技术领域
[0001] 本
发明属于
植物多倍体鉴定技术领域，具体涉及一种利用荧光SSR 标记技术快速鉴定刺槐植株是否是多倍体的方法。
背景技术
[0002] 刺槐(Robinia pseudoacacia L.)为豆科(Leguminosae)刺槐属 (Robinia)阔叶乔木，耐干旱、耐瘠薄、耐轻度盐
碱、抗污染能
力强、自然更新能力强，是荒山造林和
水土保持先锋树种，具有很高的观赏、蜜源和饲用价值。刺槐木材坚韧、抗冲击、耐腐朽、耐水湿，是重要的建筑、矿柱、车辆、造船用材；刺槐木材热值高，燃烧速度慢，是优质薪炭材和优良
生物质
能源树种。刺槐原产北美，世界范围的引种驯化始于1601年，巴黎植物园主任罗宝将刺槐引进法国，成为第一个从北美引进欧洲的林木树种，以后逐渐被其它国家和地区引种，如苏联、瑞士、意大利、德国、奥地利、匈牙利、捷克斯洛伐克、南斯拉夫、罗
马尼亚、中东、日本、韩国和中国，以及南美、非洲和澳大利亚(凯莱斯台舍， 1993)。中国的刺槐引种驯化始于清光绪年间(1877-1878)，中国官员张鲁生自日本引入，定植于南京龙蟠里薛庐做观赏用。1897年由德国人引入山东省青岛市郊造林，(陈一山，2005)。新中国成立前后20年，我国又从日本、美国和朝鲜分别引进了几批刺槐种源，种植在我国辽东、甘肃天水、湖南长沙和华北等地(顾万春等，1991)。由于刺槐对
气候条件、
土壤条件有广泛的适应性，因此自1949年以来，栽培范围逐步扩大至北纬23°-46°，东经124°-86°的27个省(市、自治区)，广布于辽宁
铁岭以南，内蒙古呼和浩特、包头、宁夏、
银川，南至福州，东至台湾、江苏、浙江沿海，西北至新疆石河子、伊宁、阿克苏、叶城、青海西宁，西南至四川雅安、
云南昆明(中国树木志，
1985)，逐渐演
化成我国的乡土树种。
[0003] 多倍体植物在自然界非常常见，通常具有生长速度快、生物产量高、抗逆性强等特征。北京林业大学1997年从韩国引入我国的
饲料型四倍体刺槐K1–K5，是由人工诱导二倍体刺槐
体细胞加倍而育成。目前国内外尚没有其他发现或者培育四倍体刺槐的报道。刺槐作为世界引种最为成功的三大树种之一，本课题组推测刺槐必然存在许多发生自然变异的多倍体。目前比较常用的鉴定植物多倍体的方法主要有植株形态学鉴定法、
染色体计数法(核型分析)和流式细胞仪法，其中形态学鉴定法最直观，最粗放，但是鉴定的准确度不高，仅能作为初步鉴定多倍体的主要方法；染色体计数法的鉴定结果最为经典、可靠，但是对植物的取材部位和细胞所处的时期要求很高，而且操作过程繁琐、工作量大；流式细胞仪法(FCM)虽然能够快速
鉴别植株的染色体倍性水平，但是样品准备时间不宜超过20分钟，否则DNA峰值
位置会发生偏移，从而影响测定结果，而且测定
费用很高。所以急需一种简便、快速、高效的鉴定多倍体植物的方法。近年来韩国辉(2012)在利用EST-SSR对柑橘多倍体进行遗传分析后，认为SSR分子标记可以作为不同倍性植株染色体倍性确认的一个参考；贾会霞等(2015)在对24份杨树种质进行 SSR指纹图谱
构建时发现，中怀1号、森海1号、森海2号、青杨和中林46杨5份种质均扩增出3个不同等位基因位点，FCM检测结果证实这5份种质均为三倍体，所以得出结论，SSR标记能够准确地反映植物的倍性。然而，经检索目前国内外尚无利用荧光SSR标记技术对刺槐多倍体进行快速鉴定的方法。
发明内容
[0004] 基于上述
现有技术，本发明的目的在于提供一种基于荧光SSR毛细管电泳技术快速鉴定刺槐多倍体的方法。
[0005] 为了实现上述目的，提供了以下技术方案：
[0006] 一种基于荧光SSR毛细管电泳技术快速鉴定刺槐多倍体的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)刺槐总DNA提取(优选的：采用植物组织基因组DNA提取
试剂盒(
磁珠法)提取刺槐总DNA)；
[0008] (2)利用SSR引物进行PCR扩增：以步骤(1)提取的刺槐总DNA 样品为模板，如SEQIDNO.1-2所示的引物进行SSR-PCR扩增；
[0009] (3)PCR扩增产物毛细管电泳；
[0010] (4)根据步骤(3)中的电泳结果构建刺槐SSR指纹图谱；
[0011] (5)根据步骤(4)中构建的刺槐SSR指纹图谱,若等位基因数大于等于3个，即可确认该植株为多倍体。
[0012] 优选的：所述步骤(2)中的引物还包括如SEQIDNO.3-4所示的引物。
[0013] 优选的：所述步骤(2)中的扩增体系采用10μL体系：步骤(1)提取的刺槐总DNA(20ng·μL-1)0.5μL，灭菌去离子水4.3μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，正反引物(即：引物SEQIDNO.1-4)各0.1μL。
[0014] 优选的：所述步骤(2)中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min； 95℃变性30s，57℃
退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸40s，14 个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，
72℃延伸40s，20个循环；72℃延伸10min。
[0015] 优选的：所述步骤(3)的具体步骤为：取PCR产物各0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min， 4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测等位基因数目。
[0016] 优选的：所述等位基因数目检测，所用参数如下：工作
电压15.0kV，进样电压1.6kV，喷射持续时间15s，稳压
电流30.0μA。
[0017] 优选的：所述等位基因数目检测用毛细管电泳仪ABI3730XL。
[0018] 优选的：所述步骤(4)的具体步骤为：采用Genemarker2.2.0
软件进行数据
整理分析，根据每对SSR引物的峰值，组合形成每个无性系的 SSR指纹图谱。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0020] 1、本发明示例的基于荧光SSR毛细管电泳技术快速鉴定刺槐多倍体的方法，利用两对荧光SSR引物组合构建指纹图谱的方法，不仅是一种从分子水平上快速、高效鉴定刺槐品种或无性系是否是多倍体的方法，还能够用来进行刺槐遗传多样性评价，同时为刺槐的引种和遗传育种选择亲本提供科学的理论依据，为刺槐种质资源管理和知识产权保护等方面奠定坚实的
基础。
[0021] 2、本发明示例的基于荧光SSR毛细管电泳技术快速鉴定刺槐多倍体的方法，结合了SSR标记与毛细管荧光检测的优点，克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳的不足，不仅能准确读出产物
片段的大小，精确度达到1bp 之内，而且成本较低，极具应用价值。
[0022] 3、本发明示例基于荧光SSR毛细管电泳技术快速鉴定刺槐多倍体的方法，采用特异性的SSR引物组进行鉴定刺槐品种多倍体，特异性高，扩增效率好，能快速、批量鉴定刺槐是否是多倍体，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受时间和环境影响。
[0023] 4、本发明示例基于荧光SSR毛细管电泳技术快速鉴定刺槐多倍体的方法，利用引物SEQIDNO.1、SEQIDNO.2这一对引物的多倍体检出率就高达85.42％，利用引物SEQIDNO.1-4的多倍体检出率能达到 100％。
[0024] 5、本发明示例基于荧光SSR毛细管电泳技术快速鉴定刺槐多倍体的方法，引物是从多对SSR引物筛选出的，多态性高、
稳定性好、能够准确鉴定刺槐是否是多倍体，利用引物只要能扩增出三个以上(包括三个)等位基因，即可鉴定该刺槐植株为多倍体。
附图说明
[0025] 图1为本发明示例的荧光SSR引物对1的部分PCR扩增产物毛细管电泳图；
[0026] 图2为本发明示例的荧光SSR引物对2的部分PCR扩增产物毛细管电泳图。
具体实施方式
[0027] 为了更好的了解本发明的技术方案，下面结合
说明书附图和具体
实施例对本发明作进一步说明。
[0028] 1、实验材料：
[0029] 本实验以从韩国引进的5个四倍体刺槐无性系为供试材料。分别为 K1(Tetraploid R.pseudoacacia K1)、K2(Tetraploid R.pseudoacacia K2)、 K3(Tetraploid R.pseudoacacia K3)、K4(Tetraploid R.pseudoacacia K4)、 K5(Tetraploid R.pseudoacacia K5)。
[0031] 2016年5月，采集幼嫩
叶片，
硅胶干燥，备用。
[0032] 2、基因组DNA的提取：
[0033] 取幼嫩的刺槐无性系叶片，采用英芮诚生化科技(上海)有限公司植物组织基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)(货号PTED-6030)按照说明书进行提取。
[0034] 3、利用SSR引物进行PCR扩增：
[0035] 以步骤2提取的刺槐总DNA样品为模板，采用如下两对引物进行SSR-PCR扩增，可以使用FAM、HEX、ROX或TAMRA其中任意两种荧光对引物进行标记，
[0036] 引物对1：上游：5‘ACTGTTGGCTATGTCCCCTG’3(如： SEQIDNO.1)
[0037] 下游：5‘GCGAATCTTGACAGCAAACA’3(如： SEQIDNO.2)；
[0038] 引物对2：上游：5‘AACCCTAAAAGCCTCGTTATC’3(如： SEQIDNO.3)
[0039] 下游：5‘TGGCATTTTTTGGAAGACACC’3(如： SEQIDNO.4)；
[0040] 上述荧光SSR-PCR采用10μL体系：DNA(20ng·μL-1)0.5μL，灭菌去离子水4.3μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，正反引物各0.1μL。
[0041] 上述荧光引物PCR扩增程序采用：95℃预变性5min；95℃变性30s， 57℃退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸40s，14个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，20个循环；72℃延伸10min。
[0042] 4、毛细管电泳上机检测
[0043] 用毛细管电泳仪ABI3730XL检测PCR产物等位基因数目。取PCR 产物各0.3μL、分子量内标(生产商ABI)0.5μL和去离子甲酰胺(生产商ABI)9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer 缓冲液上机检测。基因分析仪生产厂家是ABI公司，型号
3730xlDNAanalyzer，所用参数如下：工作电压15.0kV，进样电压1.6kV，喷射持续时间15s，稳压电流30.0μA。
[0044] 5、SSR指纹图谱构建及多倍体鉴定：采用Genemarker2.2.0软件进行数据整理分析，根据每对SSR引物的峰值，组合形成每个无性系的 SSR指纹图谱，只要指纹图谱中有一个位点出现三个以上(包括3个) 等位基因，就可以从分子水平鉴定该刺槐植株是多倍体。上述两对SSR 引物组合构建的指纹图谱见表1。
[0045] 表1：两对荧光SSR引物组合构建的指纹图谱
[0046]
[0047] 结果表明：仅利用本发明提供的SSR引物对1和引物对2即可轻松从分子水平验证无性系K1-K5确实是多倍体，两对引物对应的SSR位点在不同刺槐无性系中部分指纹带型见图1-图2。这些引物的试验结果重复性好，多态性高，能快速、准确、高效的完成刺槐品种或者无性系多倍体鉴定。
[0048] 另外，本实验室在利用引物对1构建343个刺槐品种或无性系(大部分是从
种子实生苗中选育出的优株)指纹图谱时，发现其中293个无性系在该位点有三至六个等位基因，仅利用这一对引物的多倍体检出率就高达85.42％，充分说明该发明的高效性和适用性，从分子水平验证了自然界确实存在许多发生自然变异的刺槐多倍体。
[0049] 以上描述仅为本
申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
