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一种通过远源杂交选育多年生饲用薏苡的方法

阅读：126发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种通过远源杂交选育多年生饲用薏苡的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种通过远源杂交选育多年生饲用薏苡的方法。本发明所提供的通过远源杂交选育多年生饲用薏苡的方法，包括如下步骤：以二倍体薏苡为母本，四倍体薏苡为父本进行杂交，得到三倍体多年生饲用薏苡。本发明将杂种优势和多倍体营养生长发达的特点充分结合，创制双重优势于一体的新型饲草；发现不同倍性薏苡间远源杂交成功的关键是亲本的选配，二倍体薏苡适合做母本，四倍体薏苡适合做父本，该规律的发现为今后薏苡远源杂交中，亲本的合理选配，提供了技术上的指导。，下面是一种通过远源杂交选育多年生饲用薏苡的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种通过远源杂交选育多年生饲用薏苡的方法，包括如下步骤：以二倍体薏苡为母本，四倍体薏苡为父本进行杂交，得到三倍体多年生饲用薏苡；
所述二倍体薏苡为大黑山薏苡；
所述四倍体薏苡为四倍体水生薏苡。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在进行所述杂交后，还包括从杂交所得三倍体株系中选择产草量高的株系的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：在云南省景洪市或者具有同等气候条件的地方，于7月份播种所述二倍体薏苡和所述四倍体薏苡，10月份以所述二倍体薏苡为母本，所述四倍体薏苡为父本进行杂交，将得到的种子育苗后，进行鉴定，将鉴定为三倍体植株进行无性扩繁，进行品比试验，选择草产量高的品系。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述二倍薏苡比所述四倍薏苡提前10-15天播种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述二倍薏苡和所述四倍薏苡待长到分蘖至拔节期时，每株仅保留3-5个主茎，把其余分蘖全部去掉。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述杂交于每天的10：00-12：00进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：进行所述杂交时，将所述四倍体薏苡的花粉第一次授于所述二倍体薏苡的柱头上后，还包括之后每3天补粉一次直至所述二倍体薏苡的柱头干枯为止的步骤。

说明书全文

一种通过远源杂交选育多年生饲用薏苡的方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物品种选育领域，涉及一种通过远源杂交选育多年生饲用薏苡的方法。

背景技术

[0002] 薏苡(Coix Lacryma-jobi L.)在植物分类学上为禾本科薏苡属，又称草珠子、川谷、薏米、六谷子、药玉米、薏仁米等，原产我国及老挝、缅甸等东南亚一带，在中国至少有6000～10000年的栽培驯化史。薏苡的传统利用方式是作为保健食品和药用植物，《本草纲目》和《本草经疏》等医学名著中均有以薏苡治疗湿疹、风湿性关节炎、扁平疣等症的记载。
近年来，人们从薏苡中提取的薏苡仁油和薏苡仁酯，已开始用来治疗癌症等病症，其中以薏苡作为主要原料生产的康莱特注射液和薏辛除湿止痛胶囊已在市场上销售。

[0003] 薏苡为雌雄同株的异花授粉作物，该属多为2倍体，染色体数为2n＝20，仅有少部分材料为4倍体2n＝40。根据薏苡种子形态可简单分为栽培种和野生种，栽培种种子外多有黑色或白色膜质总苞，透水、透气性好，易于通过机械加工去掉，播种后一般7天即可发芽，而野生种外多有黑色珐琅质总苞，质地坚硬，透水、透气性差，很难去掉，种子不经特殊处理，播种后发芽时间会由10天持续至半年以上。栽培薏苡主要用来加工薏仁米，多为1年生，在光热条件较好地区，刈割后可再生，但再生性较差；野生种为多年生，刈割后可再生，或冬季过后翌年春天从基部产生新的分蘖。我国云南、四川、贵州、广西等地，是薏苡的起源地之一，野生薏苡资源十分丰富，常分布于河边、塘边、沼泽地、未开垦荒地等潮湿地带，存在丰富的形态和遗传变异，具有优异的耐湿性和良好的抗病性。自然状态下，野生薏苡通过种子和根茎两种方式繁殖，薏苡为碳4植物，具备高产的生物学基础，大多分蘖旺盛，植株高大，茎叶繁茂，在广西、云南和湖南等地农民，多把当地野生薏苡作为优良饲草直接利用。除此之外，在广西柳州、云南西双版纳等少数民族地区，至今仍有采摘野生薏苡种子、根、茎等作为中药的习惯，但未见利用野生薏苡选育新型牧草的研究。

[0004] 我国滇、黔、贵、川、渝等西南地区为亚热带湿润季风气候。该区热量资源丰富，除高寒山区外，全年大于10℃积温达4500-6000℃，大部份地区无霜期300d以上。年降水量达1000mm；本区雨热同季、冬暖春早，大部分地区日照率在35％以下，为全国多云中心，特别适合以营养体利用为主的多年生饲用作物生长。另一方面，西南地区坡耕地面积大，仅滇、黔、川、渝四省(市)大于15°坡耕地总面积达713.0万hm2，占全国该类坡耕地总面积的48.0％，且具有地形破碎、坡度陡、土层浅、土质松、保水差、肥力低的特点，在此类地区尤其适合种植多年生饲草，减少水土流失，保护生态环境。

[0005] 基于此，自2000年以来，四川农业大学玉米研究所在国内外率先开展了利用野生薏苡选育多年生饲草的研究。先后在野生薏苡的起源地——我国的滇、川、贵等地和老挝、缅甸、越南等东南亚国家，广泛进行了野生薏苡种质资源的收集、整理、保存工作，并在四川农业大学南方玉米育种基地(位于云南省景洪市嘎洒镇曼广凹村)，建立了野生薏苡种质资源圃，活体保留薏苡种质资源223份，系统开展了野生薏苡农艺性状、繁殖特性、遗传特点、抗逆性、饲用特性及抗病虫性的鉴定和评价等方面的研究。从中选育出综合性状优良、多年生、营养价值高的饲用型薏苡新品种-大黑山薏苡，于2016年12月通过四川省草品种审定委员会审定，并于2017年参加了国家牧草区域试验。截止2017年10月份，该品种已在四川、云南、贵州、重庆、西藏、湖南和湖北等南方省、市(区)累计推广1万亩以上，用来养殖牛、羊、兔、鱼、豚鼠等草食性动物。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种通过远源杂交选育多年生饲用薏苡的方法。

[0007] 本发明所提供的通过远源杂交选育多年生饲用薏苡的方法，可包括如下步骤：以二倍体薏苡为母本，四倍体薏苡为父本进行杂交，得到三倍体多年生饲用薏苡。

[0008] 进一步地，在进行所述杂交后，还包括从杂交所得三倍体株系中选择产草量高的株系的步骤。

[0009] 更进一步地，所述方法包括如下步骤：在云南省景洪市或者具有同等气候条件的地方，于7月份播种二倍体薏苡和四倍体薏苡，10月份以二倍体薏苡为母本，四倍体薏苡为父本进行杂交，将得到的种子育苗后，进行染色体观察，并进行分子鉴定，将鉴定为三倍体(2n＝30)的植株进行无性扩繁，进行品比试验，选择抗性好、草产量高的品系。利用此方法可在较短的时间内选育出新型的多年生饲用薏苡。

[0010] 其中，所述草产量高是指与同条件下的亲本相比产草量有显著提高。

[0011] 在所述方法中，为使花期相遇，所述二倍薏苡最好比所述四倍薏苡提前10-15天(如15天)左右播种育苗。待苗子长到“五叶一心”期时，将所述二倍体薏苡和所述四倍体薏苡移栽至大田，株距为1.2m，行距为1.5m。

[0012] 在所述方法中，为便于杂交和杂交后易结种子，待所述二倍薏苡和所述四倍薏苡待长到分蘖至拔节期时，每株仅保留3-5个主茎，把其余分蘖全部去掉。

[0013] 在所述方法中，于杂交前的48h，用牛皮纸袋将父本(即所述四倍体薏苡)雄花序套牢，每个纸袋以套5个左右雄花为宜；为防止自交，于杂交前的72h，用牛皮纸袋将母本(即所述二倍体薏苡)整个花序套牢，并去掉雄花。

[0014] 在所述方法中，所述杂交于每天的10：00-12：00进行，因为此时散粉量大、花粉活性高。

[0015] 在所述方法中，进行所述杂交时，将所述四倍体薏苡的花粉第一次授于所述二倍体薏苡的柱头上后，还包括每3天补粉一次直至所述二倍体薏苡的柱头干枯为止(一般需补粉3次)的步骤。

[0016] 在所述方法中，最后一次授粉40天后，种子即可收获。将杂交种子、两个亲本种子同时育苗，为便于鉴定，中间种植杂交种子，两边种植亲本种子。根据双亲和杂种的表型，去掉自交的种子；取杂种根尖进行染色体数统计和分子标记鉴定，若杂种染色体为30条，即可确定杂交成功。

[0017] 在本发明的一个实施例中，所述二倍体薏苡具体为大黑山薏苡。所述四倍体薏苡具体为四倍体水生薏苡。

[0018] 本发明的创新点包括以下几方面：

[0019] 1、将杂种优势和多倍体营养生长发达的特点充分结合，创制双重优势于一体的新型饲草。

[0020] 杂种优势是杂种后代在生长势、抗逆性、品质等性状超过双亲的生物学特性，在植物界普遍存在。水稻和玉米是当前杂种优势利用最成功的作物，选育杂种优势强的后代，一直是杂交育种的重要目标。植物中的多倍体往往营养生长旺盛，多表现为叶片、茎秆等器官发达，多倍体育种对于以收获茎叶为目的的饲草育种具有尤其重要的意义。本发明通过不同倍性薏苡间的远源杂交，创制的后代结合杂种优势和多倍体营养生长发达的特点，具备双重优势，更容易选育到饲草产量高的后代。

[0021] 2、发现不同倍性薏苡间远源杂交成功的关键是亲本的选配。

[0022] 父本和母本的选配是影响远源杂交成功的关键因素之一，有些材料只适合做父本，而又有些材料只适合做母本，若双亲选择不当则杂交不易成功。本发明研究发现，在薏苡的远源杂交中，二倍体薏苡适合做母本，四倍体薏苡适合做父本，反之则杂交失败。该规律的发现为今后薏苡远源杂交中，亲本的合理选配，提供了技术上的指导。

[0023] 自2014年开始，我们以二倍体大黑山薏苡(2n＝20)和四倍体水生薏苡(2n＝40)为亲本，进行远源杂交，得到了一份体细胞染色体数为30的三倍体薏苡(2n＝30)，表现为抗逆性突出，长势旺盛，营养体发达，草产量优于双亲，已获得参加2018年度国家牧草区域试验的资格，并有望于2017年底通过四川省草品种审定委员会审定。附图说明

[0024] 图1为双亲和杂种F1的表型及根尖染色体数。图中YY1为二倍体大黑山薏苡，为母本；YY12为四倍体水生薏苡，作为父本；F1为编号为B2的杂种。

[0025] 图2为远源杂种的基因组原位杂交鉴定。A：以母本大黑山薏苡为探针无封阻杂交；B：以母本大黑山薏苡为探针，父本四倍体水生薏苡为封阻杂交。

[0026] 图3为部分玉米SSR引物鉴定结果。图中YY1为母本大黑山薏苡，YY12为父本四倍体水生薏苡，B1、B2、B3为杂种F1。

[0027] 图4为远源杂种在生产上的应用，2017年3月20日在贵州省关岭县沙营镇前进村种植，8月28日长势。

具体实施方式

[0028] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0029] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0030] 大黑山薏苡：记载于“中国畜牧兽医报2017年1月8日；四川农村日报2017年1月12日；鲁院院,田刚,余冰等.晒干大黑山薏苡全株在生长肉兔上的营养价值评定.草业科学,2017,34(5):1100-1106”，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

[0031] 实施例1、杂交亲本种苗的种植

[0032] 在云南景洪市，于7月份，将大黑山薏苡(二倍体)种子于水中浸泡10天后，播种到10cm×10cm大小的育苗盆里，播种后洒施少量辛硫磷颗粒剂，防治地老虎等地下害虫。四倍体水生薏苡播种时间比二倍体大黑山薏苡推迟15d。待幼苗长至“五叶一心”期，将大黑山薏苡和四倍体水生薏苡均移至大田(四倍体水生薏苡比大黑山薏苡提前移栽10-15天，因为其提前播种10-15天)，株距为1.2m，行距为1.5m。

[0033] 实施例2杂交亲本开花前的田间管理

[0034] 于6叶期每株穴施复合肥0.1kg，并于拔节期雨水前后洒施尿素0.1kg，在分蘖至拔节期，分几次去掉多余的分蘖，每株仅保留3-5个长势粗壮主茎。视土壤状况，中耕松土一次，并于开花前喷施氧化乐果防治蚜虫和螟虫。

[0035] 实施例3、远源杂交

[0036] 杂交时大黑山薏苡为母本，四倍体水生薏苡为父本。为防止杂花粉污染，于杂交前48h，用牛皮纸袋将父本雄花序套牢，每个纸袋以套5个左右雄花为宜；为防止自交，于杂交前72h，用牛皮纸袋将母本整个花序套牢，并严格去掉雄花。杂交于每天的10：00-12：00进行，此时散粉量大、花粉活性高。轻轻摇动父本株牛皮袋，取新鲜花粉，授于母本柱头，花粉过量，授粉后将母本株牛皮纸袋套牢。每隔3天补粉一次，持续3次，至母本柱头干枯为止，并于每次授粉时去掉牛皮袋中新长出的雄花。

[0037] 实施例4、杂交结实率的统计和杂交苗的获得

[0038] 最后一次授粉40天后，即可收获种子。野生薏苡种子受精后总苞会变黑，而没受精种子总苞为白色，因此可根据这一特性来鉴定种子是否受精结实。如表1所示，当二倍体大黑山薏苡和四倍体水生薏苡远源杂交时，四倍体水生薏苡只能做父本，做母本时杂交不成功。在该试验中，当四倍体薏苡做父本时，授粉小花数为1123个，总苞变黑种子数为10个，远源杂交结实率为0.89％。由于杂交双亲的亲缘关系较远，存在父本花粉和母本柱头相互识别困难、花粉无法萌发、花粉管生长畸形、雌雄配子无法正常结合及结合后胚胎早期发育阶段易夭折等诸多问题，而导致远源杂交的结实率很低，本研究结果和远源杂交的一般规律是相符的。

[0039] 将双亲种子和杂交种子于水中浸泡10天后，播种到10cm×10cm大小的育苗盆里，播种后洒施少量辛硫磷颗粒剂，防治地老虎等地下害虫。双亲种子都能发芽，而10粒杂交种子仅有5粒等发芽，其中又有1株在出苗后死亡，这可能是远源杂种早期发育阶段生理上的不协调引起的(4株杂交苗编号分别为B1、B2、B3、B4)。待双亲和4株杂交苗长至“五叶一心”期，移至大田，株距为1.2m，行距为1.5m。

[0040] 表1杂交方式对薏苡远源杂交结实率的影响

[0041]杂交方式授粉小花数变黑种子数结实率
YY1×YY12 1123 10 0.89％
YY12×YY1 1023 0 0

[0042] 注：表中YY1为二倍体大黑山薏苡，YY12为四倍体水生薏苡。

[0043] 实施例5、远源杂种的表型鉴定

[0044] 本研究中杂交的双亲均为整倍体，其中父本四倍体水生薏苡有40条染色体，母本大黑山薏苡有20条染色体，两者均可正常散粉，结实，而两者的杂种染色体数为30条，是非整倍体，表现为不孕、不育，雄花颖壳无法张开，不散粉。因此，通过杂种后代雄花的散粉特性即可初步判断杂交成功与否。从表2可以看出，父本和母本均能正常散粉，其各自的根尖染色体数也和实际的预期相符，在4株杂种中B1、B2、和B3颖壳不能张开，不散粉，镜检显示化药发育不正常，根尖染色体数鉴定结果为30条，为真实杂种，而B4散粉正常，根尖染色体数为20条，其表型和母本基本一致，推测可能是授粉过程中，母本花粉自交引起的。

[0045] 表2双亲和杂种后代的散粉特性及根尖染色体数

[0046]

[0047]

[0048] 注：表中YY1为二倍体大黑山薏苡，YY12为四倍体水生薏苡，B1、B2、B3和B4为杂交的F1代

[0049] 双亲和杂种后代苗期的表型如图1，可以看出杂种F1(为B2单株)表现出了双亲的表型。同时对三者的农艺性状进行了比较(表3)，杂种F1的株高、分蘖数、叶长、茎粗、外露节数超过了双亲，叶宽、叶长、叶夹角和高点长介于双亲之间。

[0050] 表3双亲和杂种F1部分农艺性状的比较

[0051]

[0052] 注：表中YY1为二倍体大黑山薏苡；YY12为四倍体水生薏苡；F1为B1、B2、B3单株平均值，大写字母代表P＜0.01显著，小写字母代表P＜0.05显著。

[0053] 实施例6、远源杂种的基因组原位杂交鉴定

[0054] 我们用基因组原位杂交的方法，对杂种的遗传组成进行了鉴定。试验以地高辛标记的大黑山薏苡的基因组为探针(荧光为绿色信号)，无封阻对多倍体后代F1进行基因组原位杂交。结果如图2中A所示，多倍体后代F1有丝分裂中期30条染色体上几乎全部有绿色密集杂交信号，且信号强度均匀，表明F1含有母本大黑山薏苡的遗传物质，而染色体全部布满杂交信号，可能是双亲基因组有较高的同源程度。为进一步探究多倍体F1遗传物质来源情况，以母本大黑山薏苡总基因组为探针，父本四倍体水生薏苡总基因组为封阻DNA，再次对F1有丝分裂中期染色体进行基因组原位杂交，结果如图2中B所示，片段化的父本四倍体水生薏苡总DNA优先与靶染色体杂交，随后再与母本大黑山薏苡总DNA杂交，多倍体后代F1染色体有20条被强烈密集的绿色杂交信号覆盖，而10条染色体几乎无绿色杂交信号，表明F1含有双亲的遗传物质。

[0055] 实施例7、远源杂种的SSR分子鉴定

[0056] 查找maize GDB(www.maizegdb.org)网站上公布的玉米SSR引物，选取2号染色体部分引物进行筛选，其中引物umc1542和umc2247扩增效果较好，umc2251无条带，其余17对引物拖带严重。薏苡上的两对多态性引物umc1284和umc1335也扩增出了多态性，引物umc2247在母本和父本中均增出两条带，引物umc1284在母本大黑山薏苡中扩增出一条带，在父本四倍体水生薏苡中扩增出三条带，三株杂种B1、B2、B3综合了父母本的带型，结果表明杂种含有双亲的遗传物质，扩增结果如图3所示。

[0057] 实施例8、双亲和杂种草产量的品比试验

[0058] 将母本大黑山薏苡、父本四倍体水生薏苡和3株鉴定为真实的杂种F1通过扦插的方法无性扩繁，进行品比试验。试验按随机区组设计，3次重复，小区面积为72m2，株行距均为1.2m。草产量为3次刈割后的累计鲜草产量。

[0059] 从表4中可看出，杂种B1、B2和B3均表现出了很强的营养体杂种优势，鲜草产量均极显著高于双亲，其中B3鲜草产量最高达11.21t/亩，比母本大黑山薏苡增产35.9％，表明通过不同倍性薏苡间的远源杂交选育高产的饲草是可行的。目前B3已经在生产上开始应用，表现为产量高、品质优，全生育期无需防治任何病虫害，图4为在贵州省关岭县沙营镇前进村大面积示范的情况。

[0060] 表4双亲和杂种F1的草产量比较(单位：t/亩)

[0061] I II III 平均草产量
YY1 8.33 7.97 8.45 8.25Cd
YY12 6.23 5.44 7.08 6.25De
B1 9.34 9.76 10.4 9.83Bc
B2 8.99 10.23 10.79 10.00Bb
B3 10.43 11.40 11.79 11.21Aa

[0062] 注：表中YY1为母本大黑山薏苡，YY12为父本四倍体水生薏苡，B1、B2、B3为杂种F1，大写字母代表P＜0.01显著，小写字母代表P＜0.05显著。

[0063] 图4为远源杂种在生产上的应用，2017年3月20日在贵州省关岭县沙营镇前进村种植，8月28日长势。

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