利用泡囊假单胞菌促进植物修复土壤镍污染的方法
专利汇可以提供利用泡囊假单胞菌促进植物修复土壤镍污染的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种利用泡囊假单胞菌(Pseudomonas vesicularis)促进 植物 修复 土壤 镍污染的方法。本方法通过将泡囊假单胞菌接种到修复土壤的植物的根部，建立 根际 细菌与植物的共生关系，利用泡囊假单胞菌具有分泌 铁 载体和降低植物体内乙烯 水 平以及能利用1- 氨 基环丙烷-1- 羧酸 作为唯一氮源的特点，在不影响植物地上部分的重金属镍含量前提下，提高植物生长速度和增大植物 生物 量，进而提高了植物对重金属镍的富集效果。土壤经过这一菌株处理后，该细菌可以在镍污染土壤中定殖，可持续促进植物对重金属镍的富集，直到土壤中的镍含量达环境安全标准。，下面是利用泡囊假单胞菌促进植物修复土壤镍污染的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用泡囊假单胞菌(Pseudomonas vesicularis)促进植物修复土壤镍污染的方法，具体步 骤包括：
(1)将泡囊假单胞菌菌种进行扩种培养，制成菌液，菌液浓度为OD600≥0.8；
(2)控制土壤pH值于5.5～7之间；
(3)以镍超积累植物作为土壤修复植物；按以下方法之一用菌液处理：(a).采用种子直接播种 时，种子表面经70％乙醇消毒1～3min，1％次氯酸钠浸泡10～15min，用无菌水将种子冲洗干净，再经菌 液浸泡1～1.5h，然后播种；(b).采用幼苗移栽种植时，先将菌液直接施用到土壤穴中，用菌液量为 10mL～20mL/穴，再将幼苗根部蘸上菌液后植入施用过菌液的土壤穴中；(c).按(a)方法处理种子并播 种，长至幼苗时按(b)方法处理并移栽幼苗；
(4)按常规管理，定期收割植物地上部，一年两次，直到土壤镍达到安全标准。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)所用的泡囊假单胞菌为泡囊假单胞菌GIM 1.0006 菌株。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)所用的镍超积累植物为庭荠属Alyssum corsicum 或庭荠属Alyssum murale。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征是步骤(3)方法(a)中用菌液浸泡种子时，种子∶菌液 ＝1∶(2～3)体积比。
5.按照权利要求1，2或3所述的方法，其特征是步骤(1)中的菌液浓度为OD600＝0.8～1.5。
技术领域
本发明涉及一种利用泡囊假单胞菌(Pseudomonas vesicularis)促进植物修复土壤镍污染的方法。
背景技术
当前，可供治理土壤重金属污染的方法主要有理化修复法和生物修复法。
理化修复法有客土(换土)法、沉淀法、淋洗法、电化法、磁化法。这些物理或化学方法各有其优 点，但一般都存在花费高、工程量较大、易造成二次污染等问题。
以植物修复技术为核心的生态恢复技术是以植物耐受和富集某种或某些有机或无机污染物为基础， 利用植物与微生物的共生体系，清除环境中污染物的一种环境污染治理技术。植物修复技术是通过植物 的吸收、挥发、根滤、稳定等作用，净化和固定环境中的污染物，达到净化环境的目的。植物修复是一 种新兴的重金属污染原位绿色修复技术，作为其核心技术之一的植物提取技术，已发展成为环境科学领 域的研究与应用热点，并引起政府、学术界和企业界的高度重视。
利用超积累植物进行重金属污染土壤的治理工作虽然取得了一些成功的案例，但由于这种植物是在 长期受重金属胁迫的土壤条件、气候条件下产生的突变体，绝大多数生长慢、生物量小，这在一定程度 上限制了土壤净化的效率。这些因素使得超积累植物要大规模商业化利用还有一定的差距。由于国内对 这一技术的研究起步较晚，在种质资源、修复技术的研究、开发和应用等方面，都亟需提高。
已知的镍超积累植物有300多种，主要集中在北美洲、大洋洲和欧洲等国家。庭荠属的Alyssum corsicum和Alyssum murale已在土壤商业修复中使用[Li YM，et al.PLANT AND SOIL.2003，249(1) 107-115]。
发明内容
本发明通过将泡囊假单胞菌接种到修复土壤的植物的根部，建立根际细菌与植物的共生关系，利 用泡囊假单胞菌具有分泌铁载体和降低植物体内乙烯水平以及能利用1-氨基环丙烷-1-羧酸作为唯一 氮源的特点，在不影响植物地上部分的重金属镍含量前提下，提高植物生长速度和增大植物生物量， 进而提高了植物对重金属镍的富集效果。土壤经过这一菌株处理后，该细菌可以在镍污染土壤中定殖， 可持续促进植物对重金属镍的富集，直到土壤中的镍含量达环境安全标准。
本发明方法的具体步骤包括：
(1)将泡囊假单胞菌菌种进行扩种培养，制成菌液，菌液浓度为OD600≥0.8(通常为OD600＝0.8～ 1.5)；
(2)控制土壤pH值于5.5～7之间；
(3)以镍超积累植物作为土壤修复植物；按以下方法之一用菌液处理：(a).采用种子直接播种 时，种子表面经70％乙醇消毒1～3min，1％次氯酸钠浸泡10～15min，用无菌水将种子冲洗干净，再经菌 液浸泡1～1.5h，然后播种(最好采用穴播，覆盖一薄层土)；(b).采用幼苗移栽种植时，先将菌液直 接施用到土壤穴中，用菌液量为10mL～20mL/穴，再将幼苗根部蘸上菌液后植入施用过菌液的土壤穴中； (c).按(a)方法处理种子并播种，长至幼苗时按(b)方法处理并移栽幼苗；
(4)按常规管理，定期收割植物地上部，一年两次，直到土壤镍达到安全标准。
收割的植物地上部分可进行统一处理，如在垃圾填埋区安全填埋或焚烧。
本发明方法所用的泡囊假单胞菌优选为泡囊假单胞菌GIM 1.0006(购自广东省菌种保藏选育实验 室)，该菌种由广东省菌种保藏选育实验室保藏并对公众公开发放，保藏编号为GIM 1.0006。
上述本发明的方法所用的镍超积累植物优选为庭荠属Alysum corsicum或庭荠属Alyssum murale。
按照上述本发明的方法，其中用菌液浸泡种子时，种子与菌液的用量比例通常为种子∶菌液＝1∶(2～ 3)体积比。
本发明的方法所用的泡囊假单胞菌还可以通过如下方法得到：
采用植物根际土壤制备土壤悬液，土壤悬液接种到PAF培养基(蛋白胨10g、酪氨酸10g、MgSO4 1.5g、 H2PO4 1.5g、甘油10mL，H2O 1000mL，pH 7.0)后，在100r/min 25℃培养5d后，将0.5mL菌液涂布于固 体平面培养基上，置培养箱内37℃培养，待平面培养基上长出菌落后，将菌落分别接种到新的FAF固体 培养基上培养，经过2～3次的分离后，得到纯化的泡囊假单胞菌(Pseudomonas vesicularis))菌株，再 转移到PAF固体斜面培养基上保存。
本发明所用的泡囊假单胞菌(Pseudomonas vesicularis)菌株的分类学特征如下：
(1)为革兰氏阴性好氧杆菌，分类上属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas) 泡囊假单胞菌。
(2)杆菌，0.5×1.0～4.0微米，鞭毛单极生，菌落的色素为黄色，氧化酶反应为弱阳性。
(3)能分泌铁载体，铵盐能作为主要氮源，而硝酸盐不能成为主要氮源。
(4)专性好氧，最适生长温度为30℃，能在37℃生长，41℃不生长，4℃也不能生长。
本发明方法具有以下突出效果：
1.本发明所选用的泡囊假单胞菌，通过根际细菌与植物的共生关系，可促进植物生长，提高植物生 物量，从而提高植物对重金属污染土壤的修复效果，潜在经济效益可观。
2.本发明所选用的泡囊假单胞菌，为本土的微生物菌种资源，容易在土壤中繁殖和定居，对植物修 复有持续的促进作用，也可提高植物抗病虫害的能力。
3.本发明所用菌种提高了目前绿色原位修复效果，所收获的植物地上部分进行集中安全填埋或焚烧， 不会造成二次污染，同时修复进程不会破坏土壤结构，并对土壤因重金属污染而引起的土壤退化和生产 力下降有改善作用。
具体实施方式
实施例：土壤修复
(1)种苗准备：供试植物为镍超积累植物——庭荠属Alyssum corsicum，分菌液处理和对照2组。种 子用70％乙醇消毒1min，1％次氯酸钠浸泡10min，后用无菌水冲洗干净(一般冲洗3次)；再用5mL菌 液(OD6000.8～1.5)浸泡1h。对照用种子直接用去离子水浸泡。随后转入营养土中发芽和育苗，等幼苗长 到4-5片叶后移栽。
(2)试验土壤：潴育型水稻土、云南元江土和云南墨江土；土壤重金属镍含量；水稻土＞400mg/kg， 云南元江土＞3500mg/kg，云南墨江土＞5400mg/kg。
(3)移栽和管理：植物移栽前，每穴施菌液(OD6000.8～1.5)20mL；移苗时，将植株根系蘸上菌液后 才植入施用过菌液的土壤穴中。对照土壤中不施菌液，植株直接移植到土壤中。植株移栽后的生长期为 70d，按常规管理。
(4)收获后测定，水稻土中加菌处理后植株地上部分生物量为558mg·株-1，较对照高29％；云南元江 土中，地上部分的生物量较对照高309％；云南墨江土中，地上部分的生物量较对照高43％。
(5)收获后测定，加菌液处理后，地上部分镍含量分别为：水稻土＞14000mg/kg，云南元江土＞ 1400mg/kg，云南墨江土＞1800mg/kg。
(6)修复效果比较：水稻土加菌处理后地上部富集镍为7.831mg株-1，较对照5.092mg株-1增加了54％； 元江土加菌处理后为0.065mg株-1，较对照0.016mg株-1增加了306％，墨江土加菌处理后为0.037mg株-1， 较对照0.028mg株-1增加了32％。
持续收割植物地上部，土壤中的镍含量不断减少，直到污染土壤镍含量减少到正常土壤水平，土壤 镍污染消除。
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