示的开放阅读框。序列表的序列8所示的DNA分子编码序列表的序列9所示的蛋白质。序列表的序列9中，第1-23位氨基酸残基组成信号肽(促使蛋白分泌到周质空间)，第24-592位氨基酸残基组成TplE蛋白，第593-972位氨基酸残基组成TplEi蛋白。
[0111] 3、将序列表的序列10第1-171位核苷酸所示的双链DNA分子插入pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-A。经测序验证，重组质粒pET26b-A中具有序列表的序列10所示的开放阅读框。序列表的序列10所示的DNA分子编码序列表的序列11所示的蛋白质。序列表的序列11中，第1-23位氨基酸残基组成信号肽(促使蛋白分泌到周质空间)，第24-57位氨基酸残基组成A肽。
[0112] 4、将序列表的序列12第1-171位核苷酸所示的双链DNA分子插入pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-K100E。经测序验证，重组质粒pET26b-K100E中具有序列表的序列12所示的开放阅读框。
[0113] 5、将序列表的序列13第1-171位核苷酸所示的DNA分子插入pET-26b(+)载体的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pET26b-W92A。经测序验证，重组质粒pET26b-W92A中具有序列表的序列13所示的开放阅读框。
[0114] 二、细菌培养试验
[0115] 第一组：将pET-26b(+)载体导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
[0116] 第二组：将重组质粒pET26b-TplE导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
[0117] 第三组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
[0118] 第四组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和pET-26b(+)载体共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
[0119] 第五组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和重组质粒pET26b-A共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
[0120] 第六组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和重组质粒pET26b-W92A共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
[0121] 第七组：将重组质粒pET26b-TplE-TplEi和重组质粒pET26b-K100E共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
[0122] 第八组：将pET-26b(+)载体和重组质粒pET26b-A共导入大肠杆菌BL21，然后挑取重组菌单克隆接种至4ml液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时，然后取样菌液并采用液体LB培养基进行10倍梯度稀释，然后滴加2微升到LB培养基平板上，37℃静置培养24小时，拍照。
[0123] 结果见图3。图3中，每一组自左至右，依次为菌液、菌液的10倍稀释液、菌液的100倍稀释液、菌液的103倍稀释液、菌液的104倍稀释液和菌液的105倍稀释液。与第一组相比，第二组的重组菌存活数量显著降低，即TplE蛋白诱导细菌发生了死亡。与第二组相比，第三组的重组菌存活数量显著增加，即TplEi蛋白对TplE蛋白诱导细菌死亡具有抑制作用。与第四组相比，第五组重组菌存活数量显著降低，即A肽通过与TplE蛋白竞争性结合TplEi蛋白，解除了TplEi蛋白对TplE蛋白诱导细菌死亡的抑制作用，TplE蛋白得以释放发挥毒性作用，细菌死亡。与第五组相比，第六组以及第七组的重组菌存活数量显著增加，即将A肽进行点突变后，其相应的作用效果显著降低。第八组的结果表明，A肽本身对细菌基本不存在致死作用。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 使用压缩的分子标记的核酸序列数据检测融合的方法 | 2020-05-08 | 437 |
| PP84蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 | 2020-05-08 | 756 |
| 一种辅助奶瓶盛水容量读数的装置及方法 | 2020-05-11 | 206 |
| 一种用于聚变装置等离子体杂质注入的机构及方法 | 2020-05-08 | 872 |
| 微孔膜截留集聚微球的免疫微孔杯、微孔板条及其检测方法 | 2020-05-08 | 604 |
| 特异性结合铜绿假单胞菌六型分泌系统免疫蛋白的多肽的设计及其抗菌活性的验证 | 2020-05-11 | 124 |
| 微孔膜截留集聚生化检测装置及其检测方法 | 2020-05-08 | 799 |
| 显示设备及其制造方法 | 2020-05-08 | 784 |
| 基于硝基还原、硫氮转位的硝基还原酶荧光探针及其制备方法 | 2020-05-08 | 401 |
| 超音波スピーカ | 2020-05-08 | 650 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈