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一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法

阅读：207发布：2020-10-27

专利汇可以提供一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法，该方法包括如下步骤：胚胎干细胞体外扩增培养；胚胎干细胞传代培养；胚胎干细胞向神经前体细胞诱导分化和体外扩增。本发明公开了一种胚胎干细胞分化神经前体细胞的方法，通过集落的形式进行体外培养，由于集落中间的细胞致密，细胞之间相互作用较强，使得外周的细胞更容易分化，同时，该方法中供体细胞来源充足、纯度高、无污染，为神经细胞的获取来源提供一种新的途径。，下面是一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、胚胎干细胞体外扩增培养；
S2、胚胎干细胞传代培养；
S3、胚胎干细胞向神经前体细胞诱导分化和体外扩增。
2.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法，其特征在于：所述S1的具体步骤为，取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上。
3.根据权利要求2所述的一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法，其特征在于：所述BG02培养基成分为：DMEM/F12培养基中加入15％KSR、4ng/mL bFGF、1.5-2mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL 链霉素、50μg/mL青霉素。
4.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法，其特征在于：所述S2的具体步骤为，将培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6。
5.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法，其特征在于：所述S3的具体步骤为，将体外培养的胚胎干细胞转移至加入神经前体细胞基础培养基的四孔培养板，贴壁培养10-12d后用0.05％的胰酶消化处理，之后接种至四孔培养板中进行扩增培养，培养基为神经前体细胞培养基中加入10-15ng/mL bFGF和10-15ng/mL EGF，培养结束后染色筛选得到神经前体细胞。
6.根据权利要求5所述的一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法，其特征在于：神经前体细胞基础培养基为DMEM/F12培养基中加入50％NeuroBasal Medium、1％N2 supplement、1％B27、1.5-2mmol谷氨酰胺、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素。

说明书全文

一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法。

背景技术

[0002] 胚胎干细来源于植入前胚胎的内细胞团，具有自我更新能力和发育全能性，能够在体内外分化为代表三个胚层的细胞类型，Thomson建立了第一株人胚胎干细胞系(hES细胞)，使胚胎干细胞由实验室研究向临床应用迈进了一大步，此后，hES细胞的研究取得了突飞猛进的发展。尽管面临许多伦理上的争议，但是hES细胞在未来再生医学方面的应用前景正吸引着越来越多的科学家。hES细胞的体外分化为研究胚胎早期发育的细胞和分子机制提供了良好的模型，也可为未来临床上的移植治疗提供供体细胞来源。由于许多神经系统的病理学损伤，如痴呆、癫痫或神经退行性疾病，如帕金森症、阿尔茨海默氏症等疾病目前只能通过药物来防止病情的恶化，而没有根治的疗法。因此，将功能性的神经细胞移植入体内可能给这些疾病的治疗带来希望。移植能够产生多巴胺的神经细胞治疗帕金森症是细胞替代治疗神经系统疾病的最早尝试；而神经前体细胞不仅能够自我更新和分化为所有类型的神经细胞，而且能够迁移并整合到中枢神经系统的受损部位，因此，利用多能性的神经前体细胞修复脑和脊髓的损伤则是细胞替代性治疗的巨大前景。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法，该方法中供体细胞来源充足、纯度高、无污染，为神经细胞的获取来源提供一种新的途径。

[0004] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0005] 一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法，该方法包括如下步骤：

[0006] S1、胚胎干细胞体外扩增培养；

[0007] S2、胚胎干细胞传代培养；

[0008] S3、胚胎干细胞向神经前体细胞诱导分化和体外扩增。

[0009] 进一步地，所述S1的具体步骤为，取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上。

[0010] 进一步地，所述BG02培养基成分为：DMEM/F12培养基中加入15％KSR、4ng/mL bFGF、1.5-2mmol谷氨酰胺、0.1-0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL 链霉素、50μg/mL青霉素。

[0011] 进一步地，所述S2的具体步骤为，将培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6。

[0012] 进一步地，所述S3的具体步骤为，将体外培养的胚胎干细胞转移至加入神经前体细胞基础培养基的四孔培养板，贴壁培养10-12d后用0.05％的胰酶消化处理，之后接种至四孔培养板中进行扩增培养，培养基为神经前体细胞培养基中加入10-15ng/mL bFGF和10-15ng/mL EGF，培养结束后染色筛选得到神经前体细胞。

[0013] 进一步地，神经前体细胞基础培养基为DMEM/F12培养基中加入50％NeuroBasal Medium、1％N2 supplement、1％B27、1.5-2mmol谷氨酰胺、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素。

[0014] 本发明具有以下有益效果：

[0015] 本发明公开了一种胚胎干细胞分化神经前体细胞的方法，通过集落的形式进行体外培养，由于集落中间的细胞致密，细胞之间相互作用较强，使得外周的细胞更容易分化，同时，该方法中供体细胞来源充足、纯度高、无污染，为神经细胞的获取来源提供一种新的途径。

[0016] 当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

具体实施方式

[0017] 本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

[0018] 本发明为一种人工诱导多能干细胞分化为神经前体细胞的方法，该方法具体步骤如下：

[0019] 实施例1

[0020] S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上，其中培养液成分为：DMEM/F12培养基中加入15％KSR、4ng/mL bFGF、1.5mmol谷氨酰胺、0.1mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；

[0021] S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5；

[0022] S3、将体外培养的胚胎干细胞转移至加入神经前体细胞基础培养基的四孔培养板，贴壁培养10d后用0.05％的胰酶消化处理；

[0023] 其中神经前体细胞基础培养基为DMEM/F12培养基中加入50％NeuroBasal Medium、1％N2 supplement、1％B27、1.5mmol谷氨酰胺、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；

[0024] S4、将S3中消化处理后的细胞接种至四孔培养板中进行扩增培养，培养基为神经前体细胞培养基中加入10ng/mL bFGF和10ng/mL EGF，培养结束后染色筛选得到神经前体细胞。

[0025] 实施例2

[0026] S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上，其中培养液成分为：DMEM/F12培养基中加入15％KSR、4ng/mL bFGF、2mmol谷氨酰胺、0.15mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；

[0027] S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:6；

[0028] S3、将体外培养的胚胎干细胞转移至加入神经前体细胞基础培养基的四孔培养板，贴壁培养12d后用0.05％的胰酶消化处理；

[0029] 其中神经前体细胞基础培养基为DMEM/F12培养基中加入50％NeuroBasal Medium、1％N2 supplement、1％B27、2mmol谷氨酰胺、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；

[0030] S4、将S3中消化处理后的细胞接种至四孔培养板中进行扩增培养，培养基为神经前体细胞培养基中加入15ng/mL bFGF和15ng/mL EGF，培养结束后染色筛选得到神经前体细胞。

[0031] 实施例3

[0032] S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上，其中培养液成分为：DMEM/F12培养基中加入15％KSR、4ng/mL bFGF、1.8mmol谷氨酰胺、0.13mol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L非必需氨基酸、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；

[0033] S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5.5；

[0034] S3、将体外培养的胚胎干细胞转移至加入神经前体细胞基础培养基的四孔培养板，贴壁培养11d后用0.05％的胰酶消化处理；

[0035] 其中神经前体细胞基础培养基为DMEM/F12培养基中加入50％NeuroBasal Medium、1％N2 supplement、1％B27、1.8mmol谷氨酰胺、50μg/mL链霉素、50μg/mL青霉素；

[0036] S4、将S3中消化处理后的细胞接种至四孔培养板中进行扩增培养，培养基为神经前体细胞培养基中加入12ng/mL bFGF和13ng/mL EGF，培养结束后染色筛选得到神经前体细胞。

[0037] 以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

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