权利要求

一种真菌来源的生物活性物质和提取方法及其医药用途技术领域本发明涉及真菌生物活性物质的生物提取，特别是一种真菌来源的菌丝体的提取 物和提取方法及其医药用途。具体说是以高效液相分离方法获得菌株中国被毛孢(所wfe"a wVie^i's Liu, Guo, Yu & Zeng) (CCTCC， No. M87101)的菌丝体中的提取物 作为杀精子的生物活性物质。背景技术计划生育是全球注目的大事，也是我们的基本国策，关系到国家的发展，人类生 存的大问题。研制安全有效无毒副作用的避孕药物是计划生育领域的重要课题。鉴于精子在生育中的关键地位，理所当然地把抑制精子形成，杀死精子作为首选 的节育途径。当前国内外市场所见的作用于精子的抗生育药物均为化学合成物质，例如 垸苯醇醚类。这类物质对人体具有一定的化学污染和刺激作用。安全有效，无毒副作用的抗生育药物的使用是计划生育中至关重要的手段。中国被毛孢（历犯^/。^"6朋& Liu， Guo, Yu& Zeng) (CCTCC, No. M87101 )是一 种真菌。刘锡进等（刘锡进，郭永兰，余永信等，真菌学报，1989, 8U): 35~40〉对 此菌进行了分离培养。黄勃等（黄勃，于春秀，陈晓琳，樊美珍，李增智，2002, 菌物系统21 (1): 33~38 )利用RAPD技术对中国被毛孢的分类鉴定作了进一歩 的研究，并绘制了 RAPD聚类树状图。通过随机引物PCR分析（RAPD)表明中国被毛 孢和野生冬虫夏草的DNA相似率达96先，证明中国被毛孢是野生冬虫夏草的无性阶段。 发酵法可以大量获得冬虫夏草菌丝体及其发酵产物。古籍中记载某种冬虫夏草具有抗生 育的作用。古籍特别指明冬虫夏草取其"夏草"具有绝孕无子功效。微生物来源的活性物质比人体细胞来源的活性物质更易得，更廉价，发酵工业技术 更成熟。所以真菌发酵产生的活性物质在生物技术向工业化的进程中具有得天独厚的优 势。发明内容本发明的目的是提供一种真菌来源的生物活性物质和提取方法及其医药用途。本发 明是以菌株中国被毛孢（/仏w/e〃G;y/"e;w/j Liu， Guo, Yu & Zeng)(CCTCC, No. M87101) 在适宜的条件下正常生长，取其菌丝体，经生物处理，以高效液相分离的手段获得杀精 子活性物质。可制备出无毒副作用的"生物避孕药物"，可以防止直接接受不良物质引 起的污染综合症。本发明成本低廉，具有工业投产的潜力，所选真菌可用发酵工程的生 物技术进行工厂化生产，可以形成生产规模。本发明提供的真菌生物活性物质是用中国被毛孢（i«wte//a W加aw^ Liu， Guo， Yu &Zeng) (CCTCC，No. M87101)菌株的孢子悬液进行发酵获得的含有活性物质的菌丝体的提取物，使用高效液相色谱方法分离出的活性物质成分并以高效液相色谱方法表征 为：259 nm有吸收峰，保留时间为2.667分钟的色谱分离产物。本发明是经过下述具体步骤-1) 由中国被毛孢（/foWe//a Liu， Guo, Yu & Zeng) ( CCTCC， No. M87101) 菌株进行发酵。将菌株中国被毛孢的孢子悬液1~50毫升接种于100毫升液体培养基中， 15〜35'C培养3〜14天，获得含有活性物质的菌丝体；所述的液体培养基的组成：发酵粉 1~10% ，水90~99% (重量/体积，克廣升或公斤/升)。2) 用超声波破碎菌丝体，破碎40秒钟，并离心30分钟，10000转/分钟。取上 清液，所得上清液作为高效液相色谱分离样品。3) 使用高效液相色谱仪进行色谱分离，以体积比为30:70的甲醇-水为流动相，流 速为l毫升/分钟，柱温30'C,检测波长为259nm,分别收集各吸收峰下的分离液，记 录各种分离液的保留时间，以旋蒸法浓縮分离液，所得高效液相色谱分离产物即为中国 被毛孢（/fe"fe//a w'"e":^ Liu, Guo, Yu & Zeng) (CCTCC， No. M87101 )的菌丝体中的 提取物，于-20'C下保存备用。4) 取各保留时间的提取物，分别进行体外杀精子试验。本发明从中国被毛孢（H/jr//e//a j/"e"^s Liu, Guo, Yu & Zeng) (CCTCC， No. M87101)的菌丝体中得到的含生物活性物质的提取物可以直接应用于杀精子的药物。 本发明的提取物配以医疗上可以接受的载体组成医药组合物，用于杀精子的药物。 本发明是由中国被毛孢（///•yWeZ/a s/"e/w/5 Liu， Guo， Yu & Zeng) (CCTCC, No, M87101)菌株迸行发酵，获得含有生物活性物质的菌丝体提取物，以高效液相分离的 方法获得的含生物活性物质的提取物在体外可杀死所取样品中的全部精子。本发明所用 发酵原料成本低廉，具有工业投产的潜力，可用发酵工程的生物技术进行工厂化生产， 可以形成生产规模。以此生物活性物质的提取物制备无毒副作用的"生物避孕药物"可 以防止直接接受不良物质引起的污染综合症。给药业产业带来发展，应用前景也非常广 阔。若工厂具有发酵生产的工艺设备，只要提供菌种和成熟的发酵工艺即可投产，并且 生产规模可以无限扩大。附图说明图1:中国被毛孢（/fewre//。 w'"e/w/s Liu， Guo， Yu & Zeng) (CCTCC, No. M87101) 的菌丝体的提取物的高效液相色谱分析图。具体实施方式实施例1. 试验材料(1) 仪器：Autoscience公司生产的AS 2060 cleaner型超声仪；德国SG公司 生产的Ultra Clear超纯水系统；Eppendorf公司生产的Centrifuge 5801R型离心机； 曰本岛津公司生产的SPD-1型高效液相色谱系统（SPD-1紫外检测器，T-414泵，LA-100 柱温箱，C18色谱柱（250毫米X 4.6毫米）。(2) 市售试剂：甲醇为国产高效液相色谱级；NaCL，壬苯醇醚均为国产分析纯； ddH20,自制；0.9%的生理盐水(0.9g NaCL加入100毫升ddH20)。(3) 菌株：中国被毛孢（//!'SMfeWflw'"e肌's Liu，Guo， Yu&Zeng) (CCTCC，No. M87101)(4) 液体培养基的组成：发酵粉H)克，水卯毫升。发酵粉配方是：100克发酵粉中含大米粉49克，玉米粉49克，蔗糖l克，豆油l克。2. 试验方法(1)获得菌丝体的方法，分别是：(1) 将菌株中国被毛孢（ifo"fe//fl w'"e/w/s Liu， Guo， Yu & Zeng) (CCTCC， No. M87101)的孢子悬液1毫升接种于100毫升液体培养基中，15°C，培养14天，获得含 有活性物质的菌丝体；(2) 将菌株中国被毛孢（/f&"〖e//fl w力e"^ Liu, Guo, Yu & Zeng) (CCTCC, No. M87101)的孢子悬液25毫升接种于100毫升液体培养基中，15'C，培养14天，获得 含有活性物质的菌丝体；(3) 将菌株中国被毛孢（/fowre/Za Liu， Guo， Yu & Zeng) (CCTCC, No. M87101)的孢子悬液50毫升接种于100毫升液体培养基中，15°C，培养14天，获得 含有活性物质的菌丝体；(4) 将菌株中国被毛孢（/fowfe//fl w'we/w/s Liu， Guo， Yu & Zeng) (CCTCC, No. M8710〗）的孢子悬液1毫升接种于IOO毫升液体培养基中，35°C，培养14天，获得含 有活性物质的菌丝体；(5) 将菌株中国被毛孢（历化"〃fl j/"e"j/j Lii^ Guo， Yu & Zeng) (CCTCC, No. M87101)的孢子悬液25毫升接种于100毫升液体培养基中，35°C，培养14天，获得 含有活性物质的菌丝体；(6) 将菌株中国被毛孢（/fewe〃a w'"my^ Liu, Guo， Yu & Zeng) (CCTCC， No. M87101)的孢子悬液50毫升接种于100毫升液体培养基中，35'C,培养14天，获得 含有活性物质的菌丝体；(7) 将菌株中国被毛孢（///w/e//fl Liu, Guo, Yu & Zeng) (CCTCC, No. M87101)的孢子悬液1毫升接种于100毫升液体培养基中，35'C，培养3天，获得含 有活性物质的菌丝体；(8) 将菌株中国被毛孢（扭swe〃a Liu， Guo, Yu & Zeng) (CCTCC， No. M87101)的孢子悬液25毫升接种于100毫升液体培养基中，35'C,培养3天'获得含有活性物质的菌丝体：(9) 将菌株中国被毛孢（//&M"//a "'"ewi5 L红Guo, Yu & Zeng) (CCTCC, No.M87101)的孢子悬液50毫升接种于100毫升液体培养基中，35'C，培养3天，获得含有活性物质的菌丝体；柳将菌株中国被毛孢（历j"fe/Za j/"e"他Liu， Guo, Yu & Zeng) (CCTCC, No. M8710i)的孢子悬液1毫升接种于100毫升液体培养基中，15'C，培养3天，获得含有活性物质的菌丝体；(U)将菌株中国被毛孢（MyWe/to Liu, Guo， Yu & Zeng) (CCTCC, No.M87101)的孢子悬液25毫升接种于100毫升液体培养基中，15'C,培养3天，获得含 有活性物质的菌丝体；(1》将菌株中国被毛孢（/fe"te//a "'Merm's Liu, Guo， Yu & Zeng) (CCTCC, No. M87101)的孢子悬液50毫升接种于100毫升液体培养基中，15'C，培养3天，获得含有活性物质的菌丝体。(2)色谱样品的制备方法 取上述（1)(或(2)-肪之中任意方法）得到的含有活性物质的菌丝体进行下述色 谱样品的制备。将上述得到的含有活性物质的菌丝体置于500毫升的烧杯中，超声破碎（IO秒X 4)，离心30分钟，10000转/分钟。取上清液，所得上清液为高效液相色谱分离用样叩o(3)高效液相色谱分离 色谱条件为：流动相为甲醇-水(30:70)，流速为1毫升/分钟，柱温为30'C，检 测波长为259nm。经高效液相色谱分离后，分别收集各吸收峰下的分离液，记录各种 分离液的保留时间，以旋蒸法浓縮分离液，所得高效液相色谱分离产物于-2(TC保存备 用。(4)体外杀精子实验方法 取各保留时间的提取物5mg、精液lOmL，分别进行体外杀精子试验。（精子样品由身 体健康的志愿者提供）。对照组样品分别为甲醇-水（30:70), 0.9 %的无菌生理盐水， 壬苯醇醚。其中甲醇-水（30:70〉为流动相对照，0.9 %的生理盐水为阴性对照，壬苯 醇醚为杀精子阳性对照物，系壬苯醇醚药膜[药号为（88)卫药准字X-20)]的杀精子 成分。按照国际计划生育基金会(IPPF)认可的杀精子实验方法（Jackso M, Berger G S， Keith L G Vaginal contraception. Boston, Massachusetts: GK Hall Medical Publishers, 1981:249)进行体外杀精子试验。此实验每份样品重复三次。 3.上述的实验结果(1 )中国被毛孢（w"e"w》 Liu, Guo， Yu & Zeng) ( CCTCC, No. M87101 ) 菌丝体的提取物的高效液相色谱分离结果。上述样品的高效液相色谱分离出现12个峰和3个谷，回收各吸收峰下的分离物 质，得到12种分离产物。保留时间分别为2. 667， 3. 200, 3. 553， 3. 840， 4. 487， 5. 307，6.390， 6.880, 8.097, 10.130， 10.683和14.933分钟。样品的高效液相色谱分析结 果如图所示。见图1,中国被毛孢（/fowfe〃fl"'"e肌's Liu，Guo，Yu&Zeng) (CCTCC， No.M87101)菌丝体的提取物的高效液相色谱分析图。中国被毛孢（/fow〖e〃a Liu, Guo， Yu & Zeng) (CCTCC，No. M87101)菌丝体的提取物经高效液相色谱分析，在259 nm有吸收峰，各分离物质的保留时间分别 是2.667， 3.200， 3.553， 3.840， 4.487， 5.307， 6.390， 6.880， 8.097， 10.130， 10.683和14.933分钟。(2)体外杀精子实验结果以体外杀精子实验的方法来研究高效液相色谱分离产物的生物活性。对样品进行 杀精子活性的测定结果如下。存 7 2 3 4 5 <5 7 8 C柳 "i"柳 "鄉 p.柳； W.柳 伍柳 P. J鄉 (6.880)实 100%杀死 50%死，其 运动正 5-10% 20%死， 40%死， 运动正 腦死，验 余运动迟 常 死，其 其余运 其余运 常 其余运结 缓 余运动 动迟缓 动正常 动稍加果 正常 剧#9 70 " 0.9%主伊攀水 壬苯糜發保柳 （7。.卿加鄉 （74鄉激水 （30, 70_实运动加运动加剧5%死，其运动加剧~运动正80-90%死，~~100%杀死验居U 余运动加 常 10%颤动，极结 剧 个别在游动 果体外杀精子实验结果表明保留时间为2.667分钟的色谱分离产物可迅速杀伤精子， 其杀精子的作用与杀精子阳性对照物壬苯醇醚相同，壬苯醇醚系壬苯醇醚药膜的杀精子 成分，壬苯醇醚药膜的药号为：（88)卫药准字X-20。同时，甲醇-水（30: 70)可以使 80-90%的精子死亡，试验证明高效液相色谱分离方法所使用的流动相经过旋蒸法浓縮 分离液以后，已经被除去。因此，以高效液相色谱方法分离到的保留时间为2.667分钟 的色谱分离产物为真菌来源的杀精子生物活性物质。