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一种蓝莓 多倍体的培养方法

阅读：888发布：2020-05-14

专利汇可以提供一种蓝莓多倍体的培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于果树生物技术领域，公开了一种蓝莓多倍体的培养方法。本发明以蓝莓品种“顶级”为研究材料，采用浸渍法，研究不同的加倍处理方式对多倍体形成产生的影响。在经过外植体的灭菌、初代培养、试验材料的加倍处理、继代培养、生根培养，建立起植株再生体系，并采用染色体计数法鉴定再生植株的倍数，最终建立起具有体系稳定、诱导效率高、环境友好等优点的蓝莓优良品种“顶级”的多倍体培养的技术体系，为蓝莓多倍体育种奠定基础。，下面是一种蓝莓多倍体的培养方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种蓝莓多倍体的培养方法，其特征是，包括以下步骤：
S1.外植体的灭菌；
将生长健壮的蓝莓的单芽茎段，转入灭菌剂中，于28℃，180r/min条件下摇床振荡处理
10min，再用无菌水冲洗，无菌滤纸吸干表面水分；
S2.初代培养；
将上述经过灭菌的单芽茎段接种在初代培养基上，培养条件为：温度24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，培养30-40天；
S3.加倍处理
将初代培养发出的嫩梢剪成单芽茎段，将其浸泡在经高压灭菌的0.05％-0.3％秋水仙素水溶液中，在该溶液中附加有0.1～0.5％尿素和0.1～0.5％硫代硫酸钠，然后放在摇床上以100r/min震荡，处理时间为6-72h，在超净工作台上将材料从秋水仙素水溶液中取出，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，备用；
S4.继代培养
将单芽茎段转接到继代培养基中，培养条件为：温度24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，培养30-40d；
S5.生根培养
待处理的腋芽萌动抽茎长至1～2cm后继代到新鲜的生根培养基中，培养条件为：温度
24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，培养30-40d；
S6.组培苗的倍性鉴定
生根培养后取茎尖或根尖进行染色体数目鉴定。
2.如权利要求1所述的一种蓝莓多倍体的培养方法，其特征是，步骤S1所述灭菌剂由艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油配制而成，配制方法：新鲜艾蒿叶片10～20g、新鲜芦荟叶片10～20g、新鲜洋葱10～20g，粉碎后加入茶树油10～20ml，用蒸馏水定容至500～1000ml，静置浸提12～24h后，过滤即得灭菌剂。
3.如权利要求1所述的一种蓝莓多倍体的培养方法，其特征是，步骤S2所述的初代培养基的配方为：MS+6-BA 0.1～0.5mg/L+IBA 0.05～0.3mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH 5.6～5.8，进行初代培养直至发出嫩梢。
4.如权利要求1所述的一种蓝莓多倍体的培养方法，其特征是，步骤S4所述的继代培养基的配方为：MS+6-BA 0.5～3.0mg/L+2ip 0.5～3.0mg/L+IAA 0.1～0.5mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH5.6～5.8。
5.如权利要求1所述的一种蓝莓多倍体的培养方法，其特征是，步骤S5所述的生根培养基为：MS+IAA 1.0～3.0mg/L+2ip 0.1～0.3mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH5.6～
5.8。

说明书全文

一种蓝莓 多倍体的培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于果树生物技术领域，本发明特别涉及一种蓝莓多倍体的培养方法。

背景技术

[0002] 多倍体(polyploid)是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体，多倍体在生物界广泛存在，常见于高等植物中，由于染色体组来源不同，可分为同源多倍体和异源多倍体，这是物种形成的另一种方式，是一种只经过一二代就能产生新物种的方式。由于多倍体生物一旦形成，它和原来的物种就发生生殖隔离，因而它成了新种，所以这种方式被称为爆发式的。多倍体有其特点并在果树生产实践和理论研究中具有重要意义。因此，世界各国非常重视果树多倍体的育种，并由此培育出一些优良的果树多倍体品种。

[0003] 蓝莓(Blueberry)是广泛种植的越桔属(Vaccinium ssp.)植物之一。大多数的蓝莓是多年生的落叶灌木，也有非常少量的常绿灌木，适合生长在疏松的酸性土壤环境中。蓝莓果实甜酸适口，还散发特有的清香，受到国内外水果爱好者的追捧。蓝莓果实还含有大量的维生素A、C、E、花青苷等生化物质，具有非常好的抗氧化、抗菌及净化效果，广泛应用于人类生活。

[0004] 目前，我国关于蓝莓的研究主要集中在资源调查、栽培生产、结果习性、生长环境分析以及生态研究等方面，有关蓝莓品种培育尤其是多倍体培育的研究还很少，这将严重影响我国蓝莓产业今后的发展。

[0005] 参考文献

[0006] [1]李晓艳,张志东,李亚东,吴林,刘海广,2010,秋水仙素诱导离体培养越橘多倍体研究,东北农业大学学报,41(1):38-42.

[0007] [2]刘庆忠,马怀宇,魏海蓉,艾呈祥,张力思,赵彦,罗伯特,戴维斯,韩振海,2008,秋水仙素诱导樱桃矮化砧木‘吉塞拉6号’获得六倍体再生植株，园艺学报,35(2):285-288.[0008] [3]石佳,郑文娟,任广炼,李政,李凌,2012,秋水仙素诱导越橘四倍体研究,西南师范大学学报(自然科学版),37(4):102-107.

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[0010] [5]马爱红,范培格,孙建设,李邵华,2005,四倍体葡萄诱导技术的研究,中国农业科学,38(8):1645-1651.

[0011] [6]张计育,李国平,乔玉山,王萌,李金凤,章镇,2009,秋水仙素对草莓离体叶片再生和多倍体诱导的影响,植物资源与环境学报,18(3):69-73.

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发明内容

[0013] 为弥补现有技术的空白，本发明提供一种蓝莓多倍体的培养方法，本发明以蓝莓品种“顶级”为研究材料，采用浸渍法，研究不同的加倍处理方式对多倍体形成产生的影响。在经过外植体的灭菌、初代培养、试验材料的加倍处理、继代培养、生根培养，建立起植株再生体系，并采用染色体计数法鉴定再生植株的倍数，最终建立起具有体系稳定、诱导效率高、环境友好等优点的蓝莓优良品种“顶级”的多倍体培养的技术体系，为蓝莓多倍体育种奠定基础。

[0014] 本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

[0015] 本发明提供了一种蓝莓多倍体的培养方法，包括以下步骤：

[0016] S1.外植体的灭菌；

[0017] 将生长健壮的蓝莓的单芽茎段，转入灭菌剂中，于28℃，180r/min条件下摇床振荡处理10min，再用无菌水冲洗，无菌滤纸吸干表面水分；

[0018] 所述灭菌剂由艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油配制而成，配制方法：新鲜艾蒿叶片10～20g、新鲜芦荟叶片10～20g、新鲜洋葱10～20g，粉碎后加入茶树油10～20ml，用蒸馏水定容至500～1000ml，静置浸提12～24h后，过滤即得灭菌剂；

[0019] S2.初代培养；

[0020] 将上述经过灭菌的单芽茎段接种在初代培养基上，初代培养基的配方为：MS+6-BA0.1～0.5mg/L+IBA 0.05～0.3mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH 5.6～5.8，进行初代培养直至发出嫩梢；培养条件为：温度24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，培养30-40天；

[0021] S3.加倍处理

[0022] 将初代培养发出的嫩梢剪成单芽茎段，将其浸泡在经高压灭菌的0.05％-0.3％秋水仙素水溶液中，在该溶液中附加有0.1～0.5％尿素和0.1～0.5％硫代硫酸钠，然后放在摇床上以100r/min震荡，处理时间为6-72h，在超净工作台上将材料从秋水仙素水溶液中取出，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，备用；

[0023] S4.继代培养

[0024] 将单芽茎段转接到继代培养基中，继代培养基的配方为：MS+6-BA 0.5～3.0mg/L+2ip0.5～3.0mg/L+IAA 0.1～0.5mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH5.6～5.8；培养条件为：温度24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，培养30-40d；

[0025] 所述2ip为2-异戊烯基腺嘌呤；

[0026] S5.生根培养

[0027] 待处理的腋芽萌动抽茎长至1～2cm后继代到新鲜的生根培养基中，生根培养基为：

[0028] MS+IAA1.0～3.0mg/L+2ip 0.1～0.3mg/L+0.5～0.7％琼脂+2～3％麦芽糖，pH5.6～5.8；培养条件为：温度24～26℃，每日日光灯光照16h，光强2000～2500lx，培养30-40d；

[0029] S6.组培苗的倍性鉴定

[0030] 生根培养后取茎尖或根尖进行染色体数目鉴定。染色体鉴定步骤：当茎尖或根尖长至1-2cm时取材，洗净。卡诺氏固定液I低温4℃固定24h，用0.002mol/L 8-羟基喹啉在4℃下预处理24h，再用1mol/LHCl(60℃)恒温解离5min，最后在卡宝液中压片染色30min，观察，照相。

[0031] 进一步的，所述灭菌剂配方优选为：新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片20g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h后，过滤，备用。

[0032] 进一步的，所述初代培养基配方优选为：MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。

[0033] 进一步的，所述继代培养基配方优选为：MS+6-BA2.0mg/L+2ip2.0mg/L+IAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。

[0034] 进一步的，所述生根培养基配方优选为：MS+IAA 2.0mg/L+2ip 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。

[0035] 优选的，步骤S3为：将初代培养发出的嫩梢剪成单芽茎段，将其浸泡在经高压灭菌的0.2％秋水仙素水溶液中，该秋水仙素水溶液中附加有0.3％尿素和0.3％硫代硫酸钠，然后放在摇床上以100r/min震荡，处理时间为36-48h，在超净工作台上将材料从秋水仙素水溶液中取出，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，备用。

[0036] 本发明与现有技术相比的有益效果是：

[0037] 1.本发明首次建立的优质蓝莓品种“顶级”多倍体培养的技术体系稳定性好；品种资源新颖。

[0038] 2.本发明采用艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油等混合溶液作为外植体灭菌剂，灭菌率最高可达到100％，与传统的外植体灭菌方法相比无毒副作用，属于环境友好型灭菌剂；

[0039] 3.本发明多倍体诱导时，采用了多种浓度的秋水仙素、尿素以及硫代硫酸钠混合溶液，其中尿素渗透性强，加入尿素会促进秋水仙素的吸收，尿素对生物大分子具有变性作用，如对蛋白质的变性，故会抑制纺锤丝的形成；硫代硫酸钠具有內吸传导的作用，借此有促进秋水仙素吸收的作用；使多倍体诱导的效果显著提高。附图说明

[0040] 图1为实施例1染色体计数鉴定图。

[0041] 图2为实施例3染色体计数鉴定图。

[0042] 图3为实施例4染色体计数鉴定图。

具体实施方式

[0043] 下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。

[0044] 实施例1

[0045] S1.外植体的灭菌；

[0046] 将生长健壮的蓝莓品种“顶级”的单芽茎段，转入灭菌剂中，摇床振荡(28℃，180r/min)处理10min，再用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分。

[0047] 所述灭菌剂由艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油配制而成，具体配制方法：新鲜艾蒿叶片10g、新鲜芦荟叶片10g、新鲜洋葱10g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提12h后，过滤，备用；

[0048] S2.初代培养；

[0049] 将上述经过灭菌的单芽茎段接种在初代培养基上，初代培养基的配方为：MS+6-BA0.1mg/L+IBA0.05mg/L+0.5％琼脂+2％麦芽糖，pH5.7，进行初代培养直至发出嫩梢。

[0050] S3.加倍处理；

[0051] 初代培养发出的嫩梢剪成单芽茎段，将其浸泡在经高压灭菌的0.05％秋水仙素水溶液(该溶液中附加有0.1％尿素和0.1％硫代硫酸钠)中；然后放在摇床上以100r/min震荡，处理时间为6h。在超净工作台上将材料从秋水仙素水溶液中取出，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，备用。

[0052] S4.继代培养；

[0053] 将单芽茎段转接到继代培养基中(MS+6-BA0.5mg/L+2ip0.5mg/L+IAA0.3mg/L+0.5％琼脂+2％麦芽糖，pH5.7)，待处理的腋芽萌动抽茎长至1cm后继代到新鲜的培养基中。

[0054] S5.生根培养；

[0055] 培养基为：MS+IAA 1.0mg/L+2ip 0.2mg/L+0.5％琼脂+2％麦芽糖，pH5.7。

[0056] S6.组培苗的倍性鉴定

[0057] 生根培养后取茎尖或根尖进行染色体数目鉴定；染色体鉴定实验步骤：当茎尖或根尖长至1cm时取材，洗净。卡诺氏固定液I低温4℃固定24h，用0.002mol/L 8-羟基喹啉在4℃下预处理24h，再用1mol/L HCl(60℃)恒温解离5min，最后在卡宝液中压片染色30min，观察，照相。

[0058] 实施例2

[0059] 本实施例考察不同浓度、组成的秋水仙素水溶液和处理时间对多倍体的影响。

[0060] 本实施例仅步骤3秋水仙素水溶液和处理时间与实施例1存在区别：

[0061] 处理方式1：以0％秋水仙素水溶液作为对照；

[0062] 处理方式2：0.1％秋水仙素水溶液，该溶液中附加有0.5％尿素和0.5％硫代硫酸钠中，处理时间为12h；

[0063] 处理方式3：0.15％秋水仙素水溶液，该溶液中附加有0.5％尿素和0.5％硫代硫酸钠中，处理时间为24h；

[0064] 处理方式4：0.2％秋水仙素水溶液，该溶液中附加有0.5％尿素和0.5％硫代硫酸钠中，处理时间为36h；

[0065] 处理方式5：0.25％秋水仙素水溶液，该溶液中附加有0.5％尿素和0.5％硫代硫酸钠中，处理时间为48h；

[0066] 处理方式6：0.3％秋水仙素水溶液，该溶液中附加有0.5％尿素和0.5％硫代硫酸钠中，处理时间为72h。

[0067] 实施例3

[0068] S1.外植体的灭菌；

[0069] 将生长健壮的蓝莓品种“顶级”的单芽茎段，转入灭菌剂中，摇床振荡(28℃，180r/min)处理10min，再用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分。

[0070] 所述灭菌剂由艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油配制而成，具体配制方法：新鲜艾蒿叶片15g、新鲜芦荟叶片15g、新鲜洋葱15g，粉碎后加入茶树油15ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提12h后，过滤，备用。

[0071] S2.初代培养；

[0072] 将上述经过灭菌的单芽茎段接种在初代培养基上(培养基的配方为：MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+0.5％琼脂+2％麦芽糖，pH5.7)，进行初代培养直至发出嫩梢。

[0073] S3.加倍处理；

[0074] 将初代培养发出的嫩梢剪成单芽茎段，将其浸泡在经高压灭菌的0.3％秋水仙素水溶液(该溶液中附加有0.5％尿素和0.5％硫代硫酸钠)中，然后放在摇床上以100r/min震荡，处理时间为72h。在超净工作台上将材料从秋水仙素水溶液中取出，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，备用。

[0075] S4.继代培养；

[0076] 将单芽茎段转接到继代培养基中(MS+6-BA3.0mg/L+2ip3.0mg/L+IAA0.5mg/L+0.5％琼脂+2％麦芽糖，pH5.7)，待处理的腋芽萌动抽茎长至2cm后继代到新鲜的培养基中。

[0077] S5.生根培养；

[0078] 培养基为：MS+IAA 3.0mg/L+2ip 0.3mg/L+0.5％琼脂+2％麦芽糖，pH 5.7。

[0079] S6.组培苗的倍性鉴定

[0080] 生根培养后进行染色体数目鉴定；染色体鉴定实验步骤：当茎尖或根尖长至2cm时取材，洗净。卡诺氏固定液I低温4℃固定24h，用0.002mol/L 8-羟基喹啉在4℃下预处理24h，再用1mol/L HCl(60℃)恒温解离5min，最后在卡宝液中压片染色30min，观察，照相。

[0081] 实施例4

[0082] S1.外植体的灭菌；

[0083] 将生长健壮的蓝莓品种“顶级”的单芽茎段，转入灭菌剂中，摇床振荡(28℃，180r/min)处理10min，再用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干表面水分。

[0084] 所述灭菌剂由艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油配制而成，配方：新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片20g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h后，过滤，备用。

[0085] S2.初代培养；

[0086] 将上述经过灭菌的单芽茎段接种在初代培养基上(培养基的配方为：MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8)，进行初代培养直至发出嫩梢。

[0087] S3.加倍处理；

[0088] 将初代培养发出的嫩梢剪成单芽茎段，将其浸泡在经高压灭菌的0.2％秋水仙素水溶液(该溶液中附加有0.3％尿素和0.3％硫代硫酸钠)中，然后放在摇床上以100r/min震荡，处理时间为36h。在超净工作台上将材料从秋水仙素水溶液中取出，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后，备用。

[0089] S4.继代培养；

[0090] 将单芽茎段转接到继代培养基中(MS+6-BA2.0mg/L+2ip2.0mg/L+IAA0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8)，待处理的腋芽萌动抽茎长至1.5cm后继代到新鲜的培养基中。

[0091] S5.生根培养；

[0092] 培养基为：MS+IAA 2.0mg/L+2ip 0.1mg/L+0.7％琼脂+3％麦芽糖，pH5.8。

[0093] S6.组培苗的倍性鉴定

[0094] 生根培养后进行染色体数目鉴定；染色体鉴定实验步骤：当茎尖或根尖长至2cm时取材，洗净。卡诺氏固定液I低温4℃固定24h，用0.002mol/L 8-羟基喹啉在4℃下预处理24h，再用1mol/L HCl(60℃)恒温解离5min，最后在卡宝液中压片染色30min，观察，照相。

[0095] 一、灭菌剂效果实验数据

[0096] 采用艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油等混合溶液作为外植体灭菌剂，灭菌率最高可达到100％实验数据：

[0097] 以蓝莓花蕾为例

[0098] 配方A：新鲜艾蒿叶片10g、新鲜芦荟叶片10g、新鲜洋葱10g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提12h的过滤液。浸泡外植体20min。

[0099] 配方B：新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片5g、新鲜洋葱5g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h的过滤液。浸泡外植体20min。

[0100] 配方C：新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片20g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h的过滤液。浸泡外植体30min。

[0101] 配方D：新鲜艾蒿叶片10g、新鲜芦荟叶片30g、新鲜洋葱10g，粉碎后加入茶树油10ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提12h的过滤液。浸泡外植体30min。

[0102] 配方E：新鲜艾蒿叶片5g、新鲜芦荟叶片5g、新鲜洋葱20g，粉碎后加入茶树油20ml，用蒸馏水定容至1000ml，静置浸提24h的过滤液。浸泡外植体30min。

[0103] 每个配方每瓶接种10个花蕾，重复5次。计算无菌率。

[0104] 实验结果如下表1-3所示：

[0105] 表1外植体灭菌效果

[0106]

[0107] 表2外植体灭菌效果的方差分析

[0108]变异来源自由度平方和均方 F值 F0.05 F0.01
处理间 4 5624.00 1406.00 43.94 2.87 4.43
误差 20 640.00 32.00
总变异 24 6264.00

[0109] 表3外植体灭菌效果的差异显著性检验

[0110]处理平均数 5％差异 1％差异
处理3 98.00 a A
处理4 72.00 b B
处理5 72.00 b B
处理2 58.00 c C
处理1 56.00 c C

[0111] 从结果可以明显得到，本发明的灭菌技术方案：处理3(C)的灭菌效果极显著地优于其他配方。

[0112] 二：秋水仙素、尿素、硫代硫酸钠三种物质的协同作用实验数据、[0113] 在实验中发现，这三种物质在一起时，对多倍体的效果极显著地好于秋水仙素以及秋水仙素与尿素和硫代硫酸钠单独配合时的效果。这一结果实际上表明三者之间确实存在着协同作用。下面是实验结果(以最佳组合为例)。

[0114] 处理1：将初代培养发出的嫩梢剪成单芽茎段，将其浸泡在经高压灭菌的0.2％秋水仙素水溶液中，该秋水仙素水溶液中附加有0.3％尿素和0.3％硫代硫酸钠。

[0115] 处理2：将初代培养发出的嫩梢剪成单芽茎段，将其浸泡在经高压灭菌的0.2％秋水仙素水溶液中。

[0116] 处理3：将初代培养发出的嫩梢剪成单芽茎段，将其浸泡在经高压灭菌的0.2％秋水仙素水溶液中，该秋水仙素水溶液中附加有0.3％尿素。

[0117] 处理4：将初代培养发出的嫩梢剪成单芽茎段，将其浸泡在经高压灭菌的0.2％秋水仙素水溶液中，该秋水仙素水溶液中附加有0.3％硫代硫酸钠。

[0118] 将上述处理后放在摇床上以100r/min震荡，处理时间为48h，在超净工作台上将材料从处理中取出，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分，经继代培养后取茎尖制片，显微镜下检查染色体的倍性，每个处理取5个茎尖(即5个重复)，每个茎尖观察20个细胞，统计形成多倍体的情况，并进行统计分析。

[0119] 实验结果如下表4-6所示：

[0120] 表4四种处理对多倍性诱导效果的影响(诱导率，％)

[0121]

[0122] 对表4进行方差分析(见表5)，结果表明4个处理之间存在极显著差异，于是对各处理进行差异显著性检验，结果见表6。

[0123] 表5四种处理对多倍性诱导效果的方差分析

[0124]变异来源自由度平方和均方 F值 F0.05 F0.01
处理间 3 2445.00 815.00 118.55 3.24 5.29
误差 16 110.00 6.88
总变异 19 2555.00

[0125] 表6四种处理对多倍性诱导效果的差异显著性检验

[0126]处理平均数 5％差异 1％差异
处理1 43.00 a A
处理3 31.00 b B
处理4 28.00 b B
处理2 12.00 c C

[0127] 由表4可知，处理1的诱导效果极显著地高于其他三个处理，处理3和处理4之间差异不显著，但二者与处理2之间差异极显著。这个结果说明，秋水仙素、尿素、硫代硫酸钠三者的混合溶液的诱导效果最好，极显著地好于其他三种处理的诱导效果；尿素或硫代硫酸钠与秋水仙素单独配合均好于秋水仙素的诱导效果，说明秋水仙素、尿素、硫代硫酸钠三者之间一定存在着协同作用。

[0128] 三、灭菌剂具有协同作用实验数据

[0129] 在实验中发现，艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油四种物质在一起时，对外植体的灭菌效果极显著地好于各自单独以及两两混合和三三混合的灭菌效果。这一结果实际上表明四者之间确实存在着协同作用，下面是实验结果。

[0130] 在生长季，取蓝莓品种“顶级”的花蕾，自来水冲洗、擦干后，直接放入到以下各种灭菌剂中。

[0131] 1号：艾蒿、芦荟、洋葱、茶树油混合溶液(新鲜艾蒿叶片20g、新鲜芦荟叶片20g、新鲜洋葱20g，粉碎后用蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油20ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。

[0132] 2号：艾蒿浸提液(新鲜艾蒿叶片80g，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。

[0133] 3号：芦荟浸提液(新鲜芦荟叶片80g，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。

[0134] 4号：洋葱浸提液(新鲜洋葱80g，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。

[0135] 5号：茶树油水溶液(茶树油80ml，加蒸馏水定容至500ml，备用)。

[0136] 6号：艾蒿和芦荟混合液(新鲜艾蒿和芦荟各40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。

[0137] 7号：艾蒿和洋葱混合液(新鲜艾蒿和洋葱各40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。

[0138] 8号：艾蒿和茶树油混合液(新鲜艾蒿40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油40ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。

[0139] 9号：芦荟和洋葱混合液(新鲜芦荟和洋葱各40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。

[0140] 10号：芦荟和茶树油混合液(新鲜芦荟40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油40ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。

[0141] 11号：洋葱和茶树油混合液(新鲜洋葱40克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油40ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。

[0142] 12号：艾蒿、芦荟和洋葱混合液(新鲜艾蒿、芦荟和洋葱各26.67克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后定容至500ml，备用)。

[0143] 13号：艾蒿、芦荟和茶树油混合液(新鲜艾蒿和芦荟各26.67克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油26.67ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。

[0144] 14号：芦荟、洋葱和茶树油混合液(新鲜芦荟和洋葱各26.67克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油26.67ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。

[0145] 15号：艾蒿、洋葱和茶树油混合液(新鲜艾蒿和洋葱各26.67克，粉碎后加入蒸馏水定容至500ml，静置浸提24h，过滤后加入茶树油26.67ml，蒸馏水定容至500ml，备用)。

[0146] 在上述15种浸提液中均浸泡20min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分，取花药接种到初代培养基上，每瓶接种20个花药，重复5次。观察、统计花药培养的无菌率。见下表7。

[0147] 表7蓝莓品种“顶级”花蕾在不同灭菌剂中的灭菌效果(无菌率)

[0148]

[0149] 对表7进行方差分析(见表8)，结果表明，处理间存在着极显著差异，于是进行处理间差异显著性检验，见表9。

[0150] 表8灭菌剂灭菌效果的方差分析

[0151]变异来源自由度平方和均方 F值 F0.05 F0.01
处理间 14 16384.67 1170.33 108.03 1.86 2.39
误差 60 650.00 10.83
总变异 74 17034.67

[0152] 表9灭菌剂灭菌效果差异显著性检验

[0153]

[0154]

[0155] 由表9可以看出，处理1的灭菌效果极显著地好于其他处理，即：这四种物质在一起的时候，对外植体的灭菌效果极显著地好于各自单独以及两两混合和三三混合的灭菌效果。由于所有处理中试剂所用总量是相当的，如果这四种物质之间不存在明显的协同作用，处理1的灭菌效果不会极显著地好于其他处理。这一结果表明四者之间确实存在着协同作用。

[0156] 四、不同秋水仙素浓度和时间处理对“顶级”组培成活率的影响、对“顶级”诱导多倍体的影响的实验数据

[0157] 表10不同秋水仙素浓度和时间处理对“顶级”组培成活率的影响

[0158]

[0159]

[0160] 表11不同秋水仙素浓度和时间处理对“顶级”诱导多倍体的影响

[0161]

[0162]

[0163]

[0164] 由表10和表11可知，在实验浓度范围内(0.00—0.30％)，最初表现为随着秋水仙素浓度的增大、时间的延长，四倍体细胞的诱导率不断增加，但蓝莓茎段成活率随之递减，至浓度达到0.30％、时间延长到48h以上时，参试的蓝莓茎段全部死亡。综合来看，以秋水仙素浓度0.20％(加入0.3％尿素和0.3％硫代硫酸钠)、浸渍36-48h的效果为好，此时蓝莓茎段成活率较高，诱导的四倍体细胞比率最高。

[0165] 注：秋水仙素浓度、时间和附加尿素、硫代硫酸钠的处理组合如下：

[0166] 1. 0％、6h(附加0.1％尿素、0.1％硫代硫酸钠)

[0167] 2. 0％、12h(附加0.1％尿素、0.1％硫代硫酸钠)

[0168] 3. 0％、24h(附加0.3％尿素、0.3％硫代硫酸钠)

[0169] 4. 0％、36h(附加0.3％尿素、0.3％硫代硫酸钠)

[0170] 5. 0％、48h(附加0.3％尿素、0.3％硫代硫酸钠)

[0171] 6. 0％、72h(附加0.5％尿素、0.5％硫代硫酸钠)

[0172] 7. 0.05％、6h(附加0.1％尿素、0.1％硫代硫酸钠)

[0173] 8. 0.05％、12h(附加0.1％尿素、0.1％硫代硫酸钠)

[0174] 9. 0.05％、24h(附加0.2％尿素、0.2％硫代硫酸钠)

[0175] 10. 0.05％、36h(附加0.3％尿素、0.3％硫代硫酸钠)

[0176] 11. 0.05％、48h(附加0.4％尿素、0.4％硫代硫酸钠)

[0177] 12. 0.05％、72h(附加0.5％尿素、0.5％硫代硫酸钠)

[0178] 13. 0.1％、6h(附加0.1％尿素、0.1％硫代硫酸钠)

[0179] 14. 0.1％、12h(附加0.2％尿素、0.2％硫代硫酸钠)

[0180] 15. 0.1％、24h(附加0.3％尿素、0.3％硫代硫酸钠)

[0181] 16. 0.1％、36h(附加0.4％尿素、0.4％硫代硫酸钠)

[0182] 17. 0.1％、48h(附加0.5％尿素、0.5％硫代硫酸钠)

[0183] 18. 0.1％、72h(附加0.5％尿素、0.5％硫代硫酸钠)

[0184] 19. 0.2％、6h(附加0.1％尿素、0.1％硫代硫酸钠)

[0185] 20. 0.2％、12h(附加0.1％尿素、0.1％硫代硫酸钠)

[0186] 21. 0.2％、24h(附加0.3％尿素、0.3％硫代硫酸钠)

[0187] 22. 0.2％、36h(附加0.3％尿素、0.3％硫代硫酸钠)

[0188] 23. 0.2％、48h(附加0.3％尿素、0.3％硫代硫酸钠)

[0189] 24. 0.2％、72h(附加0.5％尿素、0.5％硫代硫酸钠)

[0190] 25. 0.3％、6h(附加0.1％尿素、0.1％硫代硫酸钠)

[0191] 26. 0.3％、12h(附加0.2％尿素、0.2％硫代硫酸钠)

[0192] 27. 0.3％、24h(附加0.3％尿素、0.3％硫代硫酸钠)

[0193] 28. 0.3％、36h(附加0.3％尿素、0.3％硫代硫酸钠)

[0194] 29. 0.3％、48h(附加0.5％尿素、0.5％硫代硫酸钠)

[0195] 30. 0.3％、72h(附加0.5％尿素、0.5％硫代硫酸钠)

[0196] 以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

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