抗OX40抗体及其用途
阅读：2发布：2020-06-14
专利汇可以提供抗OX40抗体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了新型抗OX40 抗体 ，包括抗体的组合物，编码抗体的核酸，以及其制备和使用方法。，下面是抗OX40抗体及其用途专利的具体信息内容。
1.一种抗OX40抗体，其包含（i）包含三个CDR的VH链；以及（ii）包含三个CDR的VL链，其中：
。
2.权利要求1的抗OX40抗体，其具有包含SEQ ID NO：101、102和103的三个CDR的VH链；以及包含SEQ ID NO：104、105和106的三个CDR的VL链。
3.权利要求1的抗OX40抗体，其包含具有根据以下的氨基酸序列的VH链：
以及具有根据以下的氨基酸序列的VL链：
。
4.权利要求1、2或3的抗OX40抗体，其是单克隆的。
5.权利要求1的抗OX40抗体，其是人源化的。
6.权利要求5的抗OX40抗体，其包含具有根据以下的氨基酸序列的VH链：
以及具有根据以下的氨基酸序列的VL链：
。
7.权利要求5的抗OX40抗体，其包含具有根据SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH链；以及具有根据SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VL链。
8.权利要求5的抗OX40抗体，其包含具有根据SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VH链；以及具有根据SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VL链。
9.权利要求5的抗OX40抗体，其包含具有根据SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VH链；以及具有根据SEQ ID NO：36的氨基酸序列的VL链。
10.权利要求5的抗OX40抗体，其包含具有根据SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VH链；以及具有根据SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VL链。
11.权利要求1至10中任一项的抗OX40抗体，其是IgG。
12.权利要求11的抗OX40抗体，其是IgG1。
13.权利要求11的抗OX40抗体，其包含具有根据SEQ ID NO：41-48中任何一个的氨基酸序列的重链；以及具有根据SEQ ID NO：51-54中任何一个的氨基酸序列的轻链。
14.权利要求13的抗OX40抗体，其包含具有根据SEQ ID NO：41或42的氨基酸序列的重链；以及具有根据SEQ ID NO：51的氨基酸序列的轻链。
15.权利要求13的抗OX40抗体，其包含具有根据SEQ ID NO：43或44的氨基酸序列的重链；以及具有根据SEQ ID NO：52的氨基酸序列的轻链。
16.权利要求13的抗OX40抗体，其包含具有根据SEQ ID NO：45或46的氨基酸序列的重链；以及具有根据SEQ ID NO：53的氨基酸序列的轻链。
17.权利要求13的抗OX40抗体，其包含具有根据SEQ ID NO：47或48的氨基酸序列的重链；以及具有根据SEQ ID NO：54的氨基酸序列的轻链。
18.权利要求1至17中任一项的抗OX40抗体，其具有小于约100 nM的针对人OX40（SEQ ID NO：1）的KD。
19.一种药物组合物，其包含权利要求1至18中任一项的抗OX40抗体和药学上可接受的载体。
20.一种核酸，其包含编码权利要求1至18中任一项的抗OX40抗体的核苷酸序列。
21.一种载体，其包含权利要求20的核酸。
22.一种原核宿主细胞，其用权利要求21的载体转化。
23.一种真核宿主细胞，其用权利要求21的载体转化。
24.一种真核宿主细胞，其改造为表达权利要求20的核酸。
25.权利要求23或24的真核宿主细胞，其是哺乳动物宿主细胞。
26.一种产生抗OX40抗体的方法，其包括：（a）培养权利要求23或权利要求24的宿主细胞，和（b）回收所述抗OX40抗体。
27.一种激活免疫系统的方法，其包括向有此需要的患者施用权利要求1至18中任一项的抗OX40抗体、或根据权利要求18的药物组合物。
28.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用权利要求1至18中任一项的抗OX40抗体、或根据权利要求19的药物组合物。
29.权利要求28的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌和具有DNA错配修复缺陷证据的肿瘤。
30.权利要求29的方法，其中所述肺癌是小细胞肺癌、非小细胞肺癌或间皮瘤。
31.权利要求28的方法，其中所述抗OX40抗体作为单一疗法施用。
32.权利要求28的方法，其中所述抗OX40抗体辅助或连同常用于治疗癌症的另一种药物一起施用。
33.权利要求32的方法，其中所述抗OX40抗体辅助或连同抗PD-1抗体一起施用。
抗OX40抗体及其用途
[0001] 1. 相关申请的交叉引用本申请根据35 U.S.C. § 119（e）要求于2016年12月15日提交的美国临时申请号62/
434,761的权益，所述美国临时申请的内容整体引入本文作为参考。
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[0002] 2. 序列表本申请包含序列表，其已以ASCII格式电子提交，并且在此整体引入作为参考。于2017年10月30日创建的所述ASCII拷贝命名为381493-368WO_SL.txt，并且大小为97,999字节。
[0003] 3. 技术领域本申请尤其涉及新型抗OX40抗体，包括抗体的组合物，编码抗体的核酸，以及其制备和使用方法。
[0004] 4. 发明背景癌症疗法包括广泛范围的治疗方法，包括手术、放射和化学疗法。虽然各种方法允许广泛选择的治疗对医学从业者可用于治疗癌症，但现有治疗学具有许多缺点，例如缺乏相对于正常、健康细胞对靶向癌细胞的选择性以及由癌症发展的对治疗的抗性。
[0006] 癌症免疫疗法已作为补充现有护理标准的有希望的治疗方法出现。参见例如，Miller等人Cancer Cell，27，439-449（2015）。此类免疫治疗方法包括开发用于调节免疫系统以杀死癌细胞的抗体。
[0007] 通过用生物制品处理已增强了实体瘤患者中的抗肿瘤免疫应答。例如，存在两种批准且上市的抗PD-1单克隆抗体：纳武单抗（OPDIVO®）和帕博利珠单抗（KEYTRUDA®），其在美国和欧盟批准用于治疗疾病如不可切除的或转移性黑素瘤和转移性非小细胞肺癌。如通过无进展存活和/或总体存活中的改善测量的，用这些药物治疗患者已导致抗肿瘤应答。
[0008] 在比较OPDIVO®与常规化学疗法的临床试验中，OPDIVO®在未接受治疗的患者群体中减缓晚期肺癌进展的最近失败，突出显示了关于替代方法和另外的癌症治疗的需求，以补充现有的治疗护理标准。
[0009] 5. 发明概述本发明提供了特异性结合且激活OX40的抗OX40抗体。示例性互补决定区（CDR）、重链可变结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）区（即，分别为VH和VL链），以及示例性抗OX40抗体的重链和轻链的氨基酸序列在下文的详细描述中提供。本文提供的抗OX40抗体导致适应性免疫应答的活化。
[0011] 本文提供了包含编码本发明的抗OX40抗体的核苷酸序列的核酸，以及包含核酸的载体。另外，本文提供了用包含编码公开的抗OX40抗体的核苷酸序列的载体转化的原核和真核宿主细胞，以及改造为表达核苷酸序列的真核（例如哺乳动物）宿主细胞。还提供了通过培养宿主细胞和回收抗体产生抗体的方法，并且在下文详细描述中进一步讨论。
[0012] 在另一个方面，本发明提供了包括本文所述的抗OX40抗体的组合物。该组合物一般包含一种或多种如本文所述的抗OX40抗体，以及一种或多种赋形剂、载体或稀释剂。
[0013] 本发明提供了用抗OX40抗体治疗诊断有实体瘤的受试者例如人受试者的方法。该方法一般涉及向受试者施用有效提供治疗益处的本文所述抗OX40抗体的量。受试者可以诊断有可以是新近诊断、复发或复发和难治的许多实体瘤中的任何一种。抗OX40抗体可以每两周一次作为静脉内输注施用。
[0014] 抗OX40抗体可以作为单一治疗剂（单一疗法）或其它治疗药物的辅助或与其它治疗药物一起施用，所述其它治疗药物通常但不一定是用于治疗实体瘤的那些。治疗药物通常以其批准的剂量、施用途径和施用频率使用。
[0015] 抗OX40抗体可以经由各种施用途径或模式施用，包括但不限于静脉内输注和/或注射、以及瘤内注射。施用的量取决于施用途径、给药时间表、待治疗癌症的类型、待治疗癌症的阶段、以及其它参数（例如患者的年龄和体重，如本领域众所周知的）。
[0016] 6. 附图简述图1A-1D描绘了在用示例性抗OX40抗体Hu3738处理后，人T细胞在体外的功能性活化。
图1A描绘了在用抗OX40抗体Hu3738、或者文献抗体11D4或18D8处理后，人外周血CD4+ T细胞的增殖。图1B描绘了在用抗OX40抗体Hu3738或者文献抗体11D4或18D8处理后，通过人CD4+ T细胞的干扰素-γ（IFN-γ）产生的增加。图1C描绘了在用Hu3738或文献抗体1A7处理后，人外周血CD4+ T细胞的增殖。图1D描绘了在用Hu3738或文献抗体1A7处理后，通过人CD4+ T细胞的IFN-γ产生的增加。
图1A描绘了在用抗OX40抗体Hu3738、或者文献抗体11D4或18D8处理后，人外周血CD4+ T细胞的增殖。图1B描绘了在用抗OX40抗体Hu3738或者文献抗体11D4或18D8处理后，通过人CD4+ T细胞的干扰素-γ（IFN-γ）产生的增加。图1C描绘了在用Hu3738或文献抗体1A7处理后，人外周血CD4+ T细胞的增殖。图1D描绘了在用Hu3738或文献抗体1A7处理后，通过人CD4+ T细胞的IFN-γ产生的增加。
[0017] 图2A-2B显示了示例性抗OX40抗体Hu3738对体外人T调节（Treg）细胞介导的抑制的作用。使用两种不同比率的CD4+/CD25-应答T细胞（Tresp）与CD4+/CD25+/CD127low T调节细胞（Treg）建立Treg抑制测定。将Treg Suppression Inspector试剂珠（Insp）以1:1珠/细胞比率加入培养孔中用于刺激。透明条表示在Insp的存在下Tresp细胞的增殖。在不存在或存在以1:4比率的交联剂（F（ab'）2山羊抗人IgG，Fc特异性）的情况下，抗OX40和同种型对照人IgG1抗体以10 μg/mL最终浓度一式三份地进行测试。使板在37℃下在5% CO2中温育四天。加入1 μCi/孔3H -胸苷，并且使板进一步温育另外16小时。图表表示以每分钟计数（cpm）所示的增殖。图2A描绘了用以2:1比率的Tresp与Treg的结果；图2B描绘了用以4:1比率的Tresp与Treg的结果。
[0018] 图3描绘了在存在可溶性人OX40配体（OX40L）的情况下，示例性抗OX40抗体Hu3738的结合的抑制。该曲线图显示了平均荧光强度（MFI）相对于OX40L的浓度（μg/mL）。表达人OX40的Jurkat细胞用未标记的可溶性OX40L和0.2 μg/mL Hu3738或同种型对照抗体的滴定共染色。
[0019] 图4A显示了人OX40（SEQ ID NO：1）与小鼠OX40（SEQ ID NO：3）的氨基酸序列比对。图4B描绘了示例性抗OX40抗体Hu3738与细胞表面表达的人、鼠或嵌合人-小鼠OX40分子的结合活性，所述嵌合人-小鼠OX40分子含有交换成相应人区域的小鼠富含半胱氨酸的结构域（CRD）。人OX40显示为“293s-huOX40”，具有鼠CRDI的嵌合人OX40显示为“293s-huOX40-muCRDI”，具有鼠CRDII的嵌合人OX40显示为“293s-huOX40-muCRDII”，具有鼠CRDIII的嵌合人OX40显示为“293s-huOX40-muCRDIII”，具有鼠CRDIV的嵌合人OX40显示为“293s-huOX40-muCRDIV”，具有鼠CRDII和鼠CRDIII的嵌合人OX40显示为“293s-huOX40-muCRDII+III，并且鼠OX40显示为“293s-muOX40”。
[0020] 图5描绘了通过示例性抗OX40抗体Hu3738或文献抗体（11D4、18D8、106-222、119-122或1A7）对细胞表面人OX40结合的竞争。
[0021] 图6A描绘了在不存在添加的交联剂的情况下，在用示例性抗OX40抗体Mu3738或Hu3738、或者文献抗体11D4、18D8、106-222或119-122、或者同种型对照处理后，在人OX40转染的Jurkat报道细胞系中NF-κB的活化。图6B描绘了在存在或不存在添加的交联剂的情况下，在用示例性抗OX40抗体Hu3738、文献抗体1A7或同种型对照处理后，人OX40转染的Jurkat报道细胞系中NF-κB的活化。
[0022] 图7描绘了在NSG小鼠中，在人PC3过继性细胞肿瘤模型中，示例性抗OX40抗体Hu3738的抗肿瘤活性。
[0023] 图8描绘了在用1 mg/kg Hu3738或人IgG1同种型对照每7天处理小鼠一次，总共4个剂量后，在NSG小鼠中的人外周血单核细胞（PBMC）介导的移植物抗宿主病（GVHD）模型中，白细胞介素-8（IL-8）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）的水平。
[0024] 7. 发明详述本发明涉及特异性结合OX40的抗体及其片段，包含抗体的组合物，编码抗OX40抗体的多核苷酸，能够产生抗体的宿主细胞，可用于制备抗体的方法和组合物，以及使用其的各种方法。
[0025] 如本领域技术人员了解的，抗体及其片段本质上是“模块化的”。在公开内容自始至终，描述了组成抗OX40抗体或其结合片段的各种“模块”的各种具体实施方案。作为具体的非限制性实例，描述了重链可变结构域（VH）互补决定区（CDR）、VH链、轻链可变结构域（VL）CDR和VL链的各种具体实施方案。预期所有具体实施方案可以彼此组合，如同每个具体组合被个别地明确描述一样。
[0026] 7.1. 缩写在许多实施方案中，本文所述的抗体、结合片段和多核苷酸通过其分别的多肽或多核苷酸序列进行描述。除非另有说明，否则多肽序列以N→C取向提供；多核苷酸序列5'→3'取向提供。对于多肽序列，可以使用用于遗传编码的氨基酸的常规三字母或单字母缩写，如下表1中注明的。
[0027] 某些序列由指定属于某些类别（例如，脂肪族、疏水性等）的氨基酸残基的结构式限定。如本文使用的遗传编码的氨基酸属于其的各种类别在下表2中注明。一些氨基酸可能属于多于一个类别。含有巯基基团的半胱氨酸和构象受限的脯氨酸没有指定的类别。
[0028] 7.2 定义除非本文另有定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应该具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0029] 7.3抗OX40抗体和结合片段OX40是共刺激分子，其在增强新生免疫应答中具有关键作用，并且伴随地作用于抑制调节性T细胞活性。OX40，也称为CD134或肿瘤坏死因子受体超家族4（TNFRSF4），是在最近激活的T细胞上瞬时表达并在激活的T调节细胞上组成型表达的肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族的I型跨膜细胞表面成员。OX40的细胞外配体结合结构域由三个富含半胱氨酸的结构域（CRD）和第四部分CRD（分别为CRDI、CRDII、CRDIII和CRDIV）组成。虽然主要由激活的CD4+ T细胞表达，但OX40可以在活化后的B细胞、CD8+ T细胞以及自然杀伤（NK）和自然杀伤T（NKT）细胞上表达。还报道了嗜中性粒细胞表达OX40，并且通过OX40对人嗜中性粒细胞的信号传导抑制细胞凋亡性细胞死亡。关于OX40的配体（OX40L），也称为肿瘤坏死因子配体超家族4（TNFSF4）、CD252或糖蛋白34（gp34），被激活的抗原呈递细胞和B细胞上调。与抗原活化的T细胞上的OX40的配体结合导致下游NF-κB易位和AKT途径活化。NF-κB易位导致促存活分子如Bcl-2、Bcl XL和细胞存活的上调。针对OX40的活化抗体至少部分预期通过延长T效应细胞的活化和分化来增强抗原特异性免疫应答。
[0030] 除对抗原激活的T效应细胞的影响之外，由T调节细胞表达的靶向OX40也可以促成推定的作用机制。T调节细胞在肿瘤微环境内表达高水平的OX40。OX40活化已显示影响T调节细胞的抑制能力，并且导致OX40阳性T调节细胞从肿瘤微环境中的活跃耗尽。
[0031] 在一个方面，本发明涉及特异性结合OX40的抗体。
[0032] 如本文使用的，术语“抗体”（Ab）指特异性结合特定抗原（此处为OX40）的免疫球蛋白分子。在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体结合人OX40（SEQ ID NO：1）（NCBI参考序列NP003318），并且从而调节免疫系统。所得到的免疫系统应答对肿瘤细胞是细胞毒性的。抗OX40抗体在轻链和重链可变结构域两者中包含互补决定区（CDR），也称为高变区。可变结构域的更高度保守的部分称为构架（FR）。如本领域已知的，描绘抗体的高变区的氨基酸位置/边界可以根据上下文和本领域已知的各种定义而变。可变结构域内的一些位置可以被视为杂合高可变位置，因为这些位置可以被认为在一组标准下的高变区内，同时被认为在不同组标准下的高变区之外。这些位置中的一个或多个也可以在扩展的高变区中找到。本发明提供了包含在这些杂合高变位置中的修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域各自包含由三个CDR连接的四个FR区，在很大程度上通过采用β片层构型，所述三个CDR形成连接β片层结构且在一些情况下形成β片层结构的部分的环。每条链中的CDR通过FR区紧密接近地保持在一起，并且连同来自另一条链的CDR，促成抗体的靶结合位点的形成。参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institute of Health，Bethesda，Md. 1987）。如本文使用的，免疫球蛋白氨基酸残基的编号根据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统完成，除非另有说明。
[0033] 本发明的抗体可以是多克隆的、单克隆的、遗传改造的和/或以其它方式实质上修饰的，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。在一些实施方案中，恒定区是选自以下的同种型：IgA（例如IgA1或IgA2）、IgD、IgE、IgG（例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）和IgM。在具体实施方案中，本文所述的抗OX40抗体包含IgG1。在其它实施方案中，抗OX40抗体包含IgG2或IgG4。如本文使用的，抗体的“恒定区”包括天然恒定区，同种异型或天然变体，例如人IgG1中的D356E和L358M、或A431G。参见例如，Jefferis和Lefranc，MAbs，1（4）：332-338（2009年7月至8月）。
[0034] 抗OX40抗体的轻恒定区可以是kappa（κ）轻区或lambda（λ）区。λ轻区可以是已知亚型中的任何一种，例如λ1、λ 2、λ3或λ4。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含kappa（κ）轻区。
[0035] 如本文使用的，术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体通过本领域可获得或已知的任何手段衍生自单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆。可以使用本领域已知的广泛多样的技术制备可用于本发明的单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术、或其组合。在本发明的许多用途中，包括抗OX40抗体在人中的体内用途，可以使用嵌合、人源化或人抗体。
[0036] 如本文使用的，术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其具有衍生自非人免疫球蛋白例如大鼠或小鼠抗体的可变序列、以及通常选自人免疫球蛋白模板的人免疫球蛋白恒定区。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison，1985，Science 229（4719）:1202-7；Oi等人，1986，BioTechniques 4:214-221；Gillies等人，1985，J. Immunol. Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397。
[0037] “人源化”形式的非人（例如鼠）抗体是嵌合免疫球蛋白，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最低限度序列。一般而言，人源化抗体将包含至少一个且通常为两个可变结构域的基本上全部，其中CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且FR区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区（Fc）的至少一部分，通常为人免疫球蛋白共有序列的那种。抗体人源化的方法是本领域已知的。参见例如，Riechmann等人，1988，Nature 332:323-7；给予Queen等人的美国专利号：5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan，1991，Mol. Immunol.，28:489-498；
Studnicka等人，1994，Prot. Eng. 7:805-814；Roguska等人，1994，Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973；以及美国专利号5,565,332。
Studnicka等人，1994，Prot. Eng. 7:805-814；Roguska等人，1994，Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973；以及美国专利号5,565,332。
[0038] “人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或动物中分离的抗体，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，所述方法包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO
96/33735；和WO 91/10741。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，PCT公开WO 98/24893；WO 92/01047；
WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,
661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。另外，使用与上述类似的技术，公司例如LakePharma，Inc.（Belmont，CA）或Creative BioLabs（Shirley，NY）可以从事于提供针对所选抗原的人抗体。可以使用被称为“引导选择”的技术生成识别所选表位的全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择（参见，Jespers等人，1988，Biotechnology 12:899-903）。
96/33735；和WO 91/10741。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，PCT公开WO 98/24893；WO 92/01047；
WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,
661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。另外，使用与上述类似的技术，公司例如LakePharma，Inc.（Belmont，CA）或Creative BioLabs（Shirley，NY）可以从事于提供针对所选抗原的人抗体。可以使用被称为“引导选择”的技术生成识别所选表位的全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择（参见，Jespers等人，1988，Biotechnology 12:899-903）。
[0039] 还考虑的是抗OX40抗体结合片段。本发明的结合片段包括能够特异性结合OX40的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv片段、单链Fv（scFv）片段和单结构域片段。
[0040] Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域（CH1）。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F（ab'）2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F（ab'）2片段缺乏完整抗体的片段可结晶（Fc）区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合（参见例如，Wahl等人，1983，J. Nucl. Med. 24:316）。
[0041] 如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域（分别为CH2和CH3结构域）。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域（CH2、CH3和CH4结构域）。
[0042] “Fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由以紧密的非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体（VH-VL二聚体）组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，以限定在VH-VL二聚体的表面上的靶结合位点。通常，六个CDR对抗体赋予靶结合特异性。然而，在一些情况下，甚至单个可变结构域（或仅包含对于靶特异性的三个CDR的Fv的一半）可以具有识别且结合靶的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
[0043] “单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其致使scFv能够形成有利于靶结合的结构。
[0044] “单结构域片段”由对OX40显示出足够亲和力的单个VH或VL结构域组成。在一个具体实施方案中，单结构域片段是骆驼化的（参见例如，Riechmann，1999，Journal of Immunological Methods 231:25–38）。
[0045] 本发明的抗OX40抗体包括衍生化抗体。例如，衍生化抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白酶解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接来修饰。可以通过已知技术进行众多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可以含有一种或多种非天然氨基酸，例如，使用ambrx技术（参见例如，Wolfson，2006，Chem. Biol. 13（10）:1011-2）。
[0046] 抗OX40抗体可以是这样的抗体，其序列已进行修饰以改变至少一种恒定区介导的生物效应子功能。例如，在一些实施方案中，可以修饰抗OX40抗体，以相对于未修饰的抗体减少至少一种恒定区介导的生物效应子功能，例如，与一种或多种Fc受体（FcγR）如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB的结合减少。可以通过在FcγR相互作用所必需的特定区域处，使抗体的免疫球蛋白恒定区区段突变来减少FcγR结合（参见例如，Canfield和Morrison，1991，J. Exp. Med. 173:1483-1491；以及Lund等人，1991，J. Immunol. 147:2657-2662）。抗体的FcγR结合能力中的减少还可以减少依赖于FcγR相互作用的其它效应子功能，例如调理作用、吞噬作用和抗原依赖性细胞毒性（“ADCC”）。在说明性实例中，与相应的野生型恒定区相比，在Fc区的CH2结构域中具有V263L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S或V273Y取代的变体CH2结构域可以显示出对FcγRIIB的亲和力减少。
[0047] 本文所述的抗OX40抗体包括已进行修饰以获得或改善相对于未修饰的抗体的至少一种恒定区介导的生物效应子功能，例如以增强FcγR相互作用的抗体（参见例如，美国专利申请号2006/0134709）。例如，本发明的抗OX40抗体可以具有的恒定区以比相应的野生型恒定区更大的亲和力结合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB。在说明性实例中，与相应的野生型恒定区相比，在Fc区的CH2结构域中具有V263L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S或V273Y取代的变体CH2结构域可以显示出对FcγRIIIA更大的亲和力。
[0048] 因此，本发明的抗OX40抗体可以具有生物活性中的改变，其导致增加或降低的调理作用、吞噬作用或ADCC。此类改变是本领域已知的。例如，美国专利号5,834,597中描述了减少ADCC活性的抗体中的修饰。示例性ADCC降低变体对应于“突变体3”（也称为“M3”， 美国专利号5,834,597的图4中所示），其中残基234和237（使用EU编号）被丙氨酸取代。突变体3（也称为“M3”）变异可以用于许多抗体同种型中，例如人IgG2 M3。
[0049] 可以修饰抗OX40抗体的FcγR结合和/或ADCC效应子功能的另外取代包括Fc区中的K322A取代或L234A和L235A双重取代，例如具有L234A/L235A双重取代的人IgG1。参见例如，Hezareh等人J. Virol.，75（24）: 12161-12168（2001）。
[0050] 在一些实施方案中，抗OX40抗体具有低水平的岩藻糖或缺乏岩藻糖。缺乏岩藻糖的抗体已与增强的ADCC活性相关联，尤其是在低剂量的抗体下。参见Shields等人，2002，J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Shinkawa等人，2003，J. Biol. Chem. 278:3466-73。制备岩藻糖较少的抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞（ATCC CRL 1662）中的生长。YB2/0细胞表达低水平的FUT8 mRNA，其编码α-1,6-岩藻糖基转移酶，关于多肽的岩藻糖基化所必需的酶。
[0051] 抗OX40抗体可以包含包括氨基酸取代的修饰的（或变体）CH2结构域或整个Fc结构域，与相应的野生型CH2或Fc区的结合相比，所述氨基酸取代增加与FcγRIIB的结合和/或技术与FcγRIIIA的结合。变体CH2或变体Fc结构域已在美国专利申请号2014/0377253中描述。变体CH2或变体Fc结构域通常包括在位置263、位置266、位置273和位置305处的一个或多个取代，其中Fc结构域中的残基编号是如Kabat中的EU索引的那种。在一些实施方案中，相对于野生型CH2结构域，抗OX40抗体包含选自V263L、V266L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S、V273Y、V305K和V305W的一个或多个取代。在具体实施方案中，相对于人IgG1的CH2结构域，CH2结构域的一个或多个取代选自V263L、V273E、V273F、V273M、V273S和V273Y。例如，IgG1 CH2结构域的一个或多个取代可以是V273E。在另一个具体实施方案中，本发明的抗OX40抗体包含变体IgG1 CH2结构域，其包含氨基酸取代V263L。
[0052] 与相应的野生型CH2或Fc区的结合相比，可以提供与FcγRIIB的增加结合和/或与FcγRIIIA的减少结合的变体CH2或变体Fc结构域的其它实例包括在Vonderheide等人Clin. Cancer Res.，19（5），1035-1043（2013）中发现的那些，例如人IgG1中的S267E或S267E/L328F。
[0053] 在一些实施方案中，抗OX40抗体包括增加或降低其对胎儿Fc受体FcRn的结合亲和力的修饰，例如，通过在涉及FcRn相互作用的特定区域处使免疫球蛋白恒定区区段突变（参见例如，WO 2005/123780）。在特定实施方案中，使IgG类别的抗OX40抗体突变，使得重链恒定区的氨基酸残基250、314和428中的至少一个被单独取代，或以其任何组合取代，例如在位置250和428处，或在位置250和314处，或在位置314和428处，或在位置250、314和428处，其中位置250和428是特定组合。对于位置250，取代氨基酸残基可以是除苏氨酸外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置314，取代氨基酸残基可以是除亮氨酸外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置428，取代氨基酸残基可以是除甲硫氨酸外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。已知修饰Fc效应子功能的示例性取代是Fc取代M428L，其可以与Fc取代T250Q组合出现。合适的氨基酸取代的另外特定组合在美国专利号7,217,797的表1中鉴定。此类突变增加与FcRn的结合，其保护抗体免于降解并增加其半衰期。
[0054] 抗OX40抗体可以具有插入其一个或多个CDR内的一个或多个氨基酸，例如如Jung和Plückthun，1997，Protein Engineering 10:8，959-966；Yazaki等人，2004，Protein Eng. Des Sel. 17（5）:481-9. Epub 2004 Aug 17；和美国专利申请号2007/0280931中所述。
[0055] 对于人OX40（SEQ ID NO：1）具有高亲和力的抗OX40抗体可能是关于治疗和诊断用途所期望的。相应地，本发明考虑了对人OX40具有高结合亲和力的抗体。在具体实施方案中，抗OX40抗体以至少约100 nM的亲和力结合人OX40，但可以显示出更高的亲和力，例如至少约90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或甚至更高。在一些实施方案中，抗体以在约1 pM至约100 nM范围内的亲和力、或范围在任何前述值之间的亲和力结合人OX40，例如但不限于约0.001至10 nM、0.001至5 nM、0.01至100 nM、0.01至50 nM、0.01至10 nM、0.01至5 nM、或0.01至1 nM。
[0056] 可以使用本领域众所周知的或本文描述的技术，例如但不限于，ELISA、等温滴定量热法（ITC）、表面等离振子共振或荧光偏振测定，来测定抗OX40抗体对于人OX40的亲和力。
[0057] 抗OX40抗体一般包括包含具有三个互补决定区（“CDR”）的可变区（VH）的重链，所述三个互补决定区在本文中称为（以N→C次序）VH CDR#1、VH CDR#2和VH CDR#3，以及包含具有三个互补决定区的可变区（VL）的轻链，所述三个互补决定区在本文中称为（以N→C次序）VL CDR#1、VL CDR#2和VL CDR#3。本文提供了示例性CDR的氨基酸序列，以及示例性抗OX40的重链和轻链的VH和VL区的氨基酸序列。抗OX40抗体的具体实施方案包括这些示例性CDR和/或VH和/或VL序列，以及与此类抗体竞争结合人OX40的抗体。
[0058] 在一些实施方案中，抗OX40抗体的CDR的氨基酸序列具有选自下表3中其分别的VH和VL CDR序列的序列：。
[0059] 本文描述了具有上述CDR的抗OX40抗体的具体示例性实施方案。在一些实施方案中，抗OX40抗体具有根据SEQ ID NO: 101、102、103、104、105和106的CDR。在一些实施方案中，抗OX40抗体具有根据SEQ ID NO: 111、112、113、114、115和116的CDR。在一些实施方案中，抗OX40抗体具有根据SEQ ID NO: 121、122、123、114、125和126的CDR。在一些实施方案中，抗OX40抗体具有根据SEQ ID NO: 131、132、133、114、115和136的CDR。
[0060] 本文描述的CDR在本发明的抗OX40抗体的VH和VL链内形成结合元件。下表4和5描述了对应于含有上述CDR的示例性抗OX40抗体的VH和VL链。CDR在下表4和5中加下划线。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含具有如表4中所述的氨基酸序列的VH链：以及具有如表5中所述的氨基酸序列的VL链：
。
。
[0061] 在一些实施方案中，抗OX40抗体包含具有根据SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH链、以及具有根据SEQ ID NO：31的氨基酸序列的VL链。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含具有根据SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VH链、以及具有根据SEQ ID NO：33的氨基酸序列的VL链。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含具有根据SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VH链、以及具有根据SEQ ID NO：35的氨基酸序列的VL链。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含具有根据SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VH链、以及具有根据SEQ ID NO：37的氨基酸序列的VL链。
[0062] 在一些实施方案中，抗OX40抗体适合于施用于人。在一个具体实施方案中，抗OX40抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含具有根据SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH链、以及具有根据SEQ ID NO：32的氨基酸序列的VL链。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含具有根据SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VH链、以及具有根据SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VL链。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含具有根据SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VH链、以及具有根据SEQ ID NO：36的氨基酸序列的VL链。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含具有根据SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VH链、以及具有根据SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VL链。
[0063] 本领域技术人员将理解，本文所述的抗OX40抗体中的VH或VL序列的某些突变提供在本发明的范围内的抗OX40抗体。突变可以包括来自如本文公开的VH或VL序列的氨基酸取代、添加或缺失，同时保留显著的抗OX40活性。相应地，在一些实施方案中，抗OX40抗体包含与表4中所示VH序列中的任何一个具有至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的VH序列。与表4中所示VH序列中的任何一个相比，抗OX40抗体可以包含具有至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个或至多2个突变的VH序列。在一些实施方案中，与表4中所示VH序列中的任何一个相比，抗OX40抗体可以包含具有5个或更少、4个或更少、3个或更少、 2个或更少突变的VH序列。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含与表5中所示VL序列中的任何一个具有至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的VL序列。与表5中所示VL序列中的任何一个相比，抗OX40抗体可以包含具有至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个或至多2个突变的VL序列。在一些实施方案中，与表5中所示VL序列中的任何一个相比，抗OX40抗体可以包含具有5个或更少、4个或更少、3个或更少、 2个或更少突变的VL序列。
[0064] 全长重链和轻链氨基酸序列一般包含与适当的免疫球蛋白恒定区，例如人IgG1或κ轻恒定区连接的上述VH或VL链。可以出现对抗OX40抗体的全长序列的翻译后修饰，例如在抗体重链的C末端上的一个或多个（例如，1、2、3或更多个）氨基酸残基的切割。此类切割产物可以包含如表达的抗OX40抗体中的一些或全部。
[0065] 相应地，在一些实施方案中，抗OX40抗体包含如表6中所述的重链氨基酸序列：以及如表7中所述的轻链氨基酸序列：
其中加下划线的氨基酸代表CDR，并且斜体氨基酸代表恒定区。
其中加下划线的氨基酸代表CDR，并且斜体氨基酸代表恒定区。
[0066] 在一些实施方案中，抗OX40抗体包含根据SEQ ID NO：41或42的重链氨基酸序列、以及根据SEQ ID NO：51的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含根据SEQ ID NO：43或44的重链氨基酸序列、以及根据SEQ ID NO：52的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含根据SEQ ID NO：45或46的重链氨基酸序列、以及根据SEQ ID NO：53的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗OX40抗体包含根据SEQ ID NO：47或48的重链氨基酸序列、以及根据SEQ ID NO：54的轻链氨基酸序列。
[0067] 在一些实施方案中，抗OX40抗体包含与根据SEQ ID NO：41-48中任何一个的重链序列具有至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的重链序列。与根据SEQ ID NO：41-48中任何一个的重链序列相比，抗OX40抗体可以包含具有至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个或至多2个突变的重链序列。在一些实施方案中，与根据SEQ ID NO：41-48中任何一个的重链序列相比，抗OX40抗体可以包含具有5个或更少、4个或更少、3个或更少、 2个或更少突变的重链序列。
[0068] 在一些实施方案中，抗OX40抗体包含与根据SEQ ID NO：51-54中任何一个的轻链序列具有至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的轻链序列。与根据SEQ ID NO：51-54中任何一个的轻链序列相比，抗OX40抗体可以包含具有至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个或至多2个突变的轻链序列。在一些实施方案中，与根据SEQ ID NO：51-54中任何一个的轻链序列相比，抗OX40抗体可以包含具有5个或更少、4个或更少、3个或更少、 2个或更少突变的轻链序列。
[0069] 抗OX40抗体的另外的翻译后修饰可以包括糖基化。常见的双触角复合物可以由核心结构组成，所述核心结构具有两个N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、三个甘露糖和两个GlcNAc残基，其与α-6甘露糖和α-3甘露糖β-1,2连接，以形成两个触角。一个或多个岩藻糖（Fuc）、半乳糖（Gal）、高甘露糖聚糖Man-5或Man-9、二等分GlcNAc、以及包括N-乙酰神经氨酸（NANA）或N-羟乙酰神经氨酸（NGNA）残基的唾液酸可以附着至核心。N联糖型可以包括G0（具有核心双触角糖基化结构的蛋白质）、G0F（岩藻糖基化的G0）、G0F GlcNAc、G1（具有含有一个半乳糖残基的核心糖基化结构的蛋白质）、G1F（岩藻糖基化的G1）、G2（具有含有两个半乳糖残基的核心糖基化结构的蛋白质）、和/或G2F（岩藻糖基化的G2）。
[0070] 在一些实施方案中，抗OX40抗体在体外测定中与参考抗体竞争结合人OX40（SEQ ID NO：1）。在一些实施方案中，抗OX40抗体竞争结合在表达人OX40的细胞上的人OX40。参考抗体可以是本文所述的任何抗OX40抗体。在一些实施方案中，参考抗体是具有根据表4中所述之一的VH和根据表5中所述之一的VL的抗体。在具体实施方案中，参考抗体是包含Mu3726 VH和Mu3726 VL的小鼠抗体（“Mu3726”）、包含Mu3738 VH和Mu3738 VL的小鼠抗体（“Mu3738”）、包含Mu3739 VH和Mu3739 VL的小鼠抗体（“Mu3739”）、或包含Mu3741 VH和Mu3741 VL的小鼠抗体（“Mu3741”）。在一些实施方案中，参考抗体是Mu3726、Mu3738、Mu3739或Mu3741的人源化形式。在某些实施方案中，参考抗体是包含根据SEQ ID NO：41或42的重链和根据SEQ ID NO：51的轻链的人源化抗体（“Hu3738”）、包含根据SEQ ID NO：43或44的重链和根据SEQ ID NO：52的轻链的人源化抗体（“Hu3726”）、包含根据SEQ ID NO：45或46的重链和根据SEQ ID NO：53的轻链的人源化抗体（“Hu3739”）、或包含根据SEQ ID NO：47或48的重链和根据SEQ ID NO：54的轻链的人源化抗体（“Hu3741”）。
[0071] 本文所述的抗OX40抗体一般特异性结合人OX40。抗体与来自其它物种（例如猴，例如食蟹猴）的OX40结合的交叉反应性可以提供优点，例如在猴动物模型中测试生物活性的能力。此类动物模型测试可以用于筛选抗OX40抗体，以选择与功效相关的特性，例如有利的药代动力学，或与安全性相关的那些，例如降低的肝毒性。在一些实施方案中，抗OX40抗体结合食蟹猴OX40（SEQ ID NO：2）（NCBI参考序列XP005545179）以及人OX40。在一些实施方案中，抗OX40抗体不结合小鼠OX40（SEQ ID NO：3）（NCBI参考序列NP037181）。
[0073] 表面等离振子共振（SPR）测定允许直接测量两种蛋白质（例如受体和抗体，例如人OX40受体和抗OX40抗体）之间的结合动力学，而无需报道信号或标签。平衡解离常数KD，结合亲和力的量度，以及它的两个组分 - 结合动力学速率常数，k（a M-1-sec-1）（结合常数，kon-1或“结合速率”）和kd（sec ）（解离常数，koff或“解离速率”）- 可以使用SPR进行确定。常数通过下式相关：
KD = kd/ka。
KD = kd/ka。
[0074] 在一些实施方案中，抗OX40抗体具有至少约100 nM的KD，但可以显示出更高的亲和力，例如至少约90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或甚至更高。在一些实施方案中，抗OX40抗体具有在约1 pM至约100 nM范围内的KD、或范围在任何前述值之间的亲和力，例如但不限于约0.001至10 nM、0.001至5 nM、0.01至100 nM、0.01至50 nM、0.01至10 nM、0.01至5 nM、或约0.01至1 nM。
[0075] 在一些实施方案中，抗OX40抗体具有不超过约10 sec-1，例如，不超过约1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001 sec-1或甚至更低的解离常数kd。在一些实施方案中，抗OX40抗体具有在约0.001 sec-1至约10 sec-1范围内的kd、或范围在任何前述值之间的kd，例如但不限于约0.01至10 sec-1、0.001至0.5 sec-1、0.001至0.2 sec-1、0.001至0.1 sec-1、
0.01至1 sec-1、0.001至0.05 sec-1、或约0.001至1 sec-1。
0.01至1 sec-1、0.001至0.05 sec-1、或约0.001至1 sec-1。
[0076] 在一些实施方案中，抗OX40抗体具有至少约104 M-1-sec-1，例如至少约1 × 104、5 × 104、1 × 105、5 × 105、1 × 106、5 × 106、1 × 107 M-1-sec-1或甚至更大的结合常数ka。在一些实施方案中，抗OX40抗体具有在约104 M-1-sec-1至约107 M-1-sec-1范围内的kd、或范围在任何前述值之间的kd，例如但不限于约5 × 104至1 × 107 M-1-sec-1、5 × 104至5 × 106 M-1-sec-1、或约1 × 104至5 × 106 M-1-sec-1。
[0077] 本发明的抗OX40抗体可以显示出在对于本文所述的示例性抗OX40抗体中任何一种测量的结合动力学常数附近的范围内的KD、kd或ka。例如，在一些实施方案中，抗OX40抗体具有在Hu3738、Hu3726、Hu3739和Hu3741中任何一种的kd约0.01至约100倍，例如约0.1至约10倍、或约0.5至约5倍范围内的解离常数kd。在一些实施方案中，抗OX40抗体具有在Hu3738、Hu3726、Hu3739和Hu3741中任何一种的ka约0.01至约100倍，例如约0.1至约10倍、或约0.5至约5倍范围内的结合常数ka。
[0078] 在进行参考抗体和测试抗体（不考虑物种或同种型）之间的抗体竞争测定时，可以首先用可检测标记例如荧光团、生物素或酶促（或甚至放射性）标记来标记参考，以允许后续鉴定。在这种情况下，将表达人OX40的细胞与未标记的测试抗体一起温育，加入标记的参考抗体，并且测量结合标记的强度。如果测试抗体通过与重叠表位结合而与标记的参考抗体竞争，则相对于不含测试抗体进行的对照反应，强度将降低。
[0079] 在该测定的一个具体实施方案中，首先确定在测定条件（例如，指定的细胞密度）下产生80%最大结合的标记参考抗体的浓度（“conc80%”），并且用10X conc80%的未标记测试抗体和conc80%的标记参考抗体进行竞争测定。
[0080] 抑制可以表示为抑制常数或Ki，其根据下式计算：Ki = IC50/（1 + [参考Ab浓度]/Kd），
其中IC50是产生参考抗体的结合的50%减少的测试抗体浓度，并且Kd是参考抗体的解离常数，是关于其对于人OX40的亲和力的量度。与本文公开的抗OX40抗体竞争的抗体在本文所述的测定条件下可以具有10 pM至100 nM的Ki。
其中IC50是产生参考抗体的结合的50%减少的测试抗体浓度，并且Kd是参考抗体的解离常数，是关于其对于人OX40的亲和力的量度。与本文公开的抗OX40抗体竞争的抗体在本文所述的测定条件下可以具有10 pM至100 nM的Ki。
[0081] 在各种实施方案中，如果在其为在使用的特定测定条件下的最大结合的80%的参考抗体浓度，以及其为参考抗体浓度10倍的测试抗体浓度下，测试抗体使参考抗体的结合降低至少约20%或更多，例如至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至更多，或范围在任何前述值之间的百分比，则认为它与参考抗体竞争。
[0082] 可用于评价抗体是否如本文所述的与参考抗体竞争结合人OX40的具体测定和测定条件在节段8.1.4中提供。
[0083] 在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体激活人OX40（SEQ ID NO：1）。OX40受体活化可以通过许多机制发生，例如，通过提供针对OX40受体的配体样活性。在此类情况下，抗OX40抗体与人OX40配体（OX40L，CD252；UniProtKB/Swiss-Prot Code P23510.1）（SEQ ID NO：4）竞争结合OX40受体。
[0084] 本发明的抗OX40抗体一般可以在交联的存在下激活OX40受体。在节段8.1.8中提供了具体测定和测定条件，其可用于评价抗OX40抗体是否可以在交联的存在下激活OX40受体，例如人OX40受体（SEQ ID NO：1）。在一些实施方案中，抗OX40抗体在交联的存在下激活人OX40受体，其EC50为约1 pM至约500 nM，例如但不限于约0.01至约300 nM、约0.01至约100 nM、约0.01至约10 nM、约0.01至约1 nM、约0.1至约300 nM、约0.1 nM至约100 nM、约1 nM至约100 nM、或约0.1 nM至约100 nM。在一些实施方案中，与在不存在抗OX40抗体的情况下的人OX40受体的活性相比，以100 μg/mL的抗OX40抗体可以在交联的存在下激活人OX40受体至活性至少约3倍，例如约3至约1000，例如约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、200、400、500、700、800或约1000倍。
[0085] 可以通过许多方法提供交联，包括添加外源交联剂，例如通过对于人抗体或人源化抗体的重链、轻链或可变区特异性的抗体或抗体F（ab'）2片段；通过可溶性或固定化蛋白A；通过Fc受体转染的细胞系；通过表达内源性Fc受体的细胞系；通过将目标抗体直接涂布到塑料表面；通过涂布有外源交联抗体或Fc受体的塑料表面；或通过与上述任一种缀合的珠。在说明性实例中，目标抗体可以与蛋白质例如生物素缀合，并且可溶性或固定化抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白用作交联剂。在另一个实例中，在体内人淋巴结中，预期在结合抗OX40抗体后的OX40活化在由内源FcγR+抗原呈递细胞提供的受体交联后发生。
[0086] 在一些实施方案中，抗OX40抗体在不存在交联的情况下结合并激活人OX40受体。在一些实施方案中，抗OX40抗体在不存在OX40L例如人OX40L（SEQ ID NO：4）的情况下激活OX40受体，例如人OX40受体（SEQ ID NO：1）。在节段8.1.8中提供了具体测定和测定条件，其可用于评价抗OX40抗体是否可以无需交联而激活OX40受体。在一些实施方案中，抗OX40抗体无需交联而激活人OX40受体，其EC50为约1 pM至约500 nM，例如但不限于约0.01至约300 nM、约0.01至约100 nM、约0.1至约300 nM、约0.1 nM至约100 nM、约1 nM至约100 nM、约0.1 nM至约100 nM、约1至约300 nM、约1至约100 nM、约1至约50 nM、或约10至约100 nM。在一些实施方案中，与用等量同种型抗体给药的人OX40受体的活性相比，以100 μg/mL的抗OX40抗体可以无需交联而激活人OX40受体至活性至少约5倍，例如约5至约1000，例如约5、10、15、
20、30、40、50、60、80、100、200、300、400、500、700、800或约1000倍。在一些实施方案中，与用等量同种型抗体给药的人OX40受体的活性相比，以10 μg/mL的抗OX40抗体可以无需交联而激活人OX40受体至活性至少约3倍，例如约3至约300，例如约3、5、6、8、10、12、15、20、25、30、
40、50、60、80、100、200或约300倍。在一些实施方案中，与用等量同种型抗体给药的人OX40受体的活性相比，以1 μg/mL的抗OX40抗体可以无需交联而激活人OX40受体至活性至少约3倍，例如约3至约150，例如约3、4、5、6、7、8、10、12、15、20、25、30、40、50、60、80、100或约150倍。
20、30、40、50、60、80、100、200、300、400、500、700、800或约1000倍。在一些实施方案中，与用等量同种型抗体给药的人OX40受体的活性相比，以10 μg/mL的抗OX40抗体可以无需交联而激活人OX40受体至活性至少约3倍，例如约3至约300，例如约3、5、6、8、10、12、15、20、25、30、
40、50、60、80、100、200或约300倍。在一些实施方案中，与用等量同种型抗体给药的人OX40受体的活性相比，以1 μg/mL的抗OX40抗体可以无需交联而激活人OX40受体至活性至少约3倍，例如约3至约150，例如约3、4、5、6、7、8、10、12、15、20、25、30、40、50、60、80、100或约150倍。
[0087] 在一些实施方案中，与无需交联相比，抗OX40抗体在交联的存在下以更高水平激活OX40受体，例如人OX40受体（SEQ ID NO：1）。在节段8.1.8中提供了具体测定和测定条件，其可用于测定在其下抗OX40抗体可以无需交联而激活OX40受体的水平。例如，可以根据EC50和/或观察到的最大活化来测量活性水平。在一些实施方案中，与根据节段8.1.8的测定中无需交联的NF-κB活性相比，在约20%至约95%的NF-κB活性，例如约25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或约90%下，以100 μg/mL的抗OX40抗体无需交联而激活OX40受体，例如人OX40受体（SEQ ID NO：1）。
[0088] 在一些实施方案中，在根据节段8.1.8的测定中，抗OX40抗体无需交联而激活人OX40受体，其EC50为约0.1 nM至约500 nM，例如但不限于约1 nM至约100 nM、约0.1 nM至约100 nM、约1至约300 nM、约1至约100 nM、约1至约50 nM、或约10至约100 nM。在一些此类实施方案中，与用等量同种型抗体给药的人OX40受体的活性相比，以10 μg/mL的抗OX40抗体可以无需交联而激活人OX40受体至活性至少约3倍，例如约3至约300，例如约3、5、6、8、10、
12、15、20、25、30、40、50、60、80、100、200或约300倍。在一些此类实施方案中，在根据节段
8.1.8的测定中，抗OX40抗体在交联的存在下激活人OX40受体，其EC50为约1 pM至约300 nM，例如但不限于约0.01至约300 nM、约0.01至约100 nM、约0.01至约10 nM、约0.01至约1 nM、约0.1至约300 nM、约0.1 nM至约100 nM、约1 nM至约100 nM、或约0.1 nM至约100 nM。在一些此类实施方案中，在根据节段8.1.8的测定中，与美国公开号2015/0307617中描述的抗体
1A7的EC50相比，抗OX40抗体可以在交联的存在下以较低的EC50激活人OX40受体，例如低约
1.5至约100倍，例如约1.5至约10倍，例如约2、3、4、5、6、7、8、9或约10倍。
12、15、20、25、30、40、50、60、80、100、200或约300倍。在一些此类实施方案中，在根据节段
8.1.8的测定中，抗OX40抗体在交联的存在下激活人OX40受体，其EC50为约1 pM至约300 nM，例如但不限于约0.01至约300 nM、约0.01至约100 nM、约0.01至约10 nM、约0.01至约1 nM、约0.1至约300 nM、约0.1 nM至约100 nM、约1 nM至约100 nM、或约0.1 nM至约100 nM。在一些此类实施方案中，在根据节段8.1.8的测定中，与美国公开号2015/0307617中描述的抗体
1A7的EC50相比，抗OX40抗体可以在交联的存在下以较低的EC50激活人OX40受体，例如低约
1.5至约100倍，例如约1.5至约10倍，例如约2、3、4、5、6、7、8、9或约10倍。
[0089] 在根据节段8.1.8的测定中，本发明的抗OX40抗体可以无需交联而激活人OX40受体，其EC50为约1 nM至约100 nM，并且在根据节段8.1.8的测定中，与美国公开号2015/0307617中描述的抗体1A7的EC50相比，可以在交联的存在下以较低的EC50激活人OX40受体，例如低例如约1.5至约10倍。具有上述特性的示例性抗OX40抗体包括Mu3738和Hu3738，如本文实施例2到8中所述。
[0090] 一般地，用抗OX40抗体处理后的OX40活化导致信号转导，例如细胞因子产生（例如，干扰素-γ（IFN-γ））的增加和/或细胞增殖例如CD4+ T细胞增殖的增加。在一些实施方案中，在用1 μg/mL抗OX40抗体处理后IFN-γ产生的增加为在用等量的同种型抗体处理后IFN-γ产生水平的约1.5至约50倍，例如约1.5、2、3、4、5、6、8、10、15、20、25、30、40或约50倍。在一些实施方案中，在用1 μg/mL抗OX40抗体处理后CD4+ T细胞增殖的增加为在用等量的同种型抗体处理后CD4+ T细胞增殖水平的约1.5至约20倍，例如约1.5、2、3、4、5、6、8、10、15或约20倍。用于确定细胞因子水平或用于确定细胞增殖水平的测定是本领域已知的。本文在节段8.1.12中提供了用于确定IFN-γ产生和/或CD4+ T细胞增殖的具体测定和测定条件。
[0091] 7.4 编码抗OX40抗体的多核苷酸、表达系统及其制备方法本发明涵盖编码抗OX40抗体的免疫球蛋白轻链和重链基因的核酸分子，包含此类核酸的载体，以及能够产生本发明的抗OX40抗体的宿主细胞。
[0092] 可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备本发明的抗OX40抗体。为了重组表达抗体，用一种或多种重组表达载体转染宿主细胞，所述重组表达载体携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段，使得轻链和重链在宿主细胞中表达，并且任选地分泌到宿主细胞在其中培养的培养基内，从所述培养基中可以回收抗体。标准重组DNA方法用于获得抗体重链和轻链基因，将这些基因掺入重组表达载体内且将载体引入宿主细胞内，例如Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版（Sambrook，Fritsch和Maniatis（编辑），Cold Spring Harbor，N. Y.，1989）、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel，F.M.等人，编辑，Greene Publishing Associates，1989）以及美国专利号4,816,397中描述的那些。
[0093] 为了生成编码此类抗OX40抗体的核酸，首先获得编码轻链和重链可变区的DNA片段。这些DNA可以通过例如使用聚合酶链反应（PCR），扩增和修饰编码轻链和重链可变序列的种系DNA或cDNA来获得。用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域已知的（参见例如，“VBASE”人种系序列数据库；还参见Kabat，E. A.等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242；Tomlinson等人，1992，J. Mol. Biol. 22T:116-198；以及Cox等人，1994，Eur. J. Immunol. 24:827-836）。
[0094] 一旦获得编码抗OX40抗体相关的VH和VL区段的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转换为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与另一种DNA片段可操作地连接，所述另一种DNA片段编码另一种蛋白质，例如抗体恒定区或柔性接头。如该上下文中使用的，术语“可操作地连接”预期意指两个DNA片段这样连接，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
[0095] 通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区（CH1、CH2、CH3和任选的CH4）的另一个DNA分子可操作地连接，可以将编码VH区的分离的DNA转换为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的（参见例如，Kabat，E.A.等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242），并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但在某些实施方案中是IgG1或IgG4。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与仅编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子可操作地连接。
[0096] 通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离的DNA转换为全长轻链基因（以及Fab轻链基因）。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的（参见例如，Kabat，E.A.等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242），并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但在某些实施方案中是κ恒定区。为了产生scFv基因，编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头，例如编码氨基酸序列（Gly4 Ser）3（SEQ ID NO：60）的另一个片段可操作~地连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区通过柔性接头连接（参见例如，Bird等人，1988，Science 242:423-426；Huston等人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人，1990，Nature 348:552-554）。
[0097] 为了表达本发明的抗OX40抗体，将如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体内，使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在该上下文中，术语“可操作地连接”预期意指抗体基因连接到载体内，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体内，或者更通常地，将两个基因均插入相同的表达载体内。
[0098] 通过标准方法（例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点，则平端连接），将抗体基因插入表达载体内。在插入抗OX40抗体相关的轻链或重链序列之前，表达载体可以已经携带抗体恒定区序列。例如，将抗OX40单克隆抗体相关的VH和VL序列转换为全长抗体基因的一种方法是将它们分别插入已经编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体内，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段，并且VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。另外或可替代地，重组表达载体可以编码促进宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与抗体链基因的氨基末端框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽（即，来自非免疫球蛋白蛋白的信号肽）。
[0099] 除抗体链基因之外，本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”预期包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件（例如，多腺苷酸化信号）。此类调节序列在例如Goeddel，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA，1990中描述。本领域技术人员将了解表达载体的设计，包括调节序列的选择可以取决于此类因素如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的合适调节序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，如衍生自巨细胞病毒（CMV）（如CMV启动子/增强子）、猿猴病毒40（SV40）（如SV40启动子/增强子）、腺病毒（如腺病毒主要晚期启动子（AdMLP））和多瘤的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如通过Stinski的美国专利号5,168,062，通过Bell等人的美国专利号4,510,245和通过Schaffner等人的美国专利号4,968,615。
[0100] 除抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列（例如，复制起点）和可选择标记物基因。可选择标记物基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择（参见例如，全部通过Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017）。例如，通常可选择标记物基因对载体已引入其内的宿主细胞赋予针对药物（例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤）的抗性。合适的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶（DHFR）基因（用于在具有氨甲蝶呤选择/扩增的DHFR-宿主细胞中使用）和neo基因（用于G418选择）。对于轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞内。术语“转染”的各种形式预期涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如电穿孔、脂转染、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。
[0101] 能够在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗OX40抗体。在某些实施方案中，抗体的表达在真核细胞例如哺乳动物宿主细胞中进行，其具有正确折叠和免疫活性抗体的最佳分泌。用于表达本发明的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢（CHO细胞）（包括Urlaub和Chasin，1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中描述的DHFR- CHO细胞，与DHFR可选择标记物一起使用，例如，如Kaufman和Sharp，1982，Mol. Biol. 159:601-621中所述）、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过将宿主细胞培养一段时间来产生抗体，所述时间段足以允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。宿主细胞也可以用于产生抗体的抗OX40结合片段，例如Fab片段或scFv分子。应理解，关于上述程序的变化在本发明的范围内。例如，可能期望用编码本发明的抗OX40抗体的轻链或重链（但并非两者）的DNA转染宿主细胞。
[0102] 重组DNA技术也可以用于去除编码轻链和重链之一或两者的DNA的一些或全部，所述DNA不是结合人OX40所必需的。由此类截短的DNA分子表达的分子也由本发明的抗体涵盖。
[0103] 对于本发明的抗OX40抗体的重组表达，可以用本发明的两种表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽，并且第二载体编码轻链衍生的多肽。两个载体可以含有相同的可选择标记物，或者它们可以各自含有分开的可选择标记物。可替代地，可以使用编码重链和轻链多肽两者的单一载体。
[0104] 一旦已获得编码抗OX40抗体的一个或多个部分的核酸，就可以将进一步的改变或突变引入编码序列内，例如以生成编码具有不同CDR序列的抗体的核酸、对Fc受体具有减少的亲和力的抗体、或不同亚类的抗体。
[0105] 本发明的抗OX40抗体还可以通过化学合成（例如，通过Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984 The Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.中描述的方法）来生产。还可以使用无细胞平台（参见例如，Chu等人，Biochemia No. 2，2001（Roche Molecular Biologicals）以及Murray等人，2013，Current Opinion in Chemical Biology，17:420–426）生成变体抗体。
[0106] 一旦已通过重组表达产生本发明的抗OX40抗体，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法将它纯化，例如通过层析（例如，离子交换、亲和力和分级柱层析）、离心、差异溶解度、或通过用于纯化蛋白质的任何其它标准技术。进一步地，本发明的抗OX40抗体可以与本文描述的或本领域另外已知的异源多肽序列融合，以促进纯化。
[0107] 一旦分离，需要时，就可以例如通过高效液相层析（参见例如，Fisher，Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology，Work和Burdon，编辑，Elsevier，1980）、或通过在SuperdexTM 75柱（Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞典）上的凝胶过滤层析，进一步纯化抗OX40抗体。
[0108] 7.5. 药物组合物本文所述的抗OX40抗体可以是包含抗体和一种或多种载体、赋形剂和/或稀释剂（所有这些在本文中都被称为“载体”）（即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型洗涤剂、抗氧化剂及其它各种各样的添加剂）的组合物形式。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版（Osol，编辑1980）。可以将组合物配制用于特定用途，例如用于兽医用途或人中的药物用途。组合物的形式（例如，干粉、液体制剂等）和所使用的载体将取决于抗体的预期用途，并且对于治疗用途，取决于施用模式。
[0109] 对于治疗用途，组合物可以作为包括药学上可接受的载体的无菌药物组合物的部分供应。该组合物可以是任何合适的形式（取决于将其施用于患者的所需方法）。药物组合物可以通过各种途径，例如静脉内、瘤内或鞘内施用于患者。在任何给定的情况下，最合适的施用途径取决于特定抗体、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，药物组合物将静脉内施用。
[0110] 药物组合物可以方便地以每剂量含有预定量的本文所述的抗OX40抗体的单位剂型存在。单位剂量中包括的抗OX40抗体数量将取决于待治疗的疾病、以及如本领域众所周知的其它因素。此类单位剂量可以是冻干的干粉形式，其含有适合于单次施用的量的抗体，或者是液体的形式。干粉单位剂型可以包装在试剂盒中，所述试剂盒具有注射器、合适数量的载体和/或可用于施用的其它组分。以液体形式的单位剂量可以以预先填充有适合于单次施用数量的抗OX40抗体的注射器形式方便地供应。
[0111] 药物组合物还可以以散装形式供应，所述散装形式含有适合多次施用数量的抗OX40抗体。
[0112] 通过将具有所需纯度的抗体与本领域通常采用的任选的药学上可接受的载体混合，可以制备药物组合物用于作为冻干制剂或水溶液贮存。在所采用的剂量和浓度下，此类添加剂对接受者应该是无毒的。
[0113] 例如，对于静脉内施用，组合物可以是冻干粉末的形式，其在用无菌水或者适合于注射或输注的其它溶液（例如，0.9%盐水、林格氏溶液、乳酸林格氏溶液等）重构时提供水性组合物。
[0114] 7.6. 使用方法7.6.1 治疗益处
本文提供的数据证实，所公开的抗OX40抗体在癌细胞的存在下激活OX40受体，并且在体内发挥针对癌的有力抗癌活性。相应地，抗OX40抗体和/或包含抗OX40抗体的药物组合物可以在治疗上用于治疗癌症。
本文提供的数据证实，所公开的抗OX40抗体在癌细胞的存在下激活OX40受体，并且在体内发挥针对癌的有力抗癌活性。相应地，抗OX40抗体和/或包含抗OX40抗体的药物组合物可以在治疗上用于治疗癌症。
[0115] 在一些实施方案中，癌症是实体瘤。可以用抗OX40抗体治疗的实体瘤包括膀胱癌、乳腺癌（例如，三阴性乳腺癌）、头颈癌、肾癌（例如肾细胞癌）、肝癌（例如，肝细胞癌、胆管癌）、肺癌（例如，非小细胞肺癌、间皮瘤、小细胞肺癌）、黑素瘤（例如，不可切除或转移性黑素瘤、晚期恶性黑素瘤）、皮肤癌（例如，Merkel细胞癌）、卵巢癌、胃癌和具有DNA错配修复缺陷证据的肿瘤。癌症可以由含有表达OX40的细胞的肿瘤组成；由肿瘤组成，其中一些肿瘤含有表达OX40的细胞，并且其中一些肿瘤则不含；或由缺乏表达OX40的细胞的肿瘤组成。癌症可以是新近诊断的并且是首次用于治疗的，或者可以是复发的、难治的、或复发且难治的、或实体瘤的转移形式。在一些实施方案中，实体瘤对PD-1或PD-L1靶向剂是首次用于治疗的。在其它实施方案中，在用PD-1或PD-L1靶向剂治疗后，实体瘤是复发的或难治的。在一些实施方案中，实体瘤选自膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肺癌、黑素瘤和胃癌。在一些实施方案中，实体瘤选自：黑素瘤（例如，不可切除的或转移性黑素瘤）、肺癌（例如，非小细胞肺癌）和肾细胞癌（例如，晚期肾细胞癌）。在一些实施方案中，实体瘤选自三阴性乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、胃癌、小细胞肺癌、间皮瘤、胆管癌、Merkel细胞癌和具有DNA错配修复缺陷证据的肿瘤。在某些实施方案中，肺癌是转移性非小细胞肺癌，其在基于铂的化学疗法之时或之后进展。在某些实施方案中，肺癌是局部晚期或转移性非小细胞肺癌，对其具有失败的基于铂的疗法和用PD-1或PD-L1靶向剂的疗法。在某些实施方案中，头颈癌是复发性鳞状细胞头颈癌，其不是用局部或全身疗法的治愈性治疗的候选者，或者视为无法通过局部疗法治愈的口腔、口咽、下咽和喉的转移性（播散性）头颈鳞状细胞癌。
[0116] 如上文讨论的，本文公开的抗OX40抗体调节免疫应答。相应地，具有受损免疫系统的患者可能从治疗中排除。在一些实施方案中，在满足下述标准中的一个或多个后排除患者：（1）在过去2年内活动性或先前记录的自身免疫疾病（包括但不限于炎性肠病、乳糜泻、韦格纳综合征）。（不排除患有儿童特应性反应或哮喘、白癜风、脱发、桥本综合征、格雷夫氏病或不需要全身治疗的牛皮癣（在过去2年内）的受试者）；（2）原发性免疫缺陷、骨髓移植、慢性淋巴细胞白血病、实体器官移植或结核病的既往临床诊断史；（3）凝血病或血小板病症史；（4）确认关于人免疫缺陷病毒（HIV）的阳性检测结果或者患有慢性或活动性乙型肝炎或丙型肝炎的受试者。（具有乙型肝炎或丙型肝炎史的受试者（其在抗病毒疗法后具有已记录的治愈）可能入选）；（5）在接受免疫疗法（包括但不限于针对CTLA-4、PD L1或PD-1的药物）时，先前级别≥3的免疫介导的神经毒性或肺炎。另外，在接受免疫疗法时，任何其它先前级别≥3的免疫介导的不良事件，在3个月内未解决或未变得无症状；（6）在抗OX40抗体的第一剂量之前的28天内接受活的减毒疫苗。
[0117] 本发明的抗OX40抗体可以单独施用（单一疗法）或者辅助或连同其它抗癌疗法和/或靶向或非靶向抗癌剂一起施用。当作为抗OX40单一疗法施用时，可以使用一种或多种抗体。无论是作为单一疗法施用还是辅助或连同其它疗法或药物一起施用，施用一定量的抗OX40抗体，使得总体治疗方案提供治疗益处。
[0118] 治疗益处意指与未治疗（适当时）或已知的护理标准相比，使用抗OX40抗体治疗患者中的癌症导致任何证明的临床益处。可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法评价临床益处。在一个实施方案中，基于客观应答率（ORR）（使用RECIST版本1.1确定）、应答持续时间（DOR）、无进展存活（PFS）和/或总体存活（OS）来评价临床益处。在一些实施方案中，完全应答指示治疗益处。在一些实施方案中，部分应答指示治疗益处。在一些实施方案中，稳定疾病指示治疗益处。在一些实施方案中，总体存活的增加指示治疗益处。在一些实施方案中，治疗益处构成疾病进展的时间的改善和/或症状或生活质量的改善。在其它实施方案中，治疗益处并不转化为疾病控制时期的增加，而是显著减少的症状负担，导致改善的生活质量。如对于本领域技术人员显而易见的，可以使用单独（单一疗法）或者辅助或连同其它抗癌疗法和/或靶向或非靶向抗癌剂一起的抗OX40抗体观察治疗益处。
[0119] 通常，使用设计为测量对关于癌症的新治疗的应答的标准临床测试来评价治疗益处。为了评价本文所述的抗OX40抗体的治疗益处，可以使用下述测试之一或组合：（1）实体瘤的疗效评价标准（RECIST）版本1.1，（2）免疫相关的RECIST（irRECIST），（3）美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group）（ECOG）活动状态，（4）免疫相关应答标准（irRC），（5）可通过评价肿瘤抗原评估的疾病，（6）验证的患者报道结果量表，和/或（7）总体存活和无进展存活的卡普兰-梅尔估计量。
[0120] 肿瘤负荷中的变化评价是癌症治疗学的临床评估的重要特点。肿瘤缩小（客观应答）和疾病进展的发展时间均为癌症临床试验中的重要终点。标准化的应答标准，称为RECIST（实体瘤的疗效评价标准），于2000年公布。更新（RECIST 1.1）于2009年发布。RECIST标准通常用于临床试验中，其中客观应答是主要的研究终点，以及在其中进行稳定疾病、肿瘤进展或进展时间分析的评价的试验中，因为这些结果测量基于解剖学肿瘤负荷及其在试验过程中的变化的评价。表8提供了用于确定对研究药物，例如本文所述的抗OX40抗体的客观肿瘤应答的应答标准的定义。
[0121] 可以用于确定本文所述的抗OX40抗体的治疗益处的次要结果测量包括客观应答率（ORR）、无进展存活（PFS）、总体存活（OS）、总体应答持续时间（DOR）和应答深度（DpR）。ORR定义为达到完全应答（CR）或部分应答（PR）的参与者比例。PFS定义为从抗OX40抗体的第一剂量日期的时间到疾病进展或死亡的时间，以首先出现的为准。OS定义为从诊断日期或用于疾病的治疗开始的时间长度，被诊断有该疾病的该患者仍是活的。DOR定义为从参与者的初始CR或PR的时间到疾病进展的时间。DpR定义为与基线肿瘤负荷相比，在最大应答点观察到的肿瘤缩小的百分比。关于ORR和PFS两者的临床终点可以基于上述RECIST 1.1标准进行确定。
[0122] 可以用于对经历免疫疗法治疗的癌症患者特异性的临床评估的另外标准包括标准化的免疫相关RECIST（irRECIST）标准。参见例如，Nishino，M.等人 Eur. J. Radiol.，84（7），第1259-1268页（2015年7月）。考虑到潜在的免疫调节效应，这些指南修改了上述RECIST 1.1标准。表9提供了用于确定对免疫调节药物，例如本文所述的抗OX40抗体的客观肿瘤应答的应答标准的定义。
[0123] 表10中所示的ECOG活动状态量表用于描述患者在其自身照顾能力、日常活动和身体能力方面的功能水平。该量表由美国东部肿瘤协作组（ECOG）开发，并且于1982年公布，该组现在是ECOG-ACRIN癌症研究组（Cancer Research Group）的部分。
[0124] 可以用于完全表征且确定对免疫治疗剂，例如基于抗体的癌症疗法的应答的另一组标准是免疫相关应答标准（irRC），其于2009年开发用于测量实体瘤，并且于2013年更新（Wolchok等人Clin. Cancer Res. 2009；15（23）: 7412-7420和Nishino等人Clin. Cancer Res. 2013；19（14）: 3936-3943）。更新的irRC标准通常用于评价免疫治疗剂（例如本文所述的抗OX40抗体）对肿瘤负荷的作用，并且根据表11定义应答。
[0125] 起因于使用本文所述的抗OX40抗体治疗实体瘤的一种示例性治疗益处是完全应答，所述抗OX40抗体无论是作为单一疗法施用还是辅助或连同其它疗法或药物一起施用。起因于使用抗OX40抗体治疗实体瘤的另一种示例性治疗益处是部分应答，所述抗OX40抗体无论是作为单一疗法施用还是辅助或连同其它疗法或药物一起施用。
[0126] 验证的患者报道结果量表也可以用于表示由每个患者通过特定报道系统提供的应答。此类结果量表不是以疾病为重点，而是与管理慢性状况时的保留功能有关。验证的患者报道结果量表的一个非限制性实例是来自美国国立卫生研究院（United States National Institutes of Health）的PROMIS®（患者报道的结果测量信息系统）。例如，用于成人癌症患者的PROMIS®身体功能仪器（Physical Function Instrument）可以评估自我报道的上肢（例如，灵巧性）、下肢（例如，行走或移动）和中心区域（例如，颈部、背部活动）功能的能力，并且包括常规日常活动，如办公。
[0127] 卡普兰-梅尔曲线（Kaplan和Meier，J. Am. Stat. Assoc. 1958；53（282）: 457-481）也可以用于评估与护理标准相比，关于经历抗OX40抗体疗法的癌症患者的总体存活和无进展存活。
[0128] 7.6.2 辅助疗法抗OX40抗体可以辅助或连同具有抗癌特性的其它药物或治疗，包括标准护理疗法，例如抗PD-1抗体疗法一起使用。当辅助使用时，抗OX40抗体和其它药物可以在单一的组合药物制剂中一起配制，或者可以分开配制且在单一的协调给药方案或不同的给药方案中施用。辅助或连同抗OX40抗体一起施用的药物通常具有与抗OX40抗体互补的活性，使得抗体和其它药物不会不利地影响彼此。
[0129] 7.7. 剂量和施用方案施用的抗OX40抗体的量取决于各种因素，包括但不限于所治疗的癌症的特定类型、待治疗的癌症的阶段、施用模式、施用频率、所需的治疗益处和其它参数，例如患者的年龄、重量和其它特征等。有效提供关于特定模式和施用频率的治疗益处的剂量确定在本领域技术人员的能力范围内。
[0130] 可以最初从体内动物模型估计有效提供治疗益处的剂量。关于广泛多样的疾病的合适动物模型是本领域已知的。
[0131] 本文公开的抗OX40抗体可以通过对待治疗状况适当的任何途径施用。在一些实施方案中，抗OX40抗体是具有重链和轻链的人源化抗体中的任何一种，所述重链具有根据SEQ ID NO：41-48中任何一个的氨基酸序列，所述轻链具有根据SEQ ID NO:51-54中任何一个的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗OX40抗体具有重链和轻链，所述重链具有根据SEQ ID NO：41或42的氨基酸序列，所述轻链具有根据SEQ ID NO：51的氨基酸序列。抗OX40抗体通常肠胃外，即输注、静脉内（IV）、鞘内、推注、瘤内注射或硬膜外施用（Shire等人，2004，J. Pharm. Sciences 93（6）:1390-1402）。在一个实施方案中，抗OX40抗体作为小瓶中的冻干粉末提供。在施用之前，将冻干粉末用无菌注射用水（SWFI）或其它合适的培养基重构，以提供含有抗OX40抗体的溶液。在一些实施方案中，所得到的重构溶液进一步用盐水或用于输注的其它合适培养基稀释，并且每两周即每13、14或15天经由IV输注施用一次。
[0132] 在一些实施方案中，抗OX40抗体以0.01 mg/kg、0.1 mg/kg、1.0 mg/kg、或3.0 mg/kg作为IV输注每两周施用一次。
[0133] 当辅助或连同其它药物例如其它化学治疗剂一起施用时，抗OX40抗体可以以其它药物相同的时间表施用、或以不同的时间表施用。当以相同的时间表施用时，抗OX40抗体可以在其它药物之前、之后或同时施用。
[0134] 如本领域技术人员了解的，可能需要调整关于上述各种药物的推荐剂量，以优化患者应答且使治疗益处最大化。
[0135] 8. 实施例突出显示本文所述抗OX40抗体的示例性实施方案的某些特点和特性的下述实施例提
供用于说明而非限制性目的。
供用于说明而非限制性目的。
[0136] 实施例1：材料和方法8.1.1. 抗OX40抗体通过ELISA与人OX40结合
Immunolon 4xHB 96孔板（Thermo Scientific）用1 μg/mL人OX40-FC（R＆D Systems）在4℃下包被过夜。板用含有1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）在室温下封闭
30分钟，然后使用洗板机用PBST（具有0.1% Tween 20的PBS）洗涤三次。然后使OX40包被的板在室温下与指定浓度的测试抗体一起温育一小时。板用PBST洗涤四次，然后在室温下与
100 μL在含有1% BSA的PBS中制备为1:5000稀释度的山羊抗人Fab片段特异性生物素（Jackson ImmunoResearch）一起温育1小时。然后将板在PBST中洗涤五次，并且向每个孔中加入100 μL 1：1000稀释的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶（HRP）（Thermo
Scientific），并且在室温下温育30分钟。随后将板在PBST中洗涤五次，并且向每个孔中加入100 μL TMB One组分（Surmodics），并且在室温（RT）下温育直至显色（大约5-10分钟）。在
650 nm处读取光密度（OD）（Molecular Devices Spectromax190）。
Immunolon 4xHB 96孔板（Thermo Scientific）用1 μg/mL人OX40-FC（R＆D Systems）在4℃下包被过夜。板用含有1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）在室温下封闭
30分钟，然后使用洗板机用PBST（具有0.1% Tween 20的PBS）洗涤三次。然后使OX40包被的板在室温下与指定浓度的测试抗体一起温育一小时。板用PBST洗涤四次，然后在室温下与
100 μL在含有1% BSA的PBS中制备为1:5000稀释度的山羊抗人Fab片段特异性生物素（Jackson ImmunoResearch）一起温育1小时。然后将板在PBST中洗涤五次，并且向每个孔中加入100 μL 1：1000稀释的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶（HRP）（Thermo
Scientific），并且在室温下温育30分钟。随后将板在PBST中洗涤五次，并且向每个孔中加入100 μL TMB One组分（Surmodics），并且在室温（RT）下温育直至显色（大约5-10分钟）。在
650 nm处读取光密度（OD）（Molecular Devices Spectromax190）。
[0137] 8.1.2. 抗OX40抗体通过ELISA与食蟹猴OX40结合Immunolon 4xHB 96孔板（Thermo Scientific）用1 μg/mL Cyno OX40-Fc融合物在4℃下包被过夜。板用含有1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS在RT下封闭30分钟，然后用PBST（具有
0.1% Tween 20的PBS）洗涤三次。然后使OX40包被的板在室温下与指定浓度的抗OX40抗体一起温育一小时。板用PBST洗涤四次，然后在室温下与100 μL在含有1% BSA的PBS中制备为
1:5000稀释度的山羊抗人FAB片段特异性生物素（Jackson ImmunoResearch）一起温育1小时。然后将板在PBST中洗涤五次，并且向每个孔中加入100 μL 1：1000稀释的链霉抗生物素蛋白- HRP（Thermo Scientific），并且在室温下温育30分钟。随后将板在PBST中洗涤五次，并且向每个孔中加入100 μL TMB One组分（Surmodics），并且在室温下温育直至显色（大约
5-10分钟）。在650 nm处读取光密度（OD）（Molecular Devices Spectromax190）。
0.1% Tween 20的PBS）洗涤三次。然后使OX40包被的板在室温下与指定浓度的抗OX40抗体一起温育一小时。板用PBST洗涤四次，然后在室温下与100 μL在含有1% BSA的PBS中制备为
1:5000稀释度的山羊抗人FAB片段特异性生物素（Jackson ImmunoResearch）一起温育1小时。然后将板在PBST中洗涤五次，并且向每个孔中加入100 μL 1：1000稀释的链霉抗生物素蛋白- HRP（Thermo Scientific），并且在室温下温育30分钟。随后将板在PBST中洗涤五次，并且向每个孔中加入100 μL TMB One组分（Surmodics），并且在室温下温育直至显色（大约
5-10分钟）。在650 nm处读取光密度（OD）（Molecular Devices Spectromax190）。
[0138] 8.1.3. 抗OX40抗体通过流式细胞术与恒河猴OX40结合恒河猴（Macaca mulatta）OX40在氨基酸水平上与食蟹猴（Macaca fascicularis）OX40（SEQ ID NO：2）相同。在含有10%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素的达尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，培养表达恒河猴OX40的293 NF-κB报道细胞系。对于结合测定，将细胞以5百万个细胞/mL重悬浮。将50 μL（250,000个细胞）/孔转移至500 μL聚丙烯96孔板（Nunc）的每个孔中。在培养基中以666、333、111、37.03、12.34、4.11、0.457、0.152、0.0508、0.0169、
0.00564 nM在分开的稀释板中制备测试抗OX40抗体或同种型对照单克隆抗体的2X原液。将单克隆抗体（50 μL/孔）转移到测定板的分别孔内。使细胞在4℃下与一抗一起温育30分钟，并且通过以800 rpm离心3分钟，用250 μL/孔的PBS洗涤两次。结合的抗体用在PBS中稀释至
2 μg/mL（50 μL/孔）的Cy5-驴抗人IgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch）在4℃下检测30分钟。细胞用250 μL/孔的PBS洗涤一次，重悬浮于含有1%甲醛的PBS中，并且在双重激光FACSCalibur（Becton Dickinson）上分析。
0.00564 nM在分开的稀释板中制备测试抗OX40抗体或同种型对照单克隆抗体的2X原液。将单克隆抗体（50 μL/孔）转移到测定板的分别孔内。使细胞在4℃下与一抗一起温育30分钟，并且通过以800 rpm离心3分钟，用250 μL/孔的PBS洗涤两次。结合的抗体用在PBS中稀释至
2 μg/mL（50 μL/孔）的Cy5-驴抗人IgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch）在4℃下检测30分钟。细胞用250 μL/孔的PBS洗涤一次，重悬浮于含有1%甲醛的PBS中，并且在双重激光FACSCalibur（Becton Dickinson）上分析。
[0139] 8.1.4. 通过表面等离振子共振，抗OX40抗体与人和恒河猴OX40的结合亲和力使用抗Fc捕获测定方法，通过在25℃下在Biacore T200仪器（GE Healthcare）上进行的基于表面等离振子共振的测量，来确定抗OX40抗体与重组可溶性OX40 ECD（细胞外结构域）的结合动力学。购买人OX40（残基1-216）和恒河猴OX40（残基28-214）的重组细胞外结构域（ECD）（Creative Biomart），并且在10 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 7.4，150 mM NaCl，3 mM乙二胺四乙酸（EDTA）中，使用Superdex200（GE Healthcare）通过凝胶过滤进一步纯化。恒河猴OX40在氨基酸水平上与食蟹猴OX40（SEQ ID NO：2）相同。在测定缓冲液HBS-EP+（10 mM HEPES，pH 7.4，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.05% Tween 20）中进行芯片制备和结合动力学测量。对于抗Fc捕获芯片制备，在10 mM乙酸钠（pH 4.5）中稀释至25 μg/mL的大约2000个共振单位（RU）的山羊抗人IgG Fc多克隆抗体（Thermo Fisher Scientific Inc.），根据制造商的说明书和程序，使用标准胺偶联试剂盒直接固定在CM5生物传感器芯片上。在生物传感器表面上的未反应部分用乙醇胺封闭。对于结合动力学测量，每个测定循环由下述步骤组成：1）仅在测试表面上捕获测试抗OX40抗体；2）在参考表面和测试表面两者上的分析物注射（仅OX40 ECD或缓冲液），以80 μL/分钟的240 μL，这之后以
80 μL/分钟监测解离900秒；3）通过在参考表面和测试表面两者上的10 mM甘氨酸-HCl，pH
1.5注射再生捕获表面。在测定期间，所有测量都针对单独的捕获表面（即，没有捕获的测试抗体）进行参考，并且仅缓冲液的注射用于双重参考。在随机化的9或3倍稀释系列中，OX40注射的浓度范围分别为900 nM或300 nM至11.11 nM。使用Biacore T200 Evaluation软件，将数据处理并全局拟合至1：1结合模型，以确定结合动力学速率常数k（a M-1s-1）和k（d s-1）、以及平衡解离常数K（D M）。
80 μL/分钟监测解离900秒；3）通过在参考表面和测试表面两者上的10 mM甘氨酸-HCl，pH
1.5注射再生捕获表面。在测定期间，所有测量都针对单独的捕获表面（即，没有捕获的测试抗体）进行参考，并且仅缓冲液的注射用于双重参考。在随机化的9或3倍稀释系列中，OX40注射的浓度范围分别为900 nM或300 nM至11.11 nM。使用Biacore T200 Evaluation软件，将数据处理并全局拟合至1：1结合模型，以确定结合动力学速率常数k（a M-1s-1）和k（d s-1）、以及平衡解离常数K（D M）。
[0140] 8.1.5. 用抗OX40抗体的OX40配体阻断以2 x 105个细胞/孔培养的用人OX40稳定转染的Jurkat细胞与0.2 μg/mL测试抗OX40抗体和可溶性人OX40L（R＆D系统）的滴定一起，同时在圆底96孔板中在含有1% BSA的PBS中在RT下温育 30分钟。将细胞洗涤两次并且与用100 μL 1：500稀释的山羊抗人Fc PE/孔（Jackson ImmunoResearch）一起温育另外30分钟。然后将细胞洗涤两次，并且使用FACSCanto（BD Biosciences）获得，并且使用FACSDiva进行分析。
[0141] 8.1.6. 抗OX40抗体与细胞表面表达的人OX40结合在含有10% FBS和青霉素/链霉素（pen/strep）的DMEM中，培养表达人OX40蛋白的
Jurkat NF-κB报道细胞系。对于结合测定，将每种细胞系以5百万个细胞/mL重悬浮。将50 μL（250,000个细胞）/孔转移至500 μL聚丙烯96孔板（Nunc）的每个孔中。在培养基中以666、
333、111、37.03、12.34、4.11、0.457、0.152、0.0508、0.0169、0.00564 nM在分开的稀释板中制备测试抗OX40抗体或同种型对照mAb的2X原液。将每种抗体（50 μL/孔）转移到测定板的分别孔内。使细胞在4℃下与测试的抗OX40抗体或同种型对照抗体一起温育30分钟，并且通过以800 rpm离心3分钟，用250 μL/孔的PBS洗涤两次。结合的抗体用在PBS中稀释至2 μg/mL（50 μL/孔）的Cy5-驴抗人IgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch）在4℃下检测30分钟。细胞用250 μL/孔的PBS洗涤一次，重悬浮于含有1%甲醛的PBS中，并且在双重激光
FACSCalibur（Becton Dickinson）上分析。
Jurkat NF-κB报道细胞系。对于结合测定，将每种细胞系以5百万个细胞/mL重悬浮。将50 μL（250,000个细胞）/孔转移至500 μL聚丙烯96孔板（Nunc）的每个孔中。在培养基中以666、
333、111、37.03、12.34、4.11、0.457、0.152、0.0508、0.0169、0.00564 nM在分开的稀释板中制备测试抗OX40抗体或同种型对照mAb的2X原液。将每种抗体（50 μL/孔）转移到测定板的分别孔内。使细胞在4℃下与测试的抗OX40抗体或同种型对照抗体一起温育30分钟，并且通过以800 rpm离心3分钟，用250 μL/孔的PBS洗涤两次。结合的抗体用在PBS中稀释至2 μg/mL（50 μL/孔）的Cy5-驴抗人IgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch）在4℃下检测30分钟。细胞用250 μL/孔的PBS洗涤一次，重悬浮于含有1%甲醛的PBS中，并且在双重激光
FACSCalibur（Becton Dickinson）上分析。
[0142] 8.1.7. 抗OX40抗体与嵌合OX40受体结合生成基于293s的转染子以表达人OX40分子的嵌合形式，其中小鼠OX40富含半胱氨酸的结构域（CRD）个别交换成相应的人CRD。在G418选择后，存活的细胞在MoFlo流式细胞仪（Beckman）上就表达进行分选：293s-huOX40、293s-huOX40-muCRD1、293s-huOX40-muCRDII、
293s-huOX40-muCRDIII、293s-huOX40-muCRDIV、293s-huOX40-muCRDII+III和293s-muOX40。将每孔总共2 x 105个每种293s OX40嵌合转染细胞加入500 μL聚丙烯96孔板（Nunc）内。在将细胞铺平板后，将50 μL以2 μg/mL的Hu3738或同种型对照抗体对于每个细胞系一式两份加入相应的孔中，并且允许在冰上温育30分钟。温育后，将200 μL达尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS）加入每个孔内，并且使板以1000 rpm向下旋转三分钟。去除来自每个孔的上清液，并且以1：250稀释度加入50 μL Cy5-驴抗人IgG（Jackson ImmunoResearch）二抗，其然后在冰上在黑暗中温育30分钟。温育期后，加入200 μL DPBS，然后使板以1000 rpm向下旋转三分钟。去除上清液，并且用100 μL DPBS + 1%甲醛重悬浮每个孔。在双重激光FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson）上分析样品。
293s-huOX40-muCRDIII、293s-huOX40-muCRDIV、293s-huOX40-muCRDII+III和293s-muOX40。将每孔总共2 x 105个每种293s OX40嵌合转染细胞加入500 μL聚丙烯96孔板（Nunc）内。在将细胞铺平板后，将50 μL以2 μg/mL的Hu3738或同种型对照抗体对于每个细胞系一式两份加入相应的孔中，并且允许在冰上温育30分钟。温育后，将200 μL达尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS）加入每个孔内，并且使板以1000 rpm向下旋转三分钟。去除来自每个孔的上清液，并且以1：250稀释度加入50 μL Cy5-驴抗人IgG（Jackson ImmunoResearch）二抗，其然后在冰上在黑暗中温育30分钟。温育期后，加入200 μL DPBS，然后使板以1000 rpm向下旋转三分钟。去除上清液，并且用100 μL DPBS + 1%甲醛重悬浮每个孔。在双重激光FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson）上分析样品。
[0143] 8.1.8. 人和恒河猴OX40的NF-κB荧光报道基因活性Jurkat-NF-κB-huOX40和293-NF-κB-RhOX40，分别表达人和恒河猴OX40蛋白的NF-κB报道细胞系，维持在包含含有10% FBS和青霉素/链霉素（100 U/mL）的DMEM的培养基中。对于NF-κB报道基因测定，将Jurkat-NF-κB-huOX40细胞系以1百万/mL（最终50,000个细胞/孔）重悬浮于生长培养基（与培养基相同）中，并且将293-NF-κB-RhOX40细胞系以0.5百万/mL（最终25,000个细胞/孔）重悬浮于生长培养基中。将50 μL/孔转移至白色/透明底96孔测定板（Costar 3903）的内部60孔中。在分开的U形底96孔稀释板（Becton Dickinson）中制备下述抗体的3X原液：用作阴性对照抗体的抗PD-1抗体和抗OX40抗体。无需外源交联剂而测试抗体活性的稀释系列包括在培养基中的2000、500、125、31.25、7.812、1.953、0.488、0.122、
0.0305、0.00762 nM。测试交联剂对抗OX40抗体活性的作用的稀释系列包括200、50、12.5、
3.125、0.7812、0.1953、0.0488、0.0122、0.00305、0.000762 nM抗体。将50 μL/孔的抗体一式两份地转移到测定板的分别孔内。向单独的抗体板中，将50 μL/孔的培养基加入内部60孔中。对于交联剂稀释系列，将山羊抗人IgG Fc特异性（Jackson ImmunoResearch）稀释至
800、200、50、12.5、3.125、0.7812、0.1953、0.0488、0.0122、0.00305 nM ，并且将50 μL/孔转移至内部60孔以维持抗OX40抗体和交联剂的4:1比率。将生长培养基（150 μL）加入外部孔中，以防止内部60孔中的蒸发。使板在37℃下温育大约18小时。用BriteLite Plus（Perkin Elmer）定量荧光素酶活性。简言之，将底物用10 mL供应商提供的缓冲液溶解，并且将75 μL底物/孔加入每块板的内部60孔中。使用发光设置在Victor5（Molecular Devices）上分析板。
0.0305、0.00762 nM。测试交联剂对抗OX40抗体活性的作用的稀释系列包括200、50、12.5、
3.125、0.7812、0.1953、0.0488、0.0122、0.00305、0.000762 nM抗体。将50 μL/孔的抗体一式两份地转移到测定板的分别孔内。向单独的抗体板中，将50 μL/孔的培养基加入内部60孔中。对于交联剂稀释系列，将山羊抗人IgG Fc特异性（Jackson ImmunoResearch）稀释至
800、200、50、12.5、3.125、0.7812、0.1953、0.0488、0.0122、0.00305 nM ，并且将50 μL/孔转移至内部60孔以维持抗OX40抗体和交联剂的4:1比率。将生长培养基（150 μL）加入外部孔中，以防止内部60孔中的蒸发。使板在37℃下温育大约18小时。用BriteLite Plus（Perkin Elmer）定量荧光素酶活性。简言之，将底物用10 mL供应商提供的缓冲液溶解，并且将75 μL底物/孔加入每块板的内部60孔中。使用发光设置在Victor5（Molecular Devices）上分析板。
[0144] 8.1.9. ADCC报道基因测定按照方案推荐将表达人FcγRIII（Promega）的ADCC效应细胞解冻并生长。使用前将细胞分裂两次。用人或恒河猴OX40稳定转染的HEK293细胞作为靶细胞。这些细胞在具有10%热TM
灭活的FBS（Sigma）和5 μg/mL杀稻瘟素（Gibco Life Technologies）的HyClone DMEM中繁殖。
灭活的FBS（Sigma）和5 μg/mL杀稻瘟素（Gibco Life Technologies）的HyClone DMEM中繁殖。
[0145] 在测定前一天，用0.25%胰蛋白酶（Gibco Life Technologies）收获表达OX40的HEK293靶细胞。将细胞洗涤，计数，并且以10,000个细胞/孔在96孔Costar板（Corning）中铺平板。使板在37℃下在DMEM 10% FBS中温育过夜。测定遵循ADCC Bioassay Effector Cells，Propagation Model方案G7102。效应物与靶细胞比率为7.5：1。使用EnSpireManager软件用EnSpire Alpha阅读器（Perkin Elmer）测量发光。在该测定中测试的抗体包括同种型对照抗体和抗OX40抗体。
[0146] 8.1.10. 抗OX40抗体与活化的人CD4+ T细胞结合从购自Stanford Blood Center（Palo Alto，CA）的血沉棕黄层中分离人PBMC。简言之，将血沉棕黄层用不含镁和钙的PBS（GE Healthcare）以1：1的比率稀释。将稀释的血液（30 mL）在15 mL 90% Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare）上分层，所述90% Ficoll-Paque Plus在SepMate管（Stemcell Technologies）中包含的不含镁和钙的PBS（GE Healthcare）中制备。将管以1200 g旋转10分钟。收集界面相并且在1X PBS中洗涤两次。使用Stemcell Technologies CD4富集试剂盒（Stem Cell Technologies）分离CD4+ T细胞。将细胞在RPMI/10% FBS中重悬浮至2x106个细胞/mL。以1：1的比率添加Dynal CD3/28珠（Life Technologies）。将细胞在室温下在端面旋转器（end over end rotator）上温育20分钟。将细胞在6孔板中在37℃下培养24小时。
[0147] 在24小时后，用磁体去除珠。将细胞计数并重悬浮至1.5x106/mL。每次染色使用等分试样的细胞悬浮液（100 μL）。从1 μg/mL开始，以4倍稀释系列滴定测试抗体。将细胞染色30分钟并洗涤两次。在含有1% BSA的100 μL/孔PBS中加入1：250稀释的（4 μg/mL）山羊抗人Fc特异性-PE/孔（Jackson ImmunoResearch）。将细胞再染色30分钟并洗涤两次，转移至管并使用BD LSR Fortessa流式细胞仪获得，并且使用FACSDiva分析软件8.0.1进行分析。
[0148] 8.1.11抗OX40抗体与活化的食蟹猴T细胞结合食蟹猴全血购自Worldwide Primates。对于PBMC的分离，将全血用不含镁和钙的PBS（GE Healthcare）以1：1的比率稀释。将稀释的血液（30 mL）在13 mL 95% Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare）下分层，所述95% Ficoll-Paque Plus在50 mL锥形管中的不含镁和钙的PBS（GE Healthcare）中制备。将管以1000 g旋转25分钟。收集界面相并且在1X PBS中洗涤两次。将细胞在RPMI/10% FBS中重悬浮至2 x 106个细胞/mL。将细胞与10 mg/mL植物血凝素（PHA）（Sigma）和100 U/mL重组人白细胞介素-2（IL-2）（Proleukin®，Prometheus）一起在6孔板中温育72小时。在24小时后，将细胞洗涤，计数并重悬浮至2x106/mL。每次染色使用100 μL细胞。从1 μg/mL开始，以4倍稀释系列滴定测试抗OX40抗体。将细胞染色30分钟并洗涤两次。每孔加入在含有1% BSA的100 μL/孔PBS中1：250稀释（4 μg/mL）的山羊抗人IgG Fc特异性-PE（Jackson ImmunoResearch）。将细胞再染色30分钟并洗涤两次，转移至管并使用BD LSR Fortessa流式细胞仪获得，并且使用FACSDiva分析软件8.0.1进行分析。
[0149] 8.1.12. 活化的人T细胞增殖和IFN-γ诱导人血沉棕黄层购自Stanford Blood Center（Palo Alto，CA）。对于PBMC的分离，将血沉棕黄层用不含镁和钙的PBS（GE Healthcare）以1：1的比率稀释。将稀释的血液（30 mL）在15 mL 90% Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare）上分层，所述90% Ficoll-Paque Plus在SepMate管（Stemcell Technologies）中包含的不含镁和钙的PBS（GE Healthcare）中制备。
将管以1200 g旋转10分钟。收集界面相并且在1X PBS中洗涤两次。使用EasySep CD4+ T细胞富集试剂盒（Stemcell Technologies），从PBMC中分离CD4+ T细胞。将CD4+ T细胞以2 x
106个细胞/mL在RPMI+10% FCS加上2 μg/mL PHA（Sigma）和20 IU/mL重组人IL-2
（Proleukin®，Prometheus）中在6孔板中培养72小时。
将管以1200 g旋转10分钟。收集界面相并且在1X PBS中洗涤两次。使用EasySep CD4+ T细胞富集试剂盒（Stemcell Technologies），从PBMC中分离CD4+ T细胞。将CD4+ T细胞以2 x
106个细胞/mL在RPMI+10% FCS加上2 μg/mL PHA（Sigma）和20 IU/mL重组人IL-2
（Proleukin®，Prometheus）中在6孔板中培养72小时。
[0150] Biocoat T细胞活化对照板-96孔板（Corning）用在100 μL/孔PBS中的2 μg/mL山羊抗小鼠IgG Fc特异性（Jackson ImmunoResearch）和2 μg/mL山羊抗人IgG-Fc特异性（ Jackson ImmunoResearch）在4℃下涂布过夜。将板用200 μL/孔在PBS中的1% BSA（Rockland）在室温下封闭30分钟。将板用200 μL/孔PBS洗涤两次。在100 μL/孔PBS中加入4 ng/mL抗人CD3 OKT3（eBioscience），并且在37℃下温育90分钟。将板用200 μL/孔PBS洗涤两次。将以5 μg/mL起始的3倍稀释系列的抗OX40抗体和同种型对照单克隆抗体加入板中的
100 μL PBS中。使板在37℃下温育90分钟。板用200 μL/孔PBS洗涤两次。将洗涤的PHA和IL-
2活化的CD4+ T细胞（2 x 105）加入每个孔中。
100 μL PBS中。使板在37℃下温育90分钟。板用200 μL/孔PBS洗涤两次。将洗涤的PHA和IL-
2活化的CD4+ T细胞（2 x 105）加入每个孔中。
[0151] 在37℃下培养48小时后，合并来自每个一式两份重复的30 μL上清液用于由Luminex（Millipore）的IFN-γ分析，并且在Bioplex Manager 6.0（BioRad）上分析。将板用0.25 μCi 3H-胸苷（Perkin Elmer）脉冲过夜，并且在第二天早晨在Filtermats（Perkin Elmer）上用5 mL Ultima Gold Scintillation流体（Perkin Elmer）收获。在1450 Microbeta Wallac Trilux计数器（PerkinElmer）上对过滤垫计数。
[0152] 8.1.13. 人调节性T细胞抑制测定从AllCells或Stemcell Technologies获得新鲜的外周血单核细胞（PBMC）。将细胞向下旋转，将细胞团块用1X PBS重悬浮，并且在室温下以1200 rpm再一次向下旋转10分钟。去除上清液，然后用RoboSep缓冲液（Stemcell Technologies）重悬浮细胞。使用Vi-Cell XRcell Counter Beckman Coulter测定细胞活力和细胞计数。留出1亿至1.5亿个细胞，用于使用Stemcell EasySep Human CD4+ T cell Enrichment Kit的CD4+ T细胞富集。然后使用Stemcell EasySep Human CD25 + Selection试剂盒，使富集的CD4+ T细胞耗尽CD25 +细胞。该过程导致纯化的CD4+/CD25-应答者T细胞（Tresp）。遵循来自Stemcell EasySep Human CD4+/CD127low/CD49d- Regulatory T cell Enrichment Kit的说明书，残留的PBMC用于分离调节性T细胞（Treg）。在CD4+/CD25- Tresp和Treg分离后，细胞用具有10%热灭活的FBS和0.01mM 2-巯基乙醇的RPMI 1640分别以1 x 106个细胞/mL和5 x 105个细胞/mL重悬浮。
[0153] 使用以2：1和4：1的两种不同比率的Tresp与Treg建立Treg抑制测定。对于2：1的比4 4
率，将5 x 10个Tresp细胞和2.5 x 10个Treg细胞加入96孔U形底板中。对于4：1的比率，将
5 x 104个Tresp细胞和1.25 x 104个Treg细胞加入96孔板中。还将Treg Suppression Inspector珠试剂（Miltenyi Biotec）以1：1的珠/细胞比率加入孔中用于刺激。在不存在或存在F（ab'）2山羊抗人（GxHu）IgG，Fc特异性（Jackson ImmunoResearch）的情况下，抗OX40抗体和同种型对照人IgG1以1： 4比率以10 μg/mL最终浓度一式三份地进行测试。使板在37℃下在5% CO2中温育四天。将板用1 μCi/孔3H -胸苷处理，并且进一步在37℃下在5% CO2中再温育16小时。在温育后，收获板并且使用Ultima Gold Scintillation流体（Perkin Elmer）和1450 Microbeta Wallac Trilux闪烁计数器（PerkinElmer）测量增殖。
率，将5 x 10个Tresp细胞和2.5 x 10个Treg细胞加入96孔U形底板中。对于4：1的比率，将
5 x 104个Tresp细胞和1.25 x 104个Treg细胞加入96孔板中。还将Treg Suppression Inspector珠试剂（Miltenyi Biotec）以1：1的珠/细胞比率加入孔中用于刺激。在不存在或存在F（ab'）2山羊抗人（GxHu）IgG，Fc特异性（Jackson ImmunoResearch）的情况下，抗OX40抗体和同种型对照人IgG1以1： 4比率以10 μg/mL最终浓度一式三份地进行测试。使板在37℃下在5% CO2中温育四天。将板用1 μCi/孔3H -胸苷处理，并且进一步在37℃下在5% CO2中再温育16小时。在温育后，收获板并且使用Ultima Gold Scintillation流体（Perkin Elmer）和1450 Microbeta Wallac Trilux闪烁计数器（PerkinElmer）测量增殖。
[0154] 8.1.14. 人免疫细胞植入的PC-3小鼠肿瘤模型在接种当天，通过Vi-Cell XR（Beckman Coulter）计数人T细胞、自体人moDC（单核细胞衍生的树突状细胞）和PC-3细胞，并且组合以递送在100 μL达尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（GE Lifesciences）中的1 x 107 PC-3、1 x 106个T细胞和5 x 105 moDC/NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠）的皮下注射。在200 μL DPBS中制备10 mg/kg同种型对照单克隆抗体和10 mg/kg Hu3738的治疗组（n = 8只小鼠/组）用于腹膜内注射。在细胞混合物接种时注射单一抗体剂量。通过标准卡尺测量评价肿瘤生长的测量，并且计算肿瘤生长体积（长度x宽度x高度/2）。
[0155] 8.1.15. NSG小鼠中的人PBMC GVHD模型人外周血单核细胞（PBMC）购自AllCells（Oakland，CA）。免疫缺陷的NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）在第1天时用2 x 107人PBMC进行腹膜内接种。从第1天开始，每周一次腹膜内施用抗OX40抗体Hu3738或同种型对照。一旦小鼠显示出移植物抗宿主病（GVHD）的行为迹象（例如，驼背姿势、毛皮毛躁），就获得血清样品，并且使用Luminex珠阵列测定（Millipore）测定血清中的细胞因子水平。
[0156] 实施例2：小鼠抗OX40抗体的生成和人源化根据本领域已知的方法（E. Harlow，D. Lane. Antibody: A Laboratory Manual，（Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1998））免疫小鼠。使用Mouse Isotyping试剂盒（Roche），测定每种单克隆抗体的同种型。产生目标抗体的杂交瘤克隆被纯化，并且通过表面等离振子共振进一步表征亲和力并通过FACS表征配体竞争。
[0157] 通过本领域已知的用于表达重组单克隆抗体的方法完成表达载体的克隆和构建。
[0158] 如通过Queen，C.等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1989；86:10029-10033）概述的，进行抗体V区的人源化。CDR的规范结构根据Huang等人（Methods，2005；36:35-42）进行确定。鉴定具有相同或最相似的CDR规范结构的人可变种系序列，并且选择适当的人VH、VL和J区段序列，以提供用于抗OX40可变区的构架。在其中计算机模型提示与CDR显著接触的构架位置处，来自鼠抗OX40 V区的氨基酸被取代为原始人构架氨基酸（回复突变）。
[0159] 根据上述方法，将抗OX40小鼠抗体Mu3726、Mu3738、Mu3739和Mu3741人源化。Mu3726 VH的人源化形式是Hu3726 VH.1a，其具有人VH4-28构架区，具有I48M、V67I、M69I、V71R、F78V、A93V和R94K的7个回复突变。将Hu3726 VH.1a与其分别的人源化轻链Hu3726 VL.1b组合，所述Hu3726 VL.1b具有人VK1-39构架区，具有Y48F和F71Y的两个回复突变。
Mu3738 VH的人源化形式是Hu3738 VH.1b，其具有人VH 3-7构架区，具有W47L的一个回复突变。将Hu3738 VH.1b与其分别的人源化轻链Hu3738 VL.1组合，所述Hu3738 VL.1具有人VK4-
1构架区并且没有回复突变。Mu3739 VH的人源化形式是Hu3739 VH.1b，其具有人VH1-69构架区，具有M48I、V67A、E73T和S76N的四个回复突变。将Hu3739 VH.1b与其分别的人源化轻链Hu3739 VL.1b组合，所述Hu3739 VL.1b具有人VK1-39构架区，具有V58L和F71Y的两个回复突变。Mu3741 VH的人源化形式是Hu3741 VH.2b，其具有人VH3-66构架区，具有A24V、V48L、S49G、F67L、R71K、N76S和L78V的7个回复突变。将Hu3741 VH.2b与其分别的人源化轻链Hu3741 VL.1c组合，所述Hu3741 VL.1c具有人VK1-39构架区，具有Y36F和F71Y的两个回复突变。
Mu3738 VH的人源化形式是Hu3738 VH.1b，其具有人VH 3-7构架区，具有W47L的一个回复突变。将Hu3738 VH.1b与其分别的人源化轻链Hu3738 VL.1组合，所述Hu3738 VL.1具有人VK4-
1构架区并且没有回复突变。Mu3739 VH的人源化形式是Hu3739 VH.1b，其具有人VH1-69构架区，具有M48I、V67A、E73T和S76N的四个回复突变。将Hu3739 VH.1b与其分别的人源化轻链Hu3739 VL.1b组合，所述Hu3739 VL.1b具有人VK1-39构架区，具有V58L和F71Y的两个回复突变。Mu3741 VH的人源化形式是Hu3741 VH.2b，其具有人VH3-66构架区，具有A24V、V48L、S49G、F67L、R71K、N76S和L78V的7个回复突变。将Hu3741 VH.2b与其分别的人源化轻链Hu3741 VL.1c组合，所述Hu3741 VL.1c具有人VK1-39构架区，具有Y36F和F71Y的两个回复突变。
[0160] 实施例3：抗OX40抗体的结合亲和力下表3-1显示了示例性抗OX40抗体Hu3738、或者美国专利号7,960,515中描述的文献抗OX40抗体11D4或18D8的体外结合亲和力数据。11D4和18D8各自是人IgG1，具有轻κ区。
[0161] 如本文使用的，11D4具有含有根据以下的氨基酸序列的VH：含有根据以下的氨基酸序列的VL：
。
。
[0162] 18D8具有含有根据以下的氨基酸序列的VH：含有根据以下的氨基酸序列的VL：
。
。
[0163] Hu3738通过表面等离振子共振，或如在实施例1的测定中测量的，在表达人OX40的转染的Jurkat NF-κB报道细胞中，显示出对人OX40的有力结合特性，并且与Hu3739或Hu3741相比，通过SPR显示出更高的结合亲和力。*如根据实施例1通过表面等离振子共振测定的；显示了指数表示法（例如，3.0E-09 =
3.0 × 10-9）；N/A =不可用。
3.0 × 10-9）；N/A =不可用。
[0164] 示例性抗OX40抗体Hu3738显示出针对食蟹猴或恒河猴OX40的交叉反应性，但未证实针对小鼠或大鼠OX40的显著结合。如通过实施例1中描述的测定确定的，Hu3738与重组人或食蟹猴（cyno）OX40、或者细胞表面人或恒河猴OX40的结合活性概括于表3-2中。
[0165] 实施例4：抗OX40抗体Hu3738的体外生物活性为了评价Hu3738与内源表达的人OX40的结合，通过流式细胞术检查活化的CD4+ T细胞和未刺激的外周血单核细胞（PBMC）两者。表4-1概括了根据实施例1中描述的测定，关于Hu3738在CD3/CD28珠活化的人CD4+ T细胞、或植物血凝素（PHA）和白细胞介素-2（IL-2）活化的食蟹猴CD4+ T细胞上的细胞表面OX40上的结合数据。如表4-1中所示，Hu3738有力结合在人和食蟹猴T细胞培养物中活化的CD4+ T细胞上的OX40。
[0166] 根据节段8.1.12中描述的测定（图1A，1B），在用Hu3738的体外处理后，如通过人外周血CD4+ T细胞增加的增殖和通过人CD4+ T细胞增强的干扰素γ产生所证实的，人OX40通过Hu3738的亚纳摩尔结合提供了功能性活化。如图1A中描绘的典型实验中所示，与同种型对照huIgG1相比，Hu3738实现约1.5倍至约6倍的人外周血CD4+ T细胞的增殖增加，其与当T细胞用等价量的文献抗OX40抗体11D4或18D8给药时观察到的增殖增加可比较或更大。Hu3738在来自八个供体的平均运行中显示EC50 = 0.11 nM（16 ng/mL）。
[0167] 图1C显示了在用Hu3738的体外处理后，当各自根据节段8.1.12中描述的T细胞增殖测定进行测试时，在约0.001至约1 μg/mL的广泛范围的抗体浓度下，人外周血CD4+ T细胞的增殖与文献抗OX40抗体1A7相似。
[0168] 美国公开号2015/0307617中描述的抗体1A7是具有κ轻链的人IgG1，具有根据以下的VH氨基酸序列：根据以下的VL氨基酸序列：
。
。
[0169] 如图1B中描绘的典型实验中所示，当跨越测试的浓度范围用Hu3738处理时，人CD4+ T细胞中IFN-γ产生增加约2至约10倍。关于IFN-γ产生，Hu3738在来自九个供体的平均运行中显示出EC50 = 0.16 nM（24 ng/mL）。在这些测定条件下，文献抗OX40抗体11D4和18D8也证实对IFN-γ产生的类似作用。
[0170] 图1D显示了当各自根据节段8.1.12中描述的T细胞IFN-γ产生测定进行测试时，与文献抗OX40抗体1A7相比，Hu3738在人CD4+ T细胞中实现更高的IFN-γ产生增加。
[0171] 除增加CD4+ T细胞增殖和增强IFN-γ产生的下游信号传导活化效应之外，示例性抗OX40抗体Hu3738还在体外抑制人T调节细胞活性，提示在实体瘤内的T调节细胞可以通过Hu3738的施用得到抑制，所述T调节细胞可以抑制通过身体攻击肿瘤的免疫应答。
[0172] 根据节段8.1.13中描述的测定，在体外评价Hu3738对T调节活性的作用。将自体CD4+/CD25- T应答者（Tresp）细胞与CD4+/CD25+/CD127low T调节（Treg）细胞和活化剂珠（Insp）以2：1或4：1 Tresp：Treg比率共培养（图2A，2B）。在不存在Treg的情况下，Tresp细胞响应活化剂珠而增殖。在存在Treg的情况下，增殖被抑制。在培养基中包括10 μg/mL Hu3738对Treg介导的抑制没有影响。用于这些T调节抑制测定的同种型对照是具有恒定区变体L234A和L235A的huIgG1。具有交联剂使用huIgG1同种型对照执行的分开实验显示对测定没有作用。
[0173] 相比之下，在存在外源交联剂的情况下，Hu3738导致Tresp增殖的完全恢复（图2A和2B）。Hu3738在交联剂的存在下增强该测定中的增殖高于对单独的活化剂珠的Tresp应答水平。该结果提示OX40信号可以克服T调节细胞介导的抑制，并且可以增强与上文报道的结果一致的抗原特异性应答。
[0174] 如节段8.1.9中所述，使用商购可得的ADCC报道基因测定，评估通过Hu3738介导的ADCC活性。该测定利用表达人FcγRIIIa和活化T细胞核因子（NFAT）报道分子的改造Jurkat细胞作为效应细胞。表达人OX40的HEK 293细胞用作靶细胞，并且预期抗OX40抗体结合靶细胞上表达的OX40。另外，预期Hu3738的Fc区与报道细胞的细胞表面上的FcγRIIIa受体结合。这些结合事件将导致两种细胞类型的多重交联，导致ADCC报道活性活化，由于NFAT途径活化通过发光读出测量的效应。与同种型对照相比，Hu3738增加ADCC报道活性，其中EC50 = 0.51 nM（77 ng/mL）。
[0175] 实施例5：示例性抗OX40抗体的表位分类8.5.1. Hu3738与人/小鼠嵌合OX40的结合
在节段8.1.5中描述的表达人OX40的Jurkat细胞测定中（图3），可溶性OX40L阻断
Hu3738与OX40的结合，其中IC50 = 67 pM（10 ng/mL），提示Hu3738在分子的配体结合区中与人OX40结合。
在节段8.1.5中描述的表达人OX40的Jurkat细胞测定中（图3），可溶性OX40L阻断
Hu3738与OX40的结合，其中IC50 = 67 pM（10 ng/mL），提示Hu3738在分子的配体结合区中与人OX40结合。
[0176] 关于Hu3738抗体结合的更详细的表位作图，产生了表达人/小鼠富含半胱氨酸的结构域（CRD）的OX40分子的一系列细胞系。该方法基于Hu3738不与小鼠OX40结合的观察（图4B）。人OX40（SEQ ID NO：1）与小鼠OX40（SEQ ID NO：3）的序列比对显示于图4A中。根据序列分析，生成表达具有交换的小鼠CRD序列的人OX40受体的嵌合形式的一系列293s转染子，并且用Hu3738染色。
[0177] 人小鼠OX40受体嵌合体的氨基酸序列（包括信号序列）如下，其中鼠交换区域指示为下划线。具有鼠CRDI替换人CRDI的人OX40嵌合体具有根据以下的氨基酸序列：具有鼠CRDII替换人CRDII的人OX40嵌合体具有根据以下的氨基酸序列：
具有鼠CRDIII替换人CRDIII的人OX40嵌合体具有根据以下的氨基酸序列：
具有鼠CRDIV替换人CRDIV的人OX40嵌合体具有根据以下的氨基酸序列：
并且具有鼠CRDII和CRDIII替换人CRDII和CRDIII的人OX40嵌合体具有根据以下的氨
基酸序列：
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具有鼠CRDIII替换人CRDIII的人OX40嵌合体具有根据以下的氨基酸序列：
具有鼠CRDIV替换人CRDIV的人OX40嵌合体具有根据以下的氨基酸序列：
并且具有鼠CRDII和CRDIII替换人CRDII和CRDIII的人OX40嵌合体具有根据以下的氨
基酸序列：
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[0178] 根据节段8.1.7中描述的测定执行Hu3738与该系列嵌合体的结合测定，以将结合位点定位至特定的CRD区域。结合中的丧失提示哪些CRD对于通过特定抗体的OX40识别至关重要。在这种情况下，与小鼠中的特定CRD交换区域的可检测结合的缺乏提示通过Hu3738识别的人OX40受体区域。当用相应的小鼠CRDII替换人CRDII时，抗OX40抗体Hu3738显示丧失结合，与Hu3738结合人OX40的CRDII一致（图4B）。
[0179] 8.5.2. 用与人OX40结合的示例性抗OX40抗体Hu3738的竞争测定生成另外的文献人源化抗OX40抗体，以与本发明的示例性抗OX40抗体进行比较。美国公开号2013/0280275中描述的抗体106-222和119-122是具有κ轻链的人IgG1。
[0180] 抗体106-222具有根据以下的VH氨基酸序列：根据以下的VL氨基酸序列：
。
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[0181] 抗体119-122具有根据以下的VH氨基酸序列：根据以下的VL氨基酸序列：
。
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[0182] Hu3738与细胞表面表达的OX40的结合通过直接竞争研究显示与一些但并非全部文献抗OX40抗体竞争。如图5中所示，用剂量滴定的文献抗体处理Jurkat-NF-κB-huOX40细胞，然后经受2 μg/mL荧光ALEXA FLUOR® 647标记的Hu3738以确定结合竞争。通过流式细胞术执行分析。文献抗OX40抗体106-222或1A7与Hu3738竞争。然而，抗体11D4、18D8或119-122直至100 μg/mL都不与Hu3738竞争。
[0183] 实施例6：通过示例性抗OX40抗体Hu3738的OX40活化Jurkat NF-κB细胞数据突出显示了示例性抗OX40抗体Hu3738的活化能力，甚至在不存在交联剂的情况下（图6A，6B）。如图6A中所示，跨越约0.001至约100 μg/mL抗体的浓度范围证实显著的NF-κB信号传导活性的唯一抗OX40抗体是Hu3738和相应的鼠Mu3738。文献抗OX40抗体11D4、18D8、106-222和119-122各自直至约100 μg/mL抗体都缺乏显著的NF-κB信号传导效应。
[0184] 在不存在外源性交联的情况下，Hu3738的活性与在相同测定条件下其它文献抗OX40抗体的活性缺乏形成对比。NF-κB细胞信号传导数据的概括显示于表6-1和6-2中。值得注意的是，尽管Hu3738与文献抗OX40抗体106-222和1A7竞争结合人OX40，但在不存在交联剂的情况下，Hu3738显示出与每种抗体相比不同的功能活性。* NS = 直至100 μg/mL抗体也无显著的NF-κB信号传导；N/A =不可用。
[0185] 除其在Jurkat-NF-κB-huOX40细胞中在不存在外源交联剂的情况下实现NF-κB信号传导的能力之外，与文献抗OX40抗体11D4、18D8、106-222和119-122相比，使用交联剂，Hu3738也证实更高的效力（如通过EC50测量的）（表6-1）。
[0186] Hu3738与1A7的并排比较显示于图6B中且概括于下表6-2中。除在Jurkat-NF-κB-huOX40细胞中在不存在外源交联剂的情况下缺乏NF-κB信号传导之外，与Hu3738相比，上述文献抗OX40抗体各自也显示出较低的EC50。* NS = 直至100 μg/mL抗体也无显著的NF-κB信号传导。
[0187] 实施例7：Hu3738在小鼠中的人细胞过继转移模型中的抗肿瘤活性根据节段8.1.14中描述的方案（图7），在用人PC3细胞、T细胞和自体单核细胞衍生的树突状细胞（moDC）的单次剂量接种后，Hu3738在体内NSG小鼠模型中证实抗肿瘤活性。在接种当天，通过皮下注射，将人T细胞、moDC和PC3细胞递送至每只NSG小鼠。同种型对照单克隆抗体或Hu3738（10mg/kg）各自在每个处理组（n = 8）中的每只动物腹膜内给药，其中抗体剂量在接种时注射。通过标准卡尺测量评价肿瘤生长的测量，并且计算肿瘤生长体积（长度x宽度x高度/2）。
[0188] 如图7中所示，与等剂量的同种型对照抗体相比，Hu3738在接种后17天显著抑制NSG小鼠中的PC3肿瘤生长。
[0189] 实施例8：人PBMC GVHD模型中的体内免疫活化用人PBMC腹膜内接种NSG小鼠。然后用1 mg/kg Hu3738或huIgG1同种型对照q7d X 4
（即，每7天一次，总共4个剂量）处理小鼠，其中第一剂量在用人细胞接种后的第1天时立即给予。在第22天时，处死小鼠并且使用Luminex珠阵列测定（Millipore），测定血清中的细胞因子水平。
（即，每7天一次，总共4个剂量）处理小鼠，其中第一剂量在用人细胞接种后的第1天时立即给予。在第22天时，处死小鼠并且使用Luminex珠阵列测定（Millipore），测定血清中的细胞因子水平。
[0190] 图8中的结果证实与同种型相比，在抗OX40抗体Hu3738给药后，观察到白细胞介素-8（IL-8）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）中的增强，提示在小鼠中由于Hu3738的免疫应答增加。
[0191] 本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文件在此整体引入作为参考用于所有目的，其程度如同每个个别出版物、专利、专利申请或其它文件被个别指出引入作为参考用于所有目的。
[0192] 尽管已说明且描述了各种具体实施方案，但应了解可以进行各种改变，而不背离本发明的精神和范围。
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