哺乳动物多能干细胞、其产生方法及其用途
阅读：0发布：2022-01-18
专利汇可以提供哺乳动物多能干细胞、其产生方法及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及神经源性成体多能干细胞，其特征在于表达Oct4、Sox2、c‑Myc和Klf4，还涉及用于获得其的方法及其用途。本公开提供神经源性成体多能干细胞(在本文中被称为NEDAPS细胞)、用于获得其的方法、由其分化出的细胞及NEDAPS细胞和其分化后代的用途。NEDAPS细胞能够表达四种转录因子Oct4、Sox2、c‑Myc和Klf4，其是胚胎干细胞和多能干细胞的标志物。，下面是哺乳动物多能干细胞、其产生方法及其用途专利的具体信息内容。
1.一种哺乳动物神经源性成体多能干细胞(NEDAPS细胞)，其特征在于表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4。
2.如权利要求1所述的NEDAPS细胞，其是分离的。
3.如权利要求1或2所述的NEDAPS细胞，其特征在于以下的一个、两个、三个、四个或全部：
(a)能够分化为中胚层细胞类型，可选地，间充质细胞类型；
(b)能够分化为内胚层细胞类型；
(c)能够分化为外胚层细胞类型，可选地，神经干细胞；
(d)具有能动性；及
(e)在培养物中贴附在玻璃或塑料基底上。
4.如权利要求3所述的NEDAPS细胞，其中，所述间充质细胞类型是(a)成骨细胞或(b)内皮细胞。
5.如权利要求1～4中任一项所述的NEDAPS细胞的群。
6.如权利要求5所述的群，其是分离的，可选地，所述群是至少55％、至少60％、至少
70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同质的。
7.一种产生权利要求6所述的群的方法，其包括：
(a)离体培养暴露于NEDAPS细胞增殖条件的周围神经；或
(b)在受试者体内培养来自暴露于NEDAPS细胞增殖条件的周围神经的细胞，且(i)可选地，在培养前获取所述周围神经；和
(ii)可选地，在获取前，使所述周围神经暴露于NEDAPS细胞增殖条件。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述NEDAPS细胞增殖条件包括：
(a)使周围神经暴露于BMP2；
(b)使周围神经暴露于除BMP2以外的神经炎性试剂；
(c)向周围神经施加创伤；
(d)(a)-(c)中的两个的组合；或
(e)(a)-(c)中的三个的组合。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述NEDAPS细胞增殖条件包括使周围神经暴露于BMP2，并且其中：
(a)所述周围神经在受试者体内暴露于BMP2，可选地，其中：
(i)将BMP2直接施用至周围神经，可选地，以10ng～1mg的量施用；
(ii)通过肌内注射将BMP2施用至受试者，可选地，以10ng～1mg的量施用；或(iii)使受试者暴露于导致BMP2局部产生的条件，可选地，其中，所述条件包括骨折、钝挫伤、热损伤或电击；或
(b)通过在包含BMP2的培养基中培养周围神经而使周围神经离体暴露于BMP2，可选地，BMP2的浓度为5ng/ml～1mg/ml。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述NEDAPS细胞增殖条件包括向周围神经施加创伤，可选地，其中，所述创伤是机械创伤、电刺激、超声冲击波或热攻击。
11.如权利要求8所述的方法，其中，所述NEDAPS细胞增殖条件包括使周围神经暴露于除BMP2以外的神经炎性试剂，可选地，其中，所述神经炎性试剂是肿瘤坏死因子α、白介素-1β、神经生长因子、组胺、白介素6或它们的组合物。
12.如权利要求7～11中任一项所述的方法，其中，所述周围神经是被破坏的，可选地，通过在培养周围神经或来自周围神经的细胞之前用蛋白酶(可选地，胶原蛋白酶或基质金属蛋白酶)进行处理来破坏周围神经。
13.如权利要求7～12中任一项所述的方法，其中，所述周围神经是腓肠神经、腓肠神经的分支、手指或脚趾的固有指/趾神经、闭孔神经的薄束分支、前臂内侧皮神经的节段、前臂外侧皮神经、近端第三网络空间神经束或骨内后神经，可选地，其中，所述神经来自断肢。
14.一种产生分化的细胞的群的方法，其包括使权利要求5或6所述的群或用权利要求7～13中任一项所述的方法产生的群暴露于分化条件。
15.如权利要求14所述的方法，其中：
(a)所述分化的细胞是中胚层细胞，且所述分化条件包括在中胚层分化培养基中培养所述群；
(b)所述分化的细胞是内胚层细胞，且所述分化条件包括在内胚层分化培养基中培养所述群；或
(c)所述分化的细胞是外胚层细胞，且所述分化条件包括在外胚层分化培养基中培养所述群。
16.如权利要求14所述的方法，其中：
(a)所述分化的细胞是成骨细胞，且所述分化条件包括在成骨性分化培养基中培养所述群；
(b)所述分化的细胞是内皮细胞，且所述分化条件包括在内皮分化培养基中培养所述群；或
(c)所述分化的细胞是神经干细胞，且所述分化条件包括在神经干细胞分化培养基中培养所述群。
17.通过权利要求14～16中任一项所述的方法产生的分化的细胞的群。
18.一种治疗需要组织再生的受试者的方法，其包括将适于所述组织再生的细胞群植入所述受试者，其中，所述细胞群：
(a)通过权利要求7～16中任一项所述的方法产生；或
(b)是权利要求5～6和17中任一项所述的细胞的群，可选地，其中，所述细胞的群是受试者自体的。
19.一种治疗需要基因治疗的受试者的方法，其包括将通过引入受试者所需的基因而制造的重组的细胞群植入所述受试者，其中，所述细胞群：
(a)通过权利要求7～16中任一项所述的方法产生；或
(b)是权利要求5～6和17中任一项所述的细胞的群，可选地，其中，所述细胞的群是受试者自体的。
哺乳动物多能干细胞、其产生方法及其用途
[0001] 1.相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2014年8月4日提交的美国临时申请62/032,911号的优先权，此处通过援引将其内容整体并入本文。
[0004] 本发明是在由美国国防部授予的DARPA-11-65-Open-BAA-FP-169下由政府支持进行的。政府对本发明享有一定的权利。
[0006] 本申请包含已以ASCII格式电子提交的序列表，此处通过援引将其整体并入本文。该2015年7月31日创建的ASCII副本名为KNS-001_SL.txt，大小为2,057字节。
4.背景技术
4.背景技术
[0007] 干细胞是在大多数(如果不是全部)多细胞生物体中发现的部分未分化或完全未分化的细胞。干细胞能够通过有丝细胞分裂而自我更新并分化成许多种特化的细胞类型，包括但不限于脑、骨、软骨、腺体、肌肉、肝脏、皮肤、血管、神经和血细胞。因为干细胞具有发育成特定细胞类型的潜能，并且可以或多或少地无限增殖或者经历长时间段的更新，它们在治疗应用的情况下具有特殊的潜能。干细胞，无论它们是多能的(pluripotent)还是专能的(multipotent)，都可用于器官修复和替换、对包括退行性疾病在内各种疾病的细胞治疗、基因治疗和新药物的毒性或期望活性的测试。
[0008] 然而，可用于实验和治疗应用的干细胞以及更加分化的细胞的可用来源是有限的，通常品质较差，不适合用于治疗，且是有争议的。例如，用于人类治疗的胚胎干细胞(ESC)的应用被伦理问题及来自胚胎来源的细胞可能被患者的免疫系统排斥的风险所阻碍。ESC应用的第三个问题是，ESC能够形成被称为畸胎瘤的肿瘤。畸胎瘤包括几种不同的细胞类型，且常常包括毛发、牙齿和皮肤。这类肿瘤在技术上是良性的，但可呈现非常显著的问题。ESC的替代品是诱导型多能干细胞(iPS细胞或IPSC)。iPS细胞的产生是通过将遗传材料引入到分化的“成体”细胞的细胞核中而促使支配胚胎表型的4种转录因子的表达，即c-Myc、Klf4、Sox2和Oct4。Takakashi K.和Yamanaka S.,Cell(2006)126(4):663-76；Takahashi等,Cell(2007)131(5):861-872。常常使用逆转录病毒或慢病毒载体引入这些基因。用于诱导细胞变为iPS细胞的载体整合到宿主细胞的基因组中。这些事件导致细胞的行为类似于胚胎干细胞。iPS细胞也具有以上所确定的潜在问题，最值得注意的是免疫排斥，但由于遗传操纵，其另外还具有分化成各种类型的恶性肿瘤的实际风险。转基因大部分在iPS细胞中沉默，但这种转基因的后期再活化是可能的。一个严重的顾虑的是编码c-Myc的转基因可能导致肿瘤发生。Yamanaka S,Cell(2009)137(1):13-17。
[0009] 因此，需要避免ESC和iPS细胞的问题的干细胞。5.发明内容
[0010] 本公开提供神经源性成体多能干细胞(在本文中被称为NEDAPS细胞)，其获得方法，从其分化的细胞，以及NEDAPS细胞和其分化后代的用途。NEDAPS细胞表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，这是作为胚胎干细胞和多能干细胞的标志物的四种转录因子。本文描述的NEDAPS细胞可以来源于外周神经，并且，不受任何特定操作理论的约束，其看上去是对转变成NEDAPS细胞的静默细胞群进行特定刺激的结果。这些细胞能够分化成如本文所述的多种细胞类型，其不是胚胎来源的，不要求将新的遗传材料操纵或引入NEDAPS细胞核。这种细胞可从暴露于NEDAPS细胞增殖条件的受试者或从离体暴露于NEDAPS细胞增殖条件的神经安全地获取。该NEDAPS细胞可以在体外或离体进行培养，在分化或不分化的情况下繁殖，以用于医疗、兽医或工业应用。例如，NEDAPS细胞可以从受试者中获取，体外培养和繁殖，然后重新植入需要干细胞治疗的受试者，而没有免疫排斥这些自身来源细胞的预期风险。NEDAPS细胞可用于组织修复，或者它们可以在培养物中完全或部分地分化。当在完全分化后进行植入时，NEDAPS细胞的后代可原位发育成所选择的组织或器官(例如，肝脏组织)。NEDAPS细胞或其分化后代的自体移植避开了从胚胎获取ESC的相关问题，并避开了与移植供体组织相关的免疫排斥反应。NEDAPS细胞及其后代的应用也有望消除或大大减少移植疗法或干细胞疗法中形成畸胎瘤和恶性肿瘤的风险。6.附图说明
[0011] 图1A-1N：图1A显示了手术切除的并用苏木精和伊红染色的正常小鼠坐骨神经(对照)。图1B显示了在暴露于经皮注射的BMP2 24小时后手术切除的用苏木精和伊红染色的小鼠坐骨神经。注意细胞的增殖。图1C显示了在暴露于注射的BMP2 48小时后用H&E染色的小鼠坐骨神经。注意细胞的旺盛增殖。图1D显示了在暴露于BMP2 24小时后针对Oct4染色的小鼠坐骨神经。图1E显示了在暴露于BMP2 24小时后针对nanog染色的小鼠坐骨神经。图1F显示了在暴露于BMP2 24小时后针对Sox2染色的小鼠坐骨神经。注意细胞的增殖，其大部分表达Sox2。图1G显示了在暴露于BMP2 24小时后针对Klf4染色的小鼠坐骨神经。注意细胞的增殖，其大部分表达Klf4。图1H显示了在暴露于BMP2 24小时后针对白介素1(一种炎症标志物)而染色的小鼠坐骨神经。图1I显示了在暴露于BMP2 72小时后针对Oct4染色的小鼠坐骨神经。注意细胞的增殖，其大部分表达Oct4。图1J显示了在暴露于BMP2 48小时后针对Sox2染色的小鼠坐骨神经。注意细胞的增殖，其大部分表达Sox2。图1K显示了在暴露于BMP2 72小时后针对Sox2染色的小鼠坐骨神经。注意细胞的增殖，其大部分表达Sox2。图1L显示了在暴露于BMP2 72小时后针对Oct4染色的小鼠坐骨神经。注意细胞的增殖，其大部分表达Oct4。图1M显示了在暴露于BMP2 72小时后针对c-Myc染色的小鼠坐骨神经。注意细胞的增殖，其大部分表达c-Myc。图1N显示了在暴露于BMP2 24小时后针对c-Myc染色的小鼠坐骨神经。注意细胞的增殖，其大部分表达c-Myc。
[0012] 图2A-2F：图2A显示了来自未处理的(对照)小鼠的组织样本中的针对Oct4染色的正常小鼠坐骨神经。在未经刺激的神经中Oct4不表达。图2B显示了直接暴露于肌内(IM)注射的BMP2 24小时后针对Oct4染色的小鼠坐骨神经。注意旺盛的细胞增殖和显著异常的神经。增殖中的细胞的细胞核对此干细胞标志物是密集染色的。图2C显示来自未处理的(对照)小鼠的组织样本中的针对c-Myc染色的正常小鼠坐骨神经。在未经刺激的神经中c-Myc仅有最低限度的表达。图2D显示了在注射BMP2 24小时后针对c-Myc染色的小鼠坐骨神经和周围组织的组织切片。注意旺盛的细胞增殖，及在增殖细胞中针对c-Myc的致密核过氧化物酶染色。FIG 2E显示来自未经处理的(对照)小鼠的针对Klf4染色的正常小鼠坐骨神经。未经刺激的神经显示出没有Klf4的表达。图2F显示了在IM注射BMP2 48小时后获取的小鼠腱肌中的针对Klf4染色的坐骨神经斜切片。注意旺盛的细胞增殖和通过组织平面的迁移，以及针对Klf4的阳性过氧化物酶染色。图2G显示了在暴露于IM注射的BMP2 72小时后、在针对Sox2进行免疫染色后的小鼠坐骨神经的残留物。注意神经完整性和致密核过氧化物酶染色的损失。
[0013] 图3显示了使用机械压缩产生的、针对非特异性核染色剂DAPI(左侧图)、Sox2(左起第二图)和c-Myc(左起第三图)而染色的经培养的NEDAPS细胞。右侧图是DAPI、Sox2和c-Myc图像的叠加。
[0014] 图4显示了使用机械压缩产生的、针对非特异性核染色剂DAPI(左侧图)、Sox2(左起第二图)和Oct4(左起第三图)而染色的NEDAPS细胞。右侧图是DAPI、Sox2和Oct4图像的叠加。
[0015] 图5显示了使用机械压缩产生的、针对非特异性核染色剂DAPI(左侧图)、Klf4(左起第二图)和c-Myc(左起第三图)而染色的NEDAPS细胞。右侧图是DAPI、Klf4和c-Myc图像的叠加。
[0016] 图6显示了使用机械压缩产生的、针对非特异性核染色剂DAPI(左侧图)、Klf4(左起第二图)和Oct4(左起第三图)而染色的NEDAPS细胞。右侧图是DAPI、Klf4和Oct4图像的叠加。
[0017] 图7显示了使用机械压缩产生的、针对非特异性核染色剂DAPI(左侧图)、Sox2(左起第二图)和Klf4(左起第三图)而染色的NEDAPS细胞。右侧图是DAPI、Sox2和Klf4图像的叠加。
[0018] 图8显示了使用机械压缩产生的、针对DAPI(左侧图)、Oct4(左起第二图)和c-Myc(左起第三图)而染色的NEDAPS细胞。右侧图是DAPI、Oct4和c-Myc图像的叠加。
[0019] 图9显示了表明Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4在NEDAPS细胞中表达的PCR凝胶。M显示分子量标志物；Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的PCR产物分别显示在图A-D中。每个图中的泳道1-2显示了使用简单的机械压缩进行了刺激并在48小时获取的神经的两份重复制备物的PCR产物，每个图中的泳道3-4显示了暴露于直接体内施用的rhBMP2并在48小时获取的神经的两份重复制备物的PCR产物。
[0020] 图10是显示了在限制性干细胞培养基中生长的NEDAPS细胞的典型形态的平面显微照片。注意扁平化的细胞形状和对基底的贴附。这种形态与通常是圆形并且以最低限度贴附到基底上的胚胎干细胞明显不同。
[0021] 图11所示的PCR凝胶表明：在已在培养基中培养以分别诱导成骨细胞和内皮细胞的NEDAPS细胞中，成骨细胞和内皮细胞分化的标志物得到表达。M显示了分子量标志物；图A中的泳道1-4分别显示骨桥蛋白、I型胶原蛋白、骨钙素和阴性对照的PCR产物。图B中的泳道1-3分别显示Flt-1、Flk-1和阴性对照的PCR产物。
[0022] 图12显示了已在成骨性培养基中培养以诱导其分化为成骨细胞的NEDAPS细胞的融合培养物，已针对碱性磷酸酶活性(成骨细胞分化的标志物)进行了染色。注意染料的积累指示这种酶活性的存在，其是成骨细胞的特征。
[0023] 图13显示了在成骨性培养基中培养的NEDAPS细胞。左上图显示了在针对成骨细胞标志物I型胶原进行荧光免疫染色后的细胞。右上图显示了用Nomarski光学仪器成像的与左上图相同的视野。左下图显示了免疫染色和Nomarski图像的复合。右下图是空白。
[0024] 图14是已被诱导分化为内皮细胞表型的NEDAPS细胞的平面显微照片。细胞体的圆形外观和长而窄的突起是培养的内皮细胞在融合之前的典型特征，其后，圆形细胞体的阵列显示出“鹅卵石”外观。
[0025] 图15显示了已经在内胚层分化培养基中培养的NEDAPS细胞的四幅不同的显微照片。注意这些分化的细胞的形态与其所源自的NEDAPS细胞非常不同，显示出更圆的形状，与基底的贴附较不亲密，且细胞核较大。
[0026] 图16显示了已经在外胚层分化培养基中培养的NEDAPS细胞的四幅不同的显微照片。注意这些细胞在形态上与其所源自的NEDAPS细胞非常不同，显示出与发育中的神经组织一致的长细胞形状。
[0027] 图17显示了通过对切除的神经进行离体刺激而产生的NEDAPS细胞。上图从左至右显示了针对Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc免疫染色的细胞。下图显示了上图所示的荧光信号在相同细胞的明场图像上的叠加。
[0028] 图18示出了本公开的NEDAPS细胞可以分化的示例性途径。该图示是简略的并且没有显示出沿每种分化途径的所有可能的细胞类型或中间细胞类型。例如，造血干细胞可以分化为髓系祖细胞和淋巴系祖细胞，其分别产生髓细胞系(包括图18中显示的红细胞以及嗜中性粒细胞、肥大细胞等)和淋巴细胞系(包括淋巴细胞和自然杀伤细胞)。7.具体实施方式
[0029] 7.1.哺乳动物周围神经源性干细胞(NEDAPS细胞)
[0030] 本公开提供了神经源性成体多能干细胞(NEDAPS细胞)及其群。如在“NEDAPS”的语境中所使用，术语“成体”是指非胚胎来源。因此，NEDAPS细胞可以来自青少年或成年受试者，受试者可以是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、家养哺乳动物(例如猫、狗、兔、绵羊、猪、牛、山羊或马)，或灵长动物(例如猴或人类)。
[0031] 本公开的NEDAPS细胞表达Oct4(也称为Oct3/4和POU5F1)、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子。这四种转录因子的基因序列在哺乳动物物种之间是高度保守的(Fritz等，Journal of Biological Chemistry(2004)第279卷(47):48950-48958；Frankenberg等，Developmental Biology(2010)第337卷:162-170；Rodda等，Journal of Biological Chemistry(2005)第280卷(26):24731-24737；Flynn等，Molecular and Cellular Biology(1998)第18卷(10):5961-5969；Stewart等，Virology(1986)154(1):121-34；Eladari等，Biochem and Biophysical Res.Communications(1986)第104卷(1):313-9)。此外，通过诱导这些相同、同一的四种因子的表达，已将来自小鼠、人、大鼠和猕猴的体细胞成功地重编程为能够分化成三种胚层(外胚层、内胚层和中胚层)的iPS细胞。Takakashi和Yamanaka，Cell(2006)126(4)：663-76；Takahashi等，Cell(2007)131(5)：861-872；Liu等，Cell Stem Cell(2008)3：587-590；Liao等，Cell Stem Cell(2009)4(1)：11-15。本公开的NEDAPS细胞还可以表达干细胞标志物Nanog和SSEA1。优选地，这些转录因子的表达不是重组性的(例如，并不通过引入编码一种或多种这些转录因子的一种或多种表达载体来实现)。
[0032] 当在合适的分化条件下培养时，本公开的NEDAPS细胞能够分化为中胚层细胞(例如，间充质细胞，例如成骨细胞或内皮细胞)、内胚层细胞和外胚层细胞(例如，神经干细胞)。NEDAPS细胞可以分化成的细胞类型的实例显示在图18中。各种细胞类型的分化条件是本领域已知的，且分化培养基是商购可得的。示例性分化条件描述于第7.2.3节。
[0033] 在某些实施方式中，NEDAPS细胞在体内和体外均是能动的(例如，由体内细胞迁移和新分裂的细胞的体外迁移所证明)，其容易贴附到玻璃或塑料基底上，且/或仅偶尔形成集落。
[0034] 本公开的NEDAPS细胞或者其部分或完全分化的后代可以是重组的或基因工程改造的，从而例如并入来自其他物种的异源基因、来自相同物种的同源基因(例如，用来替换在NEDAPS细胞所源自的受试者中突变的基因)以表达相对于野生型蛋白质具有改善或改变的功能的经改造的蛋白质，或者并入标志物(例如，可检测标志物或核酸标签)以允许鉴定NEDAPS细胞或其后代，由此例如在植入后追踪其演变。使用本领域技术人员已知的方法，可以将核酸引入NEDAPS细胞(例如通过以下描述的方法：Wang和Gao，Discov Med.(2014)第18卷(97)：67-77，此处通过援引将其内容并入本文)，并且可以将该核酸并入或不并入NEDAPS细胞的基因组DNA中。例如，可以通过重组病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)、注射裸DNA或转染(例如，通过使用磷酸钙、脂质体或电穿孔的方法)将核酸引入NEDAPS细胞中。
[0035] 在另一方面中，本公开提供了NEDAPS细胞、NEDAPS细胞群和从其分化出的细胞和细胞群，例如，中胚层细胞(例如间充质干细胞、成骨细胞和内皮细胞)、内胚层细胞或外胚层细胞(例如神经干细胞)。在本公开的各个方面中，群的特征在于以下特征的一个、两个或全部三个：
[0036] (a)其是分离的；和/或
[0037] (b)其至少50％同质；和/或
[0038] (c)其包含至少10个细胞。
[0039] 在以上特征(b)的具体实施方式中，该群为至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或大于99％同质，例如，对于至少
80％同质的NEDAPS细胞群，群中至少80％的细胞是NEDAPS细胞。在以上特征(c)的具体实施方式中，该群包含至少50个细胞、至少100个细胞、至少200个细胞、至少500个细胞、至少1,
000个细胞或至少10,000个细胞。本公开还涉及特征(b)和(c)的前述实施方式的任意和全部排列组合，例如，群是至少75％同质的且包含至少200个细胞，或群是至少60％同质的且包含至少100个细胞，或群是至少90％同质的且包含至少50个细胞。
80％同质的NEDAPS细胞群，群中至少80％的细胞是NEDAPS细胞。在以上特征(c)的具体实施方式中，该群包含至少50个细胞、至少100个细胞、至少200个细胞、至少500个细胞、至少1,
000个细胞或至少10,000个细胞。本公开还涉及特征(b)和(c)的前述实施方式的任意和全部排列组合，例如，群是至少75％同质的且包含至少200个细胞，或群是至少60％同质的且包含至少100个细胞，或群是至少90％同质的且包含至少50个细胞。
[0040] 7.2.NEDAPS细胞和从NEDAPS细胞分化出的细胞的生产方法
[0041] 7.2.1.NEDAPS细胞增殖条件
[0042] 本公开提供了体内和离体产生NEDAPS细胞及其群的方法。NEDAPS细胞和NEDAPS细胞群可通过离体培养暴露于NEDAPS细胞增殖条件的周围神经或通过在受试者体内培养来自暴露于NEDAPS细胞增殖条件的周围神经的细胞而产生。在离体产生NEDAPS细胞的情况下，术语“周围神经(peripheral nerve)”包括本文所述的已被破坏的周围神经。适合产生NEDAPS细胞的神经包括在对具有重要功能的神经受损的患者进行神经移植的手术中常规获取的周围神经。有许多这样容易获得的、且具有最小限度(如果有的话)的功能损失的神经。周围神经可以是例如是腓肠神经、腓肠神经的分支、手指或脚趾的固有指(趾)神经、闭孔神经的薄束分支、前臂内侧皮神经的节段、前臂外侧皮神经、近端第三网络空间神经束、骨内后神经或其他周围神经。
[0043] NEDAPS细胞增殖条件可以包括使周围神经暴露于细胞因子，例如骨形态发生蛋白(BMP)家族细胞因子的成员。用于产生NEDAPS细胞的优选BMP蛋白是BMP2，例如重组人BMP2(rhBMP2)。rhBMP2由Medtronic作为 销售，并且被FDA批准用于刺激骨形成。研究表明BMP2诱导神经炎症，并且认为此神经炎症可能是BMP2诱导的骨形成过程的基础。Heggeness，The Spine Journal，(2011)11:506。暴露于BMP2后，在小鼠、大鼠和人类中观察到了类似的神经炎性反应。参见例如Carragee等，The Spine Journal，(2011)11:471-491；
Dmitriev等，The Spine Journal，(2011)11:500-505；Salisbury等，Journal of Cellular Biochemistry(2011)112:2748-2758。NEDAPS细胞可以通过将BMP2溶液(例如，含BMP2的盐水溶液)直接施用至手术暴露的周围神经或者通过肌内(IM)注射至周围神经附近的位置而在受试者体内产生。
Dmitriev等，The Spine Journal，(2011)11:500-505；Salisbury等，Journal of Cellular Biochemistry(2011)112:2748-2758。NEDAPS细胞可以通过将BMP2溶液(例如，含BMP2的盐水溶液)直接施用至手术暴露的周围神经或者通过肌内(IM)注射至周围神经附近的位置而在受试者体内产生。
[0044] 通常可以以10ng～1mg的量将BMP2直接施用至暴露的神经或者注射至周围神经附近的位置。在某些实施方式中，BMP2的量为10ng、25ng、40ng、50ng、60ng、75ng、100ng、150ng、200ng、250ng、300ng、400ng、500ng、750ng或1mg，或选自前述值中的任意一对所限定的范围，例如，10ng～250ng、40ng～75ng、50ng～300ng、60ng～150ng等等。直接施用至暴露的神经或者注射至周围神经附近位置的BMP2的量可以在体积为1μl～10ml的溶液中提供。
在某些实施方式中，该体积为0.1ml～2ml，例如，0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml、1.25ml，或选自前述值中的任意一对所限定的范围，例如，0.1ml～1ml、0.25ml～1ml或0.5ml～1.5ml等等。根据靶标周围神经的大小，BMP2的施用量或BMP2溶液的使用体积可以是变化的。
在某些实施方式中，该体积为0.1ml～2ml，例如，0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml、1.25ml，或选自前述值中的任意一对所限定的范围，例如，0.1ml～1ml、0.25ml～1ml或0.5ml～1.5ml等等。根据靶标周围神经的大小，BMP2的施用量或BMP2溶液的使用体积可以是变化的。
[0045] 作为另一种选择，可以通过使受试者暴露于诸如骨折、钝挫伤、热损伤或电击等导致BMP2局部产生的条件而在体内产生NEDAPS细胞。在某些实施方式中，NEDAPS细胞获自遭受骨折、钝挫伤、热损伤或电击的受试者。
[0046] NEDAPS细胞增殖条件还可以包括使周围神经暴露于除BMP2以外或与BMP2一起使用的神经炎性剂，例如肿瘤坏死因子α、白介素-1β、神经生长因子、组胺、白介素6或它们的组合。
[0047] 在其他实施方式中，NEDAPS细胞增殖条件包括向周围神经施加创伤(体内或离体)。创伤可以是例如，机械创伤，例如，压缩周围神经(例如1～2秒)、切割或切断周围神经、或者切碎周围神经、电刺激(例如，过度刺激)、超声冲击波或者热攻击。这样，在本公开的一个方面，NEDAPS细胞的产生可通过对周围神经组织进行物理伤害来刺激。
[0048] 通过在包含BMP2的培养基中培养神经和/或通过对神经施加机械创伤(例如，压缩和/或切碎)以使周围神经暴露于BMP2，也可以离体实现NEDAPS细胞增殖。在某些实施方式中，培养基中的BMP2浓度为5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、750ng/ml或1mg/ml，或选自前述值中的任意一对所限定的范围，例如，5ng/ml～50ng/ml、10ng/ml～
250ng/ml、40ng/ml～75ng/ml、50ng/ml～300ng/ml、60ng/ml～150ng/ml等等。
250ng/ml、40ng/ml～75ng/ml、50ng/ml～300ng/ml、60ng/ml～150ng/ml等等。
[0049] 也可以使用本文描述的NEDAPS细胞增殖条件的组合来产生NEDAPS细胞。例如，NEDAPS细胞可以通过使周围神经暴露于BMP2、压缩和切碎中的两种或三种的组合而产生。在一个实施方式中，NEDAPS细胞增殖条件包括将暴露或未暴露于BMP2的周围神经切碎。
[0050] 通过鉴定和使用适合的周围神经，可以以最小的发病率使用人类受试者和家养动物来实施本公开的产生NEDAPS细胞的方法。用于人类和兽医应用的适合的神经的实例是腓肠神经或其一个分支、手或脚中指(趾)的指(趾)固有神经、来自由于例如损伤或疾病而截肢的断肢的神经。在四肢的部分需要被截肢或废弃或者神经损伤无法被修复的主要创伤的情况下，可以获取这种神经，并用来产生NEDAPS细胞，它进而可以用于此受试者的再生程序和过程(即，在自体移植过程中)，或用于高度匹配的受试者(即，在高度匹配但同种异基因的移植过程中)。此技术在人类和兽医应用中对产生用于组织工程和其他再生疗法的个体遗传“完美匹配”的细胞而言将是特别理想的。
[0051] 7.2.2.神经获取和NEDAPS细胞培养
[0052] 在体内暴露于NEDAPS细胞增殖条件的受试者的周围神经可以在暴露于NEDAPS细胞增殖条件后立即通过例如手术切除而从受试者中获取，或者在一段时间后获取。在某些实施方式中，在暴露于NEDAPS细胞增殖条件后的至多4天、更优选至多3天获取周围神经。例如，可以例如约在暴露于NEDAPS细胞增殖条件后的约8小时(或1/3天)、约12小时(或半天)、约24小时(或一天)、约48小时(或两天)、或约72小时(或三天)获取周围神经，或者在暴露于NEDAPS细胞增殖条件后的选自由前述值中的任意一对所限定的范围的时间段后获取周围神经，例如8小时～72小时(或1/3天～三天)、8小时～12小时(或1/3天～半天)、12小时～24小时(或半天～一天)、24小时～48小时(或一天～两天)、或者48小时～72小时(或两天～三天)等等后。在获取后，可选地，可以破坏神经以便使NEDAPS细胞从神经中释出。
[0053] 在暴露于NEDAPS细胞增殖条件后，已暴露于NEDAPS细胞增殖条件的周围神经可以离体培养一段时间，并且可以可选地在培养之前或之后将其破坏。在某些实施方式中，在暴露于NEDAPS细胞增殖条件后，将已暴露于NEDAPS细胞增殖条件的周围神经离体培养至多4天、更优选至多3天，例如，约8小时(或1/3天)、约12小时(或半天)、约24小时(或一天)、约48小时(或两天)或约72小时(或三天)，或者培养选自由前述值中的任意一对所限定的范围的时间段，例如，8小时～72小时(或1/3天～三天)、8小时～12小时(或1/3天～半天)、12小时～24小时(或半天～一天)、24小时～48小时(或一天～两天)或者48小时～72小时(或两天～三天)等等。
[0054] 机械和/或酶方法可用于破坏周围神经。例如，神经可被切碎、拉坏和/或用一种或多种蛋白酶进行处理，例如胰蛋白酶、胶原蛋白酶(例如溶组织梭菌胶原蛋白酶)或基质金属蛋白酶.
[0055] 在某些实施方式中，在压缩、获取和通过切碎和/或用一种或多种蛋白酶进行处理而破坏周围神经后，在含BMP2的培养基中培养来自周围神经的细胞。在优选实施方式中，在压缩、获取和通过切碎和用一种或多种蛋白酶进行处理而破坏周围神经后，在含BMP2的培养基中培养来自周围神经的细胞。
[0056] 所获取的周围神经、来自被破坏的周围神经的细胞、和分离的NEDAPS细胞可在非分化性培养基中培养以使NEDAPS细胞保持在未分化状态。实施例3描述了用于培养处于未分化状态的NEDAPS细胞的适合的培养基。其他适合的非分化性培养基是本领域已知的，很多是商购可得的，例如，KnockoutTM DMEM(Gibco，目录号10829-018)和mTeSRTM 1培养基(Stemcell Technologies，目录号05857)。可以在不从神经中存在的其他细胞类型中分离出NEDAPS细胞的情况下从周围神经培养NEDAPS细胞。作为另一种选择，可以将单个或多个NEDAPS细胞与一种或多种其他细胞类型分离，例如，通过显微操作、流式细胞术或本领域已知的用于分选或分离细胞的其他方法，并进行培养以产生NEDAPS细胞的群或扩增群。
[0057] 在神经暴露于NEDAPS细胞增殖条件后，NEDAPS细胞群可在未分化形式标准培养基中保持，或分化为潜能较低的细胞类型，例如如第7.2.3节所描述。分化可以在暴露于增殖条件后立即进行，或者在将NEDAPS细胞保持在未分化形式后进行。
[0058] 7.2.3.干细胞分化
[0059] 通过暴露于分化条件，NEDAPS细胞群可分化为潜能较低的细胞类型，例如，在诱导干细胞分化为特定细胞类型的分化培养基中培养该群。本公开的NEDAPS细胞可分化为内胚层、中胚层和外胚层系的细胞。NEDAPS细胞可分化成的细胞类型的具体实例如图18所示。各种细胞类型的分化条件是本领域已知的，且分化培养基是商购可得的，例如用于分化ESC或iPS细胞的培养基。示例性方法和培养基在实施例4～6中描述。例如，StemXVivoTM Ectoderm试剂盒(R&D Systems，目录号#SC031)、StemXVivoTM Mesoderm试剂盒(R&D Systems，目录TM号#SC030)和StemXVivo Endoderm试剂盒(R&D Systems，目录号#SC019)可分别用于使NEDAPS细胞分化为外胚层细胞、中胚层细胞和内胚层细胞，实施例4中描述的培养基可用于使NEDAPS细胞群分化为成骨细胞或内皮细胞(即，两种间充质细胞类型)，实施例5中描述的培养基可用于使NEDAPS细胞群分化为内胚层细胞，实施例6中描述的培养基可用于使NEDAPS细胞群分化为神经干细胞(即，外胚层细胞类型)。
[0060] 7.3.用途
[0061] 本文描述的方法可用于产生NEDAPS细胞群和由其分化出的细胞类型的群，例如，产生具有以下特征的群：(a)是分离的和/或(b)是至少50％同质的和/或(c)包含至少10个细胞，及第7节所描述的其任何实施方式。所述群对于自体应用具有特殊优点，即，对于NEDAPS细胞所源自的(人类或其他动物)受试者中的移植具有特殊优点。
[0062] 可以对NEDAPS细胞和其分化后代进行离体操纵以产生用于治疗受试者的细胞。这些细胞可用于获益于细胞或器官再生的任何状况。具体应用包括器官培养、伤口愈合(例如治疗糖尿病下肢伤口)、夏科关节病、压力性溃疡、或骨折、神经再生、恢复免疫功能、造血、组织工程、基因治疗(例如，Wang和Gao，Discov Med.(2014)第18卷(98)：151-161中所描述的，此处通过援引将其内容并入本文)，以及可以使用在培养物中生长和诱导分化的干细胞的任何其他医疗场合。
[0063] 在一个实施方式中，未分化的NEDAPS细胞或由NEDAPS细胞分化成的成骨细胞可在体外生长，然后将其放入期望骨形成的部位，例如骨折部位、节段性骨缺损部位(例如，在肿瘤切除后)或需要骨向内生长成植入物的部位(例如，人工关节部件)。在另一个实施方式中，未分化的NEDAPS细胞或已经由NEDAPS细胞分化成的内皮细胞可在培养物中繁殖，然后通过手术或注射方式放置到需要血管形成的解剖学区域，例如血液供应降低的肢。在另一个实施方式中，由NEDAPS细胞分化成的成纤维细胞可在培养物中繁殖，然后将其放置到需要软组织愈合的解剖学区域，例如，用于治疗诸如糖尿病足溃疡等缓慢愈合的伤口。在另一个实施方式中，由NEDAPS细胞分化成的造血细胞可被注射到患有贫血的受试者的循环系统或骨髓中。然后所注射的造血细胞可以为受试者产生血细胞。
[0065] NEDAPS细胞和由其分化出的细胞可以是重组的，例如用于基因治疗用途。
[0066] 对于向受试者的植入，NEDAPS细胞和由其分化出的细胞的群可以配制在药学上可接受的介质或赋形剂中或者可生物相容的和/或生物可降解的支架或基质中。
[0067] 8.实施例
[0068] 8.1.实施例1：使用BMP2产生NEDAPS细胞
[0069] 材料和方法：麻醉十只小鼠(在经IACUC批准的方案下)并使用标准方法暴露右侧坐骨神经。在7只动物中，将50纳克的BMP2直接放置到神经上。在3只对照动物中，不对神经施用试剂。
[0071] 结果：未处理的神经看上去正常(参见图1A)，除了可能发现一些轻微的炎症，据认为其是由于手术暴露引起的。
[0072] 发现经BMP2处理的神经是片段化和受到破坏的(参见图1)，但注意到了在神经内的显著细胞增殖。注意到在切片过程中和切片之后，被处理的神经是自发片段化的。用BMP2处理的神经是异常且非常脆弱的。
[0073] 8.2.实施例2：使用IM注射的BMP2产生NEDAPS细胞
[0074] 材料和方法：麻醉二十只小鼠，经皮注射(IM)50ng或100ng的BMP2至每个小鼠的右侧腱肌。在24小时、48小时或72小时后处死小鼠。在不解剖至坐骨神经的情况下获取腱肌，但要小心地使所获取的组织包含此神经的通常解剖学位置。从4只动物获取对侧(未处理的)腱肌作为对照组织。
[0075] 因为BMP2是通过IM注射施用的，所以难以知道在获取组织和处理之后注射部位与任何给定的显微区域的接近程度如何。针对干细胞标志物的阵列和一组炎性标志物对切片染色。
[0076] 结果：即使在24小时的动物中，注射了BMP2的来自肢的神经也出现破坏和轻微片段化(参见图2B和2D)。截至72小时，来自经处理的动物的神经表现出了显著的异常(参见图2F)。72小时的样本显示出了严重异常的神经。异常的神经所呈现出的占优势地位的细胞普遍表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4全部四种ESC标志物。
[0077] 在24小时和48小时持续观察到神经内的稳健细胞增殖，而且大部分这些增殖中的细胞对全部四种ESC标志物都呈阳性染色(参见图2B、2D、2F和2G)。
[0078] 8.3.实施例3：NEDAPS细胞的产生、分离和培养
[0079] 体内NEDAPS细胞产生：所有动物活动都在卫奇塔州立大学的动物护理设施中进行，并且获得了卫奇塔州立大学动物护理和使用委员会的批准。8周～12周龄的雌性BALB/c小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)并在研究使用前使其对该设施适应至少1周～6周。在手术当天，为了预防性止痛，在手术前1小时，小鼠通过皮下注射接收0.05mg/kg的丁丙诺啡。通过腹腔注射90mg/kg的氯胺酮和8mg/kg的甲苯噻嗪来麻醉小鼠，并通过鼻锥补充1％～2％的异氟烷。每只动物的右腿被剃光并用聚维酮碘和乙醇对手术区域进行消毒。在大腿外侧面产生切口，并通过钝器解剖露出坐骨神经。使用具有1mm宽度的镊子沿露出的神经长度方向在四个或五个部位将神经手动压缩至其原始直径的大约25％，或将神经暴露于含60ng BMP2的10μl无菌生理盐水中( Bone Graft,Medtronic Spinal and
Biologies,Memphis,TN)。每只动物的切口被缝合闭合并护理动物8小时、24小时、48小时或
72小时，而后通过CO2吸入处死。在处死后立即获取神经用于组织学分析、细胞培养或使用聚合酶链式反应(PCR)方法筛选基因表达。
Biologies,Memphis,TN)。每只动物的切口被缝合闭合并护理动物8小时、24小时、48小时或
72小时，而后通过CO2吸入处死。在处死后立即获取神经用于组织学分析、细胞培养或使用聚合酶链式反应(PCR)方法筛选基因表达。
[0080] 还通过将BMP2经皮注射进小鼠大腿后侧的腱肌块来进行实验。如上进行相同的麻醉、止痛和安乐死。在注射后24小时、48小时和72小时处死动物。尸体解剖后立即通过尖锐剖离而获取建肌块，并在福尔马林中固定样本，在石蜡中包埋并切片。总计37只小鼠通过IM注射含60ng BMP2 的5μl无菌盐水而得到处理。
[0081] NEDAPS细胞的分离和培养：从小鼠坐骨神经分离出NEDAPS细胞，并根据修改的公开方案进行培养(Wu等，Biotechnology letters 2009；31:1703-1708)。简单来说，将坐骨神经段在PBS中切碎成1mm的片，以600×g离心5分钟形成沉淀块。然后将神经组织在37℃在含0.2％(0.27U/ml)胶原蛋白酶(Worthington Biochemical Corp)的0.5ml无菌DMEM中温育90分钟，然后加入等体积的0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液5分钟并搅拌。将300μl热灭活胎牛血清(FBS)添加到混合物中以终止酶消化。在通过100μm尺寸的滤网过滤后，将所分离的细胞以600×g离心10分钟形成沉淀。在补充有20％敲除血清替代品(KSR，Gibco)、100μΜMEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、1×GlutaMAXTM-I(目录号35050-079，Gibco)、55μΜβ-巯基乙醇(Gibco)、20ng/ml人白血病抑制因子(LIF，Gibco)、100U/ml青霉素(Invitrogen，Grand Island，NY)和100μg/ml链霉素(Invitrogen)的DMEM(Gibco，Life Technologies)中重悬浮细胞沉淀并且分配到6孔培养皿中或4孔腔室载玻片上。细胞在37℃、5％CO2的环境中培养。
[0082] NEDAPS细胞的表征：为了表征NEDAPS细胞，针对成对的ESC标志物(Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc)进行双染。简单来说，在室温下用4％多聚甲醛将在腔室载玻片中生长的细胞固定30分钟，用PBS洗3次，然后用3％正常驴血清和0.1％Triton X-100进行封闭。一抗包括山羊抗Klf4(R&D)、山羊抗Sox2(Santa Cruz Biotechnology)、山羊和兔抗Oct4(Abcom)及兔抗c-Myc(Santa Cruz Biotechnology)。使用的二抗是Alexa488偶联的驴抗山羊IgG和Alexa 594偶联的驴抗兔IgG(Life Technologies)。细胞用山羊和兔抗体一抗对(Klf-4+c-Myc、Sox2+c-Myc、Klf-4+Oct4、和Sox2+OCT4)在37℃双染60分钟。在用PBS冲洗后，在37℃在具有不同荧光波长的1:200二抗温育细胞30分钟，将盖玻片盖到带有DAPI Fluoromount G(SouthernBiotech)的切片上，其还复染了细胞核。在TCS SP5II激光共聚焦扫描显微镜(Leica Microsystems)下观察染色的细胞，用LAS图像分析光学软件获取图像。用1024×1024像素的扫描模式格式获取光学单切片，其像素大小为0.21μm。进行多通道图像的自动化顺序集合的采集以减少通道间的光谱串扰，对双染信号的单个图像进行叠加以产生共定位图像。
[0083] 使用先前详细描述的RT-PCR技术测定测试组之中Klf-4、c-Myc、Sox2和Oct4的基因表达谱(Yang等，J Bone Joint Surg Am.(2005)87(5)：1088-97.)。简单来说，细胞在STAT-60TM(Tel-Test，Friendswood，TX)溶液中在5-ml Dounce均质器中匀浆，通过氯仿分离和异丙醇沉淀分离出总RNA。在含5.5mM MgCl2、500μΜ的每种三磷酸脱氧核苷酸、0.5U/μΙRNase抑制剂、2.5μΜ随机六聚体和1.25U/μΙ逆转录酶(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)的40μl PCR缓冲液中，在Veriti 96孔热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上，以25℃10分钟、48℃25分钟和95℃5分钟从0.5g总RNA逆转录得到互补DNA(cDNA)。使含有SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)、2μl cDNA和400nM测试基因引物对的RT-PCR反应混合物在 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)中运行40个循环。动态记录荧光信号。使用Primer3程序(bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3)设计每个靶基因的引物对，并通过Sigma-Genosys(Woodlands，Texas)构建。引物序列在表1中示出。
[0084]
[0085] 表1-用于RT-PCR扩增的引物
[0086] 结果：如图3～9所示，培养的NEDAPS细胞表达Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc。观察到这些细胞通常是非常扁平的且遍布玻璃或塑料基底(参见图10)，这表明这些细胞是贴附性的。当更换培养基时，细胞不会被“冲洗掉”，也表明细胞是贴附在基底上的。将细胞传代至新的培养板上要求使其暴露于胰蛋白酶以进行脱附。
[0087] 8.4.实施例4：成骨细胞和内皮细胞的分化(中胚层细胞分化)
[0088] 细胞培养：保持NEDAPS细胞在胚胎干细胞培养基中培养5天后，对细胞进行分化实验。对于成骨细胞的诱导，在含有10m Mβ-甘油磷酸钠、50μg/ml抗坏血酸、和10nM地塞米松的DMEM/F12培养基中补充10％胎牛血清、100mg/ml链霉素和100U/ml青霉素得到成骨培养基，在其中培养NEDAPS细胞。7天后进行碱性磷酸酶染色和I型胶原蛋白染色，以鉴定成骨细胞的结构和功能特性。将定向为内皮细胞分化的NEDAPS细胞铺到包被纤维连接蛋白TM TM(Sigma-Aldrich，US)的培养瓶上，并在补充有EGM -2-MV SingleQuots 的内皮细胞基础培养基-2(Lonza Walkersville，Inc.Walkersville，MD)中培养，所述培养基含有5％FBS、
10ng/ml人表皮生长因子(hEGF)、50ng/ml人血管内皮生长因子(VEGF)、50ng/ml人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、1μg/ml氢化可的松和100U/ml青霉素(Invitrogen，US)和100μg/ml链霉素(Invitrogen，US)。
10ng/ml人表皮生长因子(hEGF)、50ng/ml人血管内皮生长因子(VEGF)、50ng/ml人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、1μg/ml氢化可的松和100U/ml青霉素(Invitrogen，US)和100μg/ml链霉素(Invitrogen，US)。
[0089] 分化的细胞的表征：如先前所述(Jiang等，J Biomed Mater Res A(2013)101：2817-2825)，使用市售的碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)对分化的成骨细胞中的碱性磷酸酶活性进行半定量性展示。简单来说，制备碱性染料混合物来在蒸馏水中溶解Fast Violet B胶囊和Naphthol AS_MX碱性磷酸盐。在柠檬酸缓冲的丙酮中固定30秒后，在26℃在碱性染料混合物中温育细胞30分钟，然后用Mayer's苏木精复染1分钟。所得的在细胞质内的不溶性弥散性红色染料沉积物指示碱性磷酸酶活性。还进行了针对I型胶原蛋白的免疫染色。
[0090] 如实施例3所述，使用RT-PCR技术测定了成骨细胞标志物骨桥蛋白、I型胶原蛋白和骨钙素及内皮细胞标志物Fit-1和Flk-1的基因表达谱。使用的引物在表2中示出。
[0091]
[0092] 表2-用于RT-PCR扩增的引物
[0093] 结果：在成骨培养基中培养的细胞表达成骨标志物骨桥蛋白、I型胶原蛋白和骨钙素(参见图11)，并且对于碱性磷酸酶和I型胶原蛋白的染色是阳性的(参见图12～13)，表明NEDAPS细胞已分化为成骨细胞。在内皮细胞培养基中培养的细胞具有内皮细胞典型的形态，其具有小而圆的细胞体和多个长延伸突起(参见图14)，并且表达内皮细胞标志物Flt-1和Flk-1(参见图11)。
[0094] 8.5.实施例5：定型内胚层(DE)的诱导
[0095] 细胞培养：使用来自Gibco(Life Technologies)的商业试剂盒将NEDAPS细胞诱导成DE系。简单来说，在37℃、5％CO2下用 Essential 8TM培养基在12孔板中培养TMNEDAPS细胞。在第1天，用预热的DE诱导培养基A替换Essential 8 培养基24小时。在第2天，完全吸出DE诱导培养基A，并用预热的DE诱导培养基B替换。在37℃温育平板24小时。在倒置显微镜下监测细胞的形态学变化。
[0096] 结果：在DE诱导培养基中培养之后，生长的细胞在形态学上与诱导之前的NEDAPS细胞有很大不同。与未分化的NEDAPS细胞相比，该细胞变得更圆(即，较少的鳞状)并显示出更大的核(参见图15)，表明从NEDAPS细胞发生了明确分化和内胚层特征的发展。
[0097] 8.6.实施例6：神经干细胞的分化(外胚层细胞分化)
[0098] 细胞培养：繁殖并诱导NEDAPS细胞分化为神经干细胞。对于细胞增殖，在NSC基础培养基(Stemcell Technologies，目录号05700)中含10％NeuroCultTM NSC增殖补充物(体积/体积)(Stemcell Technologies，目录号05701)的完全NeuroCultTM NSC增殖培养基中培养NEDAPS细胞。在培养物中还包含终浓度为20ng/ml的rhEGF。当达到30％的细胞融合时，移除培养基，并更换含10％NeuroCultTM NSC分化补充物的完全NeuroCultTM NSC分化培养基(Stemcell Technologies，目录号05703)，将培养物在37℃温育2天。在倒置显微镜下监测细胞的形态学变化。
[0099] 结果：在分化培养基中培养之后，细胞具有与分化前的NEDAPS细胞相比非常不同的形态。与通常为鳞状细胞形态的原始NEDAPS细胞相比，分化的细胞是非常不同的，具有非常细长的细胞体(参见图16)。这些细长的细胞显示了外胚层的特征性原始神经细胞的特征。
[0100] 8.7.实施例7：一步法产生NEDAPS细胞
[0101] 材料和方法：使用无菌技术手术暴露并取回小鼠坐骨神经。在从身体中解剖出来之前，沿该神经施加1秒～2秒的温和压缩。如实施例3所述，将神经组织切碎成1mm的碎片，并用胶原蛋白酶和胰蛋白酶进行消化。离心收集细胞，并将其在实施例3中所述的干细胞培养基中放置到12孔培养板或8孔腔室载玻片中。24小时后向培养基中添加BMP2，其终浓度为750ng/ml，并培养24小时，其后移除培养基并替换成实施例3中所述的干细胞培养基：补充有20％敲除血清替代品(KSR，Gibco)、100μΜ MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、1×GlutaMAXTM-I(目录号35050-079，Gibco)、55μΜβ-巯基乙醇(Gibco)、20ng/ml人白血病抑制因子(LIF，Gibco)、100U/ml青霉素(Invitrogen，Grand Island，NY)和100μg/ml链霉素(Invitrogen)的DMEM(Gibco，Life Technologies)。在所有阶段，在37℃和5％CO2气氛下培养细胞。
[0102] 细胞表征：针对Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc对细胞进行染色。
[0103] 结果：使用此方法产生的细胞表达Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc四种胚胎干细胞标志物(参见图17)。
[0104] 9.特定实施方式
[0105] 本公开由以下特定实施方式例示。
[0106] 1.一种在周围神经中诱导干细胞产生的方法，所述方法包括：
[0107] 提供受试者；
[0109] 在所述选定的一段时间后，从经刺激的周围神经获取干细胞；及
[0110] 在非分化性培养基中体外培养所述胚胎干细胞。
[0111] 2.如实施方式1所述的方法，其中，所述干细胞选自由全能(totipotent)细胞、多能细胞、专能细胞、寡能(oligopotent)细胞、单能细胞和它们的组合组成的组。
[0112] 3.如实施方式1所述的方法，其中，所述外源刺激是物理损伤、机械操纵、破坏、电刺激或暴露于细胞因子中的一种或多种。
[0113] 4.如实施方式3所述的方法，其中，所述细胞因子是骨形态发生蛋白(BMP)家族的细胞因子的成员。
[0114] 5.如实施方式4所述的方法，其中，所述细胞因子是BMP2。
[0115] 6.如实施方式5所述的方法，其进一步包括：向所述周围神经原位施用BMP2以刺激所述干细胞的增殖；
[0116] 手术切除所述周围神经，及
[0117] 在非分化性培养基中体外培养所述干细胞来培养干细胞的增殖，从而产生干细胞群。
[0118] 7.如实施方式3所述的方法，其进一步包括：
[0119] 向所述周围神经原位施加电刺激以刺激干细胞的增殖；
[0120] 手术切除所述周围神经，及
[0121] 在非分化性培养基中体外培养所述干细胞来培养干细胞的增殖，从而产生干细胞群。
[0122] 8.如实施方式1所述的方法，其进一步包括使所述干细胞体外暴露于一种或多种分化因子以使所述干细胞分化形成组织祖细胞。
[0123] 9.如实施方式8所述的方法，其进一步包括将所述组织祖细胞再植入到受试者体内。
[0124] 10.如实施方式9所述的方法，其中，受试者是实施方式1的周围神经的供体。
[0125] 11.如实施方式1所述的方法，其进一步包括：
[0126] 从所述受试者获取经刺激的周围神经；及
[0127] 在开始培养之前或之后机械破坏该神经以促进所述周围神经释出胚胎干细胞。
[0128] 12.如实施方式11所述的方法，其中，所述机械破坏包括切碎或分割所述周围神经的鞘中的一种或多种。
[0129] 13.如实施方式1所述的方法，其进一步包括：
[0130] 从所述受试者获取经刺激的周围神经；及
[0131] 在开始培养之前或之后对该神经进行酶处理以促进所述周围神经释出干细胞。
[0132] 14.如实施方式13所述的方法，其中，所述酶处理包括用蛋白酶进行处理。
[0133] 15.如实施方式14所述的方法，其中，所述蛋白酶是胶原蛋白酶或基质金属蛋白酶中的至少一种。
[0134] 16.如实施方式1所述的方法，其进一步包括：
[0135] 从所述受试者手术切除周围神经的至少一部分；
[0136] 使手术切除的周围神经暴露于外源刺激选定的一段时间；
[0137] 在所述选定一段时间后，从经刺激的周围神经获取胚胎干细胞；及
[0138] 在非分化性培养基中体外培养胚胎干细胞。
[0139] 虽然已示出和描述了多种具体的实施方式，但应理解的是，在不脱离本公开的主旨和范围的情况下可以进行多种变化。
[0140] 10.参考文献的引用
[0141] 本申请中引用的全部出版物、专利、专利申请和其他文件出于所有目的通过援引以其整体并入本文，其程度等同于单独指明将各个出版物、专利、专利申请和其他文件出于所有目的通过援引并入。在本文并入的一种或多种参考文献与本公开的教导不一致的情况下，以本说明书的教导为准。
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