【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝的に純系（同型接合体）のユーストマ属植物の作出方法に関する。 遺伝的に純系のユーストマ属植物とは、半数体ユーストマ属植物を倍加した倍加半数体ユーストマ属植物のことであり、これは一代雑種（Ｆ1）品種の作出などに利用できる。

【０００２】

【従来の技術】昭和10年頃に日本へ導入されたトルコぎきょう（分類的にはEustoma grandiflorum (Raf.) Shin
nersに属する）は、日本での育種が進展して、数多くの品種が育成されている。 導入当初は生育や形質にばらつきがあったものの中から、優良な形質を有するものを選抜して、自殖を繰り返し、遺伝的に固定させて、品種としていた。 ただしこの固定種では開花揃い、草姿、草勢などの均一性に欠ける面があった。 そして近年になって、主に日本の種苗会社を中心として、この均一性を実現する為に、数多くのＦ1品種が育成されてきている。
このＦ1品種を育成するためには、それぞれ遺伝的に固定されたほぼ純系の花粉親系統と種子親系統を交配することが不可欠であり、よりよいＦ1品種を選抜するためには数多くの純系同士を交配させてやる必要がある。 この純系を作出するためには、遺伝的に固定されていない植物体を５〜８年にわたって自殖させてやる過程が必要となり、長い年限を要するのが現状である。 その一方で、開発された品種の品種寿命は、消費流行の変化の加速化により、昔に比較して短くなってきている。 よって従来の自殖による方法では、消費者の嗜好の変化に対応した品種を時期相応に作出することが困難になってきている。

【０００３】純系の植物体を短期間で作出する方法としては、葯培養（Sudhir K. Sopory and Meenakshi Munsh
i, 1996, In Vitro Haploid Production in Higher Plan
ts,1, 145-176）、花粉培養（JM Dunwell, 1996, In
Vitro Haploid Productionin Higher Plants, 1, 205-2
16）、偽受精胚珠培養（Sara Sestili and Nadia Ficca
denti, 1996, In Vitro Haploid Production in Higher
Plants, 1, 263-274）、未受精胚珠培養（ER Joachi
m Keller and Larissa Korzun, 1996, In Vitro Haploid
Production in Higher Plants, 1, 217-235）などの方法がある。 葯培養とは、葯（雄しべ）の中の花粉を分裂させて植物体を再生させ、半数体の植物を得る技術である。 葯培養のうち、葯から花粉を取り出して培養する場合を特に花粉培養という。 また偽受精胚珠培養とは、偽受精を起こした胚珠から植物体を再生させ、半数体の植物を得る技術である。 通常、花粉は雌しべ（柱頭）に受粉して、花粉管を伸ばし、花粉の中の精核が卵細胞と受精する。 偽受精胚珠培養とは、放射線などで受精能力を失活させた花粉を交配させて、未受精卵の単為発生を促し（偽受精）、単為発生した偽受精卵を含む胚珠を培養して、植物体を再生させ、半数体の植物を得る手法である。 未受精胚珠培養とは、上記偽受精胚珠培養における失活させた花粉を受精させることなく、未受精卵を含む胚珠を培養する方法である。 一方、種属間交雑による半数体の作出も知られている。 種間交雑による半数体の成功例としては、オオムギ（ Hordeum vulgare ）におけるバルボサム法（KJ Kasha and KN Kao, 1970, Nat
ure 225, 874-876）や、タバコ（ Nicotiana tabacum ）
へのN.africanaの花粉の授粉による半数体タバコの作出（Burk, LG et al. 1979, Science 206, 585）や、
四倍性バレイショ（ Solanum tuberosum ）に二倍体野生種S.phureyaの花粉を授粉し、二倍性半数体のバレイショを得る事例（Hougas, RW et al. 1964, Crop Scie
nce 4, 593-595）が知られている。 属間交雑による半数体作出例としては、コムギ（ Triticum aestivum ）にバルボサム（ H.bulbosum ）やトウモロコシ（ Zea mays ）を交雑して、コムギ半数体を得た報告（IR Barclay 19
75, Nature 256, 410-411、牛山ら、1989, 育種学雑誌3
9, 別冊2, 146）や、オオムギにトウモロコシやイタリアンライグラスを交雑して、オオムギ半数体を作出した事例が知られている（Furusho et al., 1991, Japan J.
Breeding, 41, 41-44）。

【０００４】上記した方法により再生した植物は、自然倍加が起こらない限り半数体である。 そこで染色体数を倍加させる薬剤（コルヒチン、コルセミド、オリザリンなど）でカルスまたは植物体を処理し、染色体数を倍加させることにより（PS Rao and P. Suprasanna 199
6, In Vitro Haploid Production in Higher Plants,1,
317-339）、倍加半数体（純系の植物体）を得ることができる（ただし二倍性半数体であるバレイショは除く）。

【０００５】ユーストマ属の半数体作出に関する研究は先ず葯培養で行われきた（岡山農試、1991-1995）。 この葯培養によるユーストマ属半数体作出の報告例は１つだけあるが、幼苗段階で枯死している（岡山農試、199
5）。 そしてこの実験系による追試は成功していない。
また同じグループが未受精胚珠及び偽受精胚珠を培養する方法も試みていたが、成功していない（岡山農試、19
94-1995）。 一方、種属間交雑については、リンドウとの属間交雑を利用してのユーストマ属植物の半数体もしくは倍加半数体と推定される植物体の作出に関する報告がなされている（庄内日報98年8月18日付け）。 なお、
本願の出願時においてはまだ公知にはなっていないが、
偽受精胚珠培養法については、本発明者により、放射線量及び培養条件を改良することにより半数体倍加系統を作出する系が確立されている（特願平10-177103号）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、遺伝的に純系のユーストマ属植物を短期間で作出する方法としては、偽受精胚珠培養と種属間交雑を利用した方法が有効である。 しかし、偽受精胚珠培養を行うには、放射線などによる花粉の不活化が必須であり、その際X線発生装置などの放射線源が必要となる。 従って、これらの機械もしくは設備のない場合、偽受精胚珠培養を行うことが困難となりうる。 また、上記のリンドウとの属間交雑を利用する方法は、倍加半数体の作出率があまり高くなく（一さや当たり40-50粒）、また、ユーストマ属植物とリンドウの開花時期を合わせる必要があるという欠点がある。 本発明は、従来行われてきた遺伝的に純系のユーストマ属植物の作出方法に関わる諸問題を解決することを目的としたものである。 言い換えれば、短期間に純系の植物体を作出できうる手段の提供を目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、高次倍加ユーストマ属植物から得た花粉をユーストマ属植物の雌蕊に授粉することにより、花粉を受けとったユーストマ属植物において単為発生が誘発されることを見出し、本発明を完成した。 即ち、本発明は、ユーストマ属植物の雌蕊に、高次倍加ユーストマ属植物から得た花粉を授粉した後、その雌蕊の子房に含まれる胚珠もしくは種子を生育させることを特徴とする遺伝的に純系のユーストマ属植物の作出方法である。 また、本発明は、ユーストマ属植物の雌蕊に、高次倍加ユーストマ属植物から得た花粉を授粉した後、その雌蕊の子房に含まれる胚珠もしくは種子を摘出し、これを培地で培養することを特徴とする遺伝的に純系のユーストマ属植物の作出方法である。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はユーストマ属植物の全てに適用できるが、特にトルコぎきょう（Eustoma grandiflorum）では良好な結果が得られる。 本発明のユーストマ属植物は次のようにして作出することができる。 まず、ユーストマ属植物の染色体を倍加させ、高次倍加ユーストマ属植物を作出する。 染色体の倍加は、コルヒチン、コルセミド、オリザリンなどの通常の倍加処理時に用いられる試薬を含む溶液で処理することにより行うことができる。 高次倍加ユーストマ属植物としては、４倍体植物が好ましいが、６
倍体植物、８倍体植物であってもよい。

【０００９】次に、この高次倍加ユーストマ属植物から得られた花粉をユーストマ属植物の雌蕊に授粉する。 授粉時期は、ユーストマ属植物の花芽が開花し、柱頭が開いて授粉可能となった時期であれば特に限定されない。
また、単為発生を生じさせる方の植物が雄性不稔植物である場合を除き、開花前にその植物の葯を除去し、除雄しておくことが好ましい。 さらに、除雄後は、意図しない交雑が起こるのを防止するため、蕾を袋で覆っておくことが好ましい。 雄性不稔植物の場合は、除雄の必要はないが、袋がけは行うことが好ましい。 授粉後、子房が十分に肥大するまで放置する。 子房が十分肥大化するまでの期間は、植物の種類や栽培環境により異なるが、通常授粉から３〜４週間程度である。 この肥大化した子房をそのまま放置して種子を採取し、それを生育させて植物体を作出することもできるが、エタノールなどで殺菌した後、無菌的に分解して胚珠を摘出し、これを所定の培地で培養することによっても植物体を作出することができる。 摘出した胚珠は、胎座をつけたまま置床し、培養することも可能であるが、好ましくは、胚珠だけを置床する。 ここで用いる培地の基本組成は特に限定されるものではなく、例えば、ＭＳ培地の無機塩及び有機物組成に蔗糖を加えたものを用いる。 またココナッツミルクの添加が望ましい。 培養開始から３〜５週間程度で植物体が出現する。 通常は、生育又は培養過程で自然倍加するので、特別な処理をすることなく、倍加半数体系統、
即ち、遺伝的に純系の植物を得ることができるが、必要に応じて染色体を倍加させるための処理を行っていもよい。 倍加処理は、コルヒチン、コルセミド、オリザリンなどの通常の倍加処理時に用いられる試薬を含む溶液を用いて行うことができる。 また、予め半数体植物と倍加半数体植物とを識別し、半数体植物についてのみ倍加処理を行ってもよい。 識別方法としては、染色体数の調査、孔辺細胞内の葉緑体数の計測、フローサイトメトリーによる一細胞当たりのＤＮＡ含量の定量などの方法を用いることができる。

【００１０】

【実施例】［１］花粉供与植物の作出及びその遺伝的性質の確認 （１）除雄 ユーストマ属植物系統「 P94IS3B；一重性で、紫の花色」をパイプハウスで栽培し、その蕾から開葯前の葯をピンセットにより除去し、パラフィン紙製の袋で除雄した蕾を覆った。 （２）授粉 除雄から２〜７日後に、雌蕊が授粉可能となった状態の「 P94IS3B」の花の袋を取り除き、ユーストマ属植物系統（品種名：ペアクリアピンク；八重性で、明ピンクの花色のF１品種。このF１品種は、一重性のユーストマ属植物固定系統と八重性のユーストマ属植物固定系統とを交配させて育成させたものである）から採取した花粉を、「 P94IS3B」の花の雌蕊の柱頭部に授粉した。 その後再びパラフィン紙製の袋を「 P94IS3B」の花に被せて他の花粉との意図しない交雑が起こるのを防止した。

【００１１】（３）採種 授粉から５〜６週間後に「 P94IS3B」の子房を採取し、
定法に従い採種した。 （４）花粉供与植物の遺伝的性質の確認 （３）で得た種子を定法に従い播種し、植物体を70個体栽培し開花させた。 これらの植物体のうち、30個体が八重性、40個体が一重性を示し、その分離比はほぼ１：１
であった（χ ² ＝1.4286 5%上準で有意）。 もし、「ペアクリアピンク」の有する八重性という形質が一重性という形質に対して優性であり、また、「P94IS3B」が一重性という形質をホモに持つものであると仮定すれば、
八重性をヘテロに持つ「ペアクリアピンク」を「 P94IS
3B」に交配して得られる後代において、八重性と一重性の分離比は１：１となり、上記結果と一致する。 従って、この仮定は正しく、ユーストマ属植物において「ペアクリアピンク」の持つ八重性という形質は遺伝的に優性であると推察される。

【００１２】［２］倍加ユーストマ属植物体の作出 （１）倍加処理 「ペアクリアピンク」の種子を定法により播種した。 播種から２〜３週間後に子葉が展開したので、この幼植物体の茎頂部分裂組織を０.１％のコルヒチン水溶液で処理した。 （２）倍加個体の選抜 処理した「ペアクリアピンク」を栽培し、孔辺細胞内の葉緑体数及び花粉粒の大きさを調べ、また、フローサイトメトリーにより一細胞当たりのＤＮＡ含量を定量した。 この結果から染色体が倍加している個体を選抜した。 この植物体を「倍加ペアクリアピンク」とした。

【００１３】［３］授粉及び胚珠培養 （１）除雄 ［１］と同様の方法で「 P94IS3B」の除雄を行った。 （２）授粉 ［１］と同様の方法で「 P94IS3B」の雌蕊に「倍加ペアクリアピンク」の花粉を授粉した。 また、［１］と同様に授粉後の「 P94IS3B」の花にパラフィン紙製の袋を被せた。 （３）胚珠培養 授粉から２〜４週間後に「 P94IS3B」の子房を採取し、
表面殺菌後、子房を解剖し胚珠を摘出し培地に置床した。 培地には植物の組織培養で一般に利用されているＭ
Ｓ培地を用いた。 ただしショ糖を３％、ココナッツミルクを５０ml／L、ゲランガムを０.６％添加し、ｐＨは５.８に調整した。

【００１４】［４］授粉及び採種 （１）除雄 ［１］と同様の方法で「 P94IS3B」の除雄を行った。 （２）交配 （２）授粉 ［１］と同様の方法で「 P94IS3B」の雌蕊に「倍加ペアクリアピンク」の花粉を授粉した。 また、［１］と同様に授粉後の「 P94IS3B」の花にパラフィン紙製の袋を被せた。 （３）採種 授粉から５〜６週間後に「 P94IS3B」の子房を採取し、
定法に従い採種した。

【００１５】［５］授粉の結果得られた植物体の栽培試験及び倍数性の調査 （１）植物体の出現 ［３］で培養を開始した「 P94IS3B」の胚珠から３〜５
週間で植物体が出現した。 また［４］で採種した種子を定法通り播種すると、１〜２週間で発芽した。

【００１６】（２）植物の開花検定 授粉の結果得られた植物体を栽培し開花させた。 その結果、花粉として用いた「倍加ペアクリアピンク」の遺伝的関与の指標となりうる八重性を示した植物体は３００
個体中一つも見られなかった。 また、それらすべての植物体が「 P94IS3B」と同一の花色（紫）を示したわけではなく、花色が白であるものも８個体観察された。 つまり、花色の形質は分離していた。 これらの結果から、授粉の結果得られた植物体は「 P94IS3B」の体細胞に由来するものではなく、P94IS3B 」の卵細胞に由来するものと推察された。 つまり、「倍加ペアクリアピンク」から得た花粉により「 P94IS3B」において単為発生が誘発されたものと推察された。

【００１７】（３）倍数性の調査 得られた植物体から選んだ５０個体の倍数性について、
フローサイトメトリーによるＤＮＡ分析の結果、調査した個体は全て二倍性ユーストマ属植物であることが判明した。 この結果から、単為発生により生じた「 P94IS3
B」の卵細胞に由来する半数体植物が培養の過程、又は種子の形成から生育の過程で自然倍加が起きたと推察された。

【００１８】

【発明の効果】本発明は、効率的に遺伝的に純系（同型接合体）のユーストマ属植物を作出する方法を提供するものである。 このような遺伝的に純系なユーストマ属植物を利用することにより、ユーストマ属植物のＦ1品種を効率的に短期間で育成することが可能になる。