【発明の詳細な説明】 (イ)産業上の利用分野 本発明は、種々の原因によって起こる造血障害に伴う血小板減少症の治療剤に関し、更に詳しくは、ヒト造血因子の一種であるヒト単球−マクロフアージコロニー刺激因子を有効成分とする血小板減少症治療剤に関するものである。

(ロ)従来技術 種々の造血障害によって、顕著な血小板の減少または機能低下に基づき、現に重篤な出血を見ているか、またはその恐れの強い病態に対して、血小板輸血が有力な手段となっている。 しかし、各医療の現場について見ると、
十分量の血小板製剤が迅速に供給されている状況ではなく、かつ、血小板輸血に伴いＡＴＬ（adult T cell leu
kemia，成人Ｔ細胞白血病）やＡＩＤＳ（acquired immu
ne deficiency syndrome，後天性免疫不全症候群）等の病原体であるウイルスに感染する危険性が著しく増大している。

(ハ)本発明が解決しようとする問題点 白血病や悪性腫瘍の薬剤ないし放射線による治療中や、
再生不良性貧血の経過中において、重篤な出血を現に見ているか、またはその恐れの強い病態に対して、血小板の産生を促進することを目的として検討を行った結果、
本発明に係るヒト単球−マクロフアージコロニー刺激因子を有効成分としてなる製剤を悪性腫瘍の化学療法において投与することによって血中の血小板レベルの正常値への復帰が早急におこることを見いだして本発明を完成した。

(ニ)問題点を解決するための手段 本発明の治療剤の有効成分であるコロニー刺激糖蛋白質（以下、ＣＳＦという）は、本出願人の１人が出願した特願昭６２−１７８６９７号に記載されており、哺乳動物の単球−マクロフアージ系細胞のコロニー形成刺激作用を有し、次の方法によって製造される。

健康人の尿をpH８．０〜９．０に調整し、尿中の粘性物質を沈澱・除去し、その上澄を分子量１０，０００〜５
０，０００ダルトンを通過させる限外濾過膜を用いて濃縮と脱塩を行う。

少なくとも２００倍以上に濃縮（蛋白質濃度として１％
（ｗ／ｖ）以上）した後pHを６．５〜７．５に調整し、
６０℃で１０時間加熱処理（ウイルス等の不活化）する。 形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオン交換体、
例えばＤＥＡＥ−セルロース等、に有効成分を吸着させる。

次に０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（pH６．５〜７．５）
で該イオン交換体を洗浄した後０．２〜０．４Ｍの緩衝液（pH６．５〜７．５）で有効成分を溶出する。 該溶出液を必要ならば限外濾過膜で濃縮し、１Ｍ〜４Ｍの塩類、例えば硫安、食塩等を含有する緩衝液（pH６．５〜
７．５）で平衡化させたゲル濾過剤、例えばSephacryl
Ｓ−３００（Pharmacia社製）でゲル濾過し、分子量範囲が７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を回収する。 次に該画分を上記１Ｍ〜４Ｍ塩含有緩衝液で平衡化させた疎水性親和体、例えばPhenyl-Sepharose
（Pharmacia社製）に吸着させ、０．５〜１．０Ｍの塩含有緩衝液（pH６．５〜７．５）で溶出する。 該溶出液を限外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル濾過カラム、例えばＴＳＫＧ−３０００ＳＷ（東洋曹達製）でゲル濾過し、分子量範囲が７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を回収する。 該画分を再度、濃縮し、０．１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液（pH１〜２）で平衡化した高速液体逆相カラム、例えば、Hi−Pore ＲＰ−３
０４（バイオラド社製）に吸着させ、０．１％ＴＦＡを含む溶剤、例えばアセトニトリル又はイソプロパノールの直線濃度勾配溶出法により溶出する。 このようにして得られたＣＳＦは、比活性１×１０ _８単位／mg・蛋白質以上を有する純粋な物質である。

本発明のＣＳＦは更に本ＣＳＦに対する特異抗体との反応を利用して製造することができる。

この製造法は、次の３つの工程からなる。 以下順次説明する。

コロニー刺激糖蛋白質に対する特異抗体（以下、抗Ｃ
ＳＦ抗体という）の調製 前記第１の製造法又は、別個に行なったこの製造法によって得られた本発明のＣＳＦを用いて、哺乳動物例えばウサギ、ヤギ、ヒツジ及びウマ等を免疫する。 即ち、本発明のＣＳＦを０．１〜１．０mg／ｍの濃度になるように生理食塩液に溶解して、フロントの完全アジュバントと等量混合し、哺乳動物の皮下へ、週１〜２回、４〜
８週間投与して免疫する。 免疫動物の血中抗体価が上昇したら、静注又は皮下注による追加免疫を行い、追加免疫後３〜７日目に採血を行い、ＣＳＦ抗血清を採取する。 採取した抗血清のＣＳＦに対する抗体価は、後述するＣＳＦ生物力価中和試験によって測定されるが、抗血清中のＣＳＦ抗体価は、１ｍ当り５×１０ ^６単位以上のＣＳＦ生物力価を中和する抗血清を選択することが望ましい。 採取した抗血清は、２回の硫安塩析及びＤＥＡ
Ｅ−セルローズクロマトグラフィー等によって、免疫グロブリンＧ又はＭ画分の抗ＣＳＦ抗体として精製する。
また必要であれば、ＣＳＦ又は抗ＣＳＦ抗体と交錯反応を示す夾雑タンパク質をリガンドとする抗原カラムへ抗ＣＳＦ抗体を通液し、抗ＣＳＦ抗体のみを吸着するか又は夾雑タンパク質を吸着させて、更に抗ＣＳＦ抗体を精製する。

抗体結合支持体の調製工程 ＣＳＦ抗体を結合し得る不溶性支持体は、抗体蛋白質のＮＨ _２ −基又はＣＯＯＨ−基と化学結合できる不溶性支持体であれば、公知のいずれのものでも使用できる。 例えば、臭化シアン活性化又はエポキシ化多糖体ゲル、フオルミル化多糖体ゲル、アミノエチル化又はヒドラジド化ポリマー等である。 不溶性支持体と抗ＣＳＦ抗体との結合反応は、選択される不溶性支持体の結合基によって条件が異なるので、結合反応の至適条件となるよう抗体を調整する。 例えば、臭化シアン活性化支持体の場合は、pH８〜１０の炭酸緩衝液へ、エポキシ化支持体の場合は、pH１０以上の溶液へ、またフオルミル化支持体の場合は、中性の溶液へ、それぞれ抗体を溶解し、調整する。 またその結合反応の温度条件も不溶性支持体によって異なるが、本発明の結合反応の場合は、２５℃以下の低温で行なうのが望ましい。 特に臭化シアン活性化支持体の場合は、４℃以下で行う。 結合させる抗体量は、不溶性支持体１ｇ（湿重量）当り、１０〜５０mg、好ましくは２０〜３０mgであり、結合反応時の抗体濃度を１〜
４％（ｗ／ｖ）に調整する。 結合反応終了後、支持体に残った抗体非結合反応基を適当な処理法で不活性化し、
抗体結合支持体を得る。

抗体結合支持体によるＣＳＦの精製工程 抗体結合支持体を０．５〜１．０Ｍの塩、例えば塩化ナトリウムを含むpH６〜８の緩衝液で洗浄する。 洗浄した抗体結合支持体は、カラムへ充填するか又は緩衝液に懸濁させる。 前者はカラム式、クロマトグラフィー、後者は、バッチ式クロマトグラフィーとして使用する。 本発明のＣＳＦを含有する溶液は、例えば人尿濃縮液、ＣＳ
Ｆ産生細胞培養上澄液或いはＣＳＦ遺伝子組換え細胞培養上澄液などが用いられ、これをpH６〜８に調整し、次いで抗体結合支持体の洗浄に使用した前記緩衝液と同一の緩衝液と平衡化させるか又は０．５〜１．０Ｍ濃度になるように塩化ナトリウムを加え、この処理液と抗体結合支持体とを接触させる。 接触はカラム式又はバッチ式のクロマトグラフィーで行なわれ、カラム式クロマトグラフィーの場合は、室温以下、好ましくは１０℃以下で、流速５〜２０ml／cm ²・時間で通液させ、ＣＳＦを抗体結合支持体のカラムへ吸着させる。 吸着ＣＳＦ量は、抗体結合支持体１ｇ（湿重量）当り、５００〜２，
０００万単位が望ましい。 吸着させた後、上記緩衝液を通液として夾雑物質を洗浄・除去する。 バッチ式クロマトグラフィーの場合は室温又は１０℃以下で上記処理液と抗体結合支持体を混合し、１〜１０時間攪拌する。 攪拌後、ガラス濾紙等で濾過し、抗体結合支持体を回収する。 該抗体結合支持体を上記の緩衝液で洗浄して、夾雑物質を完全に除去する。 抗体結合支持体と特異的に吸着したＣＳＦは、抗源抗体複合体の解離液、例えばpH２〜
３の酢酸緩衝液、３〜４Ｍのチオシアン酸塩又は０．１
〜０．２Ｍの２，４−ジニトロフエノール等の溶液で抗体結合支持体から溶出させる。 カラム式クロマトグラフィーの場合は、溶離液をカラムへ通液することによって、またバッチ式クロマトグラフィーの場合は抗体結合支持体を溶離液へ懸濁し、攪拌することによって、ＣＳ
Ｆを溶出させる。 ここに得られるＣＳＦは不純物が除去された純粋なＣＳＦである。

以上のようにして製造された本発明のＣＳＦは次のような理化学的性状を有している。 尚、この理化学的性状の試験には、参考例１の方法により純化したＣＳＦを用いた。

a)分子量 還元剤の非存在下に、Laemmli（Nature，２２７巻、６
８０−６８５頁，１９７０年）の方法によるドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量を測定すると、７０，０００〜９０，０００ダルトンであった。

次に、０．２Ｍメルカプトエタノールで還元し、同様の方法で測定すると、分子量３５，０００〜４５，０００
ダルトンのサブユニットに解離した（第１図）。

第１図は、本発明のＣＳＦのドデシル硫酸ナトリウム・
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の泳動図であり、Ａ〜
Ｅは非還元（２量体）、Ｆ，Ｇは分子量マーカー蛋白質、Ｈ〜Ｌは還元（サブユニット）を示し、縦軸の数字は分子量（×１０ _３ダルトン）を示す。

b)サブユニット蛋白質のアミノ酸配列 ＮＨ _２ −末端アミノ酸配列は、純化ＣＳＦを気相アミノ酸シーケンサーで常法により分析した。 次に純化ＣＳＦ
を６Ｍグアニジンで変性させ、モノヨード酢酸でアルキル化した後、脱塩し、トリプシン消化及び臭化シアン分解を行った。 トリプシン消化及び臭化シアン分解ペプチドをVydacＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィーで分画し、分解されたペプチド画分を得、各画分をそれぞれ気相アミノ酸シーケンサーで分析し、ペプチド断片のアミノ酸配列を分析した。 トリプシン消化及び臭化シアン分解ペプチド断片のアミノ酸配列と本発明者らがクローニングしたｍＲＮＡの塩基配列から、サブユニット蛋白質のアミノ酸一次構造を決定した。 その結果は第１表に示すとおりである。

ＮＨ _２ −末端のアミノ酸であるグルタミン酸から１４９
番目のグルタミンまでは、公知のＣＳＦ−１と同一であるが、１５０番目から２１４番目までの６５個のアミノ酸は、公知のそれと全く異なっていた。

また、ＣＯＯ−末端のアミノ酸としては、サブユニット蛋白質の分子量に応じ２１４番目にプロリンが検出された。 １２２番目と１４０番目のアスパラギンは、Ａｓｎ
−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの典型的なＮ−グリコシド結合部位を有し、この部位で糖鎖を結合しているものと推定された。 ここでＸは任意のアミノ酸を示す。

d)糖鎖の構成単糖 ポリペプチドと結合している糖鎖の構成単糖は、加水分解して遊離させた後、高速液体クロマトグラフィーで分析した。 アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラム、
ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウ酸緩衝液濃度勾配溶出法で分画し、シアノアセタミド又はアルギニンによるポストカラム標識した後、ケイ光法により同定した。 本ＣＳＦ分子に含有される糖鎖は不均一であり、定量することは困難であったが、構成単糖としてマンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグリコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸が同定された。

e)円二色性スペクトル 円二色性分散計（ＪＡＳＣＯ社製Ｊ−６００）で遠紫外部に於けるＣＤスペクトルを測定した（第２図）。

第２図は本発明のＣＳＦのＣＤスペクトルを示し、横軸は波長（nm）、縦軸は楕円率（mdeg）を示す。 波長２０
８nm及び２２２nmにおいて極小ピークがみとめられ、本ＣＳＦの二次構造にα−ヘリックス構造が含まれているものと推定された。

f)熱安定性 本ＣＳＦを１μｇ／ｍの濃度で、希釈緩衝液（pH７．
０）に溶解し、６０±０．５℃で６０分間加熱し、そのコロニー刺激活性（後述）を測定したが、活性の低下はほとんど認められなかった。

g)赤外線吸収スペクトル 本ＣＳＦの凍結乾燥粉末について透過測定法（ＫＢｒ
窓）によりフーリエ変換赤外分光装置（Nicolet社製５
ＤＸＣ）を用いて測定した赤外線吸収スペクトルは第３
図に示すとおりであった。 第３図の横軸は波数（cm ^-1 ）
を縦軸は透過率を示す。

本ＣＳＦは１６５０cm ^-1 、１２０１cm ^-1及び１１３３cm
^-1に強い吸収、１５３７cm ^-1 、１４３２cm ^-1及び１０６
８cm ^-1に中程度の吸収を示した。

上記の理化学的性質を有し、且つ哺乳動物の単球−マクロフアージ系細胞のコロニー形成刺激作用を有する糖蛋白質は、前記の製造法により人尿から製造され、バイアル瓶中で無菌的に凍結乾燥され、粉末状で密封される。
凍結乾燥に先だちＣＳＦの安定剤としての人血清アルブミン及び溶解補助剤としてのアミノ酸又は糖類を含有する水溶液を加え、無菌濾過し、のち無菌的に凍結乾燥してもよい。

なお、本発明のＣＳＦのコロニー刺激活性は、マウス骨髄細胞による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で測定した。 ＣＳＦ試料を０．３％寒天、２０％牛胎児血清（ＦＣＳ）及びマウス骨髄細胞１×１０ ^５個を含むMc
Coy′ｓ５Ａ倍地１ｍと混合し、７．５％ＣＯ _２通気下、３７℃で７日間培養した。 培養後、５０個以上の細胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数を計測した。 コロニー刺激活性は単位で表現し、１単位は１
コロニーを形成させるに必要なＣＳＦ量と規定した。 また非活性は、ＣＳＦ蛋白質１mg当り形成されるコロニー数（単位）で表した。 その結果、本発明のＣＳＦは、
１．４×１０ ^８単位／mg・蛋白質の比活性を有していた。 また形成されたコロニーをヘマトキシリン−エオジン染色して形態学的に分類したところ、９５％以上のコロニーが単球−マクロフアージから形成されていた。

本発明の製剤は、例えば注射用生理食塩水、注射用蒸留水等に１０〜１００mg／ｍに溶解して、点滴、直接静注、筋肉内、又は皮下に投与される。

投与量は、１回１，０００単位／kg体重〜１５万単位／
kg体重を使用するが症状によっては適宜増・減量可能である。

投与時期は、化学療法及び放射線療法後、造血障害が始まったと思われる時点がよい。 投与は、血小板レベルが一定状態になるまでその変動に応じて数回、数日間（２
〜１４日間）行ってもよい。

投与対象は、造血障害によって誘起せしめられる血小板減少症の患者であれば特に限定されない。

(ホ)発明の効果 前記対象患者に、実施例に示すように、本発明の製剤を投与したところ、血中内血小板レベルは、著明な改善が認められた。 またその投与結果として有害な副作用は観察されなかった。 かくして本発明の製剤は血小板減少症治療剤として有用であることが示唆される。

(ヘ)実施例・参考例 以下に本発明の製剤の薬理効果についての実験例、毒性についての実験例、臨床実施例、参考例を示すが、本発明はなんらこれらの例に限定されるものではない。

実験例１（毒性） 参考例１により調製された糖蛋白質を用いて急性毒性をリチャードらの方法（ジャーナル・オブ・フアルマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラビユテイクス、９０巻、９９頁、１９４９年）によりＣ _５７ ＢＬ系雄性マウスで試験した。

その結果を第２表に示す。

Ｆを有効成分としてなる糖蛋白質８００万単位を連続７

日巻点滴静注した（製剤投与相）。 経時的に血中の顆粒球、血小板数を計測し、その変動を第３表に示す。 また、コントロール相と製剤投与相の血小板数の最低値および血小板レベルが１０万／mm

³以上に回復するのに要する日数を比較し第４表に示す。

−ＣＳＦを有効成分としてなる糖蛋白質８００万単位を連続７日間点滴静注した（製剤投与相）。 経済的に血中の血小板数を計測し、コントロール相と製剤投与相の血小板数の最低値および血小板レベルが１０万／mm

³以上に回復するのに要する日数を比較し第５表に示す。

次に、濃縮液をpH７．０に調整し、密封容器内で６０

℃、１０時間加熱殺菌した。 殺菌後、遠心分離（５，０

００×ｇ３０分間）して沈澱物を除去した後、０．０２

Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースと混合し、吸着させた。 ＤＥＡＥ−セルロースを０．０２Ｍリン酸緩衝液、０．０５Ｍ食塩添加０．０

２Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）で溶出させた。 溶出液を限外濾過膜（アミコン社Ｈ１Ｐ１０）で濃縮して、Seph

acryl Ｓ−３００（フアルマシア社、φ４×８０cm）

を用い、１Ｍ硫安添加緩衝液（pH７．２）でゲル濾過した。 ゲル濾過での分子量範囲７０，０００〜１５０，０

００ダルトンの画分を上記１Ｍ硫安添加緩衝液で平衡化したPhenyl-Sepharose ４Ｂカラム（フアルマシア社製、φ２×２０cm）に吸着させ、次いで、０．５Ｍ硫安添加緩衝液（pH７．２）で溶出させた。 溶出液を限外濾過膜（旭化成製、ＮＭ−３）で濃縮して、ＴＳＫＧ−

３，０００ＳＷカラム（東洋曹達製、φ４×６００mm×

２）で高速液体クロマトグラフィーにかけ、分子量範囲７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を得た。

この画分を再度濃縮し、Hi-PoreＲＰ−３０４（バイオラド社製、φ４×１５０mm）の逆相カラムで０．１Ｍトリフルオロ酢酸を含む、アセトニトリル０−１００％

（pH２．０）の直線濃度勾配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、ＣＳＦを溶出し、精製された比活性１．４×１０

^８単位／mg・蛋白質のＣＳＦを得た。 上記製造工程の各ステップにおけるＣＳＦの精製度は第６表に示すとおりであった。

得られたＣＳＦは、前記した第１表に示す２１４個のアミノ酸配列を有していた。

中で透析し、２０mg／ｍ濃度に調整した。 該抗体溶液２００ｍを、あらかじめ蒸留水及び０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄した１００ｇのフオルミル−セルロフアインへ加え、室温で２時間攪拌した後、水素化シアノホウ素ナトリウム７００mgを加えて、更に１６時間攪拌し、フオルミル−セルロフアインと抗ＣＳＦ抗体を結合させ抗体結合支持体を調製した。 結合後、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液で洗浄し、更に水素化シアノホウ素ナトリウム５００mgを含むトリス緩衝液２００mlを加え、室温で４

時間攪拌して、未反応基を不活化した。 次いで抗体結合支持体を０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液で十分洗浄した。 抗体結合支持体は、支持体１

ｇ当り、２９．５mgの抗ＣＳＦ抗体を結合していた。 次に、健常人尿１，０００を限外濾過濃縮機で濃縮し、

脱塩した後、ＤＥＡＥ−セルローズに吸着させ、非吸着の夾雑物質を除去し、０．３Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出し、該溶出液に０．５Ｍ濃度になるよう塩化ナトリウムを加えてＣＳＦを含有する溶液を調整した。 このＣＳＦ

の比活性は２×１０

^５単位／mgであった。 上記抗体結合支持体１００ｇに対し、このＣＳＦを含有する溶液（全量５００ml）を加え、１０℃以下で一夜攪拌しバッチ式クロマトグラフィー処理を行なった。 攪拌後、ガラスフィルターで濾過して、抗体結合支持体を集め、０．５Ｍ

ＮａＣｌを含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液で該抗体結合支持体を十分に洗浄した。 洗浄後、０．２Ｍ酢酸緩衝液（pH２．５）５００ｍを加え、１０℃、１時間攪拌して、ＣＳＦを溶出した。 溶出液のpHを７．０にした後、限外濾過膜で濃縮・脱塩して、精製ＣＳＦ約１０mg

を得た。 精製ＣＳＦの比活性は５．２×１０

^７単位／m

g、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による純度は９０％以上であった。 得られたＣＳＦは、前記した第１表に示す２１４個のアミノ酸配列を有していた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のＣＳＦのドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の泳動図であり、第２図及び第３図はそれぞれ本発明ＣＳＦの遠紫外部ＣＤスペクトル及び赤外線吸収スペクトルを示す。 第１図において、 Ａ〜Ｅ……非還元物（２量体） Ｆ，Ｇ……分子量マーカ蛋白質 Ｈ〜Ｌ……還元物（サブユニット）