一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用
阅读：1发布：2021-01-12
专利汇可以提供一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用。利用本发明提供的引物组从青虾精巢或卵巢中克隆到了Foxl2基因，通过利用FoxL2基因制备得到dsRNA，将其注入雄性或雌性青虾围心腔后，可以沉默精巢或卵巢中FoxL2基因的表达，使青虾精巢的发育延缓，但对青虾卵巢的发育影响不明显。因此，青虾FoxL2基因可促进精巢的发育，其功能与FoxL2基因在 哺乳动物 及鱼类中的作用相反。本发明为解决青虾性早熟现象，培育优良品种提供新的思路和有效手段。，下面是一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1.一种青虾FoxL2蛋白，其特征在于，由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成。
2.一种编码权利要求1所述的青虾 FoxL2蛋白的 FoxL2基因，其特征在于，由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成。
3.一种扩增权利要求2所述的 FoxL2 基因的引物，其特征在于，正向外引物 3FoxL2-F1的核苷酸序列如 SEQ ID NO.5 所示 ；正向内引物 3 FoxL2-F2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO.6所示；反向外引物 5 FoxL2-R1 的核苷酸序列如SEQ ID NO.7 所示；反向内引物 5 FoxL2-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.一种权利要求2所述的FoxL2基因制备 dsRNA 所用的引物，其特征在于，引物序列如SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4 所示。
5.一种延缓青虾精巢成熟的生物制剂，其特征在于，含有权利要求2所述的 FoxL2基因制备得到的dsRNA。
一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用
技术领域
背景技术
[0002] 青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称河虾，隶属十足目(Decapoda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，广泛分布于我国各地水域，生长快、适应性强、养殖经济效益高，是我国重要的淡水养殖虾类。据2012年《中国渔业年鉴》记载，全国养殖青虾年产量超过23万吨，年产值超过150亿元，是目前淡水养殖业中最有发展前途的品种之一。近年来,随着其自然资源的锐减和养殖规模的扩大,养殖的青虾出现了生产性能下降和种质资源退化的情况,其中虾个体小型化和“性早熟”的现象尤为突出。“性早熟”即雌、雄性个体性腺提前发育，在生产中小虾性腺过早成熟，产卵导致个体变小、池塘养殖密度过大、生长规格不齐、近亲交配等一系列问题，最终商品虾的规格降低，繁殖性能下降，严重影响了青虾的品质和产值，成为青虾养殖业发展的一大瓶颈。为实现青虾产业的可持续发展，寻找解决雌性青虾“性早熟”的解决方法变得刻不容缓。
[0003] Forkhead box protein L2(FoxL2)基因是一种广泛存在于哺乳动物以及鱼类体内的一种基因，其主要功能为促进卵巢分化以及卵巢的发育。FoxL2基因在小鼠卵巢分化的开始既有表达。在成熟的雌性小鼠体内敲除FoxL2基因后，其卵巢逐渐退化并伴有精巢的出现，但卵母细胞取始终存在于小鼠的体内。最近的研究表明，FoxL2基因抑制精巢的发育主要是通过抑制SOX9基因的表达。SOX9基因主要促进雄性特征的发育，并在小鼠中可导致性逆转。FoxL2基因的研究多见与哺乳动物和鱼类，但尚未见对甲壳动物中FoxL2基因的研究。
[0004] RAN干扰(RNA interference,RNAi)是一种快速有效的基因功能研究方法，已广泛用于动植物基因功能的研究。RNAi是指一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，mRNA发生降解从而阻碍特定基因的表达。RNAi技术目前已应用于甲壳动物促雄腺中基因的功能研究。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用，通过用FoxL2-dsRNA注入雄性或雌性青虾体内，研究该基因在dsRNA刺激下的表达变化以及对精巢或卵巢发育的影响，阐释FoxL2基因在青虾中的功能，推动FoxL2基因在甲壳类动物中的研究，为利用FoxL2-dsRNA干扰技术抗性早熟的实用化提供新思路和参考依据。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种青虾FoxL2蛋白，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0007] 本发明还提供了编码上述的青虾FoxL2蛋白的FoxL2基因，其具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0008] 本发明还提供了一种扩增上述的FoxL2基因的引物，其正向外引物3FoxL2-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；正向内引物3FoxL2-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；反向外引物5FoxL2-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；反向内引物5FoxL2-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0009] 本发明还提供了一种上述FoxL2基因制备dsRNA所用的引物，引物序列如SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4所示。
[0010] 本发明还提供了一种延缓青虾精巢成熟的生物制剂，其含有以上所述的FoxL2基因制备得到的dsRNA。
[0011] 本发明提供了一种青虾FoxL2蛋白及其编码基因与应用，利用FoxL2基因合成的dsRNA可以特异性的干涉精巢和卵巢中FoxL2基因的表达，将dsRNA通过注射的方式注入青虾围心腔内，可以有效地延缓青虾精巢成熟的时间，证明其能够显著的延缓青虾精巢的发育，但对卵巢发育的影响并不明显，因此FoxL2基因在青虾中的功能与其在哺乳动物及鱼类中相反，首次证明FoxL2基因可促进青虾精巢的发育，可用于调控雄性青虾精巢发育速度，为解决青虾性早熟提供理论基础。附图说明
[0012] 图1为外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雄性青虾精巢发育的影响图；
[0013] 其中0d，4d，7d，10d分别为注射后0，4，7，10天(N≥3)。
[0014] 图2.为在精巢中，外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雄性青虾内源FoxL2基因的表达量的影响图；
[0015] 其中0d，4d，7d，10d分别为注射后0，4，7，10天(N≥3)。对照组注射相同剂量的生理盐水。
[0016] 图3.为外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雌性青虾卵巢发育的影响图；
[0017] 其中0d，4d，7d，10d，14d分别为注射后0，4，7，10，14天(N≥3)。
[0018] 图4.为在卵巢中，外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雌性青虾内源FoxL2基因的表达量的影响图；
[0019] 其中0d，4d，7d，10d，14d分别为注射后0，4，7，10，14天(N≥3)。对照组注射相同剂量的生理盐水。
具体实施方式
[0020] 实施例1
[0021] 青虾FoxL2基因全长cDNA的获得，由以下步骤实现：
[0022] 步骤1：总RNA提取：
[0023] 选取5支成熟雄虾的精巢，迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，迅速的研磨。使用Takara公司的RNAiso Plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法提取精巢总RNA，提取方法参照使用说明书。经过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，分光光度计分析该样品OD260/280比值在1.8-2.0之间，并测定RNA的浓度。
[0024] 步骤2：青虾FoxL2基因全长cDNA序列的克隆：
[0025] 根据青虾促雄腺转录组文库中获得的FoxL2基因cDNA中间片段序列(SEQ ID NO.9)，设计特异性正向外引物3FoxL2-F1(SEQ ID NO.5)、正向内引物3FoxL2-F2(SEQ ID NO.6)；和反向外引物5FoxL2-R1(SEQ ID NO.7)、反向内引物5FoxL2-R2(SEQ ID NO.8)分别进行cDNA 3’和5’端快速扩增，操作步骤按TaKaRa 3’-RACE和TaKaRa5’-RACE试剂盒说明书进行。利用上海生工生物工程有限公司(Sangon)的柱式DNA胶回收试剂盒进行目的片段的回收，将产物连接到pMD18-T载体(Takara)，并转化入大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选(培养基为LB固体培养基含amp+,37℃培养12小时)，挑取单克隆白斑扩增培养(培养基为LB液体培养基含amp+,37℃培养6小时。)后，对挑选的克隆进行PCR验证(试剂成份见表1，PCR反应程序为：94℃预变性3min，然后进入下列循环：94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。)，将插入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。将得到的产物与青虾促雄腺转录组文库中的FoxL2中间片段(SEQ ID NO.9)进行拼接，得到青虾FoxL2基因的cDNA全长(SEQ ID NO.2)。利用NCBI开放阅读框预测软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)，得到青虾FoxL2基因编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)。
[0026] 经过序列比对显示，青虾FoxL2基因和其它鱼类FoxL2的同源性在70％以上。
[0027] 表1
[0028]
[0029] 实施例2：青虾FoxL2基因dsRNA的合成
[0030] 以青虾FoxL2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)为依据，在开放阅读框以内采用NCBI在线dsRNA引物设计软件(http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl)设计制备双链RNA的引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，根据Transcript AidTM T7High Yield Transcription kit(Fermentas,Inc.,USA)试剂盒说明进行体外转录合成dsRNA。将制备好的dsRNA溶解在DEPC水中，测定其浓度并在1.5％琼脂糖凝胶上检测其纯度。将上述dsRNA溶液以4ug/g的剂量注射到青虾的围心腔内。对照组注射相同体积的生理盐水，实验所用的雄虾为同一批孵出的虾以保证精巢处于同一发育时期，雌虾都处于卵巢发育初期(刚排完卵)。在注射后的第0、4、7、10天收集样品(N≥3)，将试验下的总重及采集的样品在分析天平上称重，并将组织样品保存在RNA保存液中(Takara)。最后提取各样品的总RNA并反转成cDNA，采用Real Time PCR检测FoxL2基因相对于对照组的表达量变化，以此来计算FoxL2基因干扰的效率。性腺指数是评价动物性腺发育状况的重要指标。根据性腺发育指数(Gonad Somatic Index，GSI)计算公式如下式所示，计算两组雄性和雌性青虾的GSI。
[0031]
[0032] 实施例3：青虾FoxL2基因在生产中的应用
[0033] 按照实施例2提供的方法合成青虾FoxL2基因dsRNA。挑选100只健康的雄虾，采用实施例2所提供的方法，将青虾FoxL2基因dsRNA注入到挑选的雄虾中，并与30只健康的雌虾同塘饲养。对照组为另外100只雄虾，并与另外的30只健康的雌虾同塘饲养。母虾的卵巢均已发育成熟。对照组饲养6天后即有母虾抱卵，但实验组知道第11天才发现抱卵母虾。对照组母虾全部抱卵仅需12天，而实验组母虾全部抱卵需19天。
[0034] 具体实验结果如下：
[0035] 图1所示，为外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雄性青虾精巢发育的影响图，依照实施例2中所提供的dsRNA合成，注射以及注射后基因表达量的检测方法，在精巢中，相对于对照组，注射后第4天，青虾FoxL2基因的表达量显著下降了63％，在第7天已经下降了92％，但在第10天，FoxL2基因的表达量教注射后第7天有所回升；然后FoxL2基因在对照组中的表达量取维持在一个比较稳定的水平，无明显变化。
[0036] 如图2所示，为在精巢中，外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雄性青虾内源FoxL2基因的表达量的影响图，依照实施例2中的性腺发育指数计算公式，为对照组的精巢GSI性腺发育指数和注射组的精巢性腺发育指数对比的示意图，可以看出FoxL2-dsRNA注射后，可延缓青虾精巢的发育。
[0037] 如图3所示，为外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雌性青虾卵巢发育的影响图，依照实施例2中所提供的dsRNA合成，注射以及注射后基因表达量的检测方法，在卵巢中，相对于对照组，注射后第4天，青虾FoxL2基因的表达量显著下降了30％，在第7天已经下降了30％，但在第10天，FoxL2基因的表达量下降了60％。
[0038] 如图4所示，为在卵巢中，外源性注射FoxL2-dsRNA后，对雌性青虾内源FoxL2基因的表达量的影响图，依照实施例2中的性腺发育指数计算公式，为对照组的卵巢GSI性腺发育指数和注射组的卵巢性腺发育指数对比的示意图，可以看出FoxL2-dsRNA注射后，青虾卵巢的发育无明显变化。
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