一株久留里伯克霍尔德菌及其应用
阅读：821发布：2024-02-09
专利汇可以提供一株久留里伯克霍尔德菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 微 生物 技术领域，具体公开了一株久留里伯克霍尔德氏菌及其应用。所述菌株为久留里伯克霍尔德氏菌（Burkholderia kururiensis）yy01，所述菌株于2015年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏号为CGMCC No.10631。菌株yy01兼具高效溶磷解 钾 和较高固氮酶活性，菌株通过提高 土壤 中难溶态磷与钾的有效性以及能将空气中游离的氮转为 氨 ，供作物吸收利用，对 水 稻、 烟草 等 农作物 有着明显的促生作用。，下面是一株久留里伯克霍尔德菌及其应用专利的具体信息内容。
1.一株久留里伯克霍尔德氏菌（Burkholderia kururiensis）yy01，其特征在于，所述菌株于2015 年3 月17 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏号为CGMCC No.10631。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株呈短杆状，耐NaCl的浓度达
3.0%，分泌过氧化氢酶及脲酶；所述菌株对300μg/mL氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、红霉素及50μg/mL的四环素均具有耐受性。
4.权利要求1所述菌株的应用；所述应用指溶磷、解钾或固氮中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述菌株用于制备溶磷解钾及兼具固氮酶活性的接种剂。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述菌株用于制备生物肥。
7.权利要求1所述菌株在促进作物生长方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述菌株制成菌悬液施于作物根部。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述作物为水稻，并将所述菌株制成浓度
8
为10细胞/mL的菌悬液施于水稻根部。
一株久留里伯克霍尔德菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 氮、磷、钾是植物生长所必需的三大营养元素，而我国大多数土壤中氮、磷、钾含量均较低。土壤中的磷主要以磷酸盐的形式存在，而钾主要以矿物形态存在于钾长石和云母中，植物均难以吸收利用。长期以来，为了确保农产品获得高产，人们大量使用化学肥料和农药，这样既造成了土壤结构的破坏及环境的污染，又不利于农业的可持续发展。通过微生物的作用将空气中游离的氮转为氨以及提高土壤中难溶态磷与钾的有效性，供植物吸收利用，从而促进作物的生长是微生物技术领域的研究方向之一。目前，国内外有关固氮菌、解磷菌及解钾菌的研究较多，但兼具高效溶磷解钾性能及高固氮酶活性的菌株少有相关文献报道。
[0003] 伯克霍尔德菌是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌。伯克霍尔德氏菌属的一些细菌具有生物防治、促进植物生长和生物修复等功能。伯克霍尔德菌能产生多种具有抗菌活性的代谢产物如铁载体、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱、Cepaciamide A、CepacidineA、Cepacin A 等，现已应用于生物防治，分解有毒物质等领域，但还未发现同时具有固氮、溶磷解钾功能的伯克霍尔德菌。
[0004] 从环境中筛选具有高效溶磷解钾内生固氮的菌株，应用于种植作物的土壤中，使菌株通过将空气中游离的氮转为氨以及提高土壤中难溶态磷与钾的有效性，供植物吸收利用，对促进作物生长具有重要的意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株久留里伯克霍尔德菌菌株Burkholderia kururiensis yy01，所述菌种具有高效的溶磷解钾性能及高固氮酶活性。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种上述菌株的应用。
[0007] 本发明的另一目的是提供上述菌株在促进作物生长方面的应用。
[0008] 本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现。
[0009] 一株久留里伯克霍尔德氏菌（Burkholderia kururiensis）yy01，所述菌株于2015 年3 月17 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏号为CGMCC No.10631。
[0010] 所述菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0011] 所述菌株呈短杆状，最适生长温度为37℃，最佳生长pH6~8，耐NaCl的浓度达3.0%，分泌过氧化氢酶及脲酶；所述菌株对300μg/mL氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、红霉素及50μg/mL的四环素均具有耐受性。所述菌株在LB琼脂平板上生长速度较快，在37℃，生长36小时后，菌落呈圆形凸起，米黄色不透明，菌落直径3-6毫米。所述菌株兼性厌氧，甲基红反应呈阳性，V.P反应呈阴性，过氧化氢酶阳性，不能液化明胶及水解淀粉；吲哚反应呈阳性，且能分泌生长素IAA；具有产氨能力，能分泌脲酶。5μg/mL的拉霉素、庆大霉素、链霉素能抑制该菌株的生长。
[0012] 所述菌株的应用；所述应用指溶磷、解钾或固氮中的一种或多种。
[0013] 优选地，将所述菌株用于制备溶磷解钾及兼具固氮酶活性的接种剂。
[0014] 优选的，将所述菌株用于制备生物肥。
[0015] 所述菌株在促进作物生长方面的应用。所述菌株具有溶磷解钾及固氮特性，能分泌生长素IAA，以及过氧化氢酶及脲酶，具有产氨能力，能够为作物生长提供营养物质；同时，所述菌株耐NaCl的浓度可达3%，对300μg/mL氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、红霉素及50μg/mL的四环素均具有耐受性，对环境的适应性和耐逆性较强。优选地，所述作物为水稻或烟草。
[0016] 优选地，将所述菌株制成菌悬液施于作物根部。
[0017] 优选地，所述作物为水稻，并将所述菌株制成浓度为108细胞/mL的菌悬液施于水稻根部。为显著提高水稻的高度、根长、分蘖数、鲜重、干重和根重，更优选地，将所述菌悬液施于水稻根部后，培养一段时间后补充一次所述菌悬液，培养时间共计达35d。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明筛选获得一株久留里伯克霍尔德菌Burkholderia kururiensis yy01，兼具高效溶磷解钾和较高固氮酶活性，菌株通过提高土壤中难溶态磷与钾的有效性以及能将空气中游离的氮转为氨，供作物吸收利用，对水稻、烟草等农作物有着明显的促生作用。
[0019] （2）筛选得到的久留里伯克霍尔德菌yy01生长速度快，对环境适应性和耐逆性较强，能够促进并调节植物的生长。所述菌株能分泌生长素IAA，以及过氧化氢酶及脲酶，具有产氨能力，耐NaCl的浓度可达3%，对300μg/mL氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、红霉素及50μg/mL的四环素均具有耐受性。
附图说明
附图说明
[0020] 图1为菌株yy01的16S rRNA 基因序列系统发育树。
[0021] 图2为菌株yy01溶磷解钾定性试验；注：A为磷透明圈；B为钾透明圈。
[0022] 图3为菌株yy01固氮酶nifH基因的扩增结果。
[0023] 图4为菌株yy01接种中嘉早17号的生长情况；注：CK为对照组；yy01为接种菌株yy01的实验组。
具体实施方式
[0024] 下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。
[0025] 实施例中钾选择培养基组分为：葡萄糖10.0g，Na2HPO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·2H2O 0.2g，CaCO3 5.0g，钾长石粉（200目）2.5g，琼脂15.0 g，去离子水1000mL，pH 7.2。其他培养基如LB、CCM、NFb和PKO培养基的组分均为本领域技术人员所公知。
[0026] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0027] 实施例1 伯克霍尔德菌yy01的获得药用野生稻由于长期处于野生状态，经受了各种灾害和环境的自然选择，从而使它具有抗病虫害、抗旱、耐贫瘠土壤等特性，发明人将广西药用野生稻作为材料，从中分离筛选出久留里伯克霍尔德菌yy01。
[0028] 分离纯化：取广西药用野生稻用蒸馏水洗净，剪下长度3~5cm的根、茎、叶分别置于已灭菌的3个培养皿中，用70%乙醇浸泡5min，再用0.1%的HgCl2浸泡3min，无菌水洗涤7次，每次8min，并将最后一次洗涤液涂布于LB固体培养基上，以检测表面消毒是否彻底。
将表面消毒完全的根、茎、叶用灭菌剪刀剪碎，分别用灭菌镊子夹入到3支装有CCM及3支装有NFb的半固体培养基的试管中，胶塞密封后，置于37℃的细菌培养箱内进行培养。待试管中长出菌体后，向管内注入1/10体积10%乙炔气体，其终浓度为1%，12h后，测定固氮酶活性，将有固氮酶活性的菌种再次平板划线分离，37℃继续培养。再次挑取单菌落分别接种至相应的半固体培养基中，利用乙炔还原法检测固氮酶活性，没有活性的菌株舍弃，有活性的菌株继续平板划线直到获得纯的菌株，最后通过镜检，石炭酸复红染色，进一步观察其形态确定是否纯化。纯化后的菌株于15%的甘油中-20℃保存。共获得73株具有内生固氮功能的菌株，分别编号yy01~73。
将表面消毒完全的根、茎、叶用灭菌剪刀剪碎，分别用灭菌镊子夹入到3支装有CCM及3支装有NFb的半固体培养基的试管中，胶塞密封后，置于37℃的细菌培养箱内进行培养。待试管中长出菌体后，向管内注入1/10体积10%乙炔气体，其终浓度为1%，12h后，测定固氮酶活性，将有固氮酶活性的菌种再次平板划线分离，37℃继续培养。再次挑取单菌落分别接种至相应的半固体培养基中，利用乙炔还原法检测固氮酶活性，没有活性的菌株舍弃，有活性的菌株继续平板划线直到获得纯的菌株，最后通过镜检，石炭酸复红染色，进一步观察其形态确定是否纯化。纯化后的菌株于15%的甘油中-20℃保存。共获得73株具有内生固氮功能的菌株，分别编号yy01~73。
[0029] 筛选：将分离纯化得到的菌株活化后，进行溶磷解钾定性试验，即用无菌水制成浓8
度为10细胞/mL的菌悬液，吸取10μL菌悬液点植于PKO及钾选择培养平板的中间，于
37℃细菌培养箱中培养48h，观察有无透明圈生成，测定透明圈直径(D)、菌落直径(d)。筛选出在PKO及钾选择培养平板中D/d比值均大于2的菌株，结果筛选到1株菌株yy01，它在PKO及钾选择培养基上具有高效溶磷解钾能力。
度为10细胞/mL的菌悬液，吸取10μL菌悬液点植于PKO及钾选择培养平板的中间，于
37℃细菌培养箱中培养48h，观察有无透明圈生成，测定透明圈直径(D)、菌落直径(d)。筛选出在PKO及钾选择培养平板中D/d比值均大于2的菌株，结果筛选到1株菌株yy01，它在PKO及钾选择培养基上具有高效溶磷解钾能力。
[0030] 因此，菌株yy01是具有高效溶磷解钾及固氮酶活性的菌株。
[0031] 保存：将分离纯化后的菌株yy01在LB平板上培养1-2 d后，收集平板上的菌体。保存于15%灭菌甘油(-20 ℃)。
[0032] 实施例2 伯克霍尔德菌yy01的鉴定菌株yy01呈短杆状，最适生长温度为37℃，最佳生长pH6~8，耐NaCl的浓度达3.0%，分泌过氧化氢酶及脲酶。所述菌株在LB琼脂平板上生长速度较快，在37℃，生长36小时后，菌落呈圆形凸起，米黄色不透明，菌落直径3-6毫米。通过生理生化特性测定，显示该菌兼性厌氧，甲基红反应呈阳性，V.P反应呈阴性，过氧化氢酶阳性，不能液化明胶及水解淀粉；
吲哚反应呈阳性，且能分泌生长素IAA；具有产氨能力，能分泌脲酶。所述菌株pH生长范围较小，可耐pH6~8，耐NaCl的浓度可达3%；对300μg/mL氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、红霉素及50μg/mL的四环素均具有耐受性；而5μg/mL的拉霉素、庆大霉素、链霉素便能抑制该菌株的生长。
吲哚反应呈阳性，且能分泌生长素IAA；具有产氨能力，能分泌脲酶。所述菌株pH生长范围较小，可耐pH6~8，耐NaCl的浓度可达3%；对300μg/mL氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、红霉素及50μg/mL的四环素均具有耐受性；而5μg/mL的拉霉素、庆大霉素、链霉素便能抑制该菌株的生长。
[0033] 所述菌株采用细菌16S rRNA基因通用引物25f和1492r进行扩增，将其PCR产物直接进行序列测定，结果如SEQ ID NO:1所示。将获得的序列输入GenBank进行BLAST比对，将相似性相近的序列采用邻接法（neighbor-joining method）进行聚类分析并构建系统发育树，结果见图1。初步确定本发明的菌株yy01在分类学中的种、属的位置，结果发现本发明的菌株yy01与久留里伯克霍尔德菌(Burkholderia kururiensis)模式菌株DSM13646相似性为99.4%。
[0034] 因此，通过形态学特征，生理生化特性及16S rRNA序列分析，菌株yy01鉴定为伯克霍尔德氏菌（Burkholderia kururiensis）。将所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期是2015年3月17日，保藏号是CGMCC No.10631，所述菌株分类命名为久留里伯克霍尔德氏菌Burkholderia kururiensis。菌株的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0035] 实施例3 伯克霍尔德菌yy01的溶磷解钾及固氮性能实验取菌株yy01进行溶磷解钾能力的测定。将菌株分别接种至PKO和钾选择培养平板上，通过透明圈法进行溶磷解钾定性试验，结果见图2，菌株yy01能形成非常明显的透明圈，溶磷比值为2.92，解钾比值为4.13。再以Klebsiella variicola作为参比菌株，通过钼锑抗比色法及四硼酸钠法进行溶磷解钾定量试验，结果见表1，显示菌株yy01溶无机磷量达
116.28 mg/L，是参比菌株Klebsiella variicola的2.73倍；解钾量达268.31 mg/L，是参比菌株Klebsiella variicola的4.67倍。
116.28 mg/L，是参比菌株Klebsiella variicola的2.73倍；解钾量达268.31 mg/L，是参比菌株Klebsiella variicola的4.67倍。
[0036] 表1 菌株yy01与参比菌株Klebsiella variicola的溶磷解钾能力注：D为透明圈直径，d为菌落直径；D/d的比值越大，菌株溶磷解钾效果越好。
[0037] 取菌株yy01进行固氮酶活性的测定及固氮酶nifH基因扩增。利用乙炔还原法测-1 -1得菌株yy01的固氮酶活性为8.78 μmolC2H4·mL ·h ，固氮酶活性较高。利用Zehr J P设计的引物扩增nifH基因片段，在分子水平上通过PCR技术检测菌株yy01是否存在固氮酶nifH基因。PCR反应条件：97℃预变性3 min，97℃变性1min，55℃复性50 s，72℃延伸
35s，32个循环，反应完成后，72℃延伸5 min，结果发现成功扩增出约360bp的固氮酶nifH基因片段，结果见图3。
35s，32个循环，反应完成后，72℃延伸5 min，结果发现成功扩增出约360bp的固氮酶nifH基因片段，结果见图3。
[0038] 通过研究发现，本发明筛选获得的久留里伯克霍尔德菌Burkholderia kururiensis yy01，兼具高效溶磷解钾和较高固氮酶活性。
[0039] 实施例4 伯克霍尔德菌yy01对水稻的促生效果试验实验材料：水稻中嘉早17号，2012年10月采自广西省梧州市长洲区倒水镇。
[0040] 采用盆栽法把菌株yy01回接至水稻中嘉早17号：首先，将菌株活化好，以保证在8
对数生长期内，然后制成浓度为10细胞/mL的菌悬液，浸泡有12d苗龄的水稻苗根部36h。
再将水稻苗分别转接到装有540g水稻土的1000mL塑料大杯中，每个塑料大杯中加入50mL植物无氮营养液，实验组再加入上述菌悬液30 mL，设置对照，对照组为用等量无菌水替换菌悬液。实验组和对照组均设置3个重复，放室温下同等条件进行培养，每天及时观察、添加水。培养观察至20d后，实验组再次加入上述菌悬液30mL及50mL植物无氮营养液，对照组加入30mL无菌水及50mL植物无氮营养液。继续培养观察至15d后拍照记录，并测定水稻的高度、根长、分蘖数、鲜重、干重、根重，结果见图4和表2。
对数生长期内，然后制成浓度为10细胞/mL的菌悬液，浸泡有12d苗龄的水稻苗根部36h。
再将水稻苗分别转接到装有540g水稻土的1000mL塑料大杯中，每个塑料大杯中加入50mL植物无氮营养液，实验组再加入上述菌悬液30 mL，设置对照，对照组为用等量无菌水替换菌悬液。实验组和对照组均设置3个重复，放室温下同等条件进行培养，每天及时观察、添加水。培养观察至20d后，实验组再次加入上述菌悬液30mL及50mL植物无氮营养液，对照组加入30mL无菌水及50mL植物无氮营养液。继续培养观察至15d后拍照记录，并测定水稻的高度、根长、分蘖数、鲜重、干重、根重，结果见图4和表2。
[0041] 试验结果表明菌株yy01接种水稻之后，与没有接种菌株的对照相比水稻的叶长、根长、鲜重、根重都达到了显著差异，对水稻有明显的促生作用。其中叶长增加了25.9%，根增长了42.3%，分蘖数增加了79.64%，鲜重增加了166.9%，干重增加了73.7%，根重增加了122.2%。
[0042] 表2菌株yy01接种水稻后的促生效果
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