细菌甘露聚糖酶
阅读：197发布：2020-05-13
专利汇可以提供细菌甘露聚糖酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及新的甘露聚糖酶、包含甘露聚糖酶的组合物、制备甘露聚糖酶的方法、以及使用甘露聚糖酶降解或改性含甘露聚糖的材料的方法。，下面是细菌甘露聚糖酶专利的具体信息内容。
1.一种酶组合物，包含至少一种甘露聚糖酶，所述甘露聚糖酶具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:16(Man7)具有至少70％的序列同一性，与SEQ ID NO:12(Man6)具有至少93％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO:20(Man14)具有至少79％的序列同一性。
2.如权利要求1所述的酶组合物，还包含：
a、至少一种防腐剂，选自苯甲酸、苯甲酸钠、羟基苯甲酸酯、柠檬酸、抗坏血酸或其组合；
b、选择性地，至少一种多元醇，选自丙二醇、甘油、糖、糖醇、乳酸、硼酸、硼酸衍生物、芳香硼酸酯、苯基硼酸衍生物、肽或其组合；
c、选择性地，至少一种酶，选自有或没有介质的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶水解酶、果胶裂解酶、糖苷酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶或其组合；以及
d、选择性地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
3.如权利要求1-2所述的酶组合物，其为液体组合物或固体组合物的形式，如溶液、分散剂、糊剂、粉末、细粒、颗粒、包衣颗粒、片剂、糕剂、晶体、晶体浆液、凝胶或丸粒。
4.一种重组宿主细胞，包含允许生成至少一种重组多肽的遗传元件，所述重组多肽具有甘露聚糖酶活性且与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少93％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少79％的序列同一性，
其中所述宿主细胞选自下组：
真菌细胞，
丝状真菌细胞，其选自子囊菌门、盘菌亚门；优选地选自粪壳菌纲、肉座菌亚纲、肉座菌目、小囊菌目的成员、以及曲霉、金孢霉、毁丝霉和腐质霉；
更优选地选自：肉座菌科、丛赤壳科、麦角菌科、小囊菌科、木霉属(肉座菌属的无性型)、镰刀菌属、赤霉属、丛赤壳属、穗霉属、麦角菌属、绿僵菌属、稻曲菌(Villosiclava)属、蛇形虫草属、头孢菌属和丝孢菌属；
更优选地选自：里氏木霉(红褐肉座菌)、桔绿木霉、长枝木霉、绿木霉、哈茨木霉、棘孢木霉、深绿木霉、拟里氏木霉(Trichoderma parareesei)、尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、小麦冠腐病菌、镰孢霉、藤仓赤霉、串珠状赤霉、玉蜀黍赤霉、红球丛赤壳菌(血赤壳菌)、黑葡萄穗霉、穗霉(Stachybotrys chlorohalonata)、紫色麦角菌、蝗绿僵菌、金龟子绿僵菌、稻曲病菌、冬虫夏草菌、顶头孢霉(产黄头孢霉)、尖端赛多孢子菌、黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉、腐质霉和灰腐质霉；
细菌细胞，优选为革兰氏阳性杆菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌比如大肠杆菌，放线菌比如链霉菌；以及酵母，如酿酒酵母、毕赤酵母、解脂耶罗维亚酵母；
最优选为里氏木霉或芽孢杆菌。
5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其中所述重组多肽是融合蛋白，其除了包含具有甘露聚糖酶活性的氨基酸序列外，还包含下列中的至少一种：
提供分泌信号序列的氨基酸序列，如解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶信号肽；
促进纯化的氨基酸序列，如亲和标签、组氨酸标签；
促进制备的氨基酸序列，如作为载体的氨基酸序列，比如CBM；
具有酶活性的氨基酸序列；以及
为具有结合亲和力的融合蛋白提供的氨基酸序列，如碳水化合物结合部分。
6.一种重组多肽，具有甘露聚糖酶活性，且能够通过使用如权利要求4-5所述的宿主细胞获得。
7.一种制备甘露聚糖酶的方法，包括：
a、培养如权利要求4-5所述的重组宿主细胞，其中
i、所述遗传元件包含至少一个控制序列，该控制序列控制在允许生成所述多肽的条件下在所述重组宿主细胞中生成所述重组多肽；
ii、所述遗传元件选择性地包含至少一个对用于将所述多肽转运到所述宿主细胞外的信号序列进行编码的序列；和
iii、在允许生成所述多肽的条件下进行培养；以及
b、回收所述多肽。
8.一种降解或改性含甘露聚糖的材料的方法，包括：用有效量的如权利要求1-3所述的酶组合物或如权利要求6所述的重组多肽处理所述含甘露聚糖的材料。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述含甘露聚糖的材料是植物材料、纺织品、废水、污水、油或其组合。
10.一种动物饲料，包含：
如权利要求1-3所述的酶组合物或能够从如权利要求4-5所述的重组宿主细胞获得的酶；以及
至少一种源于植物的蛋白质源或者含甘露聚糖的制品或副产品；以及
a、选择性地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b、选择性地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
11.一种饲料添加剂，包括：
如权利要求1-3所述的酶组合物或能够从如权利要求4-5所述的宿主细胞得到的酶；以及
a、选择性地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b、选择性地，至少一种填料，选自麦芽糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
12.如权利要求10所述的动物饲料或如权利要求11所述的饲料添加剂在以下应用中的用途：
a、饲喂动物，优选为单胃动物或反刍动物；和/或
b、促进动物增加体重。
13.如权利要求1-3所述的酶组合物或能够从如权利要求4-5的重组宿主细胞获得的酶在洗涤剂中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述洗涤剂是液体洗涤剂或干燥洗涤剂，优选为粉末、条、片剂、小袋、糊剂、凝胶、液体、细粒或颗粒的形式。
15.如权利要求1-3所述的酶组合物或能够从如权利要求4-5所述的重组宿主细胞获得的酶在石油钻探中的用途。
16.如权利要求1-3所述的酶组合物或能够从如权利要求4-5所述的重组宿主细胞获得的酶在咖啡提取物、果汁、菠萝汁或豆奶加工中的用途。
细菌甘露聚糖酶
技术领域
[0001] 本发明涉及细菌甘露聚糖酶。甘露聚糖酶可用于需要降解或改性甘露聚糖的工业应用中，如洗衣和清洁应用、饲料、食品、纸浆和石油工业中。本发明还提供了有用的甘露聚糖酶、编码这些酶的多核苷酸、酶组合物以及它们的制备和使用方法。
背景技术
[0002] 甘露聚糖是在很多植物中都存在的含有甘露糖的多糖。甘露聚糖在水性环境中不易溶解，且其物理化学性质导致粘性耗散。此外，甘露聚糖的水结合能力高。所有这些特性在一些行业(包括酿造、烘焙、动物营养以及洗衣和清洁应用)中引起问题。
[0003] 在植物性饮食中存在不同的β-甘露聚糖，取决于它们的量和性质，它们可以损害营养物消化、微生物定植和生长行为。甘露聚糖的酶促降解使高水溶性的甘露聚糖的消化物粘度降低，并导致甘露寡糖的生成，甘露寡糖可能会形成豆科植物中存在的不溶于水的线性甘露聚糖。甘露聚糖酶可增加所有单胃动物的平均日增重、饲料效率、重量均匀度和存活率。
[0004] 对于动物饲料应用，比如吃谷物日粮的单胃动物的饲料，甘露聚糖是肠内容物粘度的一个贡献因素，因此它对饲料消化率和动物生长速率产生不利影响。对于反刍动物，甘露聚糖代表了纤维摄入的重要组成部分，甘露聚糖的更完全消化会利于饲料转化效率提高。
[0005] 对于洗衣和清洁应用，包含甘露聚糖酶的酶组合物可用于降解甘露聚糖。然而，提供在不同的储存和使用条件下稳定同时仍显示出良好的甘露聚糖降解活性的甘露聚糖酶是有难度的。
[0006] 本发明的目的在于提供在不同工业加工中应用时表现出甘露聚糖酶活性的新酶、以及用于甘露聚糖降解或改性的酶组合物。
发明内容
[0007] 根据本发明的第一方面，提供了一种酶组合物，其包含至少一种甘露聚糖酶，所述甘露聚糖酶具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:16(Man7)具有至少70％的序列同一性，与SEQ ID NO:12(Man6)具有至少93％的序列同一性，和/或与SEQ ID NO:20(Man14)具有至少79％的序列同一性。
[0008] 根据本发明的另一方面，提供了一种酶组合物，其包含至少一种甘露聚糖酶，所述甘露聚糖酶的核心区具有的氨基酸序列与Man7SEQ ID NO:16的氨基酸27-331具有至少79％的序列同一性，与Man6SEQ ID NO:12的氨基酸35-324具有至少95％的序列同一性，和/或与Man14SEQ ID NO:20的氨基酸17-314具有至少85％的序列同一性。
[0009] 在一个实施方式中，所述至少一种甘露聚糖酶具有如上定义的核心区。
[0010] 该酶组合物的优势在于在洗涤剂和制剂中具有良好的稳定性和甘露聚糖酶活性。它也适用于需要甘露聚糖降解或改性的各种工业应用。本发明的酶组合物的甘露聚糖酶适合用于在各种化学环境中降解或改性含甘露聚糖的材料。
[0011] 如实施例所证明的，根据本发明的酶组合物中包含的甘露聚糖酶具有允许在重组宿主细胞中生产的结构和性质，使其在用于工业应用的酶组合物中有用武之地。Man6、Man7和Man14共有的共同结构元件是GH5结构域。另一个共有的结构元件是：Man6和Man7之间有60％的序列同一性，Man6和Man14之间有57％的序列同一性，Man7和Man14之间有69％的序列同一性。另一个共有的结构特征是核心区。这些结构元件是本发明的甘露聚糖酶的特征所在。
[0012] 根据第二方面，提供了一种包含遗传元件的重组宿主细胞，所述遗传元件允许生成至少一种重组多肽，所述重组多肽具有甘露聚糖酶活性且
[0013] 与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，
[0014] 与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少93％的序列同一性，和/或
[0015] 与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少79％的序列同一性，
[0016] 其中所述宿主细胞选自下组：
[0017] 真菌细胞，
[0018] 丝状真菌细胞，其选自子囊菌(Ascomycota)门、盘菌(Pezizomycotina)亚门，优选地选自粪壳菌(Sordariomycetes)纲、肉座菌(Hypocreomycetidae)亚纲、肉座菌(Hypocreales)目、小囊菌(Microascales)目的成员、以及曲霉(Aspergillus)、金孢霉(Chrysosporium)、毁丝霉(Myceliophthora)和腐质霉(Humicola)；
[0019] 更优选地选自：肉座菌(Hypocreacea)科、丛赤壳(Nectriaceae)科、麦角菌(Clavicipitaceae)科、小囊菌(Microascaceae)科、木霉属(Trichoderma，其为肉座菌(Hypocrea)属的无性型)、镰刀菌(Fusarium)属、赤霉(Gibberella)属、丛赤壳(Nectria)属、穗霉(Stachybotrys)属、麦角菌(Claviceps)属、绿僵菌(Metarhizium)属、稻曲菌(Villosiclava)属、蛇形虫草(Ophiocordyceps)属、头孢菌(Cephalosporium)属和丝孢菌(Scedosporium)属；
[0020] 更优选地选自：里氏木霉(Trichoderma reesei，红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、桔绿木霉(Trichoderma citrinoviridae)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、绿木霉(Trichoderma virens)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、深绿木霉(Trichoderma atroviridae)、拟里氏木霉(Trichoderma parareesei)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium gramineanum)、小麦冠腐病菌(Fusarium pseudograminearum)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)、串珠状赤霉(Gibberella
moniliformis)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeaea)、红球丛赤壳菌(Nectria haematococca，血赤壳菌(Haematonectria haematococca))、黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、穗霉(Stachybotrys chlorohalonata)、紫色麦角菌(Claviceps purpurea)、蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、稻曲病菌
(Villosiclava virens)、冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(Acremonium chrysogenum，产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogenum))、尖端赛多孢子菌
(Scedosporium apiospermum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、腐质霉(Humicola nigrescens)和灰腐质霉(Humicola grisea)；
moniliformis)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeaea)、红球丛赤壳菌(Nectria haematococca，血赤壳菌(Haematonectria haematococca))、黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、穗霉(Stachybotrys chlorohalonata)、紫色麦角菌(Claviceps purpurea)、蝗绿僵菌(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、稻曲病菌
(Villosiclava virens)、冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(Acremonium chrysogenum，产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogenum))、尖端赛多孢子菌
(Scedosporium apiospermum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、腐质霉(Humicola nigrescens)和灰腐质霉(Humicola grisea)；
[0021] 细菌细胞，优选为革兰氏阳性杆菌如枯草芽孢杆菌(Bacilli subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilli licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacilli megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacilli amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacilli pumilus)，革兰氏阴性细菌比如大肠杆菌(Escherichia coli)，放线菌比如链霉菌(Streptomyces sp.)；以及
[0023] 最优选为里氏木霉或芽孢杆菌。
[0024] 重组宿主细胞可用于制备甘露聚糖酶并运送编码甘露聚糖酶的多核苷酸。重组宿主细胞也可用于制备具有不同性质的甘露聚糖酶。例如，可以选择这样的宿主细胞，其提供有利于稳定性或活性的翻译后修饰，或其有利于宿主细胞中生成的甘露聚糖酶的后处理和制剂化。
[0025] 根据第三方面，提供了一种重组多肽，其具有甘露聚糖酶活性，且能够通过使用第二方面所述的宿主细胞获得。
[0026] 重组多肽可具有将其与具有相同或相似氨基酸序列的天然多肽区分开的结构或功能特性。例如，可以选择这样的宿主细胞，其为所制备的重组多肽提供翻译后修饰、使其缺少翻译后修饰、或定位以促进重组多肽的制备和/或制剂化。
[0027] 根据第四方面，提供了一种制备甘露聚糖酶的方法，包括：
[0028] a、培养第二方面所述的重组宿主细胞，其中
[0029] i、所述遗传元件包含至少一种控制序列，该控制序列控制在允许生成所述多肽的条件下在所述重组宿主细胞中生成所述重组多肽；
[0031] iii、在允许生成所述多肽的条件下进行培养；以及
[0032] b、回收所述多肽。
[0033] 该方法提供了有效的制备甘露聚糖酶的方法。因为甘露聚糖酶是在重组宿主细胞中生成的，所以提供了可以以所需方式进行优化、定制和控制的甘露聚糖酶制备系统。通过该方法制备的甘露聚糖酶可以在结构层面上不同于天然甘露聚糖酶。通过该方法制备的甘露聚糖酶可以，例如，具有糖基化模式或其它翻译后修饰，当与天然甘露聚糖酶(比如具有相似或相同氨基酸序列的甘露聚糖酶)相比或与具有相同氨基酸序列但在另一个宿主细胞中生成的甘露聚糖酶相比时，其导致结构和/或功能的差异。通过该方法制备的甘露聚糖酶可以原样使用或配制成所选定的制剂。
[0034] 根据另一方面，提供了一种包含重组多肽的酶制剂，该重组多肽具有甘露聚糖酶活性，且能够通过使用第二方面所述的宿主细胞获得。
[0035] 酶制剂或组合物可进一步包含其它酶和合适的添加剂，所述其它酶选自有或没有介质的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，所述合适的添加剂选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、助洗剂、抗再沉积剂、荧光增白剂、染料、颜料、香料、腐蚀剂、研磨剂和防腐剂。
[0036] 根据第五方面，提供了一种降解或改性含甘露聚糖的材料的方法，包括：用有效量的本发明的酶组合物或重组多肽处理所述含甘露聚糖的材料。
[0037] 根据第六方面，提供了一种动物饲料，其包含本发明的酶组合物或重组宿主细胞；至少一种源于植物的蛋白质源或含甘露聚糖的制品或副产品；以及a、选择性地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合；和b、选择性地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
[0038] 根据第七方面，提供了一种饲料添加剂，其包含本发明的酶组合物或能够从宿主细胞获得的酶；以及a、选择性地，至少一种酶，选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合；和b、选择性地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
[0039] 与不含甘露聚糖酶的饲料相比，该饲料和饲料添加剂改善了饲料的营养价值。本发明的酶组合物降解饲料中存在的甘露聚糖，从而使其更容易被动物消化。特别是对于含有豆粕的饲料，由酶消化生成的甘露寡糖对肠道微生物具有有益作用，因此对动物的行为具有有益作用。通过包含木聚糖酶来消化玉米大豆日粮中存在的阿拉伯木聚糖，可以增强甘露聚糖酶的作用。甘露聚糖酶也可用于改变湿饲料的流变性质。
[0040] 在一个实施方式中，饲料可以包含动物蛋白，例如肉粉或骨粉。
[0041] 根据第八方面，提供了第六方面的动物饲料或第七方面的饲料添加剂在以下方面的用途和使用方法：a、饲喂动物，优选为单胃动物或反刍动物；和/或b、促进动物增加体重。
[0042] 根据第九方面，提供了本发明的酶组合物或能够从宿主细胞中获得的酶在洗涤剂中的用途和使用方法。
[0043] 在本发明的一个实施方式中，洗涤剂组合物还包含一种或多种附加酶，附加酶选自：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶水解酶、果胶裂解酶、酯酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、DNA酶和/或过氧化物酶，优选地，选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。
[0044] 在本发明的另一个实施方式中，洗涤剂组合物为以下形式：条(bar)、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或多个隔室的小袋、常规的或致密的粉末、细粒、糊剂、凝胶、或者常规的、致密的或浓缩的液体。在一个实施方式中，洗涤剂组合物可以是衣物洗涤剂组合物，优选为液体的或固体的衣物洗涤剂组合物。
[0045] 本发明还涉及本文公开的酶组合物或洗涤剂组合物用于降解甘露聚糖的用途。
[0046] 在另一个实施方式中，本发明涉及本文公开的酶组合物或洗涤剂组合物在洗衣过程中的用途。
[0048] 本发明还涉及降解甘露聚糖的方法，包括：将本文公开的酶组合物或洗涤剂组合物施加到甘露聚糖，优选地，其中甘露聚糖在纺织品的表面上或至少部分地嵌入纺织品中。
[0049] 根据第十方面，提供了第一方面的本发明的酶组合物或能够从第三方面的宿主细胞中获得的酶在石油钻探中的用途和使用方法。
[0050] 本发明的酶组合物有利于改变石油钻井液的流变性质并改善石油的采收。
[0051] 根据第十一方面，提供了第一方面的本发明酶组合物或能从第三方面的宿主细胞获得的酶在加工咖啡提取物、果汁、菠萝汁或豆浆中的用途和其使用方法。
[0052] 使用本发明的酶组合物或能够从宿主细胞中获得的酶有利于加工咖啡提取物，因为它降低了咖啡提取物的粘度。
[0053] 使用本发明的酶组合物或能够从宿主细胞获得的酶有利于加工和制造果汁，因为它降低了粘度，改善了过滤速率、稳定性，并有助于提取水果组分。
[0055] 在另一方面，本文公开的序列信息涉及编码本发明的甘露聚糖酶的多核苷酸序列，可用作鉴定其它同源甘露聚糖酶的工具。例如，聚合酶链反应(PCR)可用于扩增对来自多种生物来源的其它同源甘露聚糖酶进行编码的序列。此外，基因组挖掘方法可用于鉴定对来自基因组数据库的其它同源甘露聚糖酶进行编码的序列。附图说明
[0056] 图1示出用于在芽孢杆菌中复制的载体pEV1的示意图。
[0057] 图2示意性地示出用于转化里氏木霉原生质体以过量生成重组甘露聚糖酶蛋白(Man6、Man7和Man14)的表达盒。甘露聚糖酶基因受里氏木霉cel7A/cbh1启动子(pcbh1)控制，并且通过使用里氏木霉cel7A/cbh1终止子序列(tcbh1)确保转录的终止。包含amdS基因作为转化标记。
[0058] 图3描述了pH值对40mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(pH4至pH11)中的重组Man6、Man7和Man14(由芽孢杆菌生成的)甘露聚糖酶蛋白活性的影响。反应温度为50℃，反应时间为10分钟。使用天青蛋白交联的角豆半乳甘露聚糖(azurine-crosslinked carob galactomannan)作为底物。所有测量至少重复一次。数据点是各单独测量的平均值。
[0059] 图4示出使用10分钟反应时间在40mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液(pH7)中测定的重组Man6、Man7和Man14(由芽孢杆菌生成的)甘露聚糖酶的温度曲线，使用天青蛋白交联的角豆半乳甘露聚糖作为底物。所有测量至少重复一次。数据点是各单独测量的平均值。
[0060] 图5示出细菌甘露聚糖酶的SDS PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析。
[0061] 图6描述了在存在4.4g/l市售重垢液体洗涤剂A的情况下，在40℃、16°dH、60分钟、pH值约8.3和酶作为活性单位添加时，(在芽孢杆菌和木霉属中生成的)Man6和Man7的去污性能，去污性能即亮度的增加(4种污渍的ΔL*的总和)。市售制剂 4.0L用于对比。
[0062] 图7描述了在存在4.4g/l市售重垢液体洗涤剂A的情况下，在40℃、16°dH、60分钟、pH值约8.3和酶作为活性酶蛋白(AEP)添加时，(在芽孢杆菌中生成的)Man6和Man7的去污性能，去污性能即亮度的增加(4种污渍的ΔL*的总和)。市售制剂 4.0L用于对比。
[0063] 图8描述了在存在3.8g/l市售彩色洗涤剂粉末的情况下，在40℃、16°dH、60分钟、pH值约10和酶作为活性单位添加时，(在芽孢杆菌中生成的)Man6和Man7的去污性能，去污性能即亮度的增加(4种污渍的ΔL*的总和)。市售制剂 4.0L用于比较。
[0064] 图9描述了在存在3.8g/l市售彩色洗涤剂粉末的情况下，在40℃、16°dH、60分钟、pH值约10和酶作为活性酶蛋白添加时，(在芽孢杆菌中生成的)Man6和Man7的去污性能，去污性能即亮度的增加(4种污渍的ΔL*的总和)。市售制剂 4.0L用于比较。
[0065] 图10描述了在存在4.2g/l市售漂白洗涤剂粉末的情况下，在40℃、16°dH、60分钟、pH值约9.5和酶作为活性酶蛋白添加时，(在芽孢杆菌中生成的)Man6和Man7的去污性能，去污性能即亮度的增加(3种污渍的ΔL*的总和)。市售制剂 4.0L用于比较。
[0066] 图11描述了在存在5g/l市售重垢液体洗涤剂B的情况下，在40℃、16°dH、60分钟、pH值约8.3和酶作为活性单元添加时，(在芽孢杆菌中生成的)Man14的去污性能，去污性能即亮度的增加(两种污渍的ΔL*的总和)。市售制剂 4.0L用于比较。
[0067] 图12描述了在存在5g/l市售重垢液体洗涤剂B的情况下，在40℃、16°dH、60分钟、pH值约8.3和酶作为活性酶蛋白添加时，(在芽孢杆菌中生成的)Man14的去污性能，去污性能即亮度的增加(两种污渍的ΔL*的总和)。市售制剂 4.0L用于比较。
[0068] 图13描述了在37℃下(在芽孢杆菌中生成的)Man6和Man7在液体洗涤剂(OMO Color)中的稳定性。市售制剂 4.0L用于比较。
[0069] 图14描述了市售重垢液体洗涤剂A中(在芽孢杆菌和木霉属中生成的)Man7和(在芽孢杆菌中生成的)Man6的稳定性。市售制剂 4.0L用于比较。
[0070] 图15示出与使用本发明的甘露聚糖酶有关的速溶咖啡生产的流程图。
[0072] SEQ ID NO:1寡核苷酸引物Man6_1的序列
[0073] SEQ ID NO:2寡核苷酸引物Man6_2的序列
[0074] SEQ ID NO:3寡核苷酸引物Man7_1的序列
[0075] SEQ ID NO:4寡核苷酸引物Man7_2的序列
[0076] SEQ ID NO:5寡核苷酸引物Man14_1的序列
[0077] SEQ ID NO:6寡核苷酸引物Man14_2的序列
[0078] SEQ ID NO:7寡核苷酸引物Vec_1的序列
[0079] SEQ ID NO:8寡核苷酸引物Vec_2的序列
[0080] SEQ ID NO:9克劳氏芽孢杆菌的核苷酸序列man6
[0081] SEQ ID NO:10不含信号肽编码序列且按里氏木霉密码子优化的克劳氏芽孢杆菌的核苷酸序列man6
[0082] SEQ ID NO:11克劳氏芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man6
[0083] SEQ ID NO:12不含信号肽的克劳氏芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man6
[0084] SEQ ID NO:13解半纤维素芽孢杆菌(Bacillus hemicellulosilyticus)的核苷酸序列man7
[0085] SEQ ID NO:14不含信号肽编码序列且按里氏木霉密码子优化的解半纤维素芽孢杆菌的核苷酸序列man7
[0086] SEQ ID NO:15解半纤维素芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man7
[0087] SEQ ID NO:16不含信号肽的解半纤维素芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man7[0088] SEQ ID NO:17土壤枝芽孢杆菌(Virgibacillus soli)的核苷酸序列man14
[0089] SEQ ID NO:18不含信号肽编码序列且按里氏木霉密码子优化的土壤枝芽孢杆菌的核苷酸序列man14
[0090] SEQ ID NO:19土壤枝芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man14
[0091] SEQ ID NO:20不含信号肽的土壤枝芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man14
[0092] SEQ ID NO:21寡核苷酸引物BMAN1的序列
[0093] SEQ ID NO:22寡核苷酸引物BMAN2的序列
[0094] SEQ ID NO:23寡核苷酸引物BMAN3的序列
[0095] SEQ ID NO:24寡核苷酸引物BMAN4的序列
[0096] SEQ ID NO:25短小芽孢杆菌的核苷酸序列man31
[0097] SEQ ID NO:26短小芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man31
[0098] SEQ ID NO:27解淀粉芽孢杆菌的核苷酸序列man32
[0099] SEQ ID NO:28解淀粉芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man32
[0100] SEQ ID NO:29木聚糖兼性芽孢杆菌(Amphibacillus xylanus)的核苷酸序列man33
[0101] SEQ ID NO:30木聚糖兼性芽孢杆菌(Amphibacillus xylanus)的推导的氨基酸序列Man33
[0102] SEQ ID NO:31多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的核苷酸序列man34[0103] SEQ ID NO:32多粘类芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man34
[0104] SEQ ID NO:33解半纤维素酶芽孢杆菌的核苷酸序列man35
[0105] SEQ ID NO:34解半纤维素酶芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man35
[0106] SEQ ID NO:35嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)的核苷酸序列man36[0107] SEQ ID NO:36嗜碱芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man36
[0108] SEQ ID NO:37芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)的核苷酸序列man37
[0109] SEQ ID NO:38芽孢杆菌属菌种的推导的氨基酸序列Man37
[0110] SEQ ID NO:39环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的核苷酸序列man38
[0111] SEQ ID NO:40环状芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man38
[0112] SEQ ID NO:41类芽孢杆菌属菌种(Paenibacillus sp.)的核苷酸序列man39[0113] SEQ ID NO:42类芽孢杆菌属菌种的推导的氨基酸序列Man39
[0114] SEQ ID NO:43环状芽孢杆菌的核苷酸序列man40
[0115] SEQ ID NO:44环状芽孢杆菌的推导的氨基酸序列Man40
[0116] SEQ ID NO:45尼氏芽孢杆菌(Bacillus nealsonii)的核苷酸序列man41
[0117] SEQ ID NO:46尼氏芽孢杆菌Man41的推导的氨基酸序列Man41
[0118] SEQ ID NO:47环状芽孢杆菌的核苷酸序列man42
[0119] SEQ ID NO:48环状芽孢杆菌的核苷酸序列Man42
具体实施方式
[0120] 甘露聚糖是指由通过β-1,4键连接在一起的甘露糖主链构成的多糖，其中半乳糖的侧链通过α-1,6键连接到主链上。甘露聚糖包含植物性材料如瓜尔胶和刺槐豆胶。葡甘露聚糖是这样的多糖：其具有或多或少规则交替的β-1,4连接的甘露糖和葡萄糖的主链。半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖是具有α-1,6连接的半乳糖侧链的甘露聚糖和葡甘露聚糖。
[0121] 如本文所用，术语“甘露聚糖酶”或“半乳甘露聚糖酶”是指根据本领域已知的甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶定义的甘露聚糖酶，具有别名β-甘露聚糖酶和内切-1,4-甘露聚糖酶，且促进甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中的1,4-β-D-甘露糖苷键的水解。根据酶命名法甘露聚糖酶被分类为EC 3.2.1.78。
[0122] 如本文所用，“分离的”是指在具有自然界中不存在的形式或自然界中不存在的环境中的物质。分离的物质的非限制性例子包括：(1)任何非天然存在的物质，(2)从一个或多个或所有与自然有关的天然存在的成分至少部分地除去的任何物质，包括任何酶、变体、核酸，蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于在自然界中发现的物质，任何经人的手改变的物质；或者(4)任何通过相对于与其天然相关的其它成分增加或减少该物质的量而被改变的物质，例如，宿主细胞中的重组生成；编码该物质的基因的一个或多个拷贝；以及对与编码该物质的基因天然相关的启动子使用替代性启动子。在一个实施方式中，本发明的多肽、酶、多核苷酸、宿主细胞或组合物是分离的。
[0123] 如本文所用，术语“包括”既包括广义的“包括”、“包含”和“含有”，也包括狭义的表达“由...组成”和“仅由......组成”。
[0124] 如本文所用，“片段”指缺失一个或多个氨基酸或核苷酸的蛋白质或多核苷酸。在DNA的背景下，片段包括任何长度的单链DNA和双链DNA。片段可以是活性片段，其具有蛋白质或多核苷酸的生物学功能，如酶活性或调节活性。片段也可以是无活性片段，即它不具有天然蛋白质或多核苷酸的一种或多种生物学效应。
[0125] 如本文所用，“肽”和“多肽”是包括多个连续的聚合氨基酸残基的氨基酸序列。为了本发明的目的，肽是包含不多于20个氨基酸残基的分子，多肽则包含超过20个氨基酸残基。肽或多肽可以包括修饰了的氨基酸残基、未由密码子编码的天然存在的氨基酸残基、和非天然存在的氨基酸残基。如本文所用，“蛋白质”可以指任何大小的肽或多肽。蛋白质可以是酶、蛋白、抗体、膜蛋白、肽激素、调节剂或任何其它蛋白。
[0126] 术语“多核苷酸”是指从5’至3’端读码的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，且可以从天然来源分离、在体外合成、或者由天然和合成分子的组合来制备。
[0127] 如本文所用，多核苷酸背景下的“修饰”、“修饰的”和类似术语是指多核苷酸的编码或非编码区(如调节序列、5’非翻译区、3’非翻译区、上调遗传元件、下调遗传元件、增强子、抑制子、启动子、外显子或内含子区域)中的修饰。在一些实施方式中，修饰可以仅是结构性的，对多核苷酸的生物效应、作用或功能没有影响。在其它实施方式中，修饰是提供多核苷酸的生物效应、作用或功能变化的结构修饰。这种修饰可以增强、抑制或改变多核苷酸的生物学功能。
[0128] 如本文所用，“同一性”是指两个比对序列之间的氨基酸残基的精确匹配数除以存在于两个序列的残基所处位置的总数所得的百分比。当一个序列具有的残基在另一个序列中没有相应残基时，比对程序允许比对中有间隙，且该位置不计入计算同一性的分母中。同一性是在EMBL-EBI网站上用成对序列比对工具EMBOSS Needle确定的值(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)。
[0129] 如本文所用，“宿主细胞”是指对核酸构建体或包含多核苷酸的表达载体易于转化、转染、转导、交配、杂交等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”包括由于复制过程中发生的突变而不相同的任何后代。宿主细胞的非限制性例子有：真菌细胞，选自子囊菌门、盘菌亚门的细丝真菌细胞，优选地选自粪壳菌纲、肉座菌亚纲、肉座菌目、小囊菌目的成员、以及曲霉、金孢霉、毁丝霉和腐质霉；更优选地选自：肉座菌科、丛赤壳科、麦角菌科、小囊菌科、木霉属(肉座菌属的无性型)、镰刀菌属、赤霉属、丛赤壳属、穗霉属、麦角菌属、绿僵菌属、稻曲菌(Villosiclava)属、蛇形虫草属、头孢菌属和丝孢菌属；更优选地选自：里氏木霉(红褐肉座菌)、桔绿木霉、长枝木霉、绿木霉、哈茨木霉、棘孢木霉、深绿木霉、拟里氏木霉、尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、小麦冠腐病菌、镰孢霉、藤仓赤霉、串珠状赤霉、玉蜀黍赤霉、红球丛赤壳菌(血赤壳菌)、黑葡萄穗霉、穗霉(Stachybotrys chlorohalonata)、紫色麦角菌、蝗绿僵菌、金龟子绿僵菌、稻曲病菌、冬虫夏草菌、顶头孢霉(产黄头孢霉)、尖端赛多孢子菌、黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉、腐质霉和灰腐质霉；最优选为里氏木霉。宿主细胞的非限制性例子有：细菌细胞，优选为革兰氏阳性杆菌(例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌)、革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)、放线菌(例如链霉菌)，以及酵母(例如酿酒酵母、毕赤酵母、解脂耶罗维亚酵母)。
[0130] 在一个实施方式中，宿主细胞是真菌细胞，优选为丝状真菌细胞，如木霉属或里氏木霉。在一个实施方式中，宿主细胞是细菌细胞，优选为革兰氏阳性芽孢杆菌细胞，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌。
[0131] “重组细胞”或“重组宿主细胞”是指这样的细胞或宿主细胞：其已被遗传修饰或改变以包含不是所述细胞或宿主细胞天然具有的核酸序列。在一个实施方式中，遗传修饰包括将多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中。在另一个实施方式中，多核苷酸在宿主细胞中是外源的。
[0132] 如本文所用，“表达”包括在宿主细胞中生成多肽所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、翻译、翻译后修饰和分泌。表达之后可以收集，即回收宿主细胞或被表达的产物。
[0133] 术语“表达载体”是指包含编码目的多肽的片段的线性或环状DNA分子，该编码目的多肽的片段与为其转录提供的其它片段可操作地连接。这些附加片段可包括启动子序列和终止子序列，并且可以选择性地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号、载体等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。表达载体可以是任何方便地进行重组DNA操作的表达载体，载体的选择通常取决于载体将被导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是这样的载体：当其被导入宿主细胞时，其被整合到宿主细胞基因组中并和与其整合的染色体一起被复制。
[0134] 本文所用的与多肽或蛋白质的生成有关的术语“重组生成的”根据本领域的标准定义来定义。
[0135] 本文所用的与特定微生物来源有关的术语“从......获得的”和“能够获得的”是指多核苷酸由特定来源进行表达(同源表达)，或由其中插入了来自来源的基因的细胞进行表达(异源表达)。
[0136] 术语“酶组合物”是指来自单一种类的微生物的常规酶发酵产物，可能是分离和纯化的，这种制剂通常包含许多不同的酶活性；或者是单组分酶的混合物，优选为通过使用常规重组技术从细菌或真菌物种衍生的酶，所述酶已经发酵并且可能已经分离和分别纯化，而且可以源自不同物种，优选为真菌或细菌物种，或者微生物的发酵产物，该微生物用作生成重组甘露聚糖酶的宿主细胞，但该微生物同时生成其它酶。
[0137] 当提及DNA片段时，术语“可操作地连接”是指片段被排列成，为了它们的预期目的它们一致地起作用，例如，转录在启动子中开始并通过编码片段进入终止子。
[0138] 术语“启动子”是指含有为RNA聚合酶结合和转录起始提供的DNA序列的基因的一部分。启动子序列通常(但不总是)存在于基因的5’非编码区中。
[0139] 术语“分泌信号序列”是指编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为较大多肽的组分，指导较大的多肽通过生成它的宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列可以是天然的，或者也可以用来自另一来源的分泌信号序列或载体序列替换。取决于宿主细胞，较大的肽可以在运送过程中通过分泌途径被切割以除去分泌肽。
[0140] 术语“核心区”是指酶的结构域，其可以经过或者不经过修饰或改变，但保留了其原始活性的至少一部分；催化结构域在本领域中公知保持了功能性。根据本发明的甘露聚糖酶的核心区对应于以以下氨基酸序列排列的氨基酸：Man7(SEQ ID NO:16)的氨基酸27-331，Man6(SEQ ID NO:12)的氨基酸35-324，或者Man14(SEQ ID NO:20)的氨基酸17-314。
[0141] 术语“接头”或“间隔基”是指包含至少两个氨基酸的多肽，其可存在于多结构域蛋白质(例如，包含酶核心和结构域比如碳水化合物结合模块(CBM)的酶或任何其它酶杂合体)的结构域之间，或者存在于作为融合多肽(例如包含两种核心酶的融合蛋白)生成的两种蛋白或多肽之间。例如，通过将编码酶核心的DNA序列，编码接头的DNA序列和编码CBM的DNA序列依次连接到一个开放读码框架中并表达该构建体来提供酶核心与CBM的融合蛋白。
[0142] 有效量是指足以使所选应用中的甘露糖被降解的量。
[0143] 除非另有说明，术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂”包括：固体、颗粒或粉末形式的全效或重垢洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂形式的全效洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体(HDL)类型；精细织物液体洗涤剂；手洗餐具或轻型餐具洗涤剂，特别是高发泡型的；机器洗碗剂，包括家用和机构用的各种片剂、颗粒剂、液体剂和漂洗助剂；液体清洁和消毒剂，汽车或地毯香波，浴室清洁剂；金属清洁剂；以及清洁辅助剂，如漂白添加剂和“去污渍棒(stain-stick)”或预处理类型。术语“洗涤剂”、“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”用于指这样的混合物，其旨在用于洗涤介质中以清洁被污染物体。在一些实施方式中，该术语用于指洗涤织物和/或衣服(例如“衣物洗涤剂”)。在替代实施方式中，该术语指其它洗涤剂，例如用于清洁器皿、餐具等的洗涤剂(例如“餐具洗涤剂”)。并不试图将本发明限于任何特定的洗涤剂制剂或组合物。除了根据本发明的甘露聚糖酶之外，该术语涵盖的洗涤剂还可含有：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂、漂白剂系统或漂白剂组分、聚合物、织物整理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、染料、香料、色暗抑制剂、荧光增白剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、抗腐蚀剂、助水溶剂、织物调色剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、去污聚合物、抗再沉积剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填料、泡沫调节剂、香料、颜料、草渍抑制剂、溶剂以及液体洗涤剂结构剂、结构弹性剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂和增溶剂。
[0144] 术语“纺织品”是指任何纺织材料，包括纱线、纱线中间体、纤维、无纺材料、天然材料、合成材料和任何其它纺织材料、由这些材料制成的织物和由织物制成的产品(例如服装、亚麻织品和其它物品)。所述纺织品或织物可以采取编织物、机织物、牛仔布、无纺织物、毡、纱线和毛巾布的形式。所述纺织品可以是基于纤维素的例如天然纤维素，包括棉、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维，或人造纤维素(例如源自于木浆)，包括粘胶纤维/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(tricell)、莱赛尔纤维或其混合物。纺织品或织物也可以是非纤维素基的，例如天然聚酰胺包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝，或者合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维，或它们的混合物，以及纤维素基纤维和非纤维素基纤维的混合物。混合物的例子有棉和/或人造丝/粘胶与一种或多种伴纺材料的混合物，伴纺材料例如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗衣物，例如染色的家用衣物。当使用术语织物或服装时，它旨在也包括更广义的术语纺织品。
[0145] 术语“稳定性”包括储存稳定性和使用期间(例如在洗涤过程中)的稳定性(洗涤中稳定性)，反映出根据本发明的甘露聚糖酶的稳定性随时间的变化，例如，在将甘露聚糖酶置于溶液中(尤其洗涤剂溶液中)时保留了多少活性。影响稳定性的因素很多，例如pH值、温度、洗涤剂组合物，例如蛋白酶、稳定剂、助洗剂、表面活性剂等。可以使用在实施例中描述的“活性测定”来测量甘露聚糖酶稳定性。
[0146] 如本文所用的“甘露聚糖酶活性”是指多肽的甘露聚糖降解活性。如本文所用的降解或修饰是指甘露糖单元被甘露聚糖酶从甘露聚糖水解。可以根据本领域已知的标准测试方法测试根据本发明的多肽的甘露聚糖降解活性。实施例7提供了用于确定甘露聚糖酶活性的标准方法的例子。
[0147] 在本发明的另一个实施方式中，至少一种酶具有甘露聚糖酶活性。本发明的酶组合物中包含的甘露聚糖酶适合用于在各种化学环境中(优选地，在洗涤剂组合物中)降解和改性含甘露聚糖的材料。
[0148] 在本发明的一个实施方式中，酶组合物还包含一种或多种附加酶，附加酶选自：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶水解酶、果胶裂解酶、酯酶、植酸酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、DNA酶、漆酶和/或过氧化物酶，优选地，选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。
[0149] 包含甘露聚糖酶和附加酶的本发明的酶组合物有利于提供协同效应。当本发明的包含甘露聚糖酶的酶组合物用于洗涤剂时，例如洗涤污渍时，需要这些附加酶。与甘露聚糖酶一起使用的特别有利的协同酶是淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶，或它们的组合，如包含甘露聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶的组合物。
[0150] 通常，所选择的酶的性质应与所选择的洗涤剂相容(即，最佳pH值、与其它酶和非酶成分的相容性等)，而且应当有有效量的该酶。
[0151] 例如，用于固体衣物洗涤剂的组合物可以包含，按组合物的重量计，0.000001％-5％，如0.000005-2％，如0.00001％-1％，如0.00001％-0.1％的酶蛋白。
[0152] 例如，用于洗衣液的组合物可以包含，按组合物的重量计，0.000001％-3％，如0.000005％-1％，如0.00001％-0.1％的酶蛋白。
[0153] 例如，用于自动餐具清洁的组合物可以包含，按组合物的重量计，0.000001％-5％，如0.000005％-2％，如0.00001％-1％，如0.00001％-0.1％的酶蛋白。
[0154] 在本发明的另一个实施方式中，洗涤剂组合物为以下形式：条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或多个隔室的小袋、常规的或致密的粉末、细粒、糊剂、凝胶、或者常规的、致密的或浓缩的液体。在一个实施方式中，洗涤剂组合物可以是衣物洗涤剂组合物，优选为液体的或固体的衣物洗涤剂组合物。洗涤剂制剂的形式有很多种，例如层(相同的相或不同的相)、小袋、以及用于机器加料单元的形式。
[0155] 在一个实施方式中，本发明的酶组合物还包含：
[0157] b、选择性地，至少一种多元醇，选自丙二醇、甘油、糖、糖醇、乳酸、硼酸、硼酸衍生物、芳香硼酸酯、苯基硼酸衍生物、肽或其组合；
[0158] c、选择性地，至少一种酶，选自有或没有介质的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶水解酶、果胶裂解酶、糖苷酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶或其组合；以及
[0159] d、选择性地，至少一种填充剂，选自麦芽糊精、面粉、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
[0160] 附加组分a-d为本发明的酶组合物提供了改进的性质。酶组合物与附加组分相容并改善酶组合物在各种用途中的适用性。
[0161] 盐，比如氯化钠和硫酸钠，起到干燥助剂的作用。
[0162] 在第一方面的一个实施方式中，本发明的酶组合物为液体组合物或固体组合物的形式，如溶液、分散剂、糊剂、粉末、细粒、颗粒、包衣颗粒、片剂、糕剂、晶体、晶体浆液、凝胶或丸粒。
[0163] 本发明还涉及本文公开的酶组合物的不同用途，例如用于降解甘露聚糖和用于洗衣过程。
[0164] 酶组合物也可用于清洁剂或增效剂中，所述清洁剂或增效剂在洗涤期间或之前添加到洗涤剂之上，并且是以例如液体、凝胶、粉末、颗粒或片剂的形式。酶组合物和洗涤剂组分也可以浸泡在诸如纺织品的载体中。
[0165] 在一个实施方式中，甘露聚糖酶在5.5至8.5的pH范围内具有至少50％的相对活性。相对活性可以通过实施例7中描述的方法确定。
[0166] 在本发明的一个实施方式中，甘露聚糖酶在45℃-65℃的温度范围内具有至少30％的相对活性。
[0167] 提供在高于环境温度的温度下依然保持活性的甘露聚糖酶对于需要在这种条件下降解甘露聚糖的应用是有利的。此外，根据本发明的甘露聚糖酶在碱性条件下可具有良好的稳定性和活性，这在洗涤剂用途和生物质加工中是有利的。
[0168] 在一个实施方式中，甘露聚糖酶具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:12具有至少或大约93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
[0169] 在一个实施方式中，甘露聚糖酶具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:16具有至少或大约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％的序列同一性。
100％的序列同一性。
[0170] 在一个实施方式中，甘露聚糖酶具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:20具有至少或大约79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
[0171] 在一个实施方式中，甘露聚糖酶具有与SEQ ID NO:12[Man6]、SEQ ID NO:16[Man7]或SEQ ID NO:20[Man14]不是100％相同的氨基酸序列。
[0172] 在一个实施方式中，本发明的酶组合物包含第二方面的重组宿主细胞。
[0173] 在第二方面的一个实施方式中，重组多肽是融合蛋白，其除了包含具有甘露聚糖酶活性的氨基酸序列外，还包含下列中的至少一种：
[0174] 提供分泌信号序列的氨基酸序列，如解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶信号肽；
[0175] 促进纯化的氨基酸序列，如亲和标签、组氨酸标签；
[0176] 促进制备的氨基酸序列，如作为载体的氨基酸序列，比如CBM；
[0177] 具有酶活性的氨基酸序列；以及
[0178] 为具有结合亲和力的融合蛋白提供的氨基酸序列，如碳水化合物结合部分。
[0179] CBM，碳水化合物结合部分，作为载体例如在木霉制备中是有利的。
[0180] 在一个实施方式中，宿主细胞是非致病性的。这对于在饲料中使用宿主细胞以及在家用洗衣洗涤剂等洗涤剂应用中使用宿主细胞是特别有利的。
[0181] 在第五方面的一个实施方式中，含甘露聚糖的材料选自植物性材料、纺织品、废水、污水、油或其其组合。
[0183] 在另一个实施方式中，降解或修饰在水性环境中进行，甘露聚糖酶在该水性环境中显示出活性。
[0184] 在一个优选的实施方式中，在该方法中被降解或改性的含甘露聚糖的材料在纺织品或织物上，选择性地，该纺织品或织物具有甘露聚糖污渍。通过降解附着在织物或织物上的甘露聚糖，与甘露聚糖结合的污物或污垢被释放，而且不能再结合到甘露聚糖或甘露聚糖污渍上。纺织品或织物可以是任何材料，例如棉、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维，或者人造纤维素(例如源自于木浆)，包括粘胶纤维/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(tricell)、莱赛尔纤维、铜氨纤维或其混合物。
[0185] 在第六方面的一个实施方式中，动物是单胃动物或反刍动物。在另一个实施方式中，动物是肉鸡、蛋鸡、猪、火鸡或水产养殖生物比如鱼。在另一个实施方式中，动物是反刍动物。
[0186] 在一个实施方式中，饲料包含玉米和豆粕，或者由玉米和豆粕组成。
[0187] 在一个实施方式中，植物来源的蛋白质源包含大豆，谷类如大麦、小麦、黑麦、燕麦或玉米，或者由它们组成。
[0188] 在一个实施方式中，含甘露聚糖的制品或副产品包含棕榈仁、瓜尔豆粉或椰子粉，或者由它们组成。
[0189] 在第六方面或第七方面的一个实施方式中，动物饲料或饲料添加剂被制成湿组合物或干组合物的形式。
[0190] 在第九方面的一个实施方式中，洗涤剂是液体洗涤剂或固体洗涤剂，优选为粉末、条、片剂、小袋、糊剂、凝胶、液体、细粒或颗粒的形式。
[0191] 在一个实施方式中，包含至少一种甘露聚糖酶的组合物用于纸浆和造纸工业、生物漂白、纤维改性、排水改进，以及用于石油工业，即，用于石油钻探或石油维修工业中用于水力压裂或控制钻井液的粘度。
[0193] 在一个实施方式中，甘露聚糖酶随机水解内切-β-1,4-甘露糖苷键。
[0194] 在一个实施方式中，甘露聚糖酶是可从细菌来源获得或衍生的。
[0195] 在一个实施方式中，甘露聚糖酶可以与至少一种其它多肽融合，从而形成融合多肽。除了对甘露聚糖酶的催化或结合活性之外，所述融合多肽或其它多肽可以具有其它的催化或结合活性。在一个实施方式中，所述其它多肽包含碳水化合物结合模块或由碳水化合物结合模块组成，其选择性地是衍生自与甘露聚糖酶相同或不同的有机物的另一种蛋白或酶的片段。
[0196] 在一个实施方式中，甘露聚糖酶通过接头与所述其它多肽连接。
[0197] 在一个实施方式中，提供了一种织物的机器处理方法，该方法包括：在机器洗涤过程的洗涤循环期间，采用含有第一方面的酶组合物、可从第二方面的重组宿主细胞获得的酶或第三方面的重组多肽的洗涤溶液处理织物。
[0198] 在一个实施方式中，提供了第一方面的酶组合物、可从第二方面的重组宿主细胞获得的酶、或第三方面的多肽与选自以下的酶一起在用于织物清洗和/或织物去污的清洁组合物中的用途：有或没有介质的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶水解酶、果胶裂解酶、糖苷酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶。
[0199] 在一个实施方式中，提供了第一方面的酶组合物、可从第二方面的重组宿主细胞获得的酶、或第三方面的多肽与选自以下的酶一起在用于清洁硬表面如地板、墙壁、浴室瓷砖等的清洁组合物中的用途：有或没有介质的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶水解酶、果胶裂解酶、糖苷酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶。
[0200] 在一个实施方式中，提供了第一方面的酶组合物、可从第二方面的重组宿主细胞获得的酶、或第三方面的多肽与选自以下的酶一起在用于手洗和机洗餐具的的清洁组合物中的用途：有或没有介质的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶水解酶、果胶裂解酶、糖苷酶、阿拉伯糖酶、半乳糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶。
[0201] 实施例
[0203] 实施例1：筛选
[0204] 为了鉴定新的β-1,4-甘露聚糖酶，筛选公共数据库(NCBI，EBI)和选定的专有和公共基因组。表1列出了在这项工作中使用的所有专有和公共基因组。将所有中选的基因组分组，最后根据相互之间的群落谱系距离(phylogenetic distance)选择15个细菌来源基因，用于在芽孢杆菌中进行克隆(表2)。
[0205] 表1：用于筛选β-1,4-甘露聚糖酶的专有和公共基因组的列表
[0206]菌种 菌株 来源
短小芽胞杆菌 MS8 ABE
木聚糖兼性芽孢杆菌 NBRC 15112 NCBI
解半纤维素芽孢杆菌 JCM 9152 NCBI
克劳氏芽孢杆菌 KSM-K16 NCBI
解淀粉芽孢杆菌 RH1330 ABE
土壤枝芽孢杆菌 PL205 NCBI
短小芽胞杆菌 MS8 ABE
木聚糖兼性芽孢杆菌 NBRC 15112 NCBI
解半纤维素芽孢杆菌 JCM 9152 NCBI
克劳氏芽孢杆菌 KSM-K16 NCBI
解淀粉芽孢杆菌 RH1330 ABE
土壤枝芽孢杆菌 PL205 NCBI
[0207] 表2：为了在芽孢杆菌中克隆而选择的基因列表。示出预测的PFAM结构域和蛋白质的氨基酸长度
[0208]
[0209]
[0210] 实施例2：芽孢杆菌中的细菌甘露聚糖酶的克隆
[0211] 除非另有说明，包括DNA操作和转化的分子生物学方法如Sambrook和Russell(2001)以及Harwood和Cutting(1990)中所述的进行。使用Pfx Accu Prime聚合酶(Invitrogen公司)通过PCR扩增基因man6、man7和man14。按照制造商的说明书书进行PCR。
以下PCR条件用于构建表达质粒：在94℃下初始变性120秒，然后在94℃下进行35个15秒循环，在以下50/55℃之一退火30秒：，在68℃下延伸110/290秒，最后在68℃下延伸10分钟。为了扩增man7，使用半纤维素芽孢杆菌JCM9152的基因组DNA。订购man6和man14，作为未进行密码子优化的合成基因(Eurofins MWG公司，德国)。用于克隆的引物的序列在表3中表示。
对用于杂交的突出部分加下划线。
以下PCR条件用于构建表达质粒：在94℃下初始变性120秒，然后在94℃下进行35个15秒循环，在以下50/55℃之一退火30秒：，在68℃下延伸110/290秒，最后在68℃下延伸10分钟。为了扩增man7，使用半纤维素芽孢杆菌JCM9152的基因组DNA。订购man6和man14，作为未进行密码子优化的合成基因(Eurofins MWG公司，德国)。用于克隆的引物的序列在表3中表示。
对用于杂交的突出部分加下划线。
[0212] 表3：用于扩增man6、man7和man14的引物列表
[0213]
[0214] 通过使用 高保真DNA组装预混液( Hifi DNA Assembly Master Mix，NEB公司，法兰克福)，将基因克隆到标准载体pEV1pEV1(图1)中，标准载体pEV1是包括来自地衣芽孢杆菌的启动子PaprE和来自解淀粉芽孢杆菌的木聚糖酶信号肽的pUB110衍生物。克隆时使用的载体与插入片段的比率为1：3。片段的总量为0.2pmol，总体积为20μl。将样品在50℃下培养40分钟。为了构建的目的，如Zhang和Zhang 2011中所述，通过枯草芽孢杆菌SCK6中的诱导能力来转化表达质粒。将转化的细胞接种到添加了10mg/l卡那霉素的LB(Luria-Bertani)培养板上。将培养板在37℃下培养20小时。挑取出现的菌落，用QiaPrep MiniPrep试剂盒(Qiagen公司，Hilden)分离质粒。根据制造商对革兰氏阳性质粒制剂的推荐说明进行分离程序。通过Sanger测序(GATC公司，德国)对插入片段进行测序，并揭示了对应于甘露聚糖酶Man6、Man7和Man14的成熟部分的DNA序列。使用ClustalW序列比对进行序列比较(Thompson等人，1994)。最后，通过电穿孔将表达质粒转化到合适的芽孢杆菌生产菌株中。芽孢杆菌生产菌株在含有20g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、10g NaCl和2M蔗糖的电穿孔培养基中生长，且在OD(600nm)值为0.4时收集10ml。用含有0.272M蔗糖、1mM MgCl2和7mM KH2PO4的电穿孔缓冲液洗涤细胞，最后重悬于250μl电穿孔缓冲液中。使用以下条件进行电穿孔：1.2kV、150Ω、50μF。然后加入1ml电穿孔培养基，将细胞在37℃下培养3小时。将细胞接种在添加了20mg/l卡那霉素的LB培养板上，并在37℃下培养18小时。克隆被如上所述地验证，并用于生成用于分析测试的材料。因此，菌株在蛋白质诱导条件下以标准表达接种，并在37℃下培养30小时。收集上清液，用于分析和应用测试。基因和酶的特性如表4和表5所示。
[0215] 表4：关于来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16、解半纤维芽孢杆菌JCM 9152和土壤枝芽孢杆菌PL205的GH5家族甘露聚糖酶编码基因的概述
[0216] 基因 包括SP的长度(bp) SEQ ID NOman6 975 9
man7 1473 13
man14 1449 17
man7 1473 13
man14 1449 17
[0217] 表5：从来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16、半纤维芽孢杆菌JCM 9152和土壤枝芽孢杆菌PL205的GH5甘露聚糖酶编码基因序列推导出的氨基酸序列概述
[0218]
[0219] 实施例3：里氏木霉中的细菌甘露聚糖酶man6和man7的PCR克隆
[0220] 在DNA的分离和酶处理(例如质粒DNA的分离、DNA的消化以生成DNA片段)、大肠杆菌转化、测序等中使用标准分子生物学方法。使用的基本方法要么如酶、试剂或试剂盒的制造商所述，要么如标准分子生物学手册(例如，Sambrook和Russell(2001))中所述。基因组DNA的分离如Raeder和Broda(1985)详细描述的进行。
[0221] 分别来自克劳氏芽孢杆菌和半纤维芽孢杆菌的man6和man7也被克隆，用于在里氏木霉中表达。使用按里氏木霉密码子优化的合成基因对基因进行PCR克隆。通过使用PCR除去编码信号肽的DNA序列man6和man7，生成新的克隆位点。引物的序列在表6中表示(SEQ ID NO:21-24)。
[0222] 表6：用作PCR引物以扩增解半纤维素芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌甘露聚糖酶基因的寡核苷酸
[0223]
[0224]
[0225] (a括号中的“s”＝有义链，“as”＝反义链。
[0226] 用表6中所述的引物且使用合成的DNA作为反应中的模板，通过PCR扩增基因。克劳氏芽孢杆菌man6和解半纤维素芽孢杆菌man7的PCR混合物分别包含：用于Phusion HF聚合酶(NEB/BioNordika公司，芬兰)的1×HF缓冲液、0.2mM dNTP混合物(Thermo Fisher Scientific公司，芬兰)、1μM每种引物、3％DMSO(Thermo Fisher Scientific公司)、1单位Phusion高保真聚合酶(NEB/BioNordika公司，芬兰)和50ng相应的质粒DNA。PCR反应的条件如下：在98℃下初始变性30秒，然后在98℃下进行28个10秒循环，在45/50/55/60℃中的一个温度下退火30秒，在72℃下延伸45秒，最后在72℃下延伸7分钟。
[0227] 表6中描述的引物组合生成了具有所期望大小的特定DNA产物。按照制造商的说明书用GenJet Gel Extraction试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)从琼脂糖凝胶中分离PCR产物，用NruI和BamHI限制酶(Thermo Fisher Scientific公司)消化PCR产物并克隆到用NruI和BamHI切割的表达载体中。将连接混合物(ligation mixture)转化到大肠杆菌XL1-Blue(AH Diagnostics公司)中并涂布在含有50-100μg/ml氨苄青霉素的LB培养板上。从培养板收集几个大肠杆菌菌落，用GenJet Plasmid Miniprep试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)分离DNA。使用限制性消化筛选阳性克隆。对编码克劳氏芽孢杆菌(man6)和解半纤维素芽孢杆菌(man7)GH5甘露聚糖酶的基因(没有它们自身的信号肽编码序列)进行测序，并将质粒分别命名为pALK4274和pALK4273(详情参见实施例6)。
[0228] 实施例4：合成细菌甘露聚糖酶man14的克隆
[0229] 在DNA的分离和酶处理(例如质粒DNA的分离、DNA的消化以生成DNA片段)、大肠杆菌转化、测序等中使用标准分子生物学方法。使用的基本方法要么如酶、试剂或试剂盒的制造商所述，要么如标准分子生物学手册(例如，Sambrook和Russell(2001))中所述。基因组DNA的分离如Raeder和Broda(1985)详细描述的进行。
[0230] 还克隆了来自土壤枝芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因man14用于木霉属的表达。从GenScript公司订购来自土壤枝芽孢杆菌的编码GH5家族甘露聚糖酶Man14的基因，作为具有里氏木霉密码子优化的合成构建体。
[0231] 将从GenScript公司获得的包含man14基因的质粒DNA重悬于无菌水中，按照制造商的说明书用NruI和BamI限制酶(Thermo Fisher Scientific公司)消化，并克隆到用NruI和BamI切割的表达载体中。将连接混合物转化到大肠杆菌XL1-Blue(AH Diagnostics公司)中，并涂布在含有50-100μg/ml氨苄青霉素的LB培养板上。从培养板收集几个大肠杆菌菌落，用GenJet Plasmid Miniprep试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)分离DNA。使用限制性消化筛选阳性克隆，显示出它们含有所期望的大小的插入片段。对土壤枝芽孢杆菌man14与表达质粒的融合位点进行测序，并将质粒命名为pALK4414(详情参见实施例6)。
[0232] 实施例5：在芽孢杆菌中生成重组细菌GH5甘露聚糖酶蛋白
[0233] 构建表达质粒，用于从克劳氏芽孢杆菌、半纤维芽孢杆菌和土壤枝芽孢杆菌生成重组GH5甘露聚糖酶(Man6、Man7和Man14)蛋白。构建的表达质粒列于表7中。重组GH5基因(man6、man7和man14)没有它们自己的信号序列，与地衣芽孢杆菌PaprE启动子和解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶信号肽融合。通过强终止子确保转录终止，使用卡那霉素抗性标记选择转化体。转化如实施例2中所述的进行。
[0234] 表7：构建表达质粒以在适当的芽孢杆菌表达菌株中生成来自克劳氏芽孢杆菌、半纤维芽孢杆菌和土壤枝芽孢杆菌的Man6、Man7和Man14重组蛋白。
[0235] 甘露聚糖酶(GH5)蛋白 表达质粒Man6 pEV1 Man6
Man7 pEV1 Man7
Man14 pEV1 Man14
Man7 pEV1 Man7
Man14 pEV1 Man14
[0236] 从摇瓶培养的培养上清液中分析转化体的GH5生成。将转化体从LB培养板接种到含有2％葡萄糖、6％玉米浆、1.3％(NH4)2HPO4、0.05％MgSO4·7H2O和0.5％CaCl2的摇瓶中。将pH值调节至pH 7.5。在37℃，180rpm下培养30小时后，从培养物上清液中分析转化体的GH5蛋白生成。通过SDS-PAGE分析重组蛋白的异源生成，随后进行考马斯(Coomassie)染色。
[0237] 选择产量最高的转化体在实验室规模的生物反应器中培养。转化体以37℃、蛋白质诱导条件在生物反应器中培养，并且追加补料直至达到合适的产量。通过离心或过滤回收上清液用于应用测试。
[0238] 实施例6：在里氏木霉中生成重组细菌GH5甘露聚糖酶蛋白
[0239] 在里氏木霉中构建表达质粒，用于从克劳氏芽孢杆菌、解半纤维芽孢杆菌和土壤枝芽孢杆菌(参见实施例3和4)生成重组GH5甘露聚糖酶(Man6、Man7和Man14)蛋白。构建的表达质粒列于表8中。重组GH5基因(man6、man7和man14)不含其自身信号序列，与具有里氏木霉cel6Acbh2CBM载体和接头的里氏木霉cel7A/cbh1启动子连接，后面是Kex2蛋白酶识别位点。通过里氏木霉cel7A/cbh1终止子确保转录终止，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS标记基因用于选择转化体，如Paloheimo等人(2003)中所述。在NotI消化后，线性表达盒(图2)从载体主链分离，并被转化到里氏木霉原生质体中。使用的宿主菌株不生成四种主要的里氏木霉纤维素酶(CBHI，CBHII，EGI，EGII)中的任何一种。转化如 等人(1987)所述地进行，其改进在Karhunen等人(1993)中有描述，选择乙酰胺酶作为唯一的氮源(amdS标记基因)。在选择培养板上通过单个分生孢子纯化转化体，然后使它们在PD上形成孢子。
[0240] 表8：在里氏木霉中构建表达质粒，以从克劳氏芽孢杆菌、解半纤维芽孢杆菌和土壤枝芽孢杆菌生成Man6、Man7和Man14重组蛋白。表达盒的总体结构如图2所示。
[0241] 甘露聚糖酶(GH5)蛋白 表达质粒 表达盒(aMan6 pALK4274 7.0kb NotI
Man7 pALK4273 7.5kb NotI
Man14 pALK4414 7.6kb NotI
Man7 pALK4273 7.5kb NotI
Man14 pALK4414 7.6kb NotI
[0242] (a通过使用NotI消化从载体主链中分离用于里氏木霉转化的表达盒。
[0243] 从摇瓶培养的培养上清液中分析转化体的甘露聚糖酶生成。将转化体从PD斜面接种到含有50ml用5％KH2PO4缓冲的复合乳糖基纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等人，1993)的摇瓶中。在30℃、250rpm下生长7天后，从培养物上清液中分析转化体的GH5蛋白产量。通过SDS-PAGE分析重组蛋白的异源生成，随后进行考马斯染色。
[0244] 选择产量最高的转化体在实验室规模的生物反应器中培养。转化体以典型的嗜温真菌培养温度和微酸性条件，在蛋白质诱导条件下，通过批量或通过追加补料型工艺在生物反应器中培养。培养一直持续到培养基糖耗尽或达到合适的产量。通过离心或过滤回收上清液用于应用测试。
[0245] 实施例7：通过DNS方法测定半乳甘露聚糖酶活性
[0246] 甘露聚糖酶活性(MNU)测量为在50℃和pH 7.0下在5分钟内从半乳甘露聚糖(0.3w/w-％)释放的还原糖。使用二硝基水杨酸通过分光光度法测定释放的还原性碳水化合物的量。
[0247] 测定中使用的底物(0.3w/w-％)如下制备：0.6g刺槐豆胶(Sigma G-0753)在约80℃50mM pH7柠檬酸钠缓冲液(或pH7柠檬酸盐磷酸盐缓冲液)中，使用加热磁搅拌器加热至沸点。将溶液冷却并在冷室(2-8℃)中溶解过夜，同时连续搅拌，通过离心除去不溶的残余物。之后，通过缓冲液将溶液填充至200ml。将底物冷冻保存并在沸水浴中加热融化至约80℃，冷却至室温并在使用前小心混合。
[0248] 通过将50g的3,5-二硝基水杨酸(Sigma D-550)溶解在约4升水中来制备测定中使用的DNS试剂。在连续磁力搅拌下，逐步加入80.0g NaOH并使其溶解。在连续搅拌下分小份加入1500g罗谢尔盐(酒石酸钾钠，Merck 8087)。将小心地加热至最高温度45℃的溶液冷却至室温并填充至5000ml。之后，将其通过Whatman 1滤纸过滤并在室温下储存在深色瓶中。
[0249] 首先通过向两个试管中的每一个试管都加入1.8ml底物溶液开始反应，并使其在50℃下平衡5分钟，之后将200μl适当稀释的酶溶液加入其中一个试管中，用漩涡混合器充分混合，并在50℃下精准培养5分钟。酶空白不需要平衡或培养。通过向两个管中都加入
3.0ml DNS试剂使反应终止并混合。将200μl样品溶液加入酶空白样试管中。将两个试管置于沸水浴中。煮沸恰好5分钟后，将试管置于冷却水浴中并使其冷却至室温。在540nm处测量样品的吸光度与酶空白样对比，从校准曲线读取活性并乘以稀释因子。合适的稀释样品出现0.15-0.4的吸光度差异。
3.0ml DNS试剂使反应终止并混合。将200μl样品溶液加入酶空白样试管中。将两个试管置于沸水浴中。煮沸恰好5分钟后，将试管置于冷却水浴中并使其冷却至室温。在540nm处测量样品的吸光度与酶空白样对比，从校准曲线读取活性并乘以稀释因子。合适的稀释样品出现0.15-0.4的吸光度差异。
[0250] 通过将360mg甘露糖(SigmaM-6020，储存在干燥器中)溶解在测定缓冲液中并将其稀释成含有3、6、10和14μmol/ml甘露糖的溶液，从甘露糖原液制备标准曲线20mM。除了在50℃下培养外，标准的处理方式与样品相同。在540nm处测量吸光度与试剂空白样(含有缓冲液，而不是甘露糖的标准稀释品)。对每个系列的测定构建校准曲线。
[0251] 一个甘露聚糖酶单位(MNU)定义为：在测定条件下在1秒钟内生成如下还原性碳水化合物所需的酶量，即，该还原性碳水化合物具有的还原能力与1nmol来自半乳甘露聚糖的甘露糖相对应(1MNU＝1nkat)。
[0252] 实施例8：Man6甘露聚糖酶的纯化
[0253] 通过在4℃、4000g离心10分钟，从发酵培养基中除去细胞和固体。将10ml上清液用于蛋白质纯化。将样品通过0.44μm的PVDF膜(Millex-HV，Merck Millipore公司，Carrigtwohill，IRL)过滤。将滤液加样到在20mM HEPES pH 7中平衡的HiPrep 26/10脱盐柱(GE Healthcare公司，Uppsala，瑞典)上。然后将脱盐的样品上样到用20mM HEPES pH7预平衡的5ml HiTrap Q HP柱(GE Healthcare公司，Uppsala，瑞典)上。样品上样后，用相同缓冲液洗柱至20ml。以20mM HEPES、500mM NaCl pH7线性盐梯度，15个柱体积洗脱蛋白。收集5ml的级分并在SDS-PAGE上分析。将含有靶蛋白的级分合并，并使用Vivaspin 20,10kDa MWCO超滤装置(GE Healthcare公司)浓缩至2ml。使用用20mM MES，200mM NaCl pH6.5平衡的Superdex 75 26/60凝胶过滤柱，进一步分离被浓缩的样品。收集2ml的级分并通过SDS-PAGE分析。将含有纯甘露聚糖酶的级分合并。使用相同的规程纯化其它甘露聚糖酶，但在脱盐和离子交换步骤中改变缓冲液组成。缓冲液组合物在表9中表示。
[0254] 表9：用于离子交换色谱的缓冲剂
[0255] 甘露聚糖酶 离子交换分光光度法中使用的缓冲液Man6 20mM HEPES pH 7
Man7 20mM HEPES pH 7
Man14 20mM MES pH 6
Man7 20mM HEPES pH 7
Man14 20mM MES pH 6
[0256] 被纯化的样品纯度高于95％。
[0257] 使用UV吸光度280nm测量法确定纯化样品的酶含量。通过使用ExPASy(服务器http://web.expasy.org/protparam/)，基于酶的氨基酸序列计算每种甘露聚糖酶的激发系数。(Gasteiger等人，2005年)。
[0258] 如实施例7中所述，将纯化样品的酶活性(MNU)测量为还原糖的释放量。
[0259] 通过将纯化样品的MNU活性除以纯化酶的量来计算甘露聚糖酶的比活性(MNU/mg)。将获得的数值用于计算实施例10和11中使用的酶剂量。
[0260] 甘露聚糖酶的pH曲线
[0261] 使用来自Megazyme公司的β-甘露糖酶片剂测试天青蛋白交联的角豆半乳甘露聚糖(T-MNZ11/14)，确定纯化的甘露聚糖酶的pH曲线，对所建议的规程进行了微小修改。已经用每种纯化的酶检查了测定的线性。该测定在pH值调节至在4和11之间的40mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液中进行。将酶溶液在测定缓冲液中稀释，并在加入一个底物片剂之前将500μl酶溶液在50℃水浴中平衡5分钟。10分钟后，通过加入10ml 2％三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH 12使反应终止。将反应管在室温下放置5分钟，搅拌，并将液体通过Whatman No.1纸过滤器过滤。通过测量595nm处的吸光度来量化从底物释放的蓝色染料。每种pH值下的酶活性被报告为相对活性，其中最适pH值下的活性设定为100％。pH曲线如图3所示。
[0262] 通过将样品的甘露聚糖酶活性除以参比样品的甘露聚糖酶活性来计算甘露聚糖酶的相对活性(％)。在pH曲线的情况下，参比样品是最佳pH值下的样品。在温度曲线的情况下，参比样品是在最佳温度下的样品。
[0263] 甘露聚糖酶的温度曲线
[0264] 使用来自Megazyme公司的β-甘露糖酶片剂测试天青蛋白交联的角豆半乳甘露聚糖(T-MNZ11/14)，测定纯化的甘露聚糖酶的最适温度，对所建议的规程进行了微小修改。该测定，在40mM伯瑞坦-罗宾森缓冲液pH7中，在30-90℃之间变化的温度下进行10分钟。将酶活性报告为相对活性，其中最佳温度下的活性设定为100％。温度曲线如图4所示。
[0265] 甘露聚糖酶的温度和pH特性
[0266] Man6的分子量在30-35kDa之间。该酶在pH 7下的最佳温度为50℃至70℃。所述酶在50℃下在至少pH 6至pH 9的pH范围内具有最佳pH值。使用10分钟反应时间和天青蛋白交联的角豆半乳甘露聚糖作为底物，测定最佳温度和最佳pH值。
[0267] Man7的分子量在50-55kDa之间。酶在pH 7下的最佳温度为40℃至60℃。所述酶在50℃下在至少pH 7至pH 10的pH范围内具有最佳pH值。使用10分钟反应时间和天青蛋白交联的角豆半乳甘露聚糖作为底物测定最佳温度和最佳pH值。
[0268] Man14的分子量在30-40kDa之间。酶在pH 7下的最佳温度为50℃至60℃。所述酶在50℃下在至少pH 7至pH 8的pH范围内具有最佳pH值。使用10分钟反应时间和天青蛋白交联的角豆半乳甘露聚糖作为底物测定最佳温度和最佳pH值。
[0269] 实施例9：与不含漂白剂的市售洗涤剂一起使用时，Man6和Man7甘露聚糖酶的去污性能
[0270] 对于在芽孢杆菌(如实施例5中所述)和木霉属(如实施例6中所述)中生成的Man6和Man7甘露聚糖酶，测试了与不含漂白剂的洗涤剂一起使用时，在40℃和16°dH的水硬度下去除甘露聚糖酶敏感性标准污渍的能力，并与市售甘露聚糖酶制剂 4.0L(诺维信(Novozymes)公司)进行比较。使用来自Center for test material B.V.(荷兰)的以下人工污染的测试布：带对甘露聚糖酶敏感的巧克力布丁的棉布(E-165)、带刺槐豆胶和颜料的棉布(C-S-73)和带刺槐豆胶和颜料的聚酯/棉布(PC-S-73)、以及带瓜尔胶和炭黑的棉布(C-S-43)。将织物切成6cm×6cm的小样布，并将每一种的2个小样布用于测试。
[0271] 含有除甘露聚糖酶以外的所有其它酶的市售重垢液体洗涤剂A以每升洗涤水(wash liquor)4.4g的浓度使用，不含酶的市售彩色洗涤剂粉末以3.8g/l使用。在硬度为16°dH的合成自来水中制备含有洗涤剂的洗涤水。将蛋白酶 16L(0.5w/w％)和淀粉酶 12L(0.4w/w％)加入与市售彩色洗涤剂粉末一起使用的硬水中，液体洗涤剂已
经含有淀粉酶和蛋白酶。彩色洗涤剂粉末的洗涤水的pH值约为10，液体洗涤剂的洗涤水的pH值约为8.3。
经含有淀粉酶和蛋白酶。彩色洗涤剂粉末的洗涤水的pH值约为10，液体洗涤剂的洗涤水的pH值约为8.3。
[0272] 甘露聚糖酶的剂量在洗涤剂重量的0-0.2/0.25％范围内，但是为了进行评价，把剂量计算为每毫升洗涤水有多少个酶活性单位(MNU)或每升洗涤水有多少毫克活性酶蛋白(AEP)。如实施例7中所述测量活性。如实施例8中定义的，通过将酶活性除以比活性来计算每种制剂的AEP含量。对照样品含有洗涤剂溶液但不含甘露聚糖酶。
[0273] 对于硬度为16°dH的合成自来水，在去离子水(Milli-Q或等效物)中制备以下储用溶液：
[0274] 1000°d钙硬度的储用溶液：CaCl2·2H2O(1.02382.1000，Merck KGaA公司，德国)26.22g/l
[0275] 200°d镁硬度的储用溶液：MgSO4·7H2O(1.05856.1000，Merck KGaA公司，德国)8.79g/l H2O
[0276] NaHCO3储用溶液：NaHCO3(1.06329.1000Merck KGaA公司，德国)29.6g/l
[0277] 将13.3ml CaCl2溶液、13.3ml MgSO4溶液和10.0ml新制备的NaHCO3溶液以给定的顺序加入容量瓶中，用去离子水补足至1升并混合。通过络合滴定测定水的硬度，发现是正确的。
[0278] 如下所述在Atlas LP-2Launder-Ometer水洗色牢度测试仪中进行去污处理。首先将水洗色牢度测试仪预热至40℃。然后将洗涤剂、250ml硬度为16°dH的合成自来水和稀释的酶(<1.0ml)加入1.2升容器中。添加污渍，将水洗色牢度测试仪在40℃下运行60分钟，转速为42rpm。之后，将小样布在流水下小心冲洗，并在室内空气中在防止日光照射的栅格上干燥过夜。
[0279] 通过使用Konica Minolta CM-3610A分光光度计，使用L*a*b*颜色空间坐标(光源D65/10°，420nm切割)把颜色测量为反射率值，评价去污效果。污渍褪色，作为表示甘露聚糖酶性能(去污效率)的指标，计算为ΔL*，ΔL*指被酶处理的织物的亮度值L*减去用不含甘露聚糖酶的洗涤水(对照)处理的织物的亮度值L*。最终结果(总去污效果)显示为每种污渍的ΔL*的总和。每种污渍的颜色值是2个小样布的平均值。
[0280] 用市售液体洗涤剂获得的结果在图6-7中表示。与市售甘露聚糖酶制剂4.0L相比，根据本发明的甘露聚糖酶在作为活性单位或作为活性酶蛋白添加时，与液体洗涤剂一起使用，具有类似的(Man6)或相当好的(Man7)去污性能。不论表达宿主是芽孢杆菌还是木霉属，用Man6和Man7都得到了同样的性能(图6)。
[0281] 用市售色彩洗涤剂粉末获得的结果(图8-9)表明，与市售甘露聚糖酶制剂4.0L相比，根据本发明的甘露聚糖酶在作为活性单位或作为活性酶蛋白添加
时，与彩色洗涤剂粉末一起使用，具有更好的去污性能。
时，与彩色洗涤剂粉末一起使用，具有更好的去污性能。
[0282] 实施例10：与含漂白剂的洗涤剂一起使用时，Man6和Man7甘露聚糖酶的去污性能[0283] 对于在芽孢杆菌中生成的Man6和Man7甘露聚糖酶(如实施例5中所述)，在40℃和16°dH的水硬度下，测试了它们与市售漂白洗涤剂粉末一起使用时的去除甘露聚糖酶敏感性标准污渍的能力，并与市售甘露聚糖酶制剂 4.0L(诺维信公司)进行比较。测
试系统类似于实施例9中所述，但是使用了来自Center for test material B.V.(荷兰)的三种不同的人工污染的测试布：带对甘露聚糖酶敏感的巧克力布丁的棉布(E-165)、带刺槐豆胶和颜料的棉布(C-S-73)、以及带瓜尔胶和炭黑的棉布(C-S-43)。市售彩色洗涤剂粉末以每升洗涤水4.2g的浓度使用，洗涤水的pH值约为9.5。将蛋白酶 16L(0.5w/w％)和淀粉酶 12L(0.4w/w％)加入用于测试的硬水中，因为洗涤剂不含任何酶。
试系统类似于实施例9中所述，但是使用了来自Center for test material B.V.(荷兰)的三种不同的人工污染的测试布：带对甘露聚糖酶敏感的巧克力布丁的棉布(E-165)、带刺槐豆胶和颜料的棉布(C-S-73)、以及带瓜尔胶和炭黑的棉布(C-S-43)。市售彩色洗涤剂粉末以每升洗涤水4.2g的浓度使用，洗涤水的pH值约为9.5。将蛋白酶 16L(0.5w/w％)和淀粉酶 12L(0.4w/w％)加入用于测试的硬水中，因为洗涤剂不含任何酶。
[0284] 测量处理后的小样布的颜色，并将结果计算为实施例9中所述的每3种污渍的ΔL*的总和。
[0285] 用市售的含漂白剂的洗涤剂得到的结果(图10)表明，与市售甘露聚糖酶4.0L相比，本发明的甘露聚糖酶(Man7)在作为活性酶蛋白添加时，具有明显更
好的去污性能。与市售细菌甘露聚糖酶相比，Man6得到了至少相似的性能。
好的去污性能。与市售细菌甘露聚糖酶相比，Man6得到了至少相似的性能。
[0286] 实施例11：与市售液体洗涤剂一起使用时，Man14甘露聚糖酶的去污性能
[0287] 对于在芽孢杆菌中生成的Man14甘露聚糖酶(如实施例5中所述)，在40℃和16°dH的水硬度下，测试了它们与市售重垢液体洗涤剂B一起使用时的去除甘露聚糖酶敏感性标准污渍的能力，并与市售甘露聚糖酶制剂 4.0L(诺维信公司)进行比较。测试系统类似于实施例9中所述，但是使用了来自Center for test material B.V.(荷兰)的两种不同的人工污染的测试布：带对甘露聚糖酶敏感的巧克力布丁的棉布(E-165)、以及带刺槐豆胶和颜料的棉布(C-S-73)。市售重垢液体洗涤剂B以每升洗涤水5g的浓度使用，洗涤水的pH值约为8.3。将蛋白酶 16L(0.5w/w％)和淀粉酶 12L(0.4w/w％)加入用
于测试的硬水中，因为洗涤剂不含任何酶。
于测试的硬水中，因为洗涤剂不含任何酶。
[0288] 测量处理后的小样布的颜色，并将结果计算为实施例9中所述的每两种污渍的ΔL*的总和。
[0289] 用市售的含液体的洗涤剂得到的结果(图11-12)表明，与市售产品相比，在作为活性单位或作为活性酶蛋白添加时，Man14在液体洗涤剂中具有良好的性能。
[0290] 实施例12：Man6和Man7甘露聚糖酶在市售液体洗涤剂中的稳定性
[0291] 在从当地超市获得的OMO Color液体中测试在芽孢杆菌中生成的Man6和Man7甘露聚糖酶制剂的稳定性，并与市售甘露聚糖酶制剂 4.0L进行比较。将0.5％w/w-％甘露聚糖酶制剂加入洗涤剂，样品在带有帽的塑料管中在37℃下培养5个星期。除了使用30分钟的培养时间外，通过在实施例7中描述的活性测定法以一定间隔测量了活性。结果计算为残余活性(％)，通过将在特定时间点取得的样品的活性除以样品的初始活性获得。
[0292] 还是在含有蛋白酶但不含甘露聚糖酶的市售液体重垢洗涤剂A中，对分别在芽孢杆菌和木霉属中生成的Man7以及在木霉属中生成的Man6的稳定性进行了测试，并与4.0L相对照。在该试验中，使用1％-(w/w)的甘露聚糖酶，样品在37℃下培养12
个星期。
个星期。
[0293] Omo Color中的结果(图13)表明，与 4.0L相比，Man6具有比它好得多的稳定性，而Man7具有与它相似的稳定性。在与另一种市售液体洗涤剂A一起使用时，Man7和Man6(尤其是Man6)均比 4.0L更稳定，如图14所示。在相同条件下在另一个测试
中获得的结果表明，不管表达宿主是芽孢杆菌还是木霉属，Man6都具有相似的稳定性(数据未示出)。
中获得的结果表明，不管表达宿主是芽孢杆菌还是木霉属，Man6都具有相似的稳定性(数据未示出)。
[0294] 稳定性实验的结果表明，即使在诸如37℃的高温下储存，根据本发明的甘露聚糖酶在洗涤剂中也稳定数个星期。与市售的液体洗涤剂中的细菌甘露聚糖酶相比，根据本发明的甘露聚糖酶(Man6和Man7)的稳定性提高了。
[0295] 实施例13：在肉鸡中单独使用和与非淀粉多糖(NSP)降解酶组合使用甘露聚糖酶的效率研究
[0296] 研究了本发明的重组甘露聚糖酶对肉鸡生长的影响。将包含重组甘露聚糖酶的发酵液的超滤液干燥，并以目标水平单独或与市售的基于木聚糖酶的产品组合用于颗粒状肉鸡日粮。
[0297] 在没有酶的情况下、或者在通过单独添加或与标准剂量的市售木聚糖酶组合添加不同水平的本发明的重组甘露聚糖酶的情况下，饲喂基于玉米和去壳的用溶剂萃取的大豆粉的对照日粮。
[0298] 肉鸡的初始重量在30g至50g之间。试验持续三到五个星期。每次处理包括至少6次重复，每次10只肉鸡。在每种情况下，分析饮食中的水分、粗蛋白、粗纤维、脂肪、灰分和酶蛋白。
[0299] 准备了五种日粮：
[0300] 1)不含添加的对照(基础日粮BD)
[0301] 2)BD+甘露聚糖酶1-500mg/kg
[0302] 3)BD+甘露聚糖酶1-1000mg/kg
[0303] 4)BD+甘露聚糖酶1-500mg/kg+木聚糖酶1-10mg/kg
[0304] 5)BD+木聚糖酶1-10mg/kg
[0305] 每天通过目测检查动物的健康状况和死亡率。在第0、14和35天测量体重增加(BW)、进食量(F1)和饲料转化率(FCR)。FCR计算为消耗的总饲料除以同一时期的体重增加。基于与饲喂相同日粮或饲喂相同日粮但添加了木聚糖酶的那些动物进行比较，确定重组甘露聚糖酶的效果。
[0306] 实施例14：速溶咖啡生产
[0307] 纯的甘露聚糖是咖啡胚乳中的主要储存多糖成分，并为其带来高粘度，这对速溶咖啡的技术加工产生负面影响并且增加干燥期间的能量消耗。这些效果归因于甘露聚糖形成坚硬的、不能溶解的晶体结构，在速溶咖啡生产的浓缩步骤中加入β-甘露聚糖酶(通常与其它酶如果胶酶和纤维素酶一起加入)，以降低咖啡提取物中的粘度。甘露聚糖酶也用于水解液体咖啡提取物中存在的半乳甘露聚糖，以抑制速溶咖啡冷冻干燥过程中的凝胶形成。此外，由于酶处理的使用，咖啡豆提取物可以通过低成本程序比如蒸发进行浓缩。
[0308] 根据下面图15的流程图以10℃温度和0.15％d.s.的酶剂量下进行测试。
[0309] 在包含不同酶(比如果胶酶和纤维素酶)的混合物中测试本发明的甘露聚糖酶。
[0310] 在标准工艺条件下，咖啡提取物的粘度随时间显着增加。然而，使用含有本发明甘露聚糖酶的酶混合物显著降低了粘度，从而改进了下游加工，例如喷雾或冷冻干燥。
[0311] 实施例15：菠萝加工
[0312] 特别地，甘露聚糖酶可用于菠萝榨汁提取和澄清，因为菠萝含有比例较大的甘露聚糖，包括葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖。
[0313] 甘露聚糖酶有助于改善有价值的水果成分的提取，在浓缩前降低果汁的粘度，并提高过滤速率和最终产品的稳定性。
[0314] 在绞肉机中将菠萝压碎，并将500g果糊加入1000ml烧杯中。在21℃下施加酶，反应时间为60分钟。然后根据挤压规程用小型Hafico压机挤压果糊：0巴2分钟-50巴2分钟-100巴2分钟-150巴2分钟-200巴1分钟-300巴1分钟-400巴1分钟。然后，将获得的果汁以4500rpm离心5分钟，分析浊度和粘度。
[0315] 在酶混合物A、B和C中测试本发明的甘露聚糖酶(表10)。
[0316] 在加入菠萝果糊之前，首先将酶用自来水稀释。
[0317] 表10：酶混合物
[0318]
[0319] 应用本发明的甘露聚糖酶可以提高菠萝加工中果汁的产量并降低浊度。
[0320] 实施例16：甘露聚糖酶处理大豆，用于豆浆生产
[0321] 对于为了获得豆浆的大豆的酶处理，通常使用“热工艺”。对于热豆浆工艺，将干燥的大豆混合并在混合器中用沸腾自来水以1:7(浸泡的豆：水)的比例粉碎。在加入酶之前，将整个大豆浆液冷却至50℃-55℃。大豆浆液的pH值应在pH6.5附近，并可用NaHCO3调节。以1kg/t干燥大豆的剂量，将甘露聚糖酶加入浆液中，并搅拌30分钟。在反应时间结束后，使用实验室压机挤压浆液以获得最终产品：豆浆。为了确保相同的挤压曲线，规定压力以及相应的挤压时间，如表11所示。除了用于酶促反应的样品外，还制备不含任何酶的对照样品，其中酶溶液被水替代。
[0322] 表11：压榨方案
[0323] 压强[巴] 0 50 100 300时间[分钟] 2 2 2 1
[0325] 豆浆分析：
[0326] ·以克/时间为单位的产量
[0327] ·用折光仪测定白利糖度，它与豆浆中的糖含量直接相关
[0328] ·用NTU光度计测量果汁的浊度，NTU光度计测量比浊法浊度
[0329] ·通过LAB测量法测量亮度
[0330] ·用CN分析仪测定蛋白质含量(燃烧法)
[0331] ·味道
[0332] 用本发明的甘露聚糖酶处理的豆浆显示出产量增加，颜色更白，白利糖度增加，浊度更低，蛋白质含量更高，味道更好(去除了异味)。
[0333] 实施例17：根据本发明的液体洗涤剂组合物的洗涤性能
[0334] 通过使用可从CFT(Center for Testmaterials)B.V.，Vlaardingen，荷兰(“CFT”)， Material-und Prüfanstalt Testmaterialien AG(联邦材料和测试机构，Testmaterials)，St.Gallen，瑞士(“EMPA”)和Warwick Equest公司，Unit 55，Consett Business Park，Consett，County Durham(“Equest”)获得的标准化污渍，确定根据本发明的液体洗涤剂组合物的洗涤性能。
[0335] 使用具有下列组成的液体清洗剂作为基础配方(所有值为重量百分比)：
[0336] 表12
[0337]
[0338] 洗涤剂组合物的pH值在8.2-8.6之间。
[0339] 基于该基础配方，通过添加如下所示的各种酶来制备液体洗涤剂组合物1和2：
[0340] 组合物1：根据SEQ ID NO:12(Man6)的酶
[0341] 组合物2：根据SEQ ID NO:16(Man7)的酶
[0343] 基于总蛋白质含量，以相同的量添加所有甘露聚糖酶。
[0344] 液体洗涤剂的剂量比为每升洗涤水4.0克。洗涤程序为在20℃和40℃的温度下进行60分钟，水的硬度在15.5°到16.5°(德国硬度)之间。
[0345] 得到的结果是用洗涤剂得到的缓解单位(remission unit)和用含有市售参比甘露聚糖酶(Mannaway 4.0L，获自诺维信公司)的洗涤剂得到的缓解单位之间的差值。因此，正的值表示与包含参比甘露聚糖酶的相同洗涤剂组合物相比，包含本发明的甘露聚糖酶的洗涤剂组合物的洗涤性能得到改善。在洗涤测试中，测试了大范围的污渍。
[0346] 白度，即污渍变得亮白，通过光度法测定，作为洗涤性能的指标。使用Minolta CM508d光谱仪装置，事先使用随装置提供的白色标准进行校准。
[0347] 得到的结果是用洗涤剂得到的缓解单位和用含有酶组合的洗涤剂得到的缓解单位之间的差值。因此，正的值表示洗涤性能因洗涤剂中存在酶组合而得到改善。洗涤剂组合物中的本发明的甘露聚糖酶对于各种含有甘露聚糖的污渍都显示出性能改善。
[0348] 表13
[0349]
[0350] 例18：根据本发明的粉末洗涤剂组合物的洗涤性能
[0351] 通过使用可从CFT(Center for Testmaterials)B.V.，Vlaardingen，荷兰(“CFT”)， Material-und Prüfanstalt Testmaterialien AG(联邦材料和测试机构，Testmaterials)，St.Gallen，瑞士(“EMPA”)和Warwick Equest公司，Unit 55，Consett Business Park，Consett，County Durham(“Equest”)获得的标准化污渍，确定根据本发明的粉末洗涤剂组合物的洗涤性能。
[0352] 使用具有下列组成的固体清洗剂作为基础配方(所有值为重量百分比)：
[0353] 表14
[0354]
[0355] 基于该基础配方，通过添加如下所示的各种酶制备固体洗涤剂组合物3和4：
[0356] 组合物3：根据SEQ ID NO:12(Man6)的酶
[0357] 组合物4：根据SEQ ID NO:16(Man7)的酶
[0358] 根据AISE方法如下进行洗涤：3.5kg清洁压载布，4个SBL布，Miele洗衣机，20℃和40℃短程序。基于总蛋白质含量，以相同的量添加所有甘露聚糖酶。
[0359] 粉末洗涤剂的剂量比为每升洗涤水3.8克。洗涤剂的组成列于表14中。洗涤程序为在20℃和40℃的温度下进行60分钟，水的硬度在15.5°到16.5°(德国硬度)之间。
[0360] 白度，即污渍变得亮白，通过光度法测定，作为洗涤性能的指标。使用Minolta CM508d光谱仪装置，事先使用随装置提供的白色标准进行校准。
[0361] 得到的结果是用洗涤剂得到的缓解单位和用含有参比甘露聚糖酶(Mannaway 4.0L，获自诺维信公司)的洗涤剂得到的缓解单位之间的差值。因此，正的值表示洗涤剂中的甘露聚糖酶的洗涤性能得到改善。本发明的甘露聚糖酶对表15中的几种污渍都显示出性能改善。因此，很显然，根据本发明的甘露聚糖酶与Mannaway相比显示出洗涤性能改善。
[0362] 表15：20/40℃粉末
[0363]
[0364] 在不限制专利权利要求的范围和解释的情况下，以下列出了本文公开的一个或多个方面或实施方式的某些技术效果。一个技术效果是甘露聚糖的降解或改性。另一技术效果是提供具有良好储存稳定性的甘露聚糖酶。
[0365] 前面的描述通过本发明的特定实现方式和实施方式的非限制性示例的方式，提供了发明人目前想到的用于实现本发明的最佳模式的完整且信息丰富的描述。然而，对于本领域技术人员来说清楚的是，本发明不限于上面举出的实施方式的细节，而是可以在不脱离本发明的特征的情况下使用等同手段在其它实施方式中实现它。
[0366] 而且，可以有利地使用本发明的上面公开的方面和实施方式的一些特征而无需相应地使用其它特征。因此，前面的描述应该被认为仅仅是对本发明原理的说明，而不是对其的限制。因此，本发明的范围仅受所附专利权利要求的限制。
[0367] 在一个实施方式中，本发明组合物的至少一种组分，与衍生出该至少一种组分的相应天然组分相比，具有不同的化学、结构或物理特性。在一个实施方式中，所述特性是以下项目中的至少一种：大小均匀、分散均匀、异构体不同、密码子简并性不同、翻译后修饰不同、甲基化不同、三级或四级结构不同、酶活性不同、亲和力不同、结合活性不同、以及免疫原性不同。
[0368] 参考文献：
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