一种高通量流动式杂交检测微生物的微流控芯片及其制备
方法
技术领域
[0001] 本
发明属于医疗卫生检测技术领域,涉及一种可以同
时针对多种微生物进行高通量循环流动式核酸杂交分析的微流控芯片,并提供了该芯片的制备方法。
背景技术
[0002] 目前,常规的微生物核酸杂交检测方法主要是基于DNA微阵列(DNA Microarray)的杂交分析技术。该技术通过将大量的寡核苷酸探针固定在同一支持物载体上,再利用通用引物扩增标记待测定的微生物样品,就可以一次针对大量的核酸分子进行分析,已经应用于医疗诊断、基因突变检测和
生物群落分析等领域,所使用的固相载体主要是尼龙膜、玻
硅片和玻璃等,选用的核酸探针主要是待测微生物的特异性基因
片段,或是在目标微生物保守的16S和23SrRNA等基因中的一段种特异性核酸片段作为探针。通过在保守基因序列内部设计通用PCR扩增引物,并在可变区内设计特异性核酸探针,就可以同时对大量样品进行并行检测。但是,常规
基因芯片的杂交操作需在专业实验室中进行,依赖昂贵且庞大的仪器设备,对操作人员的专业技能要求较高。此外,在常规核酸杂交反应中,由于溶液在反应室内处于静止状态,因此在反应液中需要依靠分子扩散,待游离的DNA分子移动并随机碰撞、结合于固定的核酸探针分子,因此杂交反应通常需要耗费几个小时至十几个小时。此外,由于设备便携性较差,不便于在现场进行快速检测,例如针对传染性
疾病突发疫情的现场快速分析。开发一种可用于现场检测的便携式杂交设备和缩短杂交时间已经成为亟待解决的问题。
[0003] 20世纪90年代发展起来的微流控芯片技术是一种可以在微尺度管道(5-500μm)内操控微体系
流体(10-15L-10-6L)的新型科学研究平台,是精密加工技术、分子生物学技术和计算机技术的交叉融合,可以方便地通过计算机实现对微体系流体的精确控制,具有微型化、低成本和自动化程度高的特点。通过在聚二甲基硅
氧烷和聚甲基
丙烯酸甲酯等材料上构建微米甚至纳米尺度的反应管道、腔室和微
阀门,反应所消耗的样本和
试剂量比常规方法会降低数倍至数百倍。同时,微体系下的化学反应速率往往比常规反应高一至两个数量级。在微流控芯片上构建的微小反应管道,由尺寸更小、
比表面积更大,因此反应环境的物理化学性质比传统方法具有更高的均一性,可以最大程度降低试剂消耗、提高分子碰撞效率、降低能耗和增加分析系统的集成度。
[0004] 此外,微流控芯片的体积往往只有数平方厘米,重量约数十克,适合于便携式现场快速检测的应用。相比于常规技术方法,微流控芯片的优势有:(1)试剂和样品消耗量极低,可以大幅降低成本;同时,微小的芯片便携性很强;(2)芯片的
聚合物材料成本低廉,适合大规模生产;(3)在芯片中进行微升甚至纳升级的生物化学反应,传质和
传热效率更高,分子碰撞的概率更大,反应速度更快;(4)通过微加工技术,在芯片内整合生化反应单元和电控原件,能够通过计算机实现对芯片内流体运动的精确操控,可以进一步实现高通量并行检测。可见,以微流控芯片为
基础的新型生物检测技术,不但可以替代庞大昂贵的常规仪器,而且具有更高的检测灵敏度和自动化控制程度。
[0005] 因此,如果将微流控技术与常规的基因芯片技术相结合,就能建立起一种新的微型化、便携式和速度快的微生物检测方法。在微流控芯片上构建微小的杂交腔室,由于具有更小的尺寸和更大的比表面积,因此反应速率能够大幅增加,而且能极大降低试剂的消耗,杂交时间也可以从数小时缩短到数十分钟。此外,相比于静态杂交方式,当杂交液体处于流动状态时,DNA分子的传质速度更快,与探针之间的杂交效率更高,因此可以建立一种全新的便携式快速杂交检测方法。
发明内容
[0006] 本发明提供了一种循环流动式核酸杂交芯片,可以用于多种微生物的高通量检测分析,并提供该芯片的制备方法。
[0007] 本发明提供一种基于
蠕动泵原理的循环流动式核酸杂交芯片,以弹性材料聚二甲基硅氧烷为基材,由样品流动管道层和
蠕动泵控制层组成。
[0008] 样品通道层中,共含有六条样品流通管道,管道的宽度均为300μm,深度25μm,长度1cm,为光滑凹槽;六条样品流通管道内,除第一条管道以外,其余五条管道内均固定有针对多种微生物的特异性检测核酸探针,进行高通量循环流动式杂交分析;
[0009] 微阀门蠕动泵控制层含有并行的三个气压
控制阀门,通过调节气压的大小控制阀门的开启和闭合;
[0010] 芯片右侧设置杂交液进样孔和杂交液出样孔,杂交液进样孔和杂交液出样孔分别带有气压控制阀门。
[0011] 本发明中微流控芯片的基材为具有良好的弹性和光学透性的聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)。
[0012] 本发明的核酸杂交管道的个数可由实际情况确定,可根据实际需求增加或减少管道的数量,从而可针对多种微生物进行高通量杂交分析。
[0013] 本发明的循环流动式核酸杂交芯片可以极大降低核酸杂交的时间以及样品的消耗量。
[0014] 本发明提供上述微流控芯片的制备方法:
[0015] (1)
单晶硅基片制备:利用Prianha溶液对单晶
硅片表面进行去氧化,采用SU-82025(蠕动泵控制层)和AZ-50XT(样品流动层)
光刻胶在单晶硅片表面进行
旋涂,在恒温加热板上
烘烤使光刻胶
固化;
[0016] (2)曝光和
烘焙:将带有设计图案的光掩膜板分别置于单晶硅基片表面,利用紫外曝光机进行曝光;
[0017] (3)显影:将单晶硅片置于显影液中显影5分钟,再用去离子
水清洗干净;
[0018] (4)软烘:将单晶硅片在加热板上缓慢加热固定,制成芯片模具;
[0019] (5)浇注:将聚二甲基硅氧烷
单体与固化剂在5:1至20:1混匀,分别倾倒在芯片模具上,在烘箱内烘焙,使聚二甲基硅氧烷固化并从模具上剥离;
[0020] (6)探针点置:使用SmartArrayTM-48基因芯片点样仪将寡合甘酸探针点置在
醛基化修饰的玻璃基片表面;
[0021] (7)键合:将固化后的两层聚二甲基硅氧烷芯片分别与硅片模具剥离并打孔后,将样品流动层和蠕动泵控制层相对合,经3-
氨基丙基-三甲氧基硅烷处理后与醛基修饰的玻璃基片贴合,可形成键合牢固的完整芯片。
[0022] 本发明的微流控芯片可以用于对多种微生物的循环流动式杂交检测。其方法是,将微生物样本的16S rDNA扩增产物及核酸杂交反应液通过位于芯片右侧的进样孔注入样品流动管道内,待杂交液充满管道后,将芯片置于聚酰亚胺加热膜表面加热到55℃,同时顺次开启和闭合位于芯片蠕动泵控制层的并行三个蠕动泵微阀门,
挤压推动位于样品流动管道的杂交液在芯片内进行循环流动,反应10分钟并经过芯片管道清洗后,可进行结果读取。
[0023] 该芯片的三个蠕动泵微阀门的开启和闭合由电脑进行精确控制;利用光敏器件阵列进行光学
数据采集,并传至
微处理器中与
数据库相比较,从而分析样品中的目标微生物含量。
[0024] 本发明设计的微流控芯片能够快速且高通量地检测多种微生物,芯片体积小,便于携带,易于与其它装置兼容,利于现场快速检测的应用。
附图说明
[0025] 附图是本发明的微流控芯片结构示意图。
[0026] 图中:1杂交液进样孔;2样品流动管道;3蠕动泵微阀门;4特异性核酸杂交探针;5杂交液出样孔。
具体实施方式
[0027] 1.单晶硅基片准备:将单晶硅片置于Prianha溶液中(98%浓
硫酸和30%双氧水的体积比为7:3)煮沸10分钟,用去离子水清洗干净,氮气吹干,置于200℃烘焙15分钟。
[0028] 2.甩涂:将AZ-50XT正光刻胶(样品流动层)和SU-82025负光刻胶(蠕动泵控制层)分别倾倒在单晶硅片表面的中央
位置,静置5分钟后,分别用
旋涂机(Spin-Coatemr KW-4A型)进行2000转/分钟甩涂1分钟。
[0029] 3.软烘:对于AZ-50XT正光刻胶(样品流动层),将甩涂后的硅片置于65℃、115℃和65℃
温度下分别静置1分钟、4分钟和1分钟;对于SU-82025负光刻胶(蠕动泵控制层),将甩涂后的硅片置于65℃和95℃温度下分别静置3分钟和6分钟,缓慢降至室温;
[0030] 4.曝光:将设计好的掩膜板置于单晶硅片表面,用紫外曝光机进行曝光(曝光
波长365nm)。
[0031] 5.显影:对于AZ-50XT正光刻胶(样品流动层),将单晶硅片置于光刻胶显影液中,静置5分钟后用去离子水清洗干净;对于SU-82025负光刻胶(蠕动泵控制层),将硅片置于丙二醇甲醚酯酸酯中,静置15分钟后用异丙醇和去离子水清洗干净,氮气吹干;
[0032] 6.后烘焙:将单晶硅片阳模置于120℃烘焙20分钟,使其完全固化;
[0033] 7.样品流动层构建:将聚二甲基硅氧烷单体和固化剂按5:1的比例混合,用
真空泵除去气泡后倾倒在经过三甲基氯硅烷处理后的样品流动层硅片模具上,置于80℃烘烤固化,形成样品流动微通道结构。
[0034] 8.蠕动泵控制层构建:聚二甲基硅氧烷单体和固化剂按20:1的比例混合,除去气泡后倾倒在经三甲基氯硅烷处理后的蠕动泵控制层硅片模具上,置于80℃烘烤固化,形成蠕动泵微阀门结构。
[0035] 9.核酸探针点置:使用SmartArrayTM-48基因芯片点样仪将40μM寡合甘酸探针点置在醛基化修饰的玻璃基片上,点的直径约为100μm;
[0036] 10.芯片键合:将样品通道层和蠕动泵控制层两层聚二甲基硅氧烷芯片校准后进行键合,高温烘焙,再将样品通道层芯片下表面浸于30%浓度的3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)中静置1小时,
乙醇清洗2次并吹干,而后与表面带有醛基化修饰基团的玻璃基
片层键合,完成芯片的构建。
[0037] 将样本16S rDNA的PCR产物与杂交缓冲液混合后通过图1所示的1号孔注入芯片,待杂交液充满整条样品流通管道后(附图中标注为2号),将芯片置于聚酰亚胺加热膜表面加热到55℃,由电脑控制顺次开启和闭合位于芯片蠕动泵控制层的并行三个蠕动泵微阀门,挤压推动位于样品流动管道的杂交液在芯片内进行循环流动,反应10分钟后,通过图1所示的1号孔向芯片管内顺次注入2×SSC、0.2%SDS、0.2×SSC和ddH2O,以对芯片管道进行清洗。利用微型芯片
荧光扫描仪进行光学数据采集,并传至微处理器中与数据库进行比较,从而精确分析样品中的目标微生物含量。