甘露聚糖酶变体
阅读：255发布：2020-05-08
专利汇可以提供甘露聚糖酶变体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 说明书 涉及甘露聚糖酶的变体、包含所述变体的组合物、其产生方法以及使用所述变体降解和修饰含有甘露聚糖的材料的方法。，下面是甘露聚糖酶变体专利的具体信息内容。
1.甘露聚糖酶的变体，其在对应于位置123、158、180、272、307或316的位置处包含至少一个氨基酸取代，其中所述变体具有甘露聚糖酶活性且选自：
1)与SEQ ID NO: 2的残基27-331具有至少85%序列同一性的多肽；
2)由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸在高度严格条件下与以下杂交：
a) SEQ ID NO:1 (man7)的核苷酸79-993，或
b) a)的全长互补物；和
3)由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其基因组DNA序列具有至少
95%序列同一性；
且其中氨基酸编号对应于含有信号序列的SEQ ID NO:2 (Man7)全长氨基酸序列的氨基酸编号。
2.权利要求1的变体，其在位置M123、A158、F180、G272、T307或L316或其组合处包含至少一个另外的取代。
3.权利要求1或2的变体，其包含至少一组以下位置处的取代：
M123和G272；或
A158和T307；或
L316；或
T307；或
M123、A158和T307；或
M123和L316；
A158、T307和L316；
F180和L316；或
M123、A158、G272、T307和L316；
或其组合。
4.权利要求1-3的变体，其中所述取代导致所述变体的稳定性提高。
5.权利要求1-4的变体，其包含至少一个选自以下的额外取代：
防止N283的糖基化的取代；
283或285的取代；或
N283、T285或S285的取代；或
T285或S285取代为除了T或S以外的残基
T285或S285取代为残基A。
6.权利要求5的变体，其中当在能够进行N-连接的糖基化的宿主细胞中产生时，所述额外取代导致所述变体的糖基化改变。
7.酶组合物，其包含权利要求1-6中任一项的变体和
a.至少一种防腐剂，所述防腐剂例如选自有机酸、柠檬酸、抗坏血酸、苯甲酸及其盐和衍生物、苯甲酸钠、苯甲酸盐/酯、羟基苯甲酸盐/酯和衍生物、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸盐/酯、盐诸如氯化钠或氯化钾、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)或其组合；
b.任选地，至少一种稳定剂，所述稳定剂选自多元醇、丙二醇、聚乙二醇、己二醇、甘油、糖、糖醇、多糖、乳酸、硼酸、硼酸衍生物、芳族硼酸酯、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸衍生物、肽、表面活性剂或其组合；
c. 任选地，至少一种酶，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质，或其组合；和
d.任选地，至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
8.权利要求7的酶组合物，其呈液体组合物或固体组合物、诸如溶液、分散体、糊剂、粉末、微粒、颗粒、包衣颗粒、片剂、饼、晶体、晶浆、凝胶或丸粒的形式。
9.洗涤剂组合物，其包含权利要求1-6中任一项的甘露聚糖酶的变体或权利要求7-8的酶组合物。
10.权利要求9的洗涤剂组合物，其呈液体洗涤剂或固体洗涤剂的形式，优选呈条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或多个隔室的小袋、普通或致密粉末、微粒、颗粒、糊剂、凝胶或普通、致密或浓缩液体的形式。
11.权利要求9或10的洗涤剂组合物，其进一步包含一种或多种额外的酶，所述酶选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、酯酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、DNA酶和/或过氧化物酶，优选选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。
12.包含遗传元件的重组宿主细胞，所述遗传元件允许产生至少一种包含权利要求1-6的变体的重组多肽。
13.权利要求12的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：
真菌细胞，
丝状真菌细胞，其来自子囊菌门(Division Ascomycota)，盘菌亚门(Subdivision Pezizomycotina)；优选来自由粪壳菌纲(Class Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Subclass Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和小囊菌目(Microascales)以及曲霉属(Aspergillus)、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属(Humicola)的成员组成的组；
更优选来自由肉座菌科(Hypocreacea)、丛赤壳科(Nectriaceae)、麦角菌科
(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma) (无性型肉座菌属(anamorph of Hypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属
(Cephalosporium)和赛多孢子菌属(Scedosporium)组成的组；
更优选来自由里氏木霉(Trichoderma reesei) (红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、柠檬绿木霉(T. citrinoviridae)、长枝木霉(T. longibrachiatum)、绿木霉(T. virens)、哈茨木霉(T. harzianum)、棘孢木霉(T. asperellum)、深绿木霉(T. atroviridae)、近里氏木霉(T. parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾本镰孢霉(F. gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F. pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F. venenatum)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、串珠赤霉(G. moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G. zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria (Haematonectria) haematococca)、纸葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、S. chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(M. anisopliae)、稻绿核菌(Villosiclava virens)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)(Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum)和尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)和黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)组成的组，
细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌诸如枯草芽孢杆菌(B. Subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)，革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌(Escherichia coli)，放线菌目诸如链霉菌属(Streptomyces sp.)，和
酵母，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，
最优选里氏木霉或芽孢杆菌属。
14.权利要求12-13的重组宿主细胞，其中所述重组多肽是融合蛋白，除了拥有具有甘露聚糖酶活性的氨基酸序列以外，所述融合蛋白还包含以下中的至少一种：
提供分泌信号序列的氨基酸序列；
便于纯化的氨基酸序列，诸如亲和标签或His-标签；
增强产生的氨基酸序列，诸如作为载体的氨基酸序列，诸如CBM；
具有酶活性的氨基酸序列；和
提供具有结合亲和力的融合蛋白的氨基酸序列，诸如碳水化合物结合部分。
15.用于产生包含甘露聚糖酶的变体的重组多肽的方法，其包括：
a. 培养权利要求12-14的重组宿主细胞，其中
所述遗传元件包含至少一个控制序列，其控制所述重组宿主细胞中的所述重组多肽的产生；
所述遗传元件任选地包含至少一个编码信号序列的序列，所述信号序列用于将所述重组多肽转运到所述宿主细胞外部；和
在允许产生所述重组多肽的条件下实施培养；和
b. 回收所述重组多肽。
16.用于降解或修饰含有甘露聚糖的材料的方法，其包括用有效量的权利要求7-8的酶组合物或权利要求1-6的变体处理所述含有甘露聚糖的材料。
17.权利要求16的方法，其中所述含有甘露聚糖的材料是基于植物的材料、纺织品、废水、污水、油或其组合。
18.动物饲料，其包含权利要求7-8的酶组合物或权利要求1-6中任一项的甘露聚糖酶的变体，和至少一种植物起源的蛋白来源或含有甘露聚糖的产物或副产物，和a. 任选地，至少一种酶，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b. 任选地，至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
19.饲料补充剂，其包含权利要求7-8的酶组合物或权利要求1-6中任一项的甘露聚糖酶的变体；和
a.任选地，至少一种酶，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b.任选地，至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
20.权利要求1-6的变体或权利要求7-8的酶组合物在石油钻井或水力压裂中的用途。
21.权利要求1-6的变体或权利要求7-8的酶组合物在处理咖啡提取物、果汁、菠萝汁或豆奶中的用途。
甘露聚糖酶变体
发明领域
[0001] 本发明涉及甘露聚糖酶的变体。所述变体在其中期望降解或修饰甘露聚糖的工业应用中，诸如在洗衣和清洁应用中，在饲料、食品、纸浆和纸张以及石油工业中，是有用的。本发明还提供了有用的甘露聚糖酶、编码这些酶的多核苷酸、酶组合物及其生产和使用方法。
[0002] 背景甘露聚糖是在各种植物中发现的含有甘露糖的多糖。甘露聚糖在水环境中溶解性差，
并且其物理化学特性引起粘性分散。此外，甘露聚糖具有高的水结合能力。所有这些特性在几个行业(包括酿造、烘焙、动物营养以及洗衣和清洁应用)中引起问题。
并且其物理化学特性引起粘性分散。此外，甘露聚糖具有高的水结合能力。所有这些特性在几个行业(包括酿造、烘焙、动物营养以及洗衣和清洁应用)中引起问题。
[0003] 在基于植物的膳食中，存在不同的β-甘露聚糖，并且根据它们的量和特性，它们可以损害营养物消化、微生物定植和生长性能。甘露聚糖的酶促降解降低高水溶性甘露聚糖的消化化粘度(digesta viscosity)，并导致甘露寡糖的产生，所述甘露寡糖可形成豆科植物中存在的水不溶性的线性甘露聚糖。甘露聚糖酶增加所有单胃动物中的平均日增重、饲料效率、重量均匀度和存活率。
[0004] 对于动物饲料应用(诸如含谷物膳食的单胃动物的饲料)，甘露聚糖是肠内容物的粘度的促进因素，且其由此负面影响饲料可消化性和动物生长速率。对于反刍动物，甘露聚糖代表纤维摄入的主要组分，并且甘露聚糖的更完全消化将有利于较高的饲料转化效率。
[0005] 对于洗衣和清洁应用，包含甘露聚糖酶的酶组合物可用于降解甘露聚糖。然而，提供在变化的储存和使用条件下是稳定的、同时仍然显示良好的甘露聚糖降解活性的甘露聚糖酶是困难的。
[0006] 工业酶的稳定性是重要的特性，因为所述酶经常在与所述酶的天然环境非常不同的条件下使用。经常，在初始测试中显示良好性能的野生型酶不适用于以工业规模生产，或者在典型的应用或储存条件下不稳定。
[0007] 蛋白的N-连接的糖基化是一种类型的翻译后修饰，其中称为聚糖的糖分子寡糖附接至蛋白的天冬酰胺(Asn，N)残基的酰胺氮基团。这种类型的连接对于酶和其他蛋白的结构和功能两者是重要的。
[0008] 本发明的一个目的是提供在应用于不同的工业过程中时具有提高的稳定性且表现出甘露聚糖酶活性的甘露聚糖酶的变体，以及用于甘露聚糖降解或修饰的酶组合物。
[0009] 概述根据第一个方面，提供了甘露聚糖酶的变体，其在对应于位置123、158、180、272、307或
316的位置处包含至少一个氨基酸取代，其中所述变体具有甘露聚糖酶活性且选自：
1)与SEQ ID NO: 2的残基27-331具有至少85%序列同一性的多肽；
2)由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸在高度严格条件下与以下杂交：
a) SEQ ID NO:1 (man7)的核苷酸79-993，或
b) a)的全长互补物；和
3)由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其基因组DNA序列具有至少
95%序列同一性；
且其中氨基酸编号对应于含有信号序列的SEQ ID NO:2 (Man7)全长氨基酸序列的氨
基酸编号。
316的位置处包含至少一个氨基酸取代，其中所述变体具有甘露聚糖酶活性且选自：
1)与SEQ ID NO: 2的残基27-331具有至少85%序列同一性的多肽；
2)由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸在高度严格条件下与以下杂交：
a) SEQ ID NO:1 (man7)的核苷酸79-993，或
b) a)的全长互补物；和
3)由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其基因组DNA序列具有至少
95%序列同一性；
且其中氨基酸编号对应于含有信号序列的SEQ ID NO:2 (Man7)全长氨基酸序列的氨
基酸编号。
[0010] 本发明的甘露聚糖酶的变体在具有良好的稳定性和甘露聚糖酶活性方面是有利的。所述变体在洗涤剂中且特别是在高温下具有提高的稳定性。因此，本发明的甘露聚糖酶的变体可在生产中提供提高的收率并且在使用中提供更好的性能。所述变体在洗涤剂中和在其中使用甘露聚糖降解的应用(诸如在洗衣洗涤剂中)中通常使用的温度下的稳定性特别好。
[0011] 在一个实施方案中，所述变体具有至少两个取代。这有利于进一步提高在洗涤剂中和在高温下的使用中的稳定性。或者，可以选择两个取代，使得除了稳定性以外，还改进所述变体的另一种特性。
[0012] 根据本发明的第二个方面，提供了酶组合物，其包含第一个方面的甘露聚糖酶的变体和a. 至少一种防腐剂，所述防腐剂例如选自有机酸、柠檬酸、抗坏血酸、苯甲酸及其盐和衍生物、苯甲酸钠、苯甲酸盐/酯、羟基苯甲酸盐/酯和衍生物、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸盐/酯、盐诸如氯化钠或氯化钾、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)或其组合；
b.任选地，至少一种稳定剂，所述稳定剂选自多元醇、丙二醇、聚乙二醇、己二醇、甘油、糖、糖醇、多糖、乳酸、硼酸、硼酸衍生物、芳族硼酸酯、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸衍生物、肽、表面活性剂或其组合；
c. 任选地，至少一种酶，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质，或其组合；和
d.任选地，至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
b.任选地，至少一种稳定剂，所述稳定剂选自多元醇、丙二醇、聚乙二醇、己二醇、甘油、糖、糖醇、多糖、乳酸、硼酸、硼酸衍生物、芳族硼酸酯、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸衍生物、肽、表面活性剂或其组合；
c. 任选地，至少一种酶，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质，或其组合；和
d.任选地，至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
[0013] 如实施例所证明，根据本发明的酶组合物中包含的变体具有允许在重组宿主细胞中产生并使它们可用于工业应用的酶组合物中的结构和特性。所述酶组合物对于洗涤剂制剂特别好，因为甘露聚糖酶的变体当在洗衣和洗涤应用中用来降解甘露聚糖时具有良好的稳定性、洗涤性能和比活性。
[0014] 根据第三个方面，提供了包含第一个方面的甘露聚糖酶的变体或第二个方面的酶组合物的洗涤剂组合物。
[0015] 本发明的洗涤剂组合物是有利的，因为其在除去含有甘露聚糖的污点中是稳定、有效且经济的。
[0016] 根据另一个方面，提供了本发明的酶组合物或本发明的甘露聚糖酶的变体在洗涤剂中的用途和在洗涤剂中使用本发明的酶组合物或本发明的甘露聚糖酶的变体的方法。
[0017] 根据第四个方面，提供了包含遗传元件的重组宿主细胞，所述遗传元件允许产生至少一种包含第一个方面的甘露聚糖酶的变体的重组多肽。
[0018] 根据第五个方面，提供了用于产生具有甘露聚糖酶活性的重组多肽的方法，且所述方法包括：a. 培养第四个方面的重组宿主细胞，其中
所述遗传元件包含至少一个控制序列，其控制所述重组宿主细胞中的所述重组多肽的
产生；
所述遗传元件任选地包含至少一个编码信号序列的序列，所述信号序列用于将所述重
组多肽转运到所述宿主细胞外部；和
在允许产生所述重组多肽的条件下实施培养；和
b. 回收所述重组多肽。
所述遗传元件包含至少一个控制序列，其控制所述重组宿主细胞中的所述重组多肽的
产生；
所述遗传元件任选地包含至少一个编码信号序列的序列，所述信号序列用于将所述重
组多肽转运到所述宿主细胞外部；和
在允许产生所述重组多肽的条件下实施培养；和
b. 回收所述重组多肽。
[0019] 所述方法提供了产生包含甘露聚糖酶的变体的重组多肽的有效方法。因为所述甘露聚糖酶的变体在重组宿主细胞中产生，因此提供了生产系统，其可以以期望的方式进行优化、定制和控制。由所述方法产生的甘露聚糖酶的变体可以在结构和功能水平上不同于天然甘露聚糖酶。
[0020] 根据另一个方面，提供了酶制剂，其包含具有甘露聚糖酶活性且可通过使用本发明的宿主细胞获得的重组多肽。
[0021] 所述酶制剂或酶组合物可以进一步包含选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶(具有或不具有介质)的其他酶，以及选自稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、漂白剂、介质、抗腐蚀剂、助洗剂、抗再沉积剂、光学增白剂、染料、颜料、香料、腐蚀剂、磨料和防腐剂的合适的添加剂。
[0022] 根据第六个方面，提供了用于降解或修饰含有甘露聚糖的材料的方法，其包括用有效量的本发明的酶组合物或本发明的甘露聚糖酶的变体处理所述含有甘露聚糖的材料。
[0023] 根据第七个方面，提供了动物饲料，其包含本发明的酶组合物或本发明的甘露聚糖酶的变体，和至少一种植物起源的蛋白来源或含有甘露聚糖的产物或副产物，和a. 任选地，至少一种酶，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b. 任选地，至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
b. 任选地，至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
[0024] 根据第八个方面，提供了饲料补充剂，其包含本发明的酶组合物或本发明的甘露聚糖酶的变体；和a.任选地，至少一种酶，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合；和
b.任选地，至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
b.任选地，至少一种填充剂，所述填充剂选自麦芽糖糊精、面粉、盐、氯化钠、硫酸盐、硫酸钠或其组合。
[0025] 与没有所述变体的饲料相比，所述饲料和饲料补充剂提高饲料的营养价值。本发明的酶组合物包含甘露聚糖酶的变体，其具有提高的稳定性。本发明的酶组合物和本发明的变体降解饲料中存在的甘露聚糖，且由此使其更容易被动物消化。特别是对于含有大豆粉的饲料，由酶促消化产生的甘露聚糖-寡糖对肠道微生物具有有利的影响，且因此对动物的性能具有有利的影响。通过包括木聚糖酶来消化基于玉米大豆的膳食中存在的阿拉伯木聚糖，可以增强甘露聚糖酶的变体的作用。本发明的变体还可用于改变湿饲料的流变特性。
[0026] 在一个实施方案中，所述饲料可以包含动物蛋白，诸如肉粉或骨粉。
[0027] 根据另一个方面，提供了本发明的动物饲料或本发明的饲料补充剂在以下中的用途和在以下中使用本发明的动物饲料或本发明的饲料补充剂的方法：a.饲喂动物；
b.提高动物的增重。
b.提高动物的增重。
[0028] 在一个实施方案中，所述动物是单胃动物或反刍动物。在另一个实施方案中，所述动物是肉鸡、蛋鸡、猪、火鸡或水产养殖生物诸如鱼。在另一个实施方案中，所述动物是反刍动物。
[0029] 根据第九个方面，提供了本发明的变体或本发明的酶组合物在石油钻井或水力压裂中的用途和在石油钻井或水力压裂中使用本发明的变体或本发明的酶组合物的方法。
[0030] 本发明的酶组合物和本发明的变体在改变石油钻井流体和水力压裂流体的流变特性和提高石油回收率方面是有利的。
[0031] 根据第十个方面，提供了本发明的变体或本发明的酶组合物在处理咖啡提取物、果汁、菠萝汁或豆奶中的用途和在处理咖啡提取物、果汁、菠萝汁或豆奶中使用本发明的变体或本发明的酶组合物的方法。
[0032] 使用本发明的变体和本发明的酶组合物在处理咖啡提取物中是有利的，因为其降低咖啡提取物的粘度。
[0033] 使用本发明的变体和本发明的酶组合物在处理和制造果汁中是有利的，因为其降低粘度并提高过滤速率、稳定性并有助于提取水果组分。
[0035] 在另一个方面，提供了编码本发明的甘露聚糖酶的变体的核酸分子。
[0036] 在另一个方面，提供了包含本发明的核酸分子的载体。
[0037] 在另一个方面，提供了本发明的甘露聚糖酶的变体的功能片段，和编码其的多核苷酸。
[0038] 在另一个方面，本文公开的涉及编码本发明的甘露聚糖酶的多核苷酸序列的序列信息可用作鉴定其他同源甘露聚糖酶的工具。例如，聚合酶链式反应(PCR)可用于从各种生物来源扩增编码其他同源甘露聚糖酶的序列。此外，基因组挖掘方法可用于从基因组数据库鉴定编码其他同源甘露聚糖酶的序列。
[0040] 图2示意性显示在里氏木霉的转化中使用的表达盒。
[0041] 图3A-B描述在40℃、16°dH、60min、pH近似8.3和作为每洗液的活性单位(MNU)给予的酶下，在4.4 g/l的商业重型液体洗涤剂A存在的情况下，变体和野生型Man7 (在木霉属中产生)的作为亮度的增加(3个污点的ΔL*的总和)的污点除去性能。
[0042] 图3A显示变体TBH1、TBH2、TBH3、TBH4、TBH5、TBH6、TBH7、TBH8、TBH9和野生型。
[0043] 图3B显示变体TBH6、TBH10、TBH11和野生型。
[0044] 图4A-B描述在40℃、16°dH、60min、pH近似10和作为每洗液的活性单位(MNU)给予的酶下，在3.8 g/l的商业颜色洗涤剂粉末存在的情况下，变体和野生型Man7 (在木霉属中产生)的作为亮度的增加(3个污点的ΔL*的总和)的污点除去性能。
[0045] 图4A显示变体TBH1、TBH2、TBH3、TBH4、TBH5、TBH6、TBH7、TBH8、TBH9和野生型。
[0046] 图4B显示变体TBH6、TBH10、TBH11和野生型。
[0047] 图5描述了在40℃、16°dH、60min、pH近似9.5和作为每洗液的活性单位(MNU)给予的酶下，在3.8 g/l的商业漂白洗涤剂粉末存在的情况下，变体TBH1、TBH2、TBH3、TBH4、TBH5、TBH6、TBH7、TBH8、TBH9和野生型Man7 (在木霉属中产生)的作为亮度的增加(3个污点的ΔL*的总和)的污点除去性能。
[0048] 图6描述在40℃、16°dH、60min、pH近似8.3和作为每洗液的活性单位(MNU)给予的酶下，在4.4 g/l的商业重型液体洗涤剂A存在的情况下，变体BH18、BH21、BH23、BH24、BH25和野生型Man7 (在芽孢杆菌属中产生)的作为亮度的增加(3个污点的ΔL*的总和)的污点除去性能。
[0049] 图7描述在40℃、16°dH、60min、pH近似10和作为每洗液的活性单位(MNU)给予的酶下，在3.8 g/l的商业颜色洗涤剂粉末存在的情况下，变体BH18、BH21、BH23、BH24、BH25和野生型Man7 (在芽孢杆菌属中产生)的作为亮度的增加(3个污点的ΔL*的总和)的污点除去性能。
[0050] 图8描述在40℃、16°dH、60min、pH近似9.5和作为每洗液的活性单位(MNU)给予的酶下，在3.8 g/l的商业漂白洗涤剂粉末存在的情况下，变体BH18、BH21、BH23、BH24、BH25和野生型Man7 (在芽孢杆菌属中产生)的作为亮度的增加(3个污点的ΔL*的总和)的污点除去性能。
[0051] 图9显示与在木霉属中产生的野生型酶相比，变体TBH6在商业重型液体洗涤剂中在37℃下的稳定性。
[0052] 图10显示与在芽孢杆菌属中产生的野生型酶相比，变体BH25在商业重型液体洗涤剂中在37℃下的稳定性。
[0053] 图11A-B显示在木霉属中产生的变体和野生型在商业重型液体洗涤剂中在50℃下且持续7天的稳定性。
[0054] 图11A显示变体TBH1、TBH2、TBH3、TBH4、TBH5、TBH6、TBH7、TBH8、TBH9和野生型。
[0055] 图11B显示变体TBH6、TBH10、TBH11和野生型。
[0056] 图12显示涉及使用本发明的甘露聚糖酶变体的速溶咖啡生产的流程图。
[0057] 图13显示组合变体TBH14 (TBH5和TBH6的组合)与变体TBH5和TBH6相比在商业重型液体洗涤剂中在50℃下且持续7天的稳定性。
[0058] 保藏物根据关于国际承认用于专利程序的目的的微生物保藏的布达佩斯条约，进行以下菌株
保藏：
大肠杆菌菌株RF12379(包括质粒pALK4434)在2017年3月2日保藏在德国微生物和细胞
培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM 32425。
保藏：
大肠杆菌菌株RF12379(包括质粒pALK4434)在2017年3月2日保藏在德国微生物和细胞
培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM 32425。
[0059] 大肠杆菌菌株RF12380(包括质粒pALK4435)在2017年3月2日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM
32426。
32426。
[0060] 大肠杆菌菌株RF12381(包括质粒pALK4436)在2017年3月2日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM
32427。
32427。
[0061] 大肠杆菌菌株RF12382(包括质粒pALK4437)在2017年3月2日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM
32428。
32428。
[0062] 大肠杆菌菌株RF12383(包括质粒pALK4438)在2017年3月2日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM
32429。
32429。
[0063] 大肠杆菌菌株RF12384(包括质粒pALK4439)在2017年3月2日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM
32430。
32430。
[0064] 大肠杆菌菌株RF12385(包括质粒pALK4440)在2017年3月2日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM
32431。
32431。
[0065] 大肠杆菌菌株RF12386(包括质粒pALK4441)在2017年3月2日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM
32432。
32432。
[0066] 大肠杆菌菌株RF12387(包括质粒pALK4442)在2017年3月2日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM
32433。
32433。
[0067] 大肠杆菌菌株RF12456(包括质粒pALK4432)在2017年5月18日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM 32518。
[0068] 大肠杆菌菌株RF12457(包括质粒pALK4433)在2017年5月18日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Inhoffenstrasse 7 b, D-38124 Braunschweig, 德国，并分配登记号DSM 32519。
[0069] 序列表SEQ ID NO: 1 man7的DNA序列
SEQ ID NO: 2 Man7的全长氨基酸序列
SEQ ID NO: 3 Man7的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 4 Man7的核心氨基酸序列，无CMB
SEQ ID NO: 5 变体tbh1的合成基因序列
SEQ ID NO: 6 变体TBH1的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 7 变体tbh2的合成基因序列
SEQ ID NO: 8 变体TBH2的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 9 变体tbh3的合成基因序列
SEQ ID NO: 10 变体TBH3的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 11 变体tbh4的合成基因序列
SEQ ID NO: 12 变体TBH4的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 13 变体tbh5的合成基因序列
SEQ ID NO: 14 变体TBH5的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 15 变体tbh6的合成基因序列
SEQ ID NO: 16 变体TBH6的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 17 变体tbh7的合成基因序列
SEQ ID NO: 18 变体TBH7的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 19 变体tbh8的合成基因序列
SEQ ID NO: 20 变体TBH8的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 21 变体tbh9的合成基因序列
SEQ ID NO: 22 变体TBH9的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 23 变体tbh10的合成基因序列
SEQ ID NO: 24 变体TBH10的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 25 变体tbh11的合成基因序列
SEQ ID NO: 26 变体TBH11的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:27 变体bh18的DNA序列
SEQ ID NO:28 变体BH18的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:29 变体bh21的DNA序列
SEQ ID NO:30 变体BH21的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:31 变体bh23的DNA序列
SEQ ID NO:32 变体BH23的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:33 变体bh24的DNA序列
SEQ ID NO:34 变体BH24的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:35 变体bh25的DNA序列
SEQ ID NO:36 变体BH25的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:37 寡核苷酸引物Man7_Var1的序列
SEQ ID NO:38 寡核苷酸引物Man7_Var2的序列
SEQ ID NO:39 寡核苷酸引物Man7_Var3的序列
SEQ ID NO:40 寡核苷酸引物Man7_Var4的序列
SEQ ID NO:41 寡核苷酸引物Man7_Var5的序列
SEQ ID NO:42 寡核苷酸引物Man7_Var6的序列
SEQ ID NO:43 寡核苷酸引物Man7_Var7的序列
SEQ ID NO:44 寡核苷酸引物Man7_Var8的序列
SEQ ID NO:45 寡核苷酸引物Man7_Var9的序列
SEQ ID NO:46 寡核苷酸引物Man7_Var10的序列
SEQ ID NO:47 寡核苷酸引物Man7_Var11的序列
SEQ ID NO:48 寡核苷酸引物Man7_Var12的序列。
SEQ ID NO: 2 Man7的全长氨基酸序列
SEQ ID NO: 3 Man7的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 4 Man7的核心氨基酸序列，无CMB
SEQ ID NO: 5 变体tbh1的合成基因序列
SEQ ID NO: 6 变体TBH1的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 7 变体tbh2的合成基因序列
SEQ ID NO: 8 变体TBH2的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 9 变体tbh3的合成基因序列
SEQ ID NO: 10 变体TBH3的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 11 变体tbh4的合成基因序列
SEQ ID NO: 12 变体TBH4的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 13 变体tbh5的合成基因序列
SEQ ID NO: 14 变体TBH5的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 15 变体tbh6的合成基因序列
SEQ ID NO: 16 变体TBH6的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 17 变体tbh7的合成基因序列
SEQ ID NO: 18 变体TBH7的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 19 变体tbh8的合成基因序列
SEQ ID NO: 20 变体TBH8的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 21 变体tbh9的合成基因序列
SEQ ID NO: 22 变体TBH9的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 23 变体tbh10的合成基因序列
SEQ ID NO: 24 变体TBH10的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO: 25 变体tbh11的合成基因序列
SEQ ID NO: 26 变体TBH11的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:27 变体bh18的DNA序列
SEQ ID NO:28 变体BH18的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:29 变体bh21的DNA序列
SEQ ID NO:30 变体BH21的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:31 变体bh23的DNA序列
SEQ ID NO:32 变体BH23的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:33 变体bh24的DNA序列
SEQ ID NO:34 变体BH24的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:35 变体bh25的DNA序列
SEQ ID NO:36 变体BH25的推导的氨基酸序列(成熟)
SEQ ID NO:37 寡核苷酸引物Man7_Var1的序列
SEQ ID NO:38 寡核苷酸引物Man7_Var2的序列
SEQ ID NO:39 寡核苷酸引物Man7_Var3的序列
SEQ ID NO:40 寡核苷酸引物Man7_Var4的序列
SEQ ID NO:41 寡核苷酸引物Man7_Var5的序列
SEQ ID NO:42 寡核苷酸引物Man7_Var6的序列
SEQ ID NO:43 寡核苷酸引物Man7_Var7的序列
SEQ ID NO:44 寡核苷酸引物Man7_Var8的序列
SEQ ID NO:45 寡核苷酸引物Man7_Var9的序列
SEQ ID NO:46 寡核苷酸引物Man7_Var10的序列
SEQ ID NO:47 寡核苷酸引物Man7_Var11的序列
SEQ ID NO:48 寡核苷酸引物Man7_Var12的序列。
[0070] 详述甘露聚糖是指由通过β-1,4-键连接在一起的甘露糖骨架与半乳糖的侧链(其通过α-1,
6-键附接至所述骨架)组成的多糖。甘露聚糖构成基于植物的材料，诸如瓜尔胶和刺槐豆胶。葡甘露聚糖是具有差不过规律交替的β-1,4连接的甘露糖和葡萄糖的骨架的多糖，半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖是具有α-1,6连接的半乳糖侧分支的甘露聚糖和葡甘露聚糖。
6-键附接至所述骨架)组成的多糖。甘露聚糖构成基于植物的材料，诸如瓜尔胶和刺槐豆胶。葡甘露聚糖是具有差不过规律交替的β-1,4连接的甘露糖和葡萄糖的骨架的多糖，半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖是具有α-1,6连接的半乳糖侧分支的甘露聚糖和葡甘露聚糖。
[0071] 术语"功能片段"或"有效片段"意指SEQ ID NO: 2变体的片段或部分，其保留约相同的酶促功能或作用。
[0072] 术语"甘露聚糖酶变体"和“甘露聚糖酶的变体”意指通过定点或随机诱变、插入、取代、缺失、重组和/或任何其他蛋白工程改造方法(其导致甘露聚糖酶的氨基酸序列与亲本甘露聚糖酶(即野生型甘露聚糖酶)不同)获得的任何甘露聚糖酶分子。根据本公开的术语"野生型甘露聚糖酶"、"野生型酶"、"野生型"或“wt”描述了具有自然界中发现的氨基酸序列的甘露聚糖酶或其片段。
[0073] 术语"催化活性"或"活性"定量地描述给定底物在定义的反应条件下的转化。术语"残余活性"被定义为酶在特定组条件下的催化活性与在不同组的条件下的催化活性的比率。因此，残余活性ai由ai=vi/v0给出，其中v表示催化活性的任何量度，且ai *100是以百分比计的相对活性。术语"比活性"定量地描述在定义的反应条件下每酶量的催化活性。
[0075] 如本文所用，术语"甘露聚糖酶"或"半乳甘露聚糖酶"表示一种甘露聚糖酶，其根据本领域中已知的，被定义为甘露聚糖内-1,4-β-甘露糖苷酶，并具有替代名称β-甘露聚糖酶和内-1,4-甘露聚糖酶，且催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键的水解。根据酶命名，将甘露聚糖酶分类为EC 3.2.1.78。
[0076] 如本文所用，“分离的”意指呈自然界中不存在的形式或在自然界中不存在的环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1) 任何非天然存在的物质，(2) 至少部分地从自然界中与之缔合的天然存在的成分中的一种或多种或全部移除的任何物质，包括任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子；(3) 相对于自然界中发现的物质，通过人工修饰的任何物质，诸如变体；或(4) 通过相对于与之天然缔合的其他组分增加或减少该物质的量(例如，在宿主细胞中重组产生；编码该物质的基因的一个或多个拷贝；以及使用对于与编码该物质的基因自然缔合的启动子而言替代的启动子)而修饰的任何物质。在一个实施方案中，本发明的多肽、酶、变体、多核苷酸、宿主细胞或组合物是分离的。
[0077] 如本文所用，术语“包含(comprising)”包括“包括”、“含有”和“包含(comprehending)"的较广泛含义，以及较窄的表述"由...组成"和"仅由...组成"。
[0078] 如本文所用，"变体"意指插入、取代或缺失一个或多个核苷酸/氨基酸或经化学修饰的序列或序列片段(核苷酸或氨基酸)。在一个实施方案中，术语变体也包括重组甘露聚糖酶。
[0079] 如本文所用，"保守氨基酸取代"是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。本领域中已定义具有相似侧链的氨基酸残基家族。在一个实施方案中，本说明书中的保守氨基酸是指以下分组内的氨基酸：疏水的(F W Y H K M I L V A G C)；芳族的(F W Y H)；脂族的(I L V)；极性的(W Y H K R E D C S T N Q)；带电荷的(H K R E D)；带正电荷的(H K R)；带负电荷的(E D)；小的(V C A G S P T N D)；微小的(A G S)。
因此，当氨基酸被同一组内的氨基酸取代时，发生保守的取代。
因此，当氨基酸被同一组内的氨基酸取代时，发生保守的取代。
[0080] 在一个实施方案中，所述取代是用至少一个氨基酸残基、诸如用一个氨基酸、两个氨基酸或三个氨基酸的取代。在一个进一步实施方案中，至少一个氨基酸是Ala。
[0081] 如本文所用，“非-保守氨基酸取代”是其中氨基酸被如上所定义的不同组中的氨基酸取代的氨基酸取代。非-保守取代可能导致一个氨基酸变为另一个具有不同生物化学特性(诸如电荷、疏水性和/或大小)的氨基酸。在一个实施方案中，非-保守取代改变变体的至少一种特性，诸如稳定性、糖基化模式、折叠、结构、活性或亲和力。
[0082] N-连接的糖基化过程在真核生物中发生，但在细菌中很少发生。聚糖残基与蛋白的附接要求识别共有序列。N-连接的聚糖几乎总是附接至作为Asn-X-Ser/Thr共有序列(其中X是除脯氨酸(Pro)外的任何氨基酸)的一部分存在的天冬酰胺(Asn)侧链。本发明人也已经发现，在结构上接近甘露聚糖酶的活性位点的非-糖基化Asn侧链对于获得具有良好的甘露聚糖降解性能的变体是重要的。不受任何理论的束缚，聚糖的糖是极性分子，并且当附接至Asn时，它们位于蛋白的表面上，其引起糖基化的Asn和其附近的结构变化。可以使用在Asn-Xaa-Thr(Ser)共有序列中的Asn或Ser/Thr残基的定点诱变，以防止在本发明的第一个方面的变体中的期望的N-连接的糖基化位点的糖基化。
[0083] 在一个实施方案中，所述变体的氨基酸被如下残基取代，当在能够进行N-连接的糖基化的宿主细胞中表达时，所述残基防止残基283的N-连接的糖基化。
[0084] 在一个实施方案中，本发明的变体包含至少一个Asn-X-Ser/Thr共有序列。
[0085] 在一个实施方案中，本发明的变体包含至少一个Asn-X-Ser/Thr共有序列的位置X中的Pro残基。
[0086] 在一个实施方案中，所述取代是保守的或非-保守的取代。
[0087] 如本文所用，"肽"和"多肽"是包括多个连续聚合的氨基酸残基的氨基酸序列。为了本发明的目的，肽是包括最多达20个氨基酸残基的分子，且多肽包括超过20个氨基酸残基。所述肽或多肽可包括修饰的氨基酸残基、未被密码子编码的天然存在的氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基。如本文所用，"蛋白"可指任何大小的肽或多肽。蛋白可以是酶、蛋白、抗体、膜蛋白、肽激素、调节剂或任何其他蛋白。
[0088] 术语"多核苷酸"表示从5'至3'末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以从天然来源分离，体外合成，或者从天然和合成分子的组合制备。
[0089] 如本文所用，在多聚核酸的上下文中的“修饰”、“修饰的”和类似的术语是指在多核苷酸的编码或非编码区(诸如调控序列、5’非翻译区、3’非翻译区、上调遗传元件、下调遗传元件、增强子、抑制子、启动子、外显子或内含子区域)中的修饰。在一些实施方案中，修饰可以是仅结构的，对多核苷酸的生物效应、作用或功能没有影响。在其他实施方案中，修饰是结构修饰，其提供了多核苷酸的生物效应、作用或功能的变化。这样的修饰可以增强、抑制或改变多核苷酸的生物功能。
[0090] 如本文所用，“同一性”意指两个比对序列之间的氨基酸残基的精确匹配数相对于两个序列中均存在的残基的位置数的百分比。当一个序列具有在另一个序列中没有对应残基的残基时，比对程序允许在比对中的空位，并且该位置不在同一性计算的分母中计数。同一性是用EMBL-EBI网站(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)的成对序列比对工具EMBOSS Needle确定的值。
[0091] 如本文所用，低严格条件意味着对于长度为至少100个核苷酸的探针，对应于遵循标准的Southern印迹程序，在55℃，在5× SSC、0.1 % N-月桂酰肌氨酸、0.02 % SDS、1%封闭试剂(Roche 11 096 176 001)中，在预杂交和杂交下杂交12至24小时的条件。在55℃，使用2X SSC, 0.1% SDS，将载体材料最终洗涤2-3次，每次15分钟。
[0092] 如本文所用，高度严格条件意味着对于长度为至少100个核苷酸的探针，对应于遵循标准的Southern印迹程序，在65℃，在5× SSC、0.1% N-月桂酰肌氨酸、0.02% SDS、1%封闭试剂(Roche 11 096 176 001)中，在预杂交和杂交下杂交12至24小时的条件。在65℃，使用0.1X SSC, 0.1% SDS，将载体材料最终洗涤2-3次，每次15分钟。
[0093] 如本文所用，"宿主细胞"意指易于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导、交配、杂交等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制期间发生的突变而不相同的任何后代。宿主细胞的非限制性实例是真菌细胞，丝状真菌细胞，其来自子囊菌门(Division Ascomycota)，盘菌亚门(Subdivision Pezizomycotina)；优选来自由粪壳菌纲(Class Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Subclass Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和小囊菌目(Microascales)以及曲霉属(Aspergillus)、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属(Humicola)的成员组成的组；更优选来自由肉座菌科(Hypocreacea)、丛赤壳科(Nectriaceae)、麦角菌科
(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma) (无性型肉座菌属(anamorph of Hypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属
(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属
(Cephalosporium)和赛多孢子菌属(Scedosporium)组成的组；更优选来自由里氏木霉
(Trichoderma reesei) (红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、柠檬绿木霉(T.
citrinoviridae)、长枝木霉(T. longibrachiatum)、绿木霉(T. virens)、哈茨木霉(T. harzianum)、棘孢木霉(T. asperellum)、深绿木霉(T. atroviridae)、近里氏木霉(T. parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾本镰孢霉(F. gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F. pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F. venenatum)、藤仓赤霉(Gibberella
fujikuroi)、串珠赤霉(G. moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G. zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria (Haematonectria) haematococca)、纸葡萄穗霉(Stachybotrys
chartarum)、S. chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌
(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(M. anisopliae)、稻绿核菌(Villosiclava
virens)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)(Acremonium
(Cephalosporium) chrysogenum)和尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)和黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus
oryzae)、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)组成的组，最优选里氏木霉。宿主细胞的非限制性实例是细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B.
pumilus))，革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli))，放线菌目(例如链霉菌属(Streptomyces sp.))，和酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))。
(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma) (无性型肉座菌属(anamorph of Hypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属
(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属
(Cephalosporium)和赛多孢子菌属(Scedosporium)组成的组；更优选来自由里氏木霉
(Trichoderma reesei) (红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、柠檬绿木霉(T.
citrinoviridae)、长枝木霉(T. longibrachiatum)、绿木霉(T. virens)、哈茨木霉(T. harzianum)、棘孢木霉(T. asperellum)、深绿木霉(T. atroviridae)、近里氏木霉(T. parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾本镰孢霉(F. gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F. pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F. venenatum)、藤仓赤霉(Gibberella
fujikuroi)、串珠赤霉(G. moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G. zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria (Haematonectria) haematococca)、纸葡萄穗霉(Stachybotrys
chartarum)、S. chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌
(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(M. anisopliae)、稻绿核菌(Villosiclava
virens)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)(Acremonium
(Cephalosporium) chrysogenum)和尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)和黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus
oryzae)、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)组成的组，最优选里氏木霉。宿主细胞的非限制性实例是细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B.
pumilus))，革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli))，放线菌目(例如链霉菌属(Streptomyces sp.))，和酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))。
[0094] 在一个实施方案中，所述宿主细胞是真菌细胞，优选丝状真菌细胞，诸如木霉属或里氏木霉。在一个实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌细胞，诸如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌。
[0095] 在一个实施方案中，所述宿主细胞能够进行N-连接的糖基化。
[0096] "重组细胞"或"重组宿主细胞"是指这样的细胞或宿主细胞，其已被遗传修饰或改变以包含对于所述细胞或宿主细胞不是天然的核酸序列。遗传修饰可以包括在宿主细胞的基因组中整合多核苷酸。所述多核苷酸在宿主细胞中也可以是外源的。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是重组宿主细胞。
[0097] 如本文所用，"表达"包括参与在宿主细胞中产生多肽的任何步骤，包括但不限于转录、翻译、翻译后修饰和分泌。表达之后可以是收获(即回收)宿主细胞或表达的产物。
[0098] 术语"表达载体"表示线性或环状的DNA分子，其包含编码目标多肽的区段，其可操作地连接至提供其转录的额外区段。这样的额外区段可包括启动子和终止子序列，并且可任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个可选择标记、增强子、多腺苷酸化信号、载体等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可含有两者的元件。表达载体可以是方便地进行重组DNA程序的任何表达载体，并且载体的选择将经常取决于其中待引入载体的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者，所述载体可以是在引入宿主细胞时被整合至宿主细胞基因组中并与其已整合于其中的染色体一起复制的载体。在一个实施方案中，本发明的载体是表达载体。
[0099] 本文结合多肽或蛋白的产生使用的术语"重组产生的"或"重组地产生的"根据本领域中的标准定义来定义。
[0100] 如本文结合与特定微生物来源使用的术语"获自"和“可获得的”意味着多核苷酸由特定来源表达(同源表达)或由其中已插入来自来源的基因的细胞表达(异源表达)。
[0101] 术语"酶组合物"意指传统的酶促发酵产物，其可能从微生物的单一物种分离和纯化，这样的制剂通常包含多种不同的酶促活性；或者单组分酶(优选通过使用常规的重组技术从细菌或真菌物种衍生的酶)的混合物，所述酶已经发酵并可能分开分离和纯化，并且其可以源自不同物种，优选真菌或细菌物种或微生物的发酵产物，所述微生物充当用于产生重组甘露聚糖酶的宿主细胞，但所述微生物同时产生其他酶。
[0102] 术语"可操作地连接"，当是指DNA区段时，表示排列所述区段，使它们为其预期的目的协调发挥功能，例如转录在启动子中起始，并通过编码区段行进至终止子。
[0103] 术语"启动子"表示含有DNA序列的基因的部分，所述DNA序列提供RNA聚合酶的结合和转录的起始。启动子序列通常在基因的5'非编码区中发现，但并不总是如此。
[0104] 术语"分泌信号序列"或“信号序列”表示编码多肽("分泌肽")的DNA序列，所述多肽("分泌肽")作为较大多肽的组分，引导较大多肽通过在其中产生它的宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列可以是天然的，或者其可以用来自另一来源的分泌信号序列或载体序列替代。取决于宿主细胞，在通过分泌途径转运期间，较大的肽可被切割以除去分泌肽。
[0105] 术语"核心区"或“催化结构域”表示酶的结构域，其可能已经或可能没有被修饰或改变，但其已保留其原始活性的至少一部分。根据本发明的甘露聚糖酶的核心区对应于与Man7 SEQ ID NO: 2的氨基酸27-331对齐的氨基酸。
[0106] 术语"接头"或"间隔区"意指包含至少两个氨基酸的多肽，其可存在于多结构域蛋白(例如，包含酶核心和结合结构域(诸如碳水化合物结合模块(CBM))的酶或任何其他酶杂合体)的结构域之间，或者作为融合多肽(例如包含两种核心酶的融合蛋白)产生的两个蛋白或多肽之间。例如，通过将编码酶核心的DNA序列、编码接头的DNA序列和编码CBM的DNA序列依次融合至一个开放阅读框中并表达该构建体，提供酶核心与CBM的融合蛋白。
[0107] 有效量意指在选择的应用中足以降解甘露糖的量。
[0108] 以下缩写用于氨基酸：A Ala 丙氨酸
C Cys 半胱氨酸
D Asp 天冬氨酸
E Glu 谷氨酸
F Phe 苯丙氨酸
G Gly 甘氨酸
H His 组氨酸
I Ile 异亮氨酸
K Lys 赖氨酸
L Leu 亮氨酸
M Met 甲硫氨酸
N Asn 天冬酰胺
P Pro 脯氨酸
Q Gln 谷氨酰胺
R Arg精氨酸
S Ser 丝氨酸
T Thr苏氨酸
V Val 缬氨酸
W Trp色氨酸
Y Tyr 酪氨酸。
C Cys 半胱氨酸
D Asp 天冬氨酸
E Glu 谷氨酸
F Phe 苯丙氨酸
G Gly 甘氨酸
H His 组氨酸
I Ile 异亮氨酸
K Lys 赖氨酸
L Leu 亮氨酸
M Met 甲硫氨酸
N Asn 天冬酰胺
P Pro 脯氨酸
Q Gln 谷氨酰胺
R Arg精氨酸
S Ser 丝氨酸
T Thr苏氨酸
V Val 缬氨酸
W Trp色氨酸
Y Tyr 酪氨酸。
[0110] 术语"洗涤剂组合物"和“洗涤剂”，除非另有指明，包括固体、颗粒或粉末形式的通用或重型洗涤试剂，特别是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊剂形式的通用洗涤试剂，特别是所谓的重型液体(HDL)类型；液体细织物洗涤剂；手动洗碗剂或轻型洗碗剂，特别是高发泡型的那些；机器洗碗剂，包括用于家用和机构使用的各种片剂、颗粒、液体和冲洗-助剂类型；液体清洁和消毒剂、汽车或地毯清洗剂、浴室清洁剂；金属清洁剂；以及清洗助剂诸如漂白添加剂和"染色棒(stain-stick)"或预处理类型。术语"洗涤剂”、"洗涤剂组合物"和"洗涤剂制剂"参考混合物使用，所述混合物意欲用于清洁被污染物体的洗涤介质。在一些实施方案中，该术语参考清洗织物和/或服装(例如，"洗衣洗涤剂")使用。在替代实施方案中，该术语是指其他洗涤剂，诸如用于清洁碗碟、餐具等的洗涤剂(例如，"洗碗洗涤剂")。并不意欲本发明限于任何特定的洗涤剂制剂或组合物。除了根据本发明的甘露聚糖酶以外，该术语意欲涵盖洗涤剂，其可含有例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelators)或螯合试剂(chelating agents)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、肥皂泡抑制剂、染料、香料、鞣质抑制剂(tannish inhibitor)、光学增白剂、杀细菌剂、杀真菌剂、土壤悬浮剂、防腐剂、助水溶剂、织物色调剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、土壤释放聚合物、抗再沉积剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、香料、颜料、sod抑制剂、溶剂和用于液体洗涤剂的结构化剂、结构弹性剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、蓝化剂和荧光染料、抗氧化剂和增溶剂。
[0111] 术语“纺织品”意指任何纺织品材料，包括纱线、纱线中间物、纤维、非编织材料、天然材料、合成材料和任何其他纺织品材料、由这些材料制成的织物和由织物制成的产品(例如服装、亚麻布和其他物品)。纺织品或织物可以呈针织物、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毡、纱线和毛巾布的形式。纺织品可以是基于纤维素的，诸如天然纤维素材料，包括棉、亚麻(flax)/亚麻(linen)、黄麻、苎麻、剑麻或椰棕或人造纤维素材料(例如源自木浆)，包括粘胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(tricell)、莱赛尔纤维(lyocell)或其掺合物。纺织品或织物也可以是基于非-纤维素的，诸如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛(rabit)和丝绸或合成聚合物，诸如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯(polypropylen)和spandex/弹性纤维(elastane)，或其掺合物，以及基于纤维素和基于非-纤维素的纤维的掺合物。掺合物的实例是棉和/或人造丝/粘胶与一种或多种伴随材料诸如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和含纤维素纤维(例如人造丝/粘胶、苎麻、亚麻(flax)/亚麻(linen)、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维(lyocell))的掺合物。织物可以是传统的可洗衣服，例如染色的家用衣服。当使用术语织物或服装时，同样意欲包括更广泛的术语纺织品。
[0112] 术语“稳定性”包括储存稳定性和在使用期间、例如在洗涤过程(呈洗涤稳定性)期间的稳定性，并且反映作为时间的函数的根据本发明的甘露聚糖酶的稳定性，例如，当甘露聚糖酶保持在溶液中，特别是在洗涤剂溶液中时，保留多少活性。稳定性受许多因素的影响，所述因素例如pH、温度、洗涤剂组成，例如蛋白酶、稳定剂、助洗剂、表面活性剂等。甘露聚糖酶稳定性可使用如在实施例中描述的“活性测定”来测量。
[0113] 如本文所用的“甘露聚糖酶活性”是指多肽的甘露聚糖降解活性。如本文所用的降解或修饰意味着通过甘露聚糖酶从甘露聚糖多糖水解甘露糖单元。根据本发明的多肽的甘露聚糖降解活性可以根据本领域中已知的标准测试程序测试。实施例5提供了用于测定甘露聚糖酶活性的标准方法的实例。
[0114] 在一个实施方案中，本发明的变体在位置123、158、180、272、285或307或其组合处包含至少一个取代。
[0115] 在一个实施方案中，本发明的变体在位置M123、A158、F180、G272、T285或T307或其组合处包含至少一个取代。
[0116] 在一个实施方案中，本发明的变体在位置M123、A158、F180、G272、T307或L316或其组合处包含至少一个另外的取代。在一个实施方案中，所述变体包含一个另外的取代、两个另外的取代、三个另外的取代或四个另外的取代。
[0117] 在一个实施方案中，位置316未被取代。这有利于保持在位置316周围的位点附近残基的折叠和相互作用。此外，图8显示，在商业洗涤剂中，当使用就316而言取代或未取代的变体时，可以用较低量的酶获得相似的性能。
[0118] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶的变体包含表1中列出的一组取代。
[0119] 在一个实施方案中，所述取代包含在所述位置处取代为选自以下的氨基酸：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。
[0120] 在一个实施方案中，所述变体在以下位置处包含至少一个取代或一组取代：M123、A158、F180、G272；T307或L316的单一取代；或
M123和G272；或
A158和T307；或
L316；或
T307；或
M123、A158和T307；或
M123和L316；
A158、T307和L316；
F180和L316；或
M123、A158、G272；T307和L316；
或其组合。
M123和G272；或
A158和T307；或
L316；或
T307；或
M123、A158和T307；或
M123和L316；
A158、T307和L316；
F180和L316；或
M123、A158、G272；T307和L316；
或其组合。
[0121] 在一个实施方案中，所述取代是导致所述变体的稳定性提高的取代。
[0122] 在一个实施方案中，所述变体包含至少一个选自以下的额外取代：防止N283的糖基化的取代；
283或285的取代；或
N283、T285或S285的取代；或
T285或S285取代为除了T或S以外的残基
T285或S285取代为残基A。
283或285的取代；或
N283、T285或S285的取代；或
T285或S285取代为除了T或S以外的残基
T285或S285取代为残基A。
[0123] 在一个实施方案中，当在能够进行N-连接的糖基化的宿主细胞中产生时，所述额外取代导致所述变体的糖基化改变。在一个实施方案中，糖基化改变是所述变体的糖基化程度降低。
[0124] 在一个实施方案中，所述变体具有甘露聚糖酶活性且在对应于位置123、158、180、272、307或316的位置处包含至少一个另外的氨基酸取代，其中所述变体具有甘露聚糖酶活性且选自：1)与SEQ ID NO: 2的残基27-331具有至少85%序列同一性的变体；2)由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸在高度严格条件下与以下杂交：a) SEQ ID NO:1 (man7)的核苷酸79-993，b) a)的全长互补物；和3)由多核苷酸编码的变体，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或其基因组DNA序列具有至少95%序列同一性；且其中氨基酸编号对应于SEQ ID NO:2
(Man7)的氨基酸编号。
(Man7)的氨基酸编号。
[0125] 在一个实施方案中，所述变体在位置284和/或286包含P残基。在上述位置的任一个或两个中取代为P残基可引起变体中的结构改变，其防止N-连接的糖基化。
[0126] 在本发明的变体中的一个实施方案中，位置T285或S285被取代为除了T或S以外的残基。
[0127] 在本发明的变体中的一个实施方案中，位置T285或S285被取代为丙氨酸。
[0128] 在一个实施方案中，当在能够进行N-连接的糖基化的宿主细胞中产生时，所述变体具有与SEQ ID NO: 2的残基27-331的85%序列同一性和在位置283处的非-糖基化的Asn残基。
[0129] 在一个实施方案中，本发明的变体包含至少一个额外的糖基化的N位点，其中对应于N283的位置未被糖基化。这样的变体可通过在能够进行N-糖基化的宿主细胞中产生变体而获得，导致其他N-糖基化位点的至少部分糖基化，但其中N283的N-糖基化被抑制。
[0130] 在一个进一步实施方案中，本发明的变体不包含任何糖基化的N位点。这样的变体可通过在能够进行N-糖基化的宿主细胞中产生变体而获得，导致变体的糖基化被抑制。
[0131] 在一个实施方案中，不包括信号序列的情况下，所述变体具有在50000和51000之间、优选在50800和50970之间的预测分子量。
[0132] 在一个实施方案中，所述变体的预测pI在4.5和4.8之间，优选在4.6和4.75之间。
[0133] 变体的pI或分子量的预测可如在表3中所述实施。
[0134] 在本发明的一个进一步实施方案中，所述变体具有甘露聚糖酶活性。在一个实施方案中，当在能够进行N-连接的糖基化的宿主细胞中产生时，所述变体在位置283处具有非糖基化的Asn残基，且当在真核宿主细胞中产生时，所述变体具有与野生型甘露聚糖酶相比增加的比活性。
[0135] 在本发明的酶组合物的一个实施方案中，所述酶组合物进一步包含一种或多种额外的酶，所述酶选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、酯酶、植酸酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、DNA酶、漆酶和/或过氧化物酶，优选选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。
[0136] 包含甘露聚糖酶和额外的酶的本发明的酶组合物在提供协同作用方面是有利的。当包含甘露聚糖酶的本发明的酶组合物被用于洗涤剂中时，例如当洗涤污点时，这样的额外的酶是期望的。在洗涤剂中与甘露聚糖酶一起作用的特别有利的协同酶是淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶，或其组合，诸如包含甘露聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶的组合物。
[0137] 在一个实施方案中，提供了本发明的酶组合物，其呈液体组合物或固体组合物、诸如溶液、分散体、糊剂、粉末、微粒、颗粒、包衣颗粒、片剂、饼、晶体、晶浆、凝胶或丸粒的形式。
[0138] 在一个实施方案中，本发明的洗涤剂组合物呈液体洗涤剂或固体洗涤剂的形式，优选呈条、均质片剂、具有两层或更多层的片剂、具有一个或多个隔室的小袋、普通或致密粉末、微粒、颗粒、糊剂、凝胶或普通、致密或浓缩液体的形式。
[0139] 在一个实施方案中，本发明的洗涤剂组合物进一步包含一种或多种额外的酶，所述酶选自蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶分解酶、酯酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、DNA酶和/或过氧化物酶，优选选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。
[0140] 本发明的酶组合物还可用于清洁剂或加强剂中，所述清洁剂或加强剂在洗涤期间或之前添加在洗涤剂上，并且其例如呈液体、凝胶、粉末、颗粒或片剂的形式。酶组合物和洗涤剂组分也可以浸渍于载体(如纺织品)中。
[0141] 本发明另外涉及如本文公开的酶组合物或洗涤剂组合物用于降解甘露聚糖的用途和使用如本文公开的酶组合物或洗涤剂组合物用于降解甘露聚糖的方法。
[0142] 在一个进一步实施方案中，本发明涉及如本文公开的酶组合物或洗涤剂组合物在洗衣过程中的用途和在洗衣过程中使用如本文公开的酶组合物或洗涤剂组合物的方法。
[0144] 本发明还涉及用于降解甘露聚糖的方法，其包括将如本文公开的酶组合物或洗涤剂组合物应用于甘露聚糖，优选地其中甘露聚糖在纺织品的表面上，或者至少部分嵌入纺织品中。
[0145] 通常，选择的酶的特性应当与选择的洗涤剂相容(即，pH-最佳值，与其他酶促和非酶促成分的相容性等)，且所述酶应当以有效量存在。
[0146] 用于固体洗衣洗涤剂中的组合物，例如，以所述组合物的重量计，可包括0.000001%-5%，诸如0.000005-2%，诸如0.00001%-1%，诸如0.00001%-0.1%的酶蛋白。
[0147] 用于洗衣液体中的组合物，例如，以所述组合物的重量计，可包括0.000001%-3%，诸如0.000005%-1%，诸如0.00001%-0.1%的酶蛋白。
[0148] 用于自动洗碗机中的组合物，例如，以所述组合物的重量计，可包括0.000001%-5%，诸如0.000005%-2%，诸如0.00001%-1%，诸如0.00001%-0.1%的酶蛋白。
[0149] 本发明的第二个方面的额外组分a-d为本发明的酶组合物提供改进的特性。所述酶组合物与额外的组分相容并提高所述酶组合物在各种用途中的适用性。
[0150] 盐，诸如氯化钠和硫酸钠作为干燥助剂发挥功能。
[0151] 本发明另外涉及本发明的酶组合物诸如用于降解甘露聚糖和用于洗衣过程中的不同用途。
[0152] 在一个实施方案中，所述甘露聚糖酶的变体包含核心区。
[0153] 在一个实施方案中，所述甘露聚糖酶的变体包含CBM。
[0154] 提供在高于环境温度的温度下保持活性的甘露聚糖酶对于其中在这样的条件下需要甘露聚糖降解的应用是有利的。此外，根据本发明的甘露聚糖酶在碱性条件下可具有良好的稳定性和活性，这在洗涤剂使用和生物质处理中是有利的。
[0155] 在一个实施方案中，所述甘露聚糖酶的变体具有与SEQ ID NO:2具有至少或约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。
[0156] 在一个实施方案中，所述甘露聚糖酶的变体具有与SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
[0157] 在一个实施方案中，所述甘露聚糖酶具有与SEQ ID NO:2 [Man7]没有100%同一性的氨基酸序列。
[0158] 在第三个方面的一个实施方案中，所述宿主细胞选自：真菌细胞，
丝状真菌细胞，其来自子囊菌门(Division Ascomycota)，盘菌亚门(Subdivision
Pezizomycotina)；优选来自由粪壳菌纲(Class Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Subclass Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和小囊菌目(Microascales)以及曲霉属(Aspergillus)、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属
(Humicola)的成员组成的组；
更优选来自由肉座菌科(Hypocreacea)、丛赤壳科(Nectriaceae)、麦角菌科
(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma) (无性型肉座菌属(anamorph of Hypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属
(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属
(Cephalosporium)和赛多孢子菌属(Scedosporium)组成的组；
更优选来自由里氏木霉(Trichoderma reesei) (红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、
柠檬绿木霉(T. citrinoviridae)、长枝木霉(T. longibrachiatum)、绿木霉(T. virens)、哈茨木霉(T. harzianum)、棘孢木霉(T. asperellum)、深绿木霉(T. atroviridae)、近里氏木霉(T. parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾本镰孢霉(F.
gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F. pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F. venenatum)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、串珠赤霉(G. moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G. zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria (Haematonectria) haematococca)、纸葡萄穗霉
(Stachybotrys chartarum)、S. chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(M. anisopliae)、稻绿核菌
(Villosiclava virens)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)(Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum)和尖端赛多孢子菌(Scedosporium
apiospermum)和黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉
(Myceliophthora thermophila)、特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)组成的组，
细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌诸如枯草芽孢杆菌(B. Subtilis)、地衣芽孢杆菌
(B. Licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B.
amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)，革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌
(Escherichia coli)，放线菌目诸如链霉菌属(Streptomyces sp.)，和
酵母，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia
pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，
最优选里氏木霉或芽孢杆菌属。
丝状真菌细胞，其来自子囊菌门(Division Ascomycota)，盘菌亚门(Subdivision
Pezizomycotina)；优选来自由粪壳菌纲(Class Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Subclass Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)和小囊菌目(Microascales)以及曲霉属(Aspergillus)、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)和腐质霉属
(Humicola)的成员组成的组；
更优选来自由肉座菌科(Hypocreacea)、丛赤壳科(Nectriaceae)、麦角菌科
(Clavicipitaceae)、小囊菌科(Microascaceae)和木霉属(Trichoderma) (无性型肉座菌属(anamorph of Hypocrea))、镰孢霉属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、丛赤壳属(Nectria)、葡萄状穗霉属(Stachybotrys)、麦角菌属(Claviceps)、绿僵菌属
(Metarhizium)、Villosiclava、蛇形虫草属(Ophiocordyceps)、头孢霉属
(Cephalosporium)和赛多孢子菌属(Scedosporium)组成的组；
更优选来自由里氏木霉(Trichoderma reesei) (红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、
柠檬绿木霉(T. citrinoviridae)、长枝木霉(T. longibrachiatum)、绿木霉(T. virens)、哈茨木霉(T. harzianum)、棘孢木霉(T. asperellum)、深绿木霉(T. atroviridae)、近里氏木霉(T. parareesei)、尖镰孢霉(Fusarium oxysporum)、禾本镰孢霉(F.
gramineanum)、假禾谷镰孢霉(F. pseudograminearum)、镶片镰孢霉(F. venenatum)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、串珠赤霉(G. moniliformis)、玉蜀黍赤霉(G. zeaea)、鞭毛藻丛赤壳菌(血赤壳菌)(Nectria (Haematonectria) haematococca)、纸葡萄穗霉
(Stachybotrys chartarum)、S. chlorohalonata、黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)、黄绿绿僵菌(Metarhizium acridum)、金龟子绿僵菌(M. anisopliae)、稻绿核菌
(Villosiclava virens)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、顶头孢霉(头孢霉菌)(Acremonium (Cephalosporium) chrysogenum)和尖端赛多孢子菌(Scedosporium
apiospermum)和黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、鲁克文金孢菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉
(Myceliophthora thermophila)、特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)组成的组，
细菌细胞，优选地革兰氏阳性杆菌诸如枯草芽孢杆菌(B. Subtilis)、地衣芽孢杆菌
(B. Licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(B.
amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)，革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌
(Escherichia coli)，放线菌目诸如链霉菌属(Streptomyces sp.)，和
酵母，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia
pastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，
最优选里氏木霉或芽孢杆菌属。
[0159] 在一个实施方案中，所述宿主细胞是能够进行N-连接的糖基化的真核宿主细胞。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是里氏木霉。
[0160] 重组宿主细胞可用于产生甘露聚糖酶的变体和携带编码它的多核苷酸。重组宿主细胞在制备具有不同特性的甘露聚糖酶的变体中也是有用的。例如，可以选择宿主细胞，其提供有利于稳定性或活性的翻译后修饰，或其便于在宿主细胞中产生的甘露聚糖酶的变体的后处理和配制。
[0161] 在一个实施方案中，本发明的酶组合物包含第二个方面的重组宿主细胞。
[0162] 在一个实施方案中，本发明的甘露聚糖酶的变体是重组多肽，其为融合蛋白。
[0163] 在一个实施方案中，本发明的重组多肽是融合蛋白，其进一步包含以下中的至少一种：提供分泌信号序列的氨基酸序列；
便于纯化的氨基酸序列，诸如亲和标签、His-标签；
增强产生的氨基酸序列，诸如作为载体的氨基酸序列，诸如CBM；
具有酶活性的氨基酸序列；和
提供具有结合亲和力的融合蛋白的氨基酸序列，诸如碳水化合物结合部分。
便于纯化的氨基酸序列，诸如亲和标签、His-标签；
增强产生的氨基酸序列，诸如作为载体的氨基酸序列，诸如CBM；
具有酶活性的氨基酸序列；和
提供具有结合亲和力的融合蛋白的氨基酸序列，诸如碳水化合物结合部分。
[0164] CBM，碳水化合物结合部分，作为载体，例如在木霉属生产中是有利的。
[0165] 在一个实施方案中，所述宿主细胞是非-致病的。这对于在饲料中，和在洗涤剂应用中，诸如在家用洗衣洗涤剂中使用宿主细胞是特别有利的。
[0166] 在第五个方面的一个实施方案中，所述含有甘露聚糖的材料选自基于植物的材料、纺织品、废水、污水、油或其组合。
[0167] 在一个实施方案中，含有甘露聚糖的材料是纺织品材料或织物。
[0169] 在另一个实施方案中，降解或修饰在其中甘露聚糖酶显示活性的水性环境中实施。
[0170] 在一个优选实施方案中，在该方法中降解或修饰的含有甘露聚糖的材料，在任选具有甘露聚糖污点的纺织品或织物上。通过降解附接至纺织品或织物的甘露聚糖，与甘露聚糖结合的污物或污垢被释放，并且不能再次结合至甘露聚糖或甘露聚糖污点。纺织品或织物可以是任何材料的，例如棉、亚麻(flax)/亚麻(linen)、黄麻、苎麻、剑麻或椰棕或人造纤维素制品(例如源自木浆)，包括粘胶/人造丝、莫代尔纤维(modal)、醋酸纤维素纤维(tricell)、莱赛尔纤维(lyocell)、铜铵纤维(cupro)或其掺合物。
[0171] 在一个实施方案中，本发明的饲料包含玉米和大豆粉或由玉米和大豆粉组成。
[0172] 在一个实施方案中，所述植物起源的蛋白来源包含大豆、谷物诸如大麦、小麦、黑麦、燕麦或玉米或由大豆、谷物诸如大麦、小麦、黑麦、燕麦或玉米组成。
[0173] 在一个实施方案中，所述包含甘露聚糖的产物或副产物包含棕榈仁、瓜尔豆粉或椰子核粉或由棕榈仁、瓜尔豆粉或椰子核粉组成。
[0174] 在一个实施方案中，本发明的动物饲料或本发明的饲料补充剂以湿组合物或干组合物的形式配制。
[0175] 在一个实施方案中，包含至少一种甘露聚糖酶的变体的组合物被用于纸浆和造纸工业、生物漂白、纤维改性、排水改进和石油工业中，即石油钻井或石油供应行业中，用于水力压裂或控制钻井液的粘度。
[0177] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶的变体随机地水解内-β-1,4-甘露糖苷键。
[0178] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶的变体，或编码相应野生型甘露聚糖酶的核苷酸序列可从细菌来源获得或衍生。
[0179] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶的变体与至少一种另外的多肽融合，因此形成融合多肽。除了甘露聚糖酶的那些以外，融合多肽或另外的多肽还可具有其他催化或结合活性。在一个实施方案中，另外的多肽包含碳水化合物结合模块或由碳水化合物结合模块组成，所述碳水化合物结合模块任选地是衍生自与甘露聚糖酶相同或不同生物的另一种蛋白或酶的片段。
[0180] 在一个实施方案中，甘露聚糖酶的变体用接头连接至另外的多肽。
[0181] 在一个实施方案中，提供了织物的机械处理的方法，所述方法包括在机器洗涤过程的洗涤周期期间用含有第一个方面的甘露聚糖酶的变体或第二个方面的酶组合物的洗涤溶液处理织物。
[0182] 在一个实施方案中，提供了第二个方面的酶组合物或第一个方面的甘露聚糖酶的变体与酶一起在用于织物清洁和/或织物污点除去的清洁组合物中的用途，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质。
[0183] 在一个实施方案中，提供了第一个方面的甘露聚糖酶的变体或第二个方面的酶组合物与酶一起在用于清洁硬表面，诸如地板、墙壁、浴室瓷砖等的清洁组合物中的用途，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质。
[0184] 在一个实施方案中，提供了第一个方面的甘露聚糖酶的变体或第二个方面的酶组合物与酶一起在用于手工和机器洗碗的清洁组合物中的用途，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶分解酶、果胶酸裂解酶、糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，具有或不具有介质。实施例
[0186] 实施例1. 变体设计为了提高野生型Man7甘露聚糖酶的稳定性和比活性，基于野生型酶的结构分析，设计
变体组。使用Bioluminate软件(Schrödinger LCC)，用来自芽孢杆菌物种(Bacillus sp.)内-β-D-1,4-甘露聚糖酶(1WKY)的坐标，创建Man7的结构模型。该设计包括每个变体两个或更多个特定突变。表1显示变体的列表。氨基酸编号对应于含有信号序列的SEQ ID NO: 2 (Man7)全长氨基酸序列的氨基酸编号。
变体组。使用Bioluminate软件(Schrödinger LCC)，用来自芽孢杆菌物种(Bacillus sp.)内-β-D-1,4-甘露聚糖酶(1WKY)的坐标，创建Man7的结构模型。该设计包括每个变体两个或更多个特定突变。表1显示变体的列表。氨基酸编号对应于含有信号序列的SEQ ID NO: 2 (Man7)全长氨基酸序列的氨基酸编号。
[0187] 表1. Man7变体的列表
[0188] 实施例2. 合成甘露聚糖酶变体基因的克隆在DNA的分离和酶处理(例如，质粒DNA的分离，DNA的消化以产生DNA片段)中，在大肠杆菌转化、测序等中，使用标准分子生物学方法。使用的基本方法，如酶、试剂或试剂盒制造商所述。
[0189] 从GenScript订购变体tbh1 - tbh11作为合成构建体，其没有其自身的信号肽编码序列，且针对里氏木霉进行密码子优化。将获得自GenScript的包括基因tbh1 - tbh11的质粒DNA重新悬浮于无菌水中，根据制造商的说明用NruI和BamHI限制性酶(Thermo Fisher Scientific)消化，且克隆至用NruI和BamHI切割的表达载体中。将连接混合物转化至大肠杆菌XL1-Blue或XL10-Gold细胞(AH Diagnostics)中，并铺板在含有50-100 µg/ml氨苄青霉素的LB (Luria-Bertani)板上。从板收集几个大肠杆菌菌落，并用GenJet质粒小量制备试剂盒(Thermo Fisher Scientific)分离DNA。使用限制性消化筛选阳性克隆，并显示它们含有预期大小的插入物。对tbh1- tbh11甘露聚糖酶基因的表达质粒的融合位点进行测序，并将所述质粒分别命名为pALK4415 - pALK4423、pALK4430和pALK4431(对于详情，参见实施例4)。还将由GenScript提供的包括thb基因的质粒DNA转化至XL10-Gold大肠杆菌细胞(Agilent)中，并保藏至DSMZ菌株保藏中心中。关于基因和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:5-36)的相关信息分别概述于表2和表3中。将分别包括质粒pALK4434 - pALK4442、
pALK4432和pALK4433的大肠杆菌菌株RF12379 - RF12387、RF12456和RF12457分别以登记号DSM 32425、DSM 32426、DSM 32427、DSM 32428、DSM 32429、DSM 32430、DSM 32431、DSM
32432、DSM32433、DSM 32518和DSM 32519保藏至DSMZ保藏中心。
pALK4432和pALK4433的大肠杆菌菌株RF12379 - RF12387、RF12456和RF12457分别以登记号DSM 32425、DSM 32426、DSM 32427、DSM 32428、DSM 32429、DSM 32430、DSM 32431、DSM
32432、DSM32433、DSM 32518和DSM 32519保藏至DSMZ保藏中心。
[0190] 表2. 关于编码合成基因tbh1 - tbh11的甘露聚糖酶变体的概述(a 包括终止密码子。
[0191] 表3. 从编码甘露聚糖酶变体的基因序列推导的氨基酸序列的概述。
[0192] (a 使用程序SignalP v3.0, NN/HMM对信号序列进行预测(Nielsen等人, 1997; Nielsen & Krogh, 1998; Bendtsen等人, 2004)。(b 不包括预测的信号序列。使用用于Windows的Clone Manager Professional版本9，Sci-Ed Software进行预测。
[0193] 实施例3. man7基因的定点诱变除非另有说明，否则使用标准分子生物学方法，包括DNA操作和转化。如Kunkel 1985中所述，通过定点诱变引入突变。生成的突变列于表4中。氨基酸编号对应于SEQ ID NO:2 (Man7)的氨基酸编号。
[0194] 表4. 通过定点诱变在Man7中引入的突变的列表
[0195] 对于扩增，使用Pfx Accu Prime聚合酶(Invitrogen)。根据制造商的说明进行PCR。使用以下PCR条件用于构建表达质粒：在94℃初始变性120秒，随后为35个循环的在94℃ 15秒、在以下50/55℃之一退火30秒、在68℃延伸110/290秒，且最后在68℃延伸10分钟。pEV1 man7用作用于PCR的模板。用于克隆的引物的序列显示于表5中。将用于杂交的突出端加下划线。
[0196] 表5. 用于生成man7变体的引物的列表
[0197] 为了克隆目的，根据试剂盒制造商的说明使用NEBuilder®Hifi DNA Assembly Master Mix (NEB, Frankfurt)。如Zhang & Zhang 2011中所述，通过在枯草芽孢杆菌SCK6中的诱导的感受态，转化生成的表达质粒(图1)。将转化的细胞铺板至补充有10 mg/l卡那霉素的LB (Luria-Bertani)板上。将板在37℃下孵育20h。挑取生长中的菌落，并使用QiaPrep MiniPrep试剂盒(Qiagen, Germany)分离质粒。根据制造商对于革兰氏阳性质粒制备的推荐实施分离程序。对插入物经由Sanger测序(GATC, Germany)进行测序，并揭示对应于变体1至5的成熟部分的DNA序列。使用ClustalW序列比对进行序列比较(Thompson等人 1994)。最后，将表达质粒经由电穿孔转化于芽孢杆菌生产菌株中。使芽孢杆菌生产菌株在含有20 g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、10 g NaCl和2 M蔗糖的电穿孔培养基中生长，并在0.4的OD(600nm)下收获10 ml。将细胞用含有0.272 M蔗糖、1 mM MgCl2和7 mM KH2PO4的电穿孔缓冲液洗涤，且最后重新悬浮于250 μl电穿孔缓冲液中。使用以下条件进行电穿孔：
1.2 kV，150 Ω，50 μF。然后添加1ml电穿孔培养基，并将细胞在37℃下孵育3h。将细胞铺板在补充有20 mg/l卡那霉素的LB板上，并在37℃下孵育18h。克隆如上所述验证，且用于生成材料用于分析测试。因此，在蛋白诱导条件下以标准表达接种菌株，并在37℃下孵育30h。收获上清液，且用于分析和应用测试。
1.2 kV，150 Ω，50 μF。然后添加1ml电穿孔培养基，并将细胞在37℃下孵育3h。将细胞铺板在补充有20 mg/l卡那霉素的LB板上，并在37℃下孵育18h。克隆如上所述验证，且用于生成材料用于分析测试。因此，在蛋白诱导条件下以标准表达接种菌株，并在37℃下孵育30h。收获上清液，且用于分析和应用测试。
[0198] 实施例4. 在里氏木霉中产生重组甘露聚糖酶变体蛋白构建用于在里氏木霉中产生重组甘露聚糖酶TBH1-TBH11 (SEQ ID NO: 6、8、10、12、
14、16、18、20、22、24和26)蛋白的表达质粒。构建的表达质粒列于表6中。用里氏木霉cel6A/cbh2 CBM载体和接头(随后是Kex2蛋白酶识别位点)，将重组甘露聚糖酶基因(无其自身信号序列)融合至里氏木霉cel7A/cbh1启动子。由里氏木霉cel7A/cbh1终止子确保转录终止，且构巢曲菌(A. Nidulans) amdS标记基因用于转化体的筛选，如Paloheimo等人(2003)中所述。线性表达盒(图2)在NotI消化后与载体骨架分离，并转化至里氏木霉原生质体中。所使用的宿主菌株，不产生四种主要的里氏木霉纤维素酶(CBHI、CBHII、EGI、EGII)中的任一种。所述转化如Penttilä等人(1987)中所述(具有Karhunen等人(1993)中所述的修改)进行，选择乙酰胺酶作为唯一氮源(amdS标记基因)。转化体通过单一分生孢子在筛选板上纯化，然后在PD上使它们形成孢子。
14、16、18、20、22、24和26)蛋白的表达质粒。构建的表达质粒列于表6中。用里氏木霉cel6A/cbh2 CBM载体和接头(随后是Kex2蛋白酶识别位点)，将重组甘露聚糖酶基因(无其自身信号序列)融合至里氏木霉cel7A/cbh1启动子。由里氏木霉cel7A/cbh1终止子确保转录终止，且构巢曲菌(A. Nidulans) amdS标记基因用于转化体的筛选，如Paloheimo等人(2003)中所述。线性表达盒(图2)在NotI消化后与载体骨架分离，并转化至里氏木霉原生质体中。所使用的宿主菌株，不产生四种主要的里氏木霉纤维素酶(CBHI、CBHII、EGI、EGII)中的任一种。所述转化如Penttilä等人(1987)中所述(具有Karhunen等人(1993)中所述的修改)进行，选择乙酰胺酶作为唯一氮源(amdS标记基因)。转化体通过单一分生孢子在筛选板上纯化，然后在PD上使它们形成孢子。
[0199] 表6. 经构建以在里氏木霉中产生TBH1-TBH11 (SEQ ID NO: 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26)重组蛋白的表达盒。表达盒的总体结构如图2中所述。
(a 用于里氏木霉转化的表达盒通过使用NotI消化从载体骨架分离。
(a 用于里氏木霉转化的表达盒通过使用NotI消化从载体骨架分离。
[0200] 从摇瓶培养的培养上清液分析转化体的甘露聚糖酶产生。将转化体从PD斜面接种至含有50 ml用5% KH2PO4缓冲的复合乳糖基纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等人1993)的摇瓶中。使转化体在30℃、250 rpm下生长7天后，从培养上清液分析转化体的甘露聚糖酶蛋白产生。通过SDS-PAGE与随后的考马斯染色分析重组蛋白的异源产生。还通过离心回收上清液，用于应用测试。
[0201] 选择最佳生产转化体以在实验室规模生物反应器中进行培养。在典型的中温真菌培养温度和弱酸性条件下，在蛋白诱导条件下，在生物反应器中分批或通过额外的进料类型的过程培养转化体。继续培养，直至达到培养基糖的耗尽或直至达到合适的收率。通过离心或通过过滤回收上清液，用于应用测试。
[0202] 实施例5. 通过DNS-方法测定半乳甘露聚糖酶活性测量甘露聚糖酶活性(MNU)，作为在50℃和pH 7.0下，在5 min内，从半乳甘露聚糖(0.3 w/w-%)的还原糖的释放。使用二硝基水杨酸经分光光度法测定释放的还原碳水化合物的量。
[0203] 如下制备测定法中使用的底物(0.3 w/w-%)：在约80℃，使用加热磁搅拌器，将0.6 g刺槐豆胶(Sigma G-0753)置于50 mM柠檬酸钠缓冲液pH 7 (或柠檬酸盐磷酸盐缓冲液pH 7)中，并加热直至沸点。使溶液冷却，并在冷室(2-8℃)内在连续搅拌下使其溶解过夜并通过离心除去不溶性残余物。此后通过缓冲液将溶液填充直至200 ml。底物以冷冻形式储存，并且在使用前通过在沸水浴中加热至约80℃而融化，冷却至室温，并小心混合。
[0204] 通过将50 g 3.5-二硝基水杨酸(Sigma D-550)在约4升水中溶解，制备在该测定法所用的DNS试剂。在连续磁力搅拌下，逐渐加入80.0 g NaOH并使其溶解。在连续搅拌下，分小份加入1500 g量的Rochelle盐(K-Na-酒石酸盐, Merck 8087)。将小心升温至45℃的最高温度的该溶液冷却至室温并填充直至5000 ml。此后，将其通过Whatman 1滤纸过滤，并在室温下储存在黑色瓶中。
[0205] 首先通过向两个试管的每一个中加入1.8 ml底物溶液来开始反应，并使其在50℃下平衡5分钟，其后将200 μl的适当稀释的酶溶液加入所述管之一中，用涡旋混合器充分混合，并在50℃下准确孵育5 min。酶空白不需要平衡或孵育。通过向两管中加入3.0 ml DNS试剂来停止反应并混合。向酶空白管中加入200 μl样品溶液。将两管都置于沸水浴中。煮沸准确5分钟后，将所述管置于冷却水浴中，并使其冷却至室温。在540 nm处测量样品针对酶空白的吸光度，并从校准曲线读出活性，并乘以稀释系数。合适的稀释样品产生0.15-0.4的吸光度差异。
[0206] 通过将360 mg甘露糖(SigmaM-6020, 储存在干燥器中)溶解于测定缓冲液中来制备20 mM甘露糖储备溶液，并将其稀释为含有3、6、10和14 μmol/ml甘露糖的溶液，准备标准曲线。除了在50℃下孵育以外，对标准品进行类似于样品的处理。在540 nm处针对试剂空白(含有缓冲液而不是甘露糖的标准稀释液)测量吸光度。为每个系列的测定构建校准曲线。
[0207] 一个甘露聚糖酶单位(MNU)被定义为在测定条件下在一秒内从半乳甘露聚糖产生还原碳水化合物(其还原力对应于1 nmol甘露糖)的酶的量(1 MNU = 1nkat)。
[0208] 实施例6. 在木霉属中产生的甘露聚糖酶变体与商业洗涤剂的污点除去性能用商业洗涤剂在40℃和16°dH的水硬度下，测试在木霉属中产生的TBH1-TBH11变体的
培养样品(如实施例4中所述)除去甘露聚糖酶敏感的标准污点的能力，并与野生型酶进行比较。使用来自Center for Testmaterial B.V. (荷兰)的以下人工弄脏的测试布：棉上的对甘露聚糖酶敏感的巧克力布丁(E-165)、棉上的刺槐豆胶与色素(C-S-73)和棉上的瓜尔胶与炭黑(C-S-43)。将织物切成6 cm x 6 cm布样，并在测试中使用各2片。
培养样品(如实施例4中所述)除去甘露聚糖酶敏感的标准污点的能力，并与野生型酶进行比较。使用来自Center for Testmaterial B.V. (荷兰)的以下人工弄脏的测试布：棉上的对甘露聚糖酶敏感的巧克力布丁(E-165)、棉上的刺槐豆胶与色素(C-S-73)和棉上的瓜尔胶与炭黑(C-S-43)。将织物切成6 cm x 6 cm布样，并在测试中使用各2片。
[0209] 含有除了甘露聚糖酶以外的所有其他酶的商业重型液体洗涤剂A以每升洗液4.4 g的浓度使用，无酶的商业颜色洗涤剂粉末以3.8 g/l使用，且无酶的商业漂白洗涤剂粉末以4.2 g/l使用。含有洗涤剂的洗液在硬度为16°dH的合成自来水中制备。将蛋白酶Savinase® 16 L (0.5 w/w %)和淀粉酶Stainzyme® 12 L (0.4 w/w %)与商业颜色洗涤剂粉末和漂白洗涤剂粉末一起添加至所用的硬水中，液体洗涤剂已经含有淀粉酶和蛋白酶。液体洗涤剂的洗液的pH为近似8.3，其中颜色洗涤剂粉末的pH为近似10且漂白洗涤剂的pH为近似9.5。
[0210] 甘露聚糖酶作为每ml洗液0.025和/或0.05 MNU活性给予。如实施例5中所述测量活性。对照样品含有没有甘露聚糖酶的洗涤剂溶液。
[0211] 对于具有16°dH的硬度的合成自来水，在去离子水(Milli-Q或等效物)中制备以下储备溶液：具有1000°d钙-硬度的储备溶液：CaCl2 x 2 H2O (1.02382.1000, Merck KGaA,
Germany) 26.22 g/l
具有200°d镁-硬度的储备溶液：MgSO4 x 7 H2O (1.05886.1000, Merck KGaA,
Germany) 8.79 g/l H2O
NaHCO3储备溶液：NaHCO3 (1.06329.1000 Merck KGaA, Germany) 29.6 g/l
将13.3 ml CaCl2溶液、13.3 ml MgSO4溶液和10.0 ml新鲜制备的NaHCO3溶液以给定
顺序添加于容量烧瓶中，用去离子水补足至1升并混合。通过络合滴定测定水的硬度，并且发现正确。
Germany) 26.22 g/l
具有200°d镁-硬度的储备溶液：MgSO4 x 7 H2O (1.05886.1000, Merck KGaA,
Germany) 8.79 g/l H2O
NaHCO3储备溶液：NaHCO3 (1.06329.1000 Merck KGaA, Germany) 29.6 g/l
将13.3 ml CaCl2溶液、13.3 ml MgSO4溶液和10.0 ml新鲜制备的NaHCO3溶液以给定
顺序添加于容量烧瓶中，用去离子水补足至1升并混合。通过络合滴定测定水的硬度，并且发现正确。
[0212] 如下在Atlas LP-2 Launder-Ometer中进行污点除去处理。将Launder-Ometer首先预热至40℃。然后将洗涤剂、硬度为16°dH的250 ml合成自来水和稀释的酶(<1.0 ml)添加至1.2升容器中。添加污点，并将Launder-Ometer在40℃下以42 rpm的转速运行60 min。此后，在流水下仔细冲洗布样，并在室内空气中，在防日光的栅格上干燥过夜。
[0213] 通过用Konica Minolta CM-3610A分光光度计，使用L*a*b*颜色空间坐标(光源D65/10°, 420 nm切割)测量作为反射值的颜色，评估污点除去效果。将指示甘露聚糖酶性能(污点除去效率)的污点的褪色计算为ΔL* (delta L*)，其意指酶处理织物的光度值L*减去用无甘露聚糖酶的洗液处理的织物(对照)的光度值L*。最终结果(总污点除去效果)显示为各3个污点的ΔL*的总和。各污点的颜色值为2个布样的平均值。
[0214] 用商业液体洗涤剂获得的结果显示于图3中，用商业颜色洗涤剂粉末的结果显示于图4中，且用商业漂白洗涤剂的结果显示于图5中。用不同类型的商业洗涤剂，所有变体(TBH1-TBH11)都显示优异的污点除去性能。变体的性能类似于野生型。
[0215] 实施例7. 在芽孢杆菌属中产生的甘露聚糖酶变体与商业洗涤剂的污点除去性能用商业洗涤剂在40℃和16°dH的水硬度下，测试在芽孢杆菌属中产生的变体BH18、BH21、BH23、BH24和BH2的培养上清液(如实施例3中所述)除去甘露聚糖酶敏感的标准污点的能力，并与野生型酶进行比较。使用与实施例6中所述类似的测试系统。
[0216] 用商业液体洗涤剂获得的结果显示于图6中，用商业颜色洗涤剂粉末的结果显示于图7中，且用商业漂白洗涤剂的结果显示于图8中。用不同类型的商业洗涤剂，所有变体(BH18、BH21、BH23、BH24、BH25)都显示优异的污点除去性能。变体的性能类似于野生型。
[0217] 实施例8. 甘露聚糖酶变体在商业液体洗涤剂中在37℃下的稳定性在含有蛋白酶和除了甘露聚糖酶以外的所有其他酶的商业液体重型洗涤剂A中测试木
霉属(如实施例4中所述)或芽孢杆菌属(如实施例3中所述)产生的几种甘露聚糖酶变体的培养上清液的稳定性，并与野生型酶进行比较。将甘露聚糖酶制剂以4 w/w-%添加于洗涤剂中，并将样品在带盖的塑料管中在37℃下孵育约16或24周。通过实施例5中所述的活性测定法以特定间隔测量活性，除了使用30 min孵育时间。将结果计算为残余活性(%)，其通过将在特定时间点采集的样品的活性除以样品的初始活性而获得。
霉属(如实施例4中所述)或芽孢杆菌属(如实施例3中所述)产生的几种甘露聚糖酶变体的培养上清液的稳定性，并与野生型酶进行比较。将甘露聚糖酶制剂以4 w/w-%添加于洗涤剂中，并将样品在带盖的塑料管中在37℃下孵育约16或24周。通过实施例5中所述的活性测定法以特定间隔测量活性，除了使用30 min孵育时间。将结果计算为残余活性(%)，其通过将在特定时间点采集的样品的活性除以样品的初始活性而获得。
[0218] 当在高温如37℃下储存24周时，与在木霉属中产生的Man7的野生型酶相比，变体TBH2、TBH3、TBH4、TBH5和尤其是TBH6的稳定性得到提高。TBH6与野生型相比的稳定性测试的结果显示于图9中。
[0219] 当在高温如37℃下储存几周时，与在芽孢杆菌属中产生的Man7的野生型酶相比，变体BH21、BH23、BH24和尤其是BH25的稳定性得到提高。BH25与野生型相比的稳定性测试的结果显示于图10中。
[0220] 实施例9. 甘露聚糖酶变体在商业液体洗涤剂中在50℃下的稳定性在极端条件下，在含有蛋白酶、但不含甘露聚糖酶的商业液体重型洗涤剂A中测试在木霉属中产生的TBH1-TBH11变体的培养上清液(如实施例4中所述)的稳定性，并与野生型酶进行比较。将甘露聚糖酶制剂以4 w/w-%添加于洗涤剂中，并将样品在带盖的塑料管中在50℃下孵育7天。通过实施例X中所述的活性测定法测量活性，除了使用30 min孵育时间。将结果计算为残余活性(%)，其通过将在特定时间点采集的样品的活性除以样品的初始活性而获得。
[0221] 基于图11中显示的结果，所有变体酶在50℃下持续7天的稳定性与野生型相比更好。与野生型酶相比，用TBH1、TBH2、TBH4、TBH5、TBH6、TBH10和TBH11在极端条件下的稳定性尤其得到显著提高。
[0222] 在实验室规模生物反应器中培养最佳生产变体中的一些，并使用与上述类似的测试系统(除了甘露聚糖酶制剂的量在洗涤剂中为1 w/w-%)重新测试稳定性。当使用实验室规模培养材料时，甘露聚糖酶变体TBH5和TBH6的稳定性也显著好于野生型(数据未显示)。
[0223] 结果显示，甘露聚糖酶变体具有优异的污点除去性能，并且与野生型酶相比稳定性显著提高，尤其是在高温下。由于它们的较高的比活性和收率，它们也可以更经济地产生(数据未显示)。
[0224] 实施例10. 变体TBH5和TBH6的组合为了进一步改进甘露聚糖酶特性，将TBH5和TBH6变体中的突变组合(M123I、A158S、
S229A、G272Q、T285A、T307R和L316K)。如实施例2和4中所述，将组合变体TBH14制备为合成构建体，克隆至表达载体中并在里氏木霉中产生。如实施例9中所述，组合变体TBH14的稳定性在50℃下测试7天。变体TBH6和TBH5用于比较。结果显示于图13中。组合变体TBH14的稳定性与变体TBH6或TBH5的稳定性相比至少一样好或更好，所述变体TBH6或TBH5已显示与实施例9中的野生型相比提高的稳定性，即，当在高温如50℃下储存几天时，TBH14的稳定性与在木霉属中产生的野生型酶相比也得到提高。组合变体TBH14用商业洗涤剂也显示优异的污点除去性能(类似于野生型)。
S229A、G272Q、T285A、T307R和L316K)。如实施例2和4中所述，将组合变体TBH14制备为合成构建体，克隆至表达载体中并在里氏木霉中产生。如实施例9中所述，组合变体TBH14的稳定性在50℃下测试7天。变体TBH6和TBH5用于比较。结果显示于图13中。组合变体TBH14的稳定性与变体TBH6或TBH5的稳定性相比至少一样好或更好，所述变体TBH6或TBH5已显示与实施例9中的野生型相比提高的稳定性，即，当在高温如50℃下储存几天时，TBH14的稳定性与在木霉属中产生的野生型酶相比也得到提高。组合变体TBH14用商业洗涤剂也显示优异的污点除去性能(类似于野生型)。
[0225] 实施例10b. 单独和与非-淀粉多糖(NSP)降解酶组合的甘露聚糖酶在肉鸡中的效率研究研究本发明的重组甘露聚糖酶变体对肉鸡生长的影响。将包括重组甘露聚糖酶的发酵
培养液的超滤液干燥，且将目标水平应用于单独或与商业可获得的基于木聚糖酶的产品组合的丸粒肉鸡膳食。
培养液的超滤液干燥，且将目标水平应用于单独或与商业可获得的基于木聚糖酶的产品组合的丸粒肉鸡膳食。
[0226] 饲喂基于玉米和脱壳的溶剂提取的大豆粉的对照饲料，其不含酶，或向其中添加单独或与标准剂量的商业木聚糖酶组合的不同水平的本发明的重组甘露聚糖酶。
[0227] 肉鸡的初始重量在30 g和50 g之间。试验持续3周和5周之间。每次处理最少由6次重复(各10只肉鸡)组成。在每种情况下，分析所述膳食的水分、粗蛋白、粗纤维、脂肪、灰分和酶蛋白。
[0228] 准备五种膳食：1) 未补充的对照(BD)
2) BD + 甘露聚糖酶1-500 mg/kg
3) BD + 甘露聚糖酶1-1000 mg/kg
4) BD + 甘露聚糖酶1-500 mg/kg + 木聚糖酶1-10 mg/kg
5) BD + 木聚糖酶1-10 mg/kg。
2) BD + 甘露聚糖酶1-500 mg/kg
3) BD + 甘露聚糖酶1-1000 mg/kg
4) BD + 甘露聚糖酶1-500 mg/kg + 木聚糖酶1-10 mg/kg
5) BD + 木聚糖酶1-10 mg/kg。
[0229] 动物的健康状况和死亡率每天通过视觉查验进行检查。在第0、14和35天，测量体重增加(BW)、采食量(FI)和饲料-转换率(FCR)。FCR被计算为在同一时段期间消耗的总饲料量除以重量增加。重组甘露聚糖酶变体的作用的确定基于与饲喂相同膳食或饲喂相同膳食但添加有木聚糖酶的那些动物的比较。
[0230] 实施例11. 速溶咖啡生产纯甘露聚糖是咖啡胚乳的主要储存多糖组分，并导致其高粘度，其负面影响速溶咖啡
的技术处理，且增加干燥期间的能量消耗。那些效应归因于形成硬的、不溶的晶体结构的甘露聚糖。β-甘露聚糖酶，经常与其他酶诸如果胶酶和纤维素酶一起，在速溶咖啡生产的浓缩步骤期间添加，以降低咖啡提取物中的粘度。甘露聚糖酶也用于水解液体咖啡提取物中存在的半乳甘露聚糖，以便在速溶咖啡的冷冻干燥期间抑制凝胶形成。此外，由于使用酶促处理，咖啡豆提取物可以通过低成本程序诸如蒸发来浓缩。
的技术处理，且增加干燥期间的能量消耗。那些效应归因于形成硬的、不溶的晶体结构的甘露聚糖。β-甘露聚糖酶，经常与其他酶诸如果胶酶和纤维素酶一起，在速溶咖啡生产的浓缩步骤期间添加，以降低咖啡提取物中的粘度。甘露聚糖酶也用于水解液体咖啡提取物中存在的半乳甘露聚糖，以便在速溶咖啡的冷冻干燥期间抑制凝胶形成。此外，由于使用酶促处理，咖啡豆提取物可以通过低成本程序诸如蒸发来浓缩。
[0231] 根据图12的以下流程图，在10℃的温度和0.15% d.s.的酶剂量下，进行测试。
[0232] 本发明的甘露聚糖酶变体在由不同的酶(诸如果胶酶和纤维素酶)构成的混合物中进行测试。
[0233] 在标准处理条件下，咖啡提取物的粘度随时间的推移显著增加。然而，使用含有本发明的甘露聚糖酶变体的酶混合物，粘度显著降低，得到改进的下游处理，诸如喷雾干燥或冷冻干燥。
[0235] 甘露聚糖酶有助于提高有价值的水果组分的提取，降低浓缩前果汁的粘度，并提高过滤速度和最终产物的稳定性。
[0236] 将菠萝在绞肉机中粉碎，且然后在1000 ml烧杯中装入500 g糊状物。在21℃应用酶，反应时间为60分钟。然后根据以下压制方案，用小型Hafico压机压制该糊状物：0巴2 min - 50巴2 min - 100巴2 min - 150巴2 min - 200巴1 min - 300巴1 min - 400巴1min。获得的果汁然后以4500 rpm离心5分钟，并分析其浊度和粘度。
[0237] 本发明的甘露聚糖酶变体在酶混合物A、B和C中进行测试(表7)。
[0238] 将所述酶首先用自来水稀释，然后添加至菠萝糊状物中。
[0239] 表7. 酶混合物 酶活性 剂量 [ppm] 5 ml [%酶溶液]
空白 5 ml H2O
混合物A 果胶酶 50 0.50%
混合物B 果胶酶 + 阿拉伯聚糖酶 50 0.50%
混合物C 果胶酶 + 甘露聚糖酶 50 0.50%
空白 5 ml H2O
混合物A 果胶酶 50 0.50%
混合物B 果胶酶 + 阿拉伯聚糖酶 50 0.50%
混合物C 果胶酶 + 甘露聚糖酶 50 0.50%
[0240] 应用本发明的甘露聚糖酶变体导致菠萝处理中果汁的收率增加和浊度降低。
[0241] 实施例13. 用于豆奶生产的大豆的甘露聚糖酶处理为了酶促处理大豆以得到豆奶，通常使用“热处理”。对于热豆奶处理，将干燥的大豆与沸腾的自来水按1:7的比率(浸泡的豆:水)在搅拌机中混合并粉碎。在加入酶之前，将整个大豆浆料冷却至50-55℃。大豆浆料的pH水平应在pH 6.5左右并可用NaHCO3调节。将甘露聚糖酶以1 kg/t干燥大豆的剂量加入浆料中并搅拌30 min。在反应时间完成后，使用实验室压力机压制浆料，以获得最终产物：豆奶。为了确保相同的压制概况，指定压力以及相应的压制时间，如表8中所示。除了酶促反应的样品以外，还制备没有任何酶的对照样品，其中用水替代酶溶液。
[0242] 表8. 压制方案压力[巴] 0 50 100 300
时间[min] 2 2 2 1
时间[min] 2 2 2 1
[0243] 压制后，将豆奶在微波中加热，直至沸腾以停止酶反应。豆奶的分析： 收率(以克/时间计)
用折射计测定白利糖度(°Brix)，其给出豆奶中的糖量的直接相关性
用测量比浊浊度的NTU-光度计测量果汁的浊度
用LAB-测量法测量亮度
蛋白含量用CN-分析仪测定(燃烧方法)
风味。
用折射计测定白利糖度(°Brix)，其给出豆奶中的糖量的直接相关性
用测量比浊浊度的NTU-光度计测量果汁的浊度
用LAB-测量法测量亮度
蛋白含量用CN-分析仪测定(燃烧方法)
风味。
[0244] 用本发明的甘露聚糖酶变体处理的豆奶显示增加的收率、更亮的颜色、增加的白利糖度、更低的浊度、更高的蛋白含量和更好的味道(异味除去)。
[0245] 在不限制专利权利要求的范围和解释的情况下，本文公开的一个或多个方面或实施方案的某些技术效果列于下面：一种技术效果是甘露聚糖的降解或修饰。另一技术效果是提供具有良好储存稳定性的甘露聚糖酶。
[0246] 上文的描述通过本发明的具体实施方式和实施方案的非限制性实例的方式，已提供了本发明人目前为实施本发明所设想的最佳模式的完全且翔实的描述。然而，对于本领域技术人员来说清楚的是，本发明不局限于上面呈现的实施方案的细节，而其可以在不偏离本发明的特征的情况下在其他实施方案中使用等效方式来实施。
[0247] 此外，本发明的上文公开的方面和实施方案的一些特征可以用于发挥益处，而不需要相应地使用其他特征。因此，上面的描述应被视为仅仅说明本发明的原理，且不限于此。因此，本发明的范围仅受所附专利权利要求的限制。
[0248] 在一个实施方案中，与相应的自然组分相比，本发明的组合物的至少一种组分具有不同的化学、结构或物理特征，所述至少一种组分源自所述自然组分。在一个实施方案中，所述特征是均匀大小、均匀分散、不同同种型、不同密码子简并性、不同翻译后修饰、不同甲基化、不同三级或四级结构、不同酶活性、不同亲和力、不同结合活性和不同免疫原性中的至少一种。
[0249] 参考文献
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 嵌合病毒样颗粒以及其作为免疫反应的抗原特异性重定向剂的用途 | 2020-05-11 | 777 |
| 沼水蛙分泌肽及其基因和在制药中的应用 | 2020-05-13 | 937 |
| 用于基因组工程的与核酸内切酶相连的修复模板 | 2020-05-15 | 304 |
| 白介素-13结合蛋白 | 2020-05-11 | 852 |
| 引发剂衍生肽及其用途 | 2020-05-11 | 728 |
| 基于CRISPR效应系统的诊断 | 2020-05-14 | 211 |
| 用于鉴定表位的方法和组合物 | 2020-05-08 | 109 |
| 包含核酸及CAR修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用 | 2020-05-11 | 79 |
| 一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法 | 2020-05-13 | 403 |
| 免疫调节转基因植物及相关方法 | 2020-05-12 | 281 |
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