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生物发酵法工业化生产L-色酸的方法

阅读:124发布:2023-12-28

专利汇可以提供生物发酵法工业化生产L-色酸的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了 生物 发酵 法工业化生产L-色 氨 酸的方法,该方法依次包括菌种固体培养、发酵培养、发酵液提取和精制。本发明选用 微生物 发酵法工业化生产L- 色氨酸 ,有利于L-色氨酸的产率、收率和品质。,下面是生物发酵法工业化生产L-色酸的方法专利的具体信息内容。

1.生物发酵法工业化生产L-色酸的方法,该方法依 次包括菌种固体培养、发酵培养、发酵液提取和精制;其特 征在于:菌咱固体培养:首先,菌种培养基用2mol/l的NaOH 调pH为7.0分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶中,加塞 包皮纸,121℃灭菌15分钟,冷却至50-60℃,倾斜45° 摊平,待凝固放置恒温箱培养;然后,用接种环划一环菌种 直接均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上,放置37℃±1.0 的培养箱中培养24小时,长好后直接上罐或放置2-5℃箱 中备用;
其中,菌种在固体培养基中培养,菌种来源浙江大学, 菌株是一种Escherichia coli K-12 W3110变种;菌种固体培养 基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂 组成,最终浓度为20mg/l,培养基中的胰蛋白胨1%、酵母 浸出粉0.5%、氯化钠0.5%、琼脂2.0%,其中浓度为20g/l 的TC溶液由盐酸四环素溶解于浓度50%的乙醇溶液中制 得;
其中,发酵培养首先是菌种在液体培养基中培养得到成 熟的种子,然后,成熟的种子移入发酵罐的发酸培养基中发 酵代谢产生的L-色氨酸;其中,2.4T液体种子培养基由水中 加入以下组份组成:酵母浸出粉18kg、柠檬酸三钠3.6kg, MgSO4.7H2O 7.56kg、(NH4)2SO4 4.8kg、KH2PO4 1.8kg、 KCl 4.56kg、FeSO4.7H2O 6.72kg、钼酸铵0.672g、酸12g、 CoCl2.6H2O 3.36g、MnSO4.H2O 1.2g、CuSO4.7H2O 1.2g、 ZnSO4.7H2O 1.44g、Na2SO4 1.2g、VB1 57.6g、消泡剂0.72kg、 TC 6g、糖96kg;其中,22T发酵培养基由水中加入以下组 份组成:酵母浸出粉22kg、柠檬酸三钠.H2O22kg、柠檬酸 22kg、MgSO4 69.3kg、(NH4)2SO4 66kg、KH2PO4 33kg、 KCl 41.8kg、FeSO4.7H2O 1.66kg、钼酸铵6.16kg、H3BO3 110g、CoCl2.6H2O 61.6g、CuSO4.5H2O 22g、MnSO4.H2O 22g、ZnSO4.7H2O 26.4g、Na2SO4 110g、消泡剂6.6kg、糖 330kg;其中,成熟种子的培养方法包括以下步骤:①空罐 灭菌:0.15-0.2Mpa,保压30分钟;②实罐灭菌:液体种子 培养基投入罐,4T种子罐配2.4T种子培养基,调pH至7.0, 关闭罐盖,夹套加热至90℃,直接进蒸汽加热到121℃, 0.1Mpa压保温10分钟;③冷却:灭菌完毕冷却降温至36 ℃,待接种;④接种:采用压差法将菌液接入罐内,接种温 度35-36℃,pH0.8-7.0,压力0.1Mpa,打开接种口防护盖, 用浸泡过95%乙醇的花圈圈住接种口,点燃棉花圈,接种 瓶移至点燃棉花圈接种口旁,慢慢旋开接种瓶针头保护塞, 迅速将接种瓶针头插入接种口,移开棉花圈并熄灭,缓缓打 开罐上排气,调压0.05-0.1Mpa,接种量10%,接种结束 后,用浸过75%乙醇的棉花球放置在接种口上,拨出接种针 头,旋上接种口防护盖,开始培养;⑤培养:培养温度36 ℃、罐压0.03Mpa、量0.6-1.2m3/h、pH6.5、搅拌转速 400-700rpm、溶20%以上、培养时间12-18小时、最终 OD660nm:15-20、最终葡萄糖含量小于10g/l;其中,发酵 培养包括以下步骤:①空罐灭菌:0.15-0.17Mpa压力、温度 128℃灭菌30分钟;②实罐灭菌:发酵培养基投入罐中,30T 罐加22T培养基,关闭罐盖,夹套预热泪盈眶到95-105℃, 直接进蒸流加热到121℃,压力0.1Mpa,保温10分钟,冷 却降温至36℃,氨调pH6.5等接种;③接种:采用压差法将 种子液压入罐内培养;④培养:培养温度36℃,罐压0.03Mpa, 风量0.6-1.1m3/h,pH6.5,搅拌转速400-700rpm,发酵结束 时色氨酸生成浓度在20-60g/l、糖浓度1.2g/l;⑤发酵结束后, 放罐前在发酵罐内加千分之一的明矾,发酵液加热至80℃, 立即降温至37℃,用压缩空气压至发酵液储存罐;
其中,发酵液提取依次包括以下步骤:首先发酵液微滤, 储罐中的发酵液用打入加热罐中,加热并保温55±5℃, 开启膜过滤器对发酵液进行过滤,微滤温度35-50℃,微滤 压力0.30Mpa,微滤流速80-100l/m2.l,膜孔径0.05-1.0μm, 膜厚度10-150μm;然后,微滤后的滤液进一步超滤,超滤温 度55-60℃,超滤压力1.0Mpa,超滤流速30-35l/m2.h,膜孔 径0.015-0.1μm,膜厚度150-250μm,非对称性膜;最后,超 滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液,纳滤温度55-60℃,纳 滤压力0.5-3.5Mpa,纳滤流速2.5-4.0l/m2.h,膜孔径1-2nm, 膜厚度150μm,非对称性膜;
其中,精制依次包括粗结晶和精制过程,其中,粗结晶 过程为:①将浓缩液打入结晶罐中,迅速搅拌降温至5-15 ℃,5±3℃静止结晶4小时;②将粗品离心甩干,水淋洗, 60℃下进热循环干燥箱干燥6小时,控制水份≤5.0%得粗品; 其中,精制过程为:①在搅拌下将粗品加入20倍重量的60 ℃纯水中,升温至75℃完全溶解,按粗品重量0.1%加入明 矾;②按粗品重量的30%加入303#活性,在75℃脱色15 分钟,过滤;③脱色液经冷盘管降温至5-15℃,按体积比 15%加入浓度80%工业醋酸,搅拌有大量晶体折出后停,保温 5±3℃结晶4小时,结晶结束时母液浓度2-3g/l;④将结晶 液转入离心机离心,冰水淋洗,湿粉在双锥干燥器80℃下真 空干燥4-6小时得精品。

说明书全文

技术领域

发明涉及生物发酵法,具体涉及生物发酵法工业化生 产L-色酸的方法。

背景技术

目前,生物发酵法生产L-色氨酸的研究基于实验室阶 段,实验室阶段的技术参数尚不能应用于工业化生产,尤其 是菌种的固体培养基及培养方法、发酵液的提取方法、浓缩 液的精制方法将影响L-色氨酸的品质、收率和产率。

发明内容

本发明的目的在于:提供一种生物发酵法工业化生产L- 色氨酸的方法,采用该方法应用于工业化生产L-色氨酸,有 利于提高L-色氨酸的产率、收率和品质。
本发明的技术解决方案是该发酵法依次包括以下步骤: 菌种固体菌种培养、发酵培养、发酵液提取和精制。
其中,菌种固体培养:首先,菌种培养基用2mol/l的 NaOH调pH为7.0分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶中, 加塞包皮纸,121℃灭菌15分钟,冷却至50-60℃,倾斜 45°摊平,待凝固放置恒温箱培养;然后,用接种环划一环 菌种直接均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上,放置37℃± 1.0的培养箱中培养24小时,长好后直接上罐或放置2-5℃ 箱中备用。
其中,菌种在固体培养基中培养,菌种来源浙江大学, 菌株是一种Escherichia coli K-12 W3110变种;菌种固体培养 基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂 组成,最终浓度为20mg/l,培养基中的胰蛋白胨1%、酵母 浸出粉0.5%、氯化钠0.5%、琼脂2.0%,其中浓度为20g/l 的TC溶液由盐酸四环素溶解于浓度50%的乙醇溶液中制 得。
其中,发酵培养首先是菌种在液体培养基中培养得到成 熟的种子,然后,成熟的种子移入发酵罐的发酸培养基中发 酵代谢产生的L-色氨酸;其中,2.4T液体种子培养基由水中 加入以下组份组成:酵母浸出粉18kg、柠檬酸三钠3.6kg、 MgSO4.7H2O 7.56kg、(NH4)2SO4 4.8kg、KH2PO4 1.8kg、 KCl 4.56kg、FeSO4.7H2O 6.72kg、钼酸铵0.672g、酸12g、 CoCl2.6H2O 3.36g、MnSO4.H2O 1.2g、CuSO4.7H2O 1.2g、 ZnSO4.7H2O 1.44g、Na2SO4 1.2g、VB1 57.6g、消泡剂0.72kg、 TC 6g、糖96kg;其中,22T发酵培养基由水中加入以下组 份组成:酵母浸出粉22kg、柠檬酸三钠.H2O22kg、柠檬酸 22kg、MgSO4 69.3kg、(NH4)2SO4 66kg、KH2PO4 33kg、 KCl 41.8kg、FeSO4.7H2O 1.66kg、钼酸铵6.16kg、H3BO3 110g、CoCl2.6H2O 61.6g、CuSO4.5H2O 22g、MnSO4.H2O 22g、ZnSO4.7H2O 26.4g、Na2SO4 110g、消泡剂6.6kg、糖 330kg;其中,成熟种子的培养方法包括以下步骤:①空罐 灭菌:0.15-0.2Mpa,保压30分钟;②实罐灭菌:液体种子 培养基投入罐,4T种子罐配2.4T种子培养基,调pH至7.0, 关闭罐盖,夹套加热至90℃,直接进蒸汽加热到121℃, 0.1Mpa压保温10分钟;③冷却:灭菌完毕冷却降温至36 ℃,待接种;④接种:采用压差法将菌液接入罐内,接种温 度35-36℃,pH6.8-7.0,压力0.1Mpa,打开接种口防护盖, 用浸泡过95%乙醇的花圈圈住接种口,点燃棉花圈,接种 瓶移至点燃棉花圈接种口旁,慢慢旋开接种瓶针头保护塞, 迅速将接种瓶针头插入接种口,移开棉花圈并熄灭,缓缓打 开罐上排气,调压0.05-0.1Mpa,接种量10%,接种结束 后,用浸过75%乙醇的棉花球放置在接种口上,拨出接种针 头,旋上接种口防护盖,开始培养;⑤培养:培养温度36 ℃、罐压0.03Mpa、量0.6-1.2m3/h、pH6.5、搅拌转速 400-700rpm、溶20%以上、培养时间12-18小时、最终 OD660nm:15-20、最终葡萄糖含量小于10g/l;其中,发酵 培养包括以下步骤:①空罐灭菌:0.15-0.17Mpa压力、温度 128℃灭菌30分钟;②实罐灭菌:发酵培养基投入罐中,30T 罐加22T培养基,关闭罐盖,夹套预热到95-105℃,直接进 蒸流加热到121℃,压力0.1Mpa,保温10分钟,冷却降温 至36℃,氨调pH6.5等接种;③接种:采用压差法将种子液 压入罐内培养;④培养:培养温度36℃,罐压0.03Mpa,风 量0.6-1.1m3/h,pH6.5,搅拌转速400-700rpm,发酵结束时 色氨酸生成浓度在20-60g/l、糖浓度1.2g/l;⑤发酵结束后, 放罐前在发酵罐内加千分之一的明矾,发酵液加热至80℃, 立即降温至37℃,用压缩空气压至发酵液储存罐。
其中,发酵液提取依次包括以下步骤:首先发酵液微滤, 储罐中的发酵液用打入加热罐中,加热并保温55±5℃, 开启膜过滤器对发酵液进行过滤,微滤温度35-50℃,微滤 压力0.30Mpa,微滤流速80-100l/m2·l,膜孔径0.05-1.0μm, 膜厚度10-150μm;然后,微滤后的滤液进一步超滤,超滤温 度55-60℃,超滤压力1.0Mpa,超滤流速30-35l/m2.h,膜孔 径0.015-0.1μm,膜厚度150-250μm,非对称性膜;最后,超 滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液,纳滤温度55-60℃,纳 滤压力0.5-3.5Mpa,纳滤流速2.5-4.0l/m2.h,膜孔径1-2nm, 膜厚度150μm,非对称性膜。
其中,精制依次包括粗结晶和精制过程,其中,粗结晶 过程为:①将浓缩液打入结晶罐中,迅速搅拌降温至5-15 ℃,5±3℃静止结晶4小时;②离心甩干,水淋洗,60℃ 下进热循环干燥箱干燥6小时,控制水份≤5.0%得粗品;其 中,精制过程为:①在搅拌下将粗品加入20倍重量的60℃ 纯水中,升温至75℃完全溶解,按粗品重量0.1%加入明矾; ②按粗品重量的30%加入303#活性,在75℃脱色15分钟, 过滤;③脱色液经冷盘管降温至5-15℃,按体积比15%加入 浓度80%工业醋酸,搅拌有大量晶体折出后停,保温5±3℃ 结晶4小时,结晶结束时母液浓度2-3g/l;④将结晶液转入 离心机离心,冰水淋洗,湿粉在双锥干燥器80℃下真空干燥 4-6小时得精品。
本发明选用生物发酵法经菌种培养、发酵培养、发酵液 提取和精制工艺化生产L-色氨酸,有利于L-色氨酸的产率、 收率和品质。

具体实施方式

下面结合具体的实施例,进一步详细地描述本发明。应 理解,这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方 式限制本发明的范围。
例1:菌种固体培养:首先,菌种培养基用2mol/l的NaOH 调pH为7.0分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶中,加塞 包牛皮纸,121℃灭菌15分钟,冷却至50℃,倾斜45°摊 平,待凝固放置恒温箱培养;然后,用接种环划一环菌种直 接均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上,放置37℃±1.0的 培养箱中培养24小时,长好后直接上罐或放置2℃水箱中备 用。
其中,菌种在固体培养基中培养,菌种来源浙江大学, 菌株是一种Escherichia coli K-12 W3110变种;菌种固体培养 基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂 组成,最终浓度为20mg/l,培养基中的胰蛋白胨1%、酵母 浸出粉0.5%、氯化钠0.5%、琼脂2.0%,其中浓度为20g/l 的TC溶液由盐酸四环素溶解于浓度50%的乙醇溶液中制 得。
其中,发酵培养首先是菌种在液体培养基中培养得到成 熟的种子,然后,成熟的种子移入发酵罐的发酸培养基中发 酵代谢产生的L-色氨酸;其中,2.4T液体种子培养基由水中 加入以下组份组成:酵母浸出粉18kg、柠檬酸三钠3.6kg、 MgSO4.7H2O 7.56kg、(NH4)2SO4 4.8kg、KH2PO4 1.8kg、 KCl 4.56kg、FeSO4.7H2O 6.72kg、钼酸铵0.672g、硼酸12g、 CoCl2.6H2O 3.36g、MnSO4.H2O 1.2g、CuSO4.7H2O 1.2g、 ZnSO4.7H2O 1.44g、Na2SO4 1.2g、VB1 57.6g、消泡剂0.72kg、 TC 6g、糖96kg;其中,22T发酵培养基由水中加入以下组 份组成:酵母浸出粉22kg、柠檬酸三钠.H2O22kg、柠檬酸 22kg、MgSO4 69.3kg、(NH4)2SO4 66kg、KH2PO4 33kg、 KCl 41.8kg、FeSO4.7H2O 1.66kg、钼酸铵6.16kg、H3BO3 110g、CoCl2.6H2O 61.6g、CuSO4.5H2O 22g、MnSO4.H2O 22g、ZnSO4.7H2O 26.4g、Na2SO4 110g、消泡剂6.6kg、糖 330kg;其中,成熟种子的培养方法包括以下步骤:①空罐 灭菌:0.15Mpa,保压30分钟;②实罐灭菌:液体种子培养 基投入罐,4T种子罐配2.4T种子培养基,调pH至7.0,关 闭罐盖,夹套加热至90℃,直接进蒸汽加热到121℃,0.1Mpa 压力保温10分钟;③冷却:灭菌完毕冷却降温至36℃,待 接种;④接种:采用压差法将菌液接入罐内,接种温度35 ℃,pH6.8,压力0.1Mpa,打开接种口防护盖,用浸泡过95% 乙醇的棉花圈圈住接种口,点燃棉花圈,接种瓶移至点燃棉 花圈接种口旁,慢慢旋开接种瓶针头保护塞,迅速将接种瓶 针头插入接种口,移开棉花圈并熄灭,缓缓打开罐上排气阀, 调压0.05Mpa,接种量10%,接种结束后,用浸过75%乙醇 的棉花球放置在接种口上,拨出接种针头,旋上接种口防护 盖,开始培养;⑤培养:培养温度36℃、罐压0.03Mpa、风 量0.6m3/h、pH6.5、搅拌转速400rpm、溶氧20%以上、培养 时间12小时,最终OD660nm:15、最终葡萄糖含量小于10g/l; 其中,发酵培养包括以下步骤:①空罐灭菌:0.15Mpa压力、 温度128℃灭菌30分钟;②实罐灭菌:发酵培养基投入罐中, 30T罐加22T培养基,关闭罐盖,夹套预热到95℃,直接进 蒸流加热到121℃,压力0.1Mpa,保温10分钟,冷却降温 至36℃,氨调pH6.5等接种;③接种:采用压差法将种子液 压入罐内培养;④培养:培养温度36℃,罐压0.03Mpa,风 量0.6m3/h,pH6.5,搅拌转速400rpm,发酵结束时色氨酸生 成浓度在20g/l、糖浓度1.2g/l;⑤发酵结束后,放罐前在发 酵罐内加千分之一的明矾,发酵液加热至80℃,立即降温至 37℃,用压缩空气压至发酵液储存罐。
其中,发酵液提取依次包括以下步骤:首先发酵液微滤, 储罐中的发酵液用泵打入加热罐中,加热并保温55±5℃, 开启膜过滤器对发酵液进行过滤,微滤温度35℃,微滤压力 0.30Mpa,微滤流速80l/m2.l,膜孔径0.05μm,膜厚度10μm; 然后,微滤后的滤液进一步超滤,超滤温度55℃,超滤压力 1.0Mpa,超滤流速30l/m2.h,膜孔径0.015μm,膜厚度150μm, 非对称性膜;最后,超滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液, 纳滤温度55℃,纳滤压力0.5Mpa,纳滤流速2.5l/m2.h,膜 孔径1nm,膜厚度150μm,非对称性膜。
其中,精制依次包括粗结晶和精制过程,其中,粗结晶 过程为:①将浓缩液打入结晶罐中,迅速搅拌降温至5℃,5 ±3℃静止结晶4小时;②离心甩干,冰水淋洗,60℃下进 热循环干燥箱干燥6小时,控制水份≤5.0%得粗品;其中, 精制过程为:①在搅拌下将粗品加入20倍重量的60℃纯水 中,升温至75℃完全溶解,按粗品重量0.1%加入明矾;② 按粗品重量的30%加入303#活性碳,在75℃脱色15分钟, 过滤;③脱色液经冷盘管降温至5℃,按体积比15%加入浓 度80%工业醋酸,搅拌有大量晶体折出后停,保温5±3℃结 晶4小时,结晶结束时母液浓度2g/l;④将结晶液转入离心 机离心,冰水淋洗,湿粉在双锥干燥器80℃下真空干燥4小 时得精品。
例2:其中,菌种固体培养:首先,菌种培养基用2mol/l 的NaOH调pH为7.0分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶 中,加塞包牛皮纸,121℃灭菌15分钟,冷却至55℃,倾斜 45°摊平,待凝固放置恒温箱培养;然后,用接种环划一环 菌种直接均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上,放置37℃± 1.0的培养箱中培养24小时,长好后直接上罐或放置4℃水 箱中备用。
其中,菌种在固体培养基中培养,菌种来源浙江大学, 菌株是一种Escherichia coli K-12W3110变种;菌种固体培养 基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂 组成,最终浓度为20mg/l,培养基中的胰蛋白胨1%、酵母 浸出粉0.5%、氯化钠0.5%、琼脂2.0%,其中浓度为20g/l 的TC溶液由盐酸四环素溶解于浓度50%的乙醇溶液中制 得。
其中,发酵培养首先是菌种在液体培养基中培养得到成 熟的种子,然后,成熟的种子移入发酵罐的发酸培养基中发 酵代谢产生的L-色氨酸;其中,2.4T液体种子培养基由水中 加入以下组份组成:酵母浸出粉18kg、柠檬酸三钠3.6kg、 MgSO4.7H2O 7.56kg、(NH4)2SO4 4.8kg、KH2PO4 1.8kg、 KCl 4.56kg、FeSO4.7H2O 6.72kg、钼酸铵0.672g、硼酸12g、 CoCl2.6H2O 3.36g、MnSO4.H2O 1.2g、CuSO4.7H2O 1.2g、 ZnSO4.7H2O 1.44g、Na2SO4 1.2g、VB1 57.6g、消泡剂0.72kg、 TC 6g、糖96kg;其中,22T发酵培养基由水中加入以下组 份组成:酵母浸出粉22kg、柠檬酸三钠.H2O22kg、柠檬酸 22kg、MgSO4 69.3kg、(NH4)2SO4 66kg、KH2PO4 33kg、 KCl 41.8kg、FeSO4.7H2O 1.66kg、钼酸铵6.16kg、H3BO3 110g、CoCl2.6H2O 61.6g、CuSO4.5H2O 22g、MnSO4.H2O 22g、ZnSO4.7H2O 26.4g、Na2SO4 110g、消泡剂6.6kg、糖 330kg;其中,成熟种子的培养方法包括以下步骤:①空罐 灭菌:0.18Mpa,保压30分钟;②实罐灭菌:液体种子培养 基投入罐,4T种子罐配2.4T种子培养基,调pH至7.0,关 闭罐盖,夹套加热至90℃,直接进蒸汽加热到121℃,0.1Mpa 压力保温10分钟;③冷却:灭菌完毕冷却降温至36℃,待 接种;④接种:采用压差法将菌液接入罐内,接种温度35 ℃,pH6.9,压力0.1Mpa,打开接种口防护盖,用浸泡过95% 乙醇的棉花圈圈住接种口,点燃棉花圈,接种瓶移至点燃棉 花圈接种口旁,慢慢旋开接种瓶针头保护塞,迅速将接种瓶 针头插入接种口,移开棉花圈并熄灭,缓缓打开罐上排气阀, 调压0.75Mpa,接种量10%,接种结束后,用浸过75%乙醇 的棉花球放置在接种口上,拨出接种针头,旋上接种口防护 盖,开始培养;⑤培养:培养温度36℃、罐压0.03Mpa、风 量0.9m3/h、pH6.5、搅拌转速550rpm、溶氧20%以上、培养 时间15小时、最终OD660nm:18、最终葡萄糖含量小于10g/l; 其中,发酵培养包括以下步骤:①空罐灭菌:0.16Mpa压力、 温度128℃灭菌30分钟;②实罐灭菌:发酵培养基投入罐中, 30T罐加22T培养基,关闭罐盖,夹套预热泪盈眶到100℃, 直接进蒸流加热到121℃,压力0.1Mpa,保温10分钟,冷 却降温至36℃,氨调pH6.5等接种;③接种:采用压差法将 种子液压入罐内培养;④培养:培养温度36℃,罐压0.03Mpa, 风量0.8m3/h,pH6.5,搅拌转速550rpm,发酵结束时色氨酸 生成浓度在40g/l、糖浓度1.2g/l;⑤发酵结束后,放罐前在 发酵罐内加千分之一的明矾,发酵液加热至80℃,立即降温 至37℃,用压缩空气压至发酵液储存罐。
其中,发酵液提取依次包括以下步骤:首先发酵液微滤, 储罐中的发酵液用泵打入加热罐中,加热并保温55±5℃, 开启膜过滤器对发酵液进行过滤,微滤温度43℃,微滤压力 0.30Mpa,微滤流速90l/m2.l,膜孔径0.75μm,膜厚度80μm; 然后,微滤后的滤液进一步超滤,超滤温度58℃,超滤压力 1.0Mpa,超滤流速33l/m2.h,膜孔径0.75μm,膜厚度200μm, 非对称性膜;最后,超滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液, 纳滤温度58℃,纳滤压力2.0Mpa,纳滤流速3.3l/m2.h,膜 孔径1.5nm,膜厚度150μm,非对称性膜。
其中,精制依次包括粗结晶和精制过程,其中,粗结晶 过程为:①将浓缩液打入结晶罐中,迅速搅拌降温至10℃, 5±3℃静止结晶4小时;②离心甩干,冰水淋洗,60℃下进 热循环干燥箱干燥6小时,控制水份≤5.0%得粗品;其中, 精制过程为:①在搅拌下将粗品加入20倍重量的60℃纯水 中,升温至75℃完全溶解,按粗品重量0.1%加入明矾;② 按粗品重量的30%加入303#活性碳,在75℃脱色15分钟, 过滤;③脱色液经冷盘管降温至10℃,按体积比15%加入浓 度80%工业醋酸,搅拌有大量晶体折出后停,保温5±3℃结 晶4小时,结晶结束时母液浓度2.5g/l;④将结晶液转入离 心机离心,冰水淋洗,湿粉在双锥干燥器80℃下真空干燥5 小时得精品。
例3:其中,菌种固体培养:首先,菌种培养基用2mol/l 的NaOH调pH为7.0分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶 中,加塞包牛皮纸,121℃灭菌15分钟,冷却至60℃,倾斜 45°摊平,待凝固放置恒温箱培养;然后,用接种环划一环 菌种直接均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上,放置37℃± 1.0的培养箱中培养24小时,长好后直接上罐或放置5℃水 箱中备用。
其中,菌种在固体培养基中培养,菌种来源浙江大学, 菌株是一种Escherichia coli K-12 W3110变种;菌种固体培养 基由TC溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂 组成,最终浓度为20mg/l,培养基中的胰蛋白胨1%、酵母 浸出粉0.5%、氯化钠0.5%、琼脂2.0%,其中浓度为20g/l 的TC溶液由盐酸四环素溶解于浓度50%的乙醇溶液中制 得。
其中,发酵培养首先是菌种在液体培养基中培养得到成 熟的种子,然后,成熟的种子移入发酵罐的发酸培养基中发 酵代谢产生的L-色氨酸;其中,2.4T液体种子培养基由水中 加入以下组份组成:酵母浸出粉18kg、柠檬酸三钠3.6kg、 MgSO4.7H2O 7.56kg、(NH4)2SO4 4.8kg、KH2PO4 1.8kg、 KCl 4.56kg、FeSO4.7H2O 6.72kg、钼酸铵0.672g、硼酸12g、 CoCl2.6H2O 3.36g、MnSO4.H2O 1.2g、CuSO4.7H2O 1.2g、 ZnSO4.7H2O 1.44g、Na2SO4 1.2g、VB1 57.6g、消泡剂0.72kg、 TC 6g、糖96kg;其中,22T发酵培养基由水中加入以下组 份组成:酵母浸出粉22kg、柠檬酸三钠.H2O22kg、柠檬酸 22kg、MgSO4 69.3kg、(NH4)2SO4 66kg、KH2PO4 33kg、 KCl 41.8kg、FeSO4.7H2O 1.66kg、钼酸铵6.16kg、H3BO3 110g、CoCl2.6H2O 61.6g、CuSO4.5H2O 22g、MnSO4.H2O 22g、ZnSO4.7H2O 26.4g、Na2SO4 110g、消泡剂6.6kg、糖 330kg;其中,成熟种子的培养方法包括以下步骤:①空罐 灭菌:0.2Mpa,保压30分钟;②实罐灭菌:液体种子培养 基投入罐,4T种子罐配2.4T种子培养基,调pH至7.0,关 闭罐盖,夹套加热至90℃,直接进蒸汽加热到121℃,0.1Mpa 压力保温10分钟;③冷却:灭菌完毕冷却降温至36℃,待 接种;④接种:采用压差法将菌液接入罐内,接种温度36 ℃,pH0.8-7.0,压力0.1Mpa,打开接种口防护盖,用浸泡过 95%乙醇的棉花圈圈住接种口,点燃棉花圈,接种瓶移至点 燃棉花圈接种口旁,慢慢旋开接种瓶针头保护塞,迅速将接 种瓶针头插入接种口,移开棉花圈并熄灭,缓缓打开罐上排 气阀,调压0.1Mpa,接种量10%,接种结束后,用浸过75% 乙醇的棉花球放置在接种口上,拨出接种针头,旋上接种口 防护盖,开始培养;⑤培养:培养温度36℃、罐压0.03Mpa、 风量1.2m3/h、pH6.5、搅拌转速700rpm、溶氧20%以上、培 养时间18小时、最终OD660nm:20、最终葡萄糖含量小 于10g/l;其中,发酵培养包括以下步骤:①空罐灭菌: 0.17Mpa压力、温度128℃灭菌30分钟;②实罐灭菌:发酵 培养基投入罐中,30T罐加22T培养基,关闭罐盖,夹套预 热泪盈眶到105℃,直接进蒸流加热到121℃,压力0.1Mpa, 保温10分钟,冷却降温至36℃,氨调pH6.5等接种;③接 种:采用压差法将种子液压入罐内培养;④培养:培养温度 36℃,罐压0.03Mpa,风量1.1m3/h,pH6.5,搅拌转速700rpm, 发酵结束时色氨酸生成浓度在60g/l、糖浓度1.2g/l;⑤发酵 结束后,放罐前在发酵罐内加千分之一的明矾,发酵液加热 至80℃,立即降温至37℃,用压缩空气压至发酵液储存罐。
其中,发酵液提取依次包括以下步骤:首先发酵液微滤, 储罐中的发酵液用泵打入加热罐中,加热并保温55±5℃, 开启膜过滤器对发酵液进行过滤,微滤温度50℃,微滤压力 0.30Mpa,微滤流速100l/m2.l,膜孔径1.0μm,膜厚度150μm; 然后,微滤后的滤液进一步超滤,超滤温度60℃,超滤压力 1.0Mpa,超滤流速30-35l/m2.h,膜孔径0.1μm,膜厚度250μm, 非对称性膜;最后,超滤后的提纯液进一步纳滤得浓缩液, 纳滤温度60℃,纳滤压力60℃,纳滤压力3.5Mpa,纳滤流 速4.0l/m2.h,膜孔径2nm,膜厚度150μm,非对称性膜。
其中,精制依次包括粗结晶和精制过程,其中,粗结晶 过程为:①将浓缩液打入结晶罐中,迅速搅拌降温至15℃, 5±3℃静止结晶4小时;②离心甩干,冰水淋洗,60℃下进 热循环干燥箱干燥6小时,控制水份≤5.0%得粗品;其中, 精制过程为:①在搅拌下将粗品加入20倍重量的60℃纯水 中,升温至75℃完全溶解,按粗品重量0.1%加入明矾;② 按粗品重量的30%加入303#活性碳,在75℃脱色15分钟, 过滤;③脱色液经冷盘管降温至15℃,按体积比15%加入浓 度80%工业醋酸,搅拌有大量晶体折出后停,保温5±3℃结 晶4小时,结晶结束时母液浓度3g/l;④将结晶液转入离心 机离心,冰水淋洗,湿粉在双锥干燥器80℃下真空干燥6小 时得精品。
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