【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えば糸状菌又は担子菌等の菌類が有している有用遺伝子を酵母菌に導入して利用可能にする細胞融合法、および該方法によって得られた融合細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、遺伝子工学技術の進歩は著しく、
同種または異種細胞間の遺伝子の授受に関する手法は数多く開発され、また実用化されているものもある。 代表的な方法では、母細胞中の有用遺伝子の存在を染色体上で捜し出し、確認し、次いでその有用遺伝子部分を適当な制限酵素を用いて切り出す。 次いで適当なベクターを用いて、適当な宿主細胞に導入して形質転換することによって行われている。

【０００３】しかし、目的とする有用な物質の産生能（もしくは機能）が、複数の成分から構成されている場合、（たとえば、トリコデルマ属糸状菌のセルラーゼ成分は大きく分けても、アビセル分解酵素成分、ＣＭ
Ｃ分解酵素成分、β−グルコシダーゼ成分、の３成分からなり、さらに各々が複数の成分からなっており、このことは、必要とするセルラーゼの情報が多数の遺伝子群にまたがって存在していることになる）各々の成分の遺伝子に関して上記の操作を行うことは、複雑な操作及び確認方法が必要となり、現実的でない。

【０００４】また、母細胞の遺伝子情報を有するＤＮＡ
を直接、宿主菌、例えば酵母菌のプロトプラストを用いてトランスフォーメーションする方法もあるが、宿主菌内には、異種ＤＮＡを排除分解する酵素が存在するので、裸のＤＮＡが酵母菌体内にトランスフォーメーションされても、破壊される可能性が高く、目的とするＤＮ
Ａが宿主染色体中に取り込まれた酵母が得られる頻度はきわめて低い。

【０００５】即ち、ＤＮＡトランスフォーメーションについては、サイズの非常に大きな染色体やＤＮＡを壊すこと無く精製するには非常に困難である。 このステップで染色体やＤＮＡの大半は物理的に破壊されてしまう。

【０００６】また、たとえ、破壊されずに精製しても菌体に導入するステップで再び物理的に破壊されることになる。 たとえ、菌体内に導入されたとしても、酵母菌体中の核酸分解酵素が導入された染色体やＤＮＡを異物として認識し、破壊しようとすることになる。 これではうまくいっても、導入染色体やＤＮＡのごく一部のみしか酵母核に組込まれないこととなる。 万一、どのステップでも破壊されずに導入できたとしても、必要な遺伝子群以外の多数の不必要な遺伝子群も組込んでしまい雑種の遺伝安定性に不安が生じる。

【０００７】自然界から選択、分離によって同等の微生物を獲得する手段はあるが、莫大な労力と時間を必要とする。 たとえ、この方法で目的株が得られて、更に生産性を上げようとしても手段がなく、また自然界から探すことになりかねない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、従来の遺伝子操作で、非常に多数存在するトリコデルマの酵素成分遺伝子を一つ一つプラスミドに組込み、その一つ一つに遺伝子を発現させるためのプロモータを組込むとしたら莫大な労力と時間を要することになる。 たとえ実施したとしても、酵母菌体が莫大な数のプラスミドを安定に保持できるか定かではない。

【０００９】一方、本発明者は、糸状菌または担子菌についてコルヒチン、またはコルセミド誘導体で処理することにより、同質多倍数体が高頻度で効率的に得られることを見出し、既に特願平１−５００９１号（特開平２
−２３１０８０号）として提案しているが、同じく糸状菌または担子菌とくにトリコデルマ属糸状菌またはアスペルギルス属糸状菌について、コルヒチン、コルセミドなどの倍数体誘発剤で、非栄養条件下に長時間処理を行うと、細胞内の核が小型化した、微小核状態となることを見出した。

【００１０】本発明は、この微小核状態となる現象を利用して、複数の遺伝子情報からなる機能を一括して、目的の宿主細胞、特に酵母菌細胞に導入する細胞融合法を提供することを目的とし、さらに具体的に、本法を用いて例えばセルラーゼ産生能を有する酵母菌を得ることを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本請求項１に記載の発明に係る細胞融合法では、所定の遺伝子を有する菌類の分生子又は菌糸体の被験細胞を非栄養条件下で倍数体誘発剤に曝して微小核を形成させた後に前記細胞を細胞壁溶解酵素で処理してプロトプラストとし、酵母菌を細胞壁溶解酵素で処理してプロトプラストとし、前記２つのプロトプラストを融合させるものである。

【００１２】また、本請求項２に記載の発明に係る細胞融合法では、前記２つのプロトプラストを融合させた後に、２つのプロトプラスト由来の核同士を融合させる核融合処理を行うものである。

【００１３】更に具体的には、前記菌類がトリコデルマ属糸状菌であるもの、前記倍数体誘発剤がコルヒチン又はコルセミドであるものを開示するものである。

【００１４】また、前記細胞融合法によって得られた融合細胞では、前記請求項１〜４の何れかに記載の方法で得られた融合細胞において、前記被験細胞がセルラーゼ産生遺伝子を有するトリコデルマ・リーゼイとし、前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエとしたものであり、具体的にＴＲＳＣ−２，ＴＲＳＣ−３，又はＴＲＳ
Ｃ−４を開示するものである。

【００１５】

【作用】本発明においては、所定の遺伝子を有する菌類の分生子又は菌糸体の被験細胞を非栄養条件下で倍数体誘発剤に曝して微小核を形成させた後に前記細胞を細胞壁溶解酵素で処理してプロトプラストとし、酵母菌を細胞壁溶解酵素で処理してプロトプラストとし、前記２つのプロトプラストを融合させるものであるため、複数の遺伝子群からなる有用生産物の遺伝子を含む微小核を形成し、その他の不必要な遺伝子群が雑種形成にさほど関与しないようにでき、異属間プロトプラスト融合における雑種獲得頻度を向上させ、得られる異属間雑種の遺伝安定性を向上させることができる。

【００１６】即ち、通常の核を用いた異属間プロトプラスト融合では、融合プロトプラストが再生する間に両方の菌体が「分離」してしまい、バラバラになってしまう。 たとえ「分離」せずに融合物がコロニーを形成しても、著しく低頻度でしか生じず、この融合物は継代培養中に高頻度で「分離」してしまう。 導入する側を微小核にして異属間融合を行うと以上の問題が全て克服できる。 これは、高頻度で遺伝的に安定な異属間雑種が得られることを意味する。

【００１７】また、例えば有用生産物の遺伝子等の所定の遺伝子を含む染色体を微小核として、一度の操作で酵母に導入し、酵母核に組込むことにより、容易に交互にその種の有用生産物を生産させることができる。

【００１８】更に、２つのプロトプラストを融合させた後に、２つのプロトプラスト由来の核同士を融合させる核融合処理を行った場合には、目的とする安定な融合細胞の獲得頻度が向上する。 核融合処理とは、具体的に紫外線照射やカンファー処理等であり、この場合にも、一方が微小核であるために、比較的容易に核融合処理が行うことができる。

【００１９】更に詳しく付言するならば、目的とする有用遺伝子情報を有する糸状菌または担子菌、特にトリコデルマ属糸状菌またはアスペルギルス属糸状菌の微小核保持菌体を得るには、該菌糸体もしくは分生子を倍数体誘発剤、好ましくはコルヒチン，コルセミドに曝して処理することにより得られる。 この際、処理するコルヒチン水溶液中に栄養成分が存在すると、同質多倍数体の生成がともなうので、蒸溜水溶液等の非栄養条件下で行うことが必要である。 また、この倍数体誘発剤処理は、比較的長時間、例えば１０時間〜数日間行うことが望ましい。

【００２０】次に、微小核保持菌体をプロトプラストとして、導入を目的とする宿主酵母菌のプロトプラストとの間に、融合細胞を生成させる。 各々のプロトプラスト化は常法により、すなわち適当な細胞壁溶解酵素で対象となる微小核保持菌体および宿主酵母菌を処理する。

【００２１】次いで、微小核保持菌体のプロトプラスト、宿主酵母菌のプロトプラストとの融合細胞は、常法により行われる。 即ち、例えばポリエチレングリコール水溶液中で塩化カルシウムの存在下で処理することにより融合細胞を得ることができる。

【００２２】目的とする、有用遺伝子を含む融合細胞の獲得は、前記の融合細胞を適当な培地で培養・再生処理を行い、次いで、目的とする機能を有しているかの確認を行い、目的の機能を有した融合細胞を採取することにより達成される。 このとき、前記融合操作で得られた融合細胞にさらに紫外線照射、カンファー処理等の核融合処理を行うと、目的とする安定な融合細胞の獲得確率が向上する。

【００２３】以上の操作で具体的に得られた融合細胞として、セルラーゼ産生遺伝子を有するトリコデルマ・リーゼイと、サッカロマイセス・セレビシエとを融合したＴＲＳＣ−２，ＴＲＳＣ−３，又はＴＲＳＣ−４を開示するものである。 尚、このうち、ＴＲＳＣ−４は微工研菌寄第１２４４６号として寄託済みである。 本融合細胞は、セルラーゼ産生酵母であり、セルロース資化能力を有し、セルロースからアルコール直接発酵を可能とする。 よって、未利用資源や廃資源の有効利用への道等が開かれることになり、社会的、経済的に有望である。

【００２４】

【実施例】

実施例１（コルヒチン処理） トリコデルマ・リーゼイ( Trichoderma reesei ) ＱＭ９
４１４（ＡＴＣＣ１３６３１株）の分生子を５０ｍｌのスピッチグラスに入れた５％コルヒチン水溶液（ｐＨ
９．０）に加え、室温で２４時間往復振盪すると分生子中に微小核が形成される。 この微小核を保持する分生子由来の菌体中には同様に微小核が形成される。 この小型の微小核は染色体の異常分裂或いは染色体の脱濃縮によって生じたものと考えられる。

【００２５】実施例２（プロトプラスト化及び融合細胞） 次に、得られた微小核のプロトプラストと、酵母のプロトプラストとを融合させた。 プロトプラストは、実施例１で得られたコルヒチン処理分生子由来の菌体を３．５
％濃度の細胞壁溶解酵素”ファンセラーゼ(Funcelase)
ヤクルト本社製”で４０℃、３時間処理して微小核のプロトプラストを調製した。また、２０時間培養した酵母菌体を同様の処理を行い酵母のプロトプラストを調整した。

【００２６】調製した各々のプロトプラストを０．１Ｍ
ＣａＣｌ ₂を含む３３％ポリエチレングリコール中で３５℃、３０分間加温後、１０００ｇで５分間遠心分離を行い融合処理した。 融合プロトプラストは洗浄後０．
１％ＣＭＣ−Ｎａを含む寒天培地に塗布し、同培地を重層し、２８℃で培養すると約１週間で再生、コロニー増殖が見られ、コロニーの一部分がＣＭＣ−Ｎａ層を通過して培地表面に現れたものを融合された細胞として選別した。 尚、酵母元株は、７日間培養しても境界面に微小なコロニーを形成するだけで、上層を突破できず表面にも現われなかった（元株にはセルラーゼ生産性がないためＣＭＣ−Ｎａ存在下では増殖できないが、融合株はセルラーゼ生産性があるため増殖可能である）。 トリコデルマは、この培地中で再生して表面に出てくるのに１４
日間かかり、培養７日間ではまだ表面に現れなかった。
３回の融合操作を行ない、表面に生じた融合株からランダムに１個ずつ選択し、ＴＲＳＣ−２，ＴＲＳＣ−３，
ＴＲＳＣ−４とした。

【００２７】実施例３（核融合処理） 実施例２で得られたコロニーはトリコデルマ菌体を分離するものが多く、遺伝的に不安定であることが推測されたので核融合処理を施した。 核融合処理は、０．１％カンファー（樟脳）を加えた培地上にコロニーを置いて数日培養し、増殖するコロニーを、核融合処理が完了したコロニーとした。

【００２８】実施例４（セルラーゼ産生能の確認） 得られたコロニーを用いてセルラーゼ産生能を確認した。 次の表１はセルラーゼ産生能を有する株の融合頻度の結果を示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】尚、表中プロトプラスト融合を行い、ＣＭ
Ｃ−Ｎａ層を通過して培地表面に現れたものを融合細胞数とし、初発プロトプラスト数に対する割合を求め融合頻度とした。 １回目の融合（Ｔ．リーゼイプロトプラスト数：酵母プロトプラスト数＝６×１０ ⁴ ：４×１０
⁴ ）ではそのようなコロニーが１０万個のプロトプラストに対して９個生じた。 このコロニーをカンファーとＣ
ＭＣ−Ｎａを含む培地上で培養した後、コンゴーレッド水溶液を加え１５分間放置後食塩水で洗浄するとコロニーの真下及び周辺に淡黄色の透明域が見られセルラーゼが生産されていると確認された。

【００３１】また、本実施例の場合には、カンファーを含まない培地で培養するとトリコデルマの菌体がセクター（扇状の異質なコロニーとして生じた）として現われ培地表面を覆った。 トリコデルマの分生子ないしは菌糸の混入の可能性については、融合株を一度プレートに塗布してコロニーを単離した場合でも同様な結果が得られたので、トリコデルマの分生子ないしは菌糸の混入の可能性は削除した。

【００３２】表に示すように、各々のプロトプラストの数を変えて、プロトプラスト融合を更に行って、多数の融合株を獲得したが獲得頻度はほぼ同様で融合株が一定の頻度で獲得できることが確認された。

【００３３】実施例５（セルラーゼ産生能） 次に核融合処理した融合株のセルラーゼ生産を調べた。
トリコデルマ、酵母元株、それに０．１％カンファーと０．１％ＣＭＣ−Ｎａを含む寒天培地上で核融合処理した融合株（ＴＲＳＣ−２，ＴＲＳＣ−３，ＴＲＳＣ−
４）を０．１％カンファーと０．１％ＣＭＣ−Ｎａを含む液体培地で２８℃、６日間回転振盪培養した後、菌体を遠心分離して除去し上清をエタノール沈殿し、沈殿物を０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解して試料とした。

【００３４】これらの試料を長さ７ｃｍのガラス管で、
５０mmのディスクゲルでディスクゲル電気泳動を行い泳動終了後ゲルを５mm毎に切断して、これをホモジナイズして０．１Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁させた。 セルラーゼの主要な３成分としてＣＭＣ分解活性、
アビセル(Avicel)分解活性、及びサリシン(Salicin) 分解活性の有無を各分画毎に基質と４０℃で１時間反応させて調べた。

【００３５】

【表２】

【００３６】表２に示したように、トリコデルマでは、
ＣＭＣ分解活性、アビセル分解活性、及びサリシン分解活性共に複数の成分が存在していた。

【００３７】核融合処理を行った融合株ＴＲＳＣ−２，
ＴＲＳＣ−３，ＴＲＳＣ−４は全てコンゴーレッドで透明域を形成したが、各分解活性を示す分画が１個から３
個ゲル上に存在した。 この結果により、融合株にはセルロース分解に必要な成分全てが存在していることが確認された。

【００３８】実施例６（遺伝安定性試験） 核融合処理した融合株のセルラーゼ生産性の遺伝安定性を継代培養によって調べた。 核融合処理した融合株を１
世代目として個数を計測し、これをＣＭＣ−Ｎａを含む培地に塗布して生ずるコロニー数から１世代目の何％がセルラーゼ生産性を保持するか調べた。 ＣＭＣ−Ｎａを含む培地上に新たに生ずるコロニーの中から適当に１個選択して次世代目とし、再び個数計測等の同様な操作を行い５世代目まで調べた。

【００３９】

【表３】

【００４０】表３に示すように、元株では、この培地で増殖するコロニーは得られなかった。 しかしながら、Ｔ
ＲＳＣ−２，ＴＲＳＣ−３，ＴＲＳＣ−４では継代培養すると５世代目でも、なおＣＭＣ−Ｎａ存在下で増殖し、セルラーゼ生産性は失われていないことが確認された。

【００４１】以上のように、微小核を用いた酵母とのプロトプラスト融合でセルラーゼ生産性を保持する安定な融合株が得られた。 この微小核によって異種間、異属間の安定な雑種獲得の可能性が高まると考えられる。

【００４２】また、従来より糸状菌でしか生産できずコスト面で限界があった有用生産物を、酵母を用いて低いコストで生産できることになる。 更に植物に付いても本発明は充分適用でき、色素やアルカロイド等の有用成分を酵母で生産できる可能性が考えられる。

【００４３】また、得られたセルラーゼ生産酵母は、セルロースからアルコール直接発酵を可能とする。 よって、未利用資源や廃資源の有効利用への道が開かれることになる。 社会的、経済的に有望である。

【００４４】また、アスペルギルス属やスポロトリクム
(Sporotrichum)属の糸状菌類や椎茸，カワラタケ等の担子菌類でも、同様に微小核を得て、有用な遺伝子を酵母に導入することが可能である。

【００４５】

【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、所定の遺伝子を有する菌類の分生子又は菌糸体の被験細胞を非栄養条件下で倍数体誘発剤に曝して微小核を形成させた後に前記細胞を細胞壁溶解酵素で処理してプロトプラストとし、酵母菌を細胞壁溶解酵素で処理してプロトプラストとし、前記２つのプロトプラストを融合させるものであるため、複数の遺伝子群からなる有用生産物の遺伝子を、主に微小核に組込みその他の不必要な遺伝子群が雑種形成にさほど関与しないようにでき、異属間プロトプラスト融合における雑種獲得頻度を向上させ、得られる異属間雑種の遺伝安定性を向上させることができる。 また、有用生産の遺伝子を微小核として一度に酵母に導入し、酵母核に組込むことにより、容易に交互にその種の有用生産物を生産させることができる。

【００４６】更に、２つのプロトプラストを融合させた後に、２つのプロトプラスト由来の核同士を融合させる核融合処理を行った場合には、目的とする融合細胞の獲得頻度が向上する。 核融合処理とは、具体的に紫外線照射やカンファー処理等であり、この場合にも、一方が微小核であるために、比較的容易に融合処理が行うことができる。

【００４７】具体的に得られた融合細胞として、セルラーゼ産生遺伝子を有するトリコデルマ・リーゼイと、サッカロマイセス・セレビシエとを融合したＴＲＳＣ−
２，ＴＲＳＣ−３，又はＴＲＳＣ−４を開示するものである。 本融合細胞は、セルラーゼ産生酵母であり、セルロース資化能力を有し、セルロースからアルコール直接発酵を可能とする。 よって、未利用資源や廃資源の有効利用への道等が開かれることになり、社会的、経済的に有望である等の効果を有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁵識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865）