一种基因工程菌在制备泛酸中的应用

(一） 技术领域

本发明涉及一种基因工程菌在制备泛酸中的应用。

(二） 背景技术

泛酸（Pantothenic acid)，又名遍多酸、本多生酸、鸡抗皮炎因子，属 于水溶性B族维生素，广泛分布于生物界中，于1933年从酵母中首次分 离。泛酸在体内主要以辅酶A (CoA)形式参与糖、月旨、蛋白质代谢。泛 酸缺乏时，过氧化物酶体脂肪酸卩-氧化受到抑制，并可能诱导脑部伤害。

泛酸是人及许多动物、微生物必须的营养物质。泛酸或D-泛S吏4丐被 广泛地用作食品或饲料的营养添加剂。泛酸在临床上一直用于维生素B 缺乏症、周围神经炎、手术后便梗塞、链霉素中毒及类风湿等；还可用于 治疗斑秃、慢性炎症、抗氧和解决食欲不振、以及作为治疗肝紊乱的营养 食品。另外，在食品上作为添加剂可增加食品风味。

D-泛酸钓的合成方法分为化学法和生物法，现在工业上普遍采用化 学法。化学法首先要得到DL-泛解酸内脂。根据其合成起始原料的差异可 分为三类：（l)异丁醛、曱醛法（即stiller法）；（2)异丁醛、羟乙腈法；（3) 异丁醛、乙醛酸法。其中stiller法应用范为最广，现在改进的stiller法已 不再使用剧毒NaCN。 DL-泛解酸内脂可以采用手性试剂进行拆分（前拆 分），得到D-泛解酸内脂后直接与（3-丙氨酸缩合得到DL-泛酸钙后采用物 理方法进行拆分（后拆分），即加入D-泛酸4丐晶种诱导溶液中D-泛酸钙 结晶。化学法生产成本高，生产场地安全性要求高，其原料、中间体及副 产物有毒，对环境污染比较严重。

生物法分为直接发酵法和酶法转化与拆分，目前多处于研究阶段。泛酸在生物体内主要通过泛解酸内酯和(3-丙氨酸缩合生成。P-丙氨酸

在生物体内有多条合成途径。国外对L-天冬氨酸脱羧获得（3-丙氨酸已经 有所研究。在L-天冬氨酸a-脱羧酶的作用下，L-天冬氨酸的a位羧基能 立体特异性地脱去生成p-丙氨酸和C02，随着C02的释放，该反应基本 上是不可逆的。1971年，Nakano等首先表明来自大肠杆菌B林的粗提取 物中有此酶活性。1979年，Williamson等进一步研究了把大肠杆菌中的 该酶纯化到表观均一后的酶活性。1980年，Cronan等也研究了 （3-丙氨酸 在大肠杆菌中的合成，接着，人们又对该酶的晶体结构和形成机制进行了 研究。但由于该酶的活性非常低，直接从自然界中筛选产酶高活力菌林比 较困难，到目前为止还未见相关报道。1996年，美国NSC技术有限公司 通过基因重组的方法，构建含该酶的菌株(NS3291)，用于拆分DL-天冬氨 酸。

(三）发明内容

为解决现有技术中直接从自然界中筛选产酶高活力菌林比较困难、泛 酸化学法生产成本高、对环境污染比较严重的不足，本发明提供了一种育 种目标明确、效率高、合成P-丙氨酸的能力强的基因工程菌在制备泛酸 中的应用。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种基因工程菌在制备泛酸中的应用，所述的基因工程菌通过如下方 法制备得到：利用PCR扩增含有戶"Z)基因的供体菌的L-天冬氨酸a-脱 羧酶基因并将其克隆到能高效表达外源基因的质粒上，得到戶"D 基因高表达载体，再将所得的p朋D基因高表达载体转化入受体菌，即得 到所述的基因工程菌。所述供体菌优选为含有；w/7"基因的埃希氏菌属、棒杆菌属、芽孢杆

菌属、分枝杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、变形菌属、固氮菌属、根 瘤菌属、克雷伯氏菌属、螺杆菌属、李斯特菌属、蛭弧菌属、产碱杆菌属、 弗朗西斯菌属、志贺氏菌属、嗜冷杆菌属或嗜肺军团菌属的细菌。

所述受体菌优选为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、结核 分枝杆菌、枯草杆菌、天蓝色链霉菌或富养罗尔斯通氏菌。。

所述能高效表达外源基因的质粒优选为下列之一：①pET系列，② pUC系列，③pGEM系列，④pBluescript系列，⑤pEKEx2系列，©pCMVTNT 系列，⑦pGAl系列，⑧pJCl系列。

具体的，所述基因工程菌制备方法如下：

(1) PCR扩增供体菌L-天冬氨酸a-脱羧酶基因PCR产物经 凝胶回收后克隆至能高效表达外源基因的质粒上，得到p^iD基 因高表达载体；

(2) 步骤（1)所得的高表达载体转化宿主菌感受态细胞，获得含有 p朋Z)基因高表达质粒的宿主菌细胞；

(3) 步骤（2)所得的含有w"D基因高表达质粒的宿主菌细胞，涂 布到含卡那霉素的适宜于培养细菌的培养基如LB平板上， 2(K37。C培养6〜24h，即得所述基因工程菌。

所述基因工程菌优选为大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28 b(+)-panD (Esc/2^c/z/"co/z' BL21 (DE3)/pET28 b(+)-panD),保藏于中国典型培养物 保藏中心，保藏日期2006年10月27日，保藏编号CCTCCNO:M206114。 所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD菌落边缘整齐，表面有光泽、 湿润、光滑，能发酵乳糖产酸产气，在伊红美蓝琼脂平板上呈现金龟子色。所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD由如下方法制备得到： (1 ) PCR扩增大肠杆菌DH5a的L-天冬氨酸a-脱羧酶基因p""Z), PCR 产物经凝胶回收后通过限制性内切酶5awH I III酶切后克隆

至经BawH I / ///"d III同样处理的质粒pET28b(+)载体上，得到重组 质粒pET28b(+)-panD; 正向引物：AACGGATCCTATGATTCGCACGATGCTG, 反向引物：CCAAAGCTTAGCAACCTGTACCGGAATC, PCR反应条件：

90-98。C变性1〜10min;接着进行20〜50个循环，参数为94~95°C , 1〜5min; 50〜70°C, 1〜3min; 70~75°C, 20〜180s;最后72。C延伸2〜30min;

(2) 将大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等细菌感受态细胞，置于冰上，完全解 冻后将细胞均匀悬浮，取步骤l)所得质粒pET28b(+)-panD,加入 到感受态细胞中混匀，水上放置5~30min, 10~60°C水浴热激 30〜120s，再水上》文置5〜30min;加入SOB(SOB培养基市购或自制， 自制配方如下（终浓度计）：胰蛋白胨，20g/L; NaCl， 0.5g/L;酵 母膏，5g/L ; MgS04 . 7H20， 5g/L)或LB培养基（LB培养基可市 购或自制，自制配方如下（终浓度计）：蛋白胨，10g/L;酵母膏， 5g/L; NaCl, 10g/L; pH7.0。 ）， 20〜37°C， 50 ~ 250 r/min振荡培养 0.5~2h,室温下3000~5000r/min离心5〜15min,吸去上清液，用培 养液将细胞悬浮；

(3) 将步骤2)的转化产物涂布于含10〜100jig/mL卡那霉素的平板， 20〜37。C培养，长出菌种后重复传代两次，所得菌种提取质粒经酶 切后琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定确认后保存菌种，即得所述大肠杆 菌BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD。具体的，所述的应用为：将所述基因工程菌经斜面培养、种子培养、 发酵培养，离心取菌体，加入底物泛解酸内酯至终浓度0.01〜10mol/L, 20~80。C 、 50 ~ 250 r/min转化1〜90h,反应液经分离纯化得到泛酸。所述 的斜面培养基、种子培养基、发酵培养基均为培养大肠杆菌的适用 培养基，可釆用一切可用于培养大肠杆菌的常规培养基，如SOB或LB 培养基等。

所述用于培养大肠杆菌的常规培养基，可市购，也可自制，SOB培 养基自制配方如下（终浓度计）：胰蛋白胨，20g/L; NaCl， 0.5g/L;酵母 膏，5g/L ; MgS04 • 7H20， 5g/L; LB自制配方如下（终浓度计）：蛋 白胨，10g/L;酵母膏，5g/L; NaCl， 10g/L; pH7.0。斜面i咅养基为LB培 养基再加入20g/L琼脂，在121°C下灭菌20min。

优选的，所述的应用为：将所述基因工程菌经斜面培养基20〜37。C活 化后接入种子培养基，在20〜37°C、 50〜250 r/min培养12〜48h后，以 0.1%~20%体积比接种量转入发酵培养基，20~37°C、 50~250 r/min培养 1〜24h后，加入诱导物D-半乳糖苷至终浓度0.01~1.5mmol/ L或乳糖至终 浓度0.1~50g/L，在20〜37°C 、 50 ~ 250 r/min培养12〜48h后，离心取菌体， 加入0.01~lmol/L的L-天门冬氨酸溶液，20~80°C、 50 ~ 250 r/min转化 1〜72h,加入底物泛解酸内酯至终浓度0.01〜10mol/L， 20〜80°C、 50-250 r/min转化l~90h，反应液经分离纯化得到泛酸。

本发明的有益效果主要体现在：（1 )所得基因工程菌合成泛酸的能力 强；初步研究发现转化液中泛酸浓度可达到1.34g/L，而出发菌抹用相同 方法检测不出泛酸；（2)运用基因工程技术对大肠杆菌进行改良，育种目 标明确、效率高。(四） 附图说明

图1为实施例1构建高表达载体pET28b(+)-panD图谱，kan为卡那霉素 抗性基因；

图2为泛酸标准样品HPLC分析结果图，泛酸保留时间4.903min;

图3为实施例3所得基因工程菌合成的泛酸HPLC分析结果图，泛酸保 留时间4.815min。

图4实施例3所得出发菌co/ZDH5a合成的泛酸HPLC分析结果图，未 才企测到泛酸。

(五） 具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

(所用LB培养基为自制，配方如下（终浓度计）：蛋白胨，10g/L;酵 母膏，5g/L; NaCl, 10g/L; pH7.0)

实施例1:高表达载体的构建 步骤：

(1 )根据五.co//的L-天冬氨酸a-脱羧酶基因( GenBank登录号： NC—000913 ) 的序列设计引物（正向引物： AACGGATCCTATGATTCGCACGATGCTG ，下划线的序列为限制 酶 BamH I 切 点 ； 反 向 引 物 ： CCAAAGCTTAGCAACCTGTACCGGAATC,下划线的序列为限制 酶///"d III切点），利用PCR技术扩增编码区序列；PCR反应条 件：95。C变性3min;接着进行35个循环，参数是94。C, lmin; 60°C, lmin和72。C, 45s;最后在72。C延伸5min。

(2) PCR产物经凝胶回收后，用限制酶5awH I / ///"d III克隆至pET28b(+)的相应位点，形成；?^Z)基因高表达载体 pET28b(+)-panD,质粒构建图谱见图1。 (3)取100pl大肠杆菌DH5a感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻 将细胞均匀悬浮，取所得质粒pET28b(+)-panD5)al，加入到感受态 细胞中轻轻混匀，冰上放置30min。 42'C水浴热激90s,冰上放置 15〜20min。加入400jJ LB培养基，37°C， 200 ~ 250 r/min振荡培养 lh。室温下4000r/min离心5min,用枪头吸掉400 |il上清液，用剩 余的培养基将细胞悬浮，获得大量载体pET28b(+)-panD。

实施例2:工程菌的获得 步骤：

(1) 取100iul大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，置于水上，完全解冻后 轻轻将细胞均匀悬浮。

(2) 取实施例1所得质粒pET28b(+)-panD5nl，加入到感受态细胞中轻 轻混勾。冰上》文置30min。

(3 ) 42。C水浴热激90s,水上放置15〜20min。

(4 )加入400|iil LB培养基，37°C ， 200 ~ 250 r/min振荡培养lh。

(5 )室温下4000r/min离心5min,用枪头吸掉400 |Lil上清液，用剩余的

培养基将细胞悬浮。 (6)将转入载体的细菌涂布在LB (含卡那霉素30pg/mL)平板上。 (7 )平板在37。C下正向放置lh以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜， 长出菌种后重复传代两次，所得菌种提取质粒经酶切及测序鉴定正确 后保存菌种，即为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28 b(+)-panD。

实施例3:泛酸合成能力对比实验将实施例2所得的基因工程菌在LB培养基上培养16~24h后，接入 含卡那霉素30|ig/mL的LB液体培养基中，37°C 、 200 r/min摇床培养过 夜。然后以1%的接种量转入相同的LB液体培养基中，250ml装30mlLB 液体培养基，37°C、 200r/min摇床培养至OD6oo约为0.4〜1.0时，加入诱 导物（IPTG终浓度为0.4mmol/L或加入乳糖至终浓度为8g/L) , 30°C、 200 r/min摇床培养12~20h,然后放于37°C 、 200r/min下摇床培养8h。 4°C, 4500r/min离心10min，收集菌体，用10mL无菌水离心洗涤两次，最后 加入5mL 0.2mol/L L-asp (用NaOH调pH至7.0 ) ， 37°C 、 200r/min下转 化ld。再加入0.5mL0.8mol/L泛解酸内脂，继续37。C、 200r/min下转化 ld。转化液于4500r/min离心10min取上清，上清液用HPLC测定。

选取的对照为co//DH5a、 co//BL21(DE3)、 E co/z'BL21(DE3)/ pET28b(+)，采用上述相同方法处理。

样品用反相高效液相色谱分析泛酸的含量。高效液相色谱仪为 Agilent 1100 Series,色谱柱为Zorbax SB C18柱（4.6x250mm)。色谱条 件如下：流速：1.0m 1/min; 4企测波长：200nm;柱温：30°C;流动相： 乙腈-20mmol/LKH2PO4溶液（体积比1: 9) ， pH3.0。

泛酸标样也用相同方法分析。根据标准物色谱峰的保留时间定性，根 据标准物的标准曲线对样品中泛酸进行定量。进样量为20pL。

泛酸标准样品HPLC分析结果图谱见图2;实施例2所得的基因工程菌 合成的泛酸的HPLC分析结果图谱见图3。实施例2所得的出发菌五.co// DH5a合成的泛酸的HPLC分析结果图谱见图4。

对照样五.co// DH5a、 co// BL21(DE3)、 co// BL21(DE3)/ pET28 b(+) 用相同方法没有检测出泛酸，所以基因工程菌泛酸的合成能力比出发菌抹 有显著提高。实施例4:泛酸合成

将实施例2所得的基因工程菌在LB培养基上培养20h后，接入含卡 那霉素30吗/mL的LB液体培养基中，37°C、 200 r/min摇床培养17h。 然后以1%的4娄种量转入相同的LB液体培养基中，250ml装30mlLB液 体培养基，37°C、 200 r/min摇床培养2h,加入IPTG至终浓度为0.4mmo1/ L， 28°C、 200 r/min摇床培养19h,然后放于37。C、 200r/min下摇床培养 6h。 4°C， 4500r/min离心lOmin,收集菌体，用lOmL无菌水离心洗涤两 次，最后加入5mL 0.2mol/L L-asp(用NaOH调pH至7.0 )， 37°C 、 200r/min 下转化ld。再加入0.5mL 0.8mol/L泛解酸内脂，继续37°C 、 200r/min下 转化ld。

样品用反相高效液相色谱分析泛酸的含量。高效液相色谱仪为 Agilent 1100 Series,色谱柱为Zorbax SB C18柱（4.6x250mm )。色谱条 件如下：流速：1.0m 1/min;检测波长：200nm;柱温：30°C;流动相： 乙腈-20mmol/LKH2PO4溶液（体积比1: 9) , pH3.0。

结果显示工程菌转化液中泛酸含量达到1.34g/L。