排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒及制备方法和应用
阅读：930发布：2020-05-13
专利汇可以提供排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒及制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 学技术领域，本发明公开了一种排除羊痘病毒检测 牛 结节性 皮肤 病病毒用 试剂 盒 及制备方法和应用。所述的试剂盒包括特异性引物和探针，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的试剂盒具有特异性强和灵敏度高的优点。，下面是排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒及制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括特异性引物和探针，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照中的一种或多种。
3.一种排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：针对牛结节性皮肤病病毒基因序列，选取G蛋白偶联趋化因子受体基因作为靶区域，从NCBI上下载37条牛结节性皮肤病病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列，5条绵羊痘病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列，2条山羊痘病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列，共44条序列，在多重序列比对的基础上，设计能排除绵羊痘和山羊痘病毒的特异性引物和探针，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒的制备方法，其特征在于，还包括步骤配制荧光PCR反应液，具体包括如下步骤：
配制5×PCR缓冲液的：称取三羟甲基氨基甲烷：3.03g，KCl：9.32g，MgCl2.6H2O：0.76g，聚乙二醇辛基苯基醚：2.5mL，加焦碳酸二乙酯处理水至400mL，调pH值至8.3，定容至500mL，过滤除菌后放在2～8℃保存备用；
配制25mmol/L MgCl2溶液：称取0.51g MgCl2.6H2O，加焦碳酸二乙酯处理水定容至
100mL，高压灭菌冷却后放在2～8℃保存备用；
配制荧光PCR反应液：取2.5mmol/L的dNTP Mixture2μL、浓度为10μmol/L的上游引物LSDVF2.5μL、浓度为10μmol/L的下游引物LSDVR2.5μL、浓度为10μmol/L的探针LSDVP0.3μL、
5×PCR缓冲液5μL、25mmol/L的MgCl2溶液2μL、焦碳酸二乙酯处理水5.7μL，混匀后用0.45μm滤膜过滤除菌，分装成小管，加贴标签。
5.根据权利要求3所述的排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒的制备方法，其特征在于，还包括步骤制备阳性对照和阴性对照；具体包括如下步骤：
制备阳性对照：克隆牛结节性皮肤病病毒G蛋白偶联趋化因子受体基因，构建pMD20-T-GPCR载体质粒，对质粒中的G蛋白偶联趋化因子受体基因进行序列测定，测序结果正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将其扩大培养，提取质粒，作为阳性对照；
制备阴性对照：量取1mL的焦碳酸二乙酯，加入到双蒸水中并定容至1L，得到体积浓度为0.1％的焦碳酸二乙酯溶液，室温搅拌处理12h，高压121℃蒸汽灭菌15min，作为阴性对照，无菌分装，加贴标签。
6.根据权利要求3所述的排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒的制备方法，其特征在于，反应条件为：在0.2mL反应管中加入荧光PCR反应液20μL和Taq DNA聚合酶
0.5μL，再加入提取的核酸5.0μL，同时设置阳性及阴性对照管，盖紧管帽，500g离心10s，放入荧光PCR检测仪内，反应条件为：第一阶段94℃/3分钟；第二阶段94℃/15秒，60℃/1分钟，共40个循环；荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。
7.一种试剂盒在检测牛血液、唾液、皮肤结节、皮肤痂皮中牛结节性皮肤病病毒的应用，其特征在于，所述的试剂盒为权利要求1-2任一项所述的试剂盒或权利要求3-6任一项所述的制备方法制得的试剂盒。
排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒及制备方法
和应用
技术领域
背景技术
[0003] 牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)，是由牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起的一种牛的接触性传染病，该病发病率在5％至45％之间，病死率最高可达10％。病原是牛结节性皮肤病病毒，属于痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科山羊痘病毒属，与绵羊痘病毒和山羊痘病毒的基因组的同源性高达96％。该病是OIE的通报性疾病(OIE 2014年版名录)，是我国《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中的一类传染病，澳大利亚(澳大利亚2013年版名录)、加拿大(加拿大2014年版名录)、美国(美国国家动物卫生通报系统疾病名录)、欧盟(欧盟动物疫情通报系统疾病名录)的通报性疾病，该病的发生可以引起产奶量暂时性下降，引起公牛暂时或永久性不育，损坏皮张，甚至因为继发细菌感染而导致动物死亡，从而对我国的经济带来非常严重的影响。本病已于2019年8月12日被发现传入我国新疆地区，这是我国首次确诊发生该病。经当地畜牧兽医部门排查，伊犁州察布查尔县、霍城县、伊宁市等地均有该病发生，这将对我国的养殖业带来非常严重的影响，同时也给我国的防控工作带来一定的压力。快速有效的防控、检测、鉴别牛结节性皮肤病病毒是当前的工作重点。
[0004] 牛结节性皮肤病病毒与绵羊痘病毒和山羊痘病毒同属于痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科山羊痘病毒属，目前我国还没有专用疫苗对LSDV进行预防，由于LSDV与山羊痘病毒、绵羊痘病毒具有相同的免疫抗原，故可以选用致弱的绵羊和山羊的毒株用作活毒苗。但这种疫苗会在接种部位引起局部反应，有时甚至较为严重，从而出现因接种山羊痘、绵羊痘疫苗而误诊的情况。为了有效排除山羊痘、绵羊痘病毒，检测牛结节性皮肤病，解决动物因接种山羊痘、绵羊痘疫苗而出现的误诊，建立一种能区分山羊痘、绵羊痘病毒、检测LSDV毒株的检测方法具有非常重要的意义。
[0005] 对于牛结节性皮肤病病毒检测，目前常用方法为病毒分离鉴定、血清学检测方法以及分子生物学检测方法。病毒分离鉴定周期长且需要在一定级别生物安全实验室进行，病毒中和试验是特异性最高的血清学检测方法，但由于动物机体对LSD病毒感染主要表现为细胞免疫应答，仅产生低水平的中和抗体，因此该方法敏感性欠佳。
[0006] 由于LSDV与绵羊痘病毒和山羊痘病毒的基因组的同源性高达96％，这对鉴别检测带来很大困难，解决动物因接种羊痘疫苗而出现的误诊、快速对LSDV进行检测成为了目前研究工作中需要重点攻克的难题。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒及制备方法和应用。本发明的试剂盒具有特异性强、敏感性高等优点。
[0008] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
[0009] 第一方面，本发明提供了一种排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒，所述的试剂盒包括特异性引物和探针，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010] 进一步的，试剂盒还包括荧光PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照中的一种或多种。
[0011] 第二方面，本发明提供了一种排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒的制备方法，包括如下步骤：针对牛结节性皮肤病病毒基因序列，选取G蛋白偶联趋化因子受体基因作为靶区域，从NCBI上下载37条牛结节性皮肤病病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列，5条绵羊痘病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列，2条山羊痘病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列，共44条序列，在多重序列比对的基础上，设计能排除绵羊痘和山羊痘病毒的特异性引物和探针，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012] 进一步的，还包括步骤配制荧光PCR反应液，具体包括如下步骤：
[0013] 配制5×PCR缓冲液的：称取三羟甲基氨基甲烷：3.03g，KCl：9.32g，MgCl2.6H2O：0.76g，聚乙二醇辛基苯基醚：2.5mL，加焦碳酸二乙酯处理水至400mL，调pH值至8.3，定容至
500mL，过滤除菌后放在2～8℃保存备用；
500mL，过滤除菌后放在2～8℃保存备用；
[0014] 配制25mmol/L MgCl2溶液：称取0.51g MgCl2.6H2O，加焦碳酸二乙酯处理水定容至100mL，高压灭菌冷却后放在2～8℃保存备用；
[0015] 配制荧光PCR反应液：取2.5mmol/L的dNTP Mixture2μL、浓度为10μmol/L的上游引物LSDVF2.5μL、浓度为10μmol/L的下游引物LSDVR2.5μL、浓度为10μmol/L的探针LSDVP0.3μL、5×PCR缓冲液5μL、25mmol/L的MgCl2溶液2μL、焦碳酸二乙酯处理水5.7μL，混匀后用0.45μm滤膜过滤除菌，分装成小管，加贴标签。
[0016] 进一步的，还包括步骤制备阳性对照和阴性对照；具体包括如下步骤：
[0017] 制备阳性对照：克隆牛结节性皮肤病病毒G蛋白偶联趋化因子受体基因，构建pMD20-T-GPCR载体质粒，对质粒中的G蛋白偶联趋化因子受体基因进行序列测定，测序结果正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将其扩大培养，提取质粒，作为阳性对照；
[0018] 制备阴性对照：量取1mL的焦碳酸二乙酯，加入到双蒸水中并定容至1L，得到体积浓度为0.1％的焦碳酸二乙酯溶液，室温搅拌处理12h，高压121℃蒸汽灭菌15min，作为阴性对照，无菌分装，加贴标签。
[0019] 进一步的，反应条件为：在0.2mL反应管中加入荧光PCR反应液20μL和Taq DNA聚合酶0.5μL，再加入提取的核酸5.0μL，同时设置阳性及阴性对照管，盖紧管帽，500g离心10s，放入荧光PCR检测仪内，反应条件为：第一阶段94℃/3分钟；第二阶段94℃/15秒，60℃/1分钟，共40个循环；荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。
[0020] 第三方面，本发明提供了一种试剂盒在检测牛血液、唾液、皮肤结节、皮肤痂皮中牛结节性皮肤病病毒的应用，所述的试剂盒为上述的试剂盒或上述的制备方法制得的试剂盒。
[0021] 本发明排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒及制备方法和应用具有如下有益效果：
[0022] 本申请的试剂盒特异性强，灵敏度高，在特异性方面，与山羊痘病毒、口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、绵羊痘病毒均无阳性交叉反应；在灵敏度方面，对104～100copies/μL的牛结节性皮肤病病毒质粒DNA模板进行荧光PCR检测，结果显示检测极限达到101copies/μL。
[0023] 本发明的试剂盒根据荧光PCR仪判定结果，减少主观性，方法准确可靠。
[0024] 本发明选择牛结节性皮肤病病毒GPCR基因作为检测靶基因，设计特异性引物、探针建立LSDV特异性的荧光PCR检测方法。克服了由于LSDV与羊痘病毒同源性高而无法区分的难题。
[0025] 适用范围广，本发明的试剂盒可以用于牛的唾液、血液、皮肤结节、皮肤痂皮中牛结节性皮肤病病毒的检测。
[0027] 图1为本发明一实施例中设计的引物探针序列比对情况；
[0028] 图2为本发明一实施例中牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒灵敏度试验结果图；
[0029] 图3为本发明一实施例中牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒特异性试验结果图。
具体实施方式
[0030] 下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。
[0031] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
[0032] 一种排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒，所述的试剂盒包括特异性引物和探针，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0033] 在本发明的一些实施例中，试剂盒还包括荧光PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照中的一种或多种。
[0034] 一种排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒的制备方法，包括如下步骤：针对牛结节性皮肤病病毒基因序列，选取G蛋白偶联趋化因子受体基因作为靶区域，从NCBI上下载37条牛结节性皮肤病病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列，5条绵羊痘病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列，2条山羊痘病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列，共44条序列，在多重序列比对的基础上，设计能排除绵羊痘和山羊痘病毒的特异性引物和探针，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0035] 在本发明的另一些实施例中，还包括步骤配制荧光PCR反应液，具体包括如下步骤：
[0036] 配制5×PCR缓冲液的：称取三羟甲基氨基甲烷：3.03g，KCl：9.32g，MgCl2.6H2O：0.76g，聚乙二醇辛基苯基醚：2.5mL，加焦碳酸二乙酯处理水至400mL，调pH值至8.3，定容至
500mL，过滤除菌后放在2～8℃保存备用；
500mL，过滤除菌后放在2～8℃保存备用；
[0037] 配制25mmol/L MgCl2溶液：称取0.51g MgCl2.6H2O，加焦碳酸二乙酯处理水定容至100mL，高压灭菌冷却后放在2～8℃保存备用；
[0038] 配制荧光PCR反应液：取2.5mmol/L的dNTP Mixture2μL、浓度为10μmol/L的上游引物LSDVF2.5μL、浓度为10μmol/L的下游引物LSDVR2.5μL、浓度为10μmol/L的探针LSDVP0.3μL、5×PCR缓冲液5μL、25mmol/L的MgCl2溶液2μL、焦碳酸二乙酯处理水5.7μL，混匀后用0.45μm滤膜过滤除菌，分装成小管，加贴标签。
[0039] 在本发明的另一些实施例中，还包括步骤制备阳性对照和阴性对照；具体包括如下步骤：
[0040] 制备阳性对照：克隆牛结节性皮肤病病毒G蛋白偶联趋化因子受体基因，构建pMD20-T-GPCR载体质粒，对质粒中的G蛋白偶联趋化因子受体基因进行序列测定，测序结果正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将其扩大培养，提取质粒，作为阳性对照；
[0041] 制备阴性对照：量取1mL的焦碳酸二乙酯，加入到双蒸水中并定容至1L，得到体积浓度为0.1％的焦碳酸二乙酯溶液，室温搅拌处理12h，高压121℃蒸汽灭菌15min，作为阴性对照，无菌分装，加贴标签。
[0042] 在本发明的另一些实施例中，反应条件为：在0.2mL反应管中加入荧光PCR反应液20μL和Taq DNA聚合酶0.5μL，再加入提取的核酸5.0μL，同时设置阳性及阴性对照管，盖紧管帽，500g离心10s，放入荧光PCR检测仪内，反应条件为：第一阶段94℃/3分钟；第二阶段94℃/15秒，60℃/1分钟，共40个循环；荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。
[0043] 一种试剂盒在检测牛血液、唾液、皮肤结节、皮肤痂皮中牛结节性皮肤病病毒的应用，所述的试剂盒为上述的试剂盒或上述的制备方法制得的试剂盒。
[0044] 一种基于荧光PCR方法排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒，包含荧光PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照。试剂盒的制备方法，具体包括：
[0045] 1.引物、探针设计：
[0046] 1.1引物、探针设计原则
[0047] 为确保引物、探针的保守性和特异性，选取GPCR基因作为靶区域，秉着下游引物中羊痘病毒GPCR基因序列与牛结节性皮肤病病毒3’端最后两个碱基不匹配；探针中有多个碱基不匹配时，上游引物序列一致；探针中有两个碱基不匹配时，上游引物序列3’端最后一个碱基不匹配的原则，确保引物和探针不能同时与羊痘病毒目标序列配对发生扩增，以此消除对羊痘病毒核酸的非特异性扩增。
[0048] 1.2引物探针设计
[0049] 从NCBI上下载37条牛结节性皮肤病病毒毒株GPCR基因序列，5条绵羊痘病毒(SPPV)毒株GPCR基因序列，2条山羊痘病毒(GTPV)毒株GPCR基因序列，共44条序列，利用Prime 5.0引物设计软件进行引物探针设计，在进行初步的筛选后，进行人工设计，在多重序列比对的基础上，设计能排除绵羊痘和山羊痘病毒的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和探针SEQ ID NO.3。
[0050] 1.3引物探针设计特色
[0051] 引物长度为20个碱基左右，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于2℃。探针的长度在20～30个碱基左右，由于模板序列GC含量较低，为了使探针的Tm值高于引物5℃以上，将探针的部分碱基进行了锁核酸设计。
[0052] 从Gene Bank下载134条牛结节性皮肤病病毒GPCR基因序列，54条绵羊痘病毒(SPPV)毒株GPCR基因序列，38条山羊痘病毒(GTPV)毒株GPCR基因序列，共226条序列，将设计的引物探针序列与之比对，发现在可以排除山羊痘病毒绵羊痘病毒的基础上未发现漏检情况。
[0053] 2、荧光PCR反应液配制
[0054] 5×PCR缓冲液的配制称取三羟甲基氨基甲烷(Tris base)：3.03g，KCl：9.32g，MgCl2.6H2O：0.76g，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)：2.5mL，加焦碳酸二乙酯处理水(DEPC处理水)至400mL，调pH值至8.3(25℃)，定容至500mL。过滤(0.45μm)除菌后放在2～8℃保存备用。
[0055] 25mmol/L Mgcl2溶液的配制称取Mgcl2.6H2O：0.51g，加DEPC处理水定容至100mL。高压灭菌冷却后放在2～8℃保存备用。
[0056] 荧光PCR反应液配制取2.5mmol/L腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶脱氧核苷酸混合物(dNTP Mixture)2μL、上游引物LSDVF(10μmol/L)2.5μL、下游引物LSDVR(10μmol/L)2.5μL、探针LSDVP(10μmol/L)0.3μL、5×PCR缓冲液5μL、25mmol/L MgCl2 2μL、焦碳酸二乙酯处理水(DEPC)处理水5.7μL，混匀后(全程无菌低温)用0.45μm滤膜过滤除菌，分装成小管，加贴标签。
[0057] 3、制备阳性对照：以常规方法克隆牛结节性皮肤病病毒GPCR基因，构建pMD20-T-GPCR载体质粒，对质粒中的GPCR基因进行序列测定。测序结果正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将其扩大培养，提取质粒，作为阳性对照。
[0058] 4、阴性对照的制备：量取1mL的焦碳酸二乙酯，加入到双蒸水中并定容至1L，使其终浓度为0.1％，室温搅拌处理12h，高压121℃蒸汽灭菌15min，作为阴性对照，无菌分装，加贴标签。
[0059] 5、Taq DNA聚合酶的制备：Taq DNA聚合酶为外购商品(Promega公司)，浓度为5U/μL，100μL/管。将Taq DNA聚合酶无菌定量分装，加贴标签。
[0060] 6、经过优化的反应条件为：在0.2mL反应管中加入荧光PCR反应液20μL和Taq DNA聚合酶0.5μL，再加入提取的核酸5.0μL，同时设置阳性及阴性对照管。盖紧管帽，瞬时离心，放入荧光PCR检测仪内。反应条件为：94℃/3分钟；94℃/15秒，60℃/1分钟共40个循环。荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。
[0061] 7、试剂盒验证方法：(1)用DEPC处理水将pMD20-T-GPCR重组质粒(DNA含量为105copies/μL)作1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀释，作为灵敏度质控样品。按照
6中方法对灵敏度质控样品(拷贝数依次为104、103、102、101、100copies/μL)进行检测，验证本试剂盒的灵敏度应达到101copies/μL。(2)检测山羊痘病毒核酸、口蹄疫病毒核酸、牛传染性鼻气管炎病毒核酸、绵羊痘病毒核酸，验证本试剂盒的特异性，应无阳性交叉反应。
6中方法对灵敏度质控样品(拷贝数依次为104、103、102、101、100copies/μL)进行检测，验证本试剂盒的灵敏度应达到101copies/μL。(2)检测山羊痘病毒核酸、口蹄疫病毒核酸、牛传染性鼻气管炎病毒核酸、绵羊痘病毒核酸，验证本试剂盒的特异性，应无阳性交叉反应。
[0062] 实施实例1
[0063] 1.引物、探针设计及牛结节性皮肤病病毒pMD20-T-GPCR基因重组质粒的构建[0064] 引物、探针设计
[0065] 1.1引物、探针设计原则
[0066] 为确保引物、探针的保守性和特异性，选取GPCR基因作为靶区域，秉着下游引物中羊痘病毒GPCR基因序列与牛结节性皮肤病病毒3’端最后两个碱基不匹配；探针中有多个碱基不匹配时，上游引物序列一致；探针中有两个碱基不匹配时，上游引物序列3’端最后一个碱基不匹配的原则，详见图1，确保引物和探针不能同时与羊痘病毒目标序列配对发生扩增，消除对羊痘病毒核酸的非特异性扩增。
[0067] 本领域大多数的引物设计都是软件直接合成，选取最优引物序列，本申请实施例中涉及到的引物序列是在软件和人工设计的结果；实施例中涉及到的引物探针序列可以保证不漏检，可以覆盖GeneBank中所登录的全部序列，并且可以区分羊痘病毒。这一点是现有技术中引物探针序列所不能达到的。
[0068] 1.2引物探针设计
[0069] 从NCBI上下载37条牛结节性皮肤病病毒毒株GPCR基因序列，5条绵羊痘病毒(SPPV)毒株GPCR基因序列，2条山羊痘病毒(GTPV)毒株GPCR基因序列，共44条序列，见表1，利用Prime 5.0引物设计软件进行引物探针设计，在进行初步的筛选后，进行人工设计，在多重序列比对的基础上，设计能排除绵羊痘和山羊痘病毒的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和探针SEQ ID NO.3。
[0070] 表1用于引物、探针设计的部分牛结节性皮肤病病毒参比毒株
[0071]
[0072]
[0073] 1.3引物探针设计特色
[0074] 引物长度为20个碱基左右，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于2℃。探针的长度在20～30个碱基左右，由于模板序列GC含量较低，为了使探针的Tm值高于引物5℃以上，将探针的部分碱基进行了锁核酸。用于筛选比较的其它引物、探针的名称、序列来源见表2。
[0075] 表2用于筛选比较的引物、探针的名称及序列
[0076]
[0077]
[0078] 从GeneBank下载134条牛结节性皮肤病病毒GPCR基因序列，54条绵羊痘病毒(SPPV)毒株GPCR基因序列，38条山羊痘病毒(GTPV)毒株GPCR基因序列，共226条序列，将设计的引物探针序列与之比对，发现在可以排除山羊痘病毒绵羊痘病毒的基础上未发现漏检情况，因此，可以通过引物探针碱基的差异来区分羊痘病毒和LSDV，故最终确定引物探针的核苷酸序列如下：
[0079] 上游引物LSDVF：TGTTACAACGCCTTCAACTTATG；SEQ ID NO.1；
[0080] 下游引物LSDVR：CCAAATAATCCAAGAAAGAATATAGTCG；SEQ ID NO.2；
[0081] 探针LSDVP：ACGA TATC TAATT ATA CAACCGCA；SEQ ID NO.3；
[0082] pMD20-T-GRCP重组质粒的构建：根据已发表的牛结节性皮肤病病毒(GeneBank:MK302071.1)GPCR基因序列，委托华大基因合成，克隆到pMD20-T载体，形成pMD20-T-GPCR质粒。按常规方法转化Top10细菌感受态细胞(购买的产品)，用氨苄抗性的琼脂平板筛选克隆菌，用PCR鉴定。PCR反应体系：25μL的反应体系中，含有2.5μL 10×PCR缓冲液，2μL2.5mmol/L的dNTP Mixture，10μmol/L的上游引物GPCR-F(AGTTAGTAGCGCAACCATGTATAATAG)、GPCR-R(TGCTACGCAATCGTAAAAGC)各0.5μL，5U/μL Taq酶0.5μL，菌液1μL。PCR反应程序：95℃/8分钟；94℃/15秒，55℃/30秒，72℃/1分钟，35个循环；最后72℃延伸10分钟。将PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒，送测序公司进行测序，测序结果与参考模板的序列比对一致。
[0083] 牛结节性皮肤病病毒荧光PCR反应体系的建立
[0084] 在多重序列比对的基础上，设计能排除绵羊痘和山羊痘病毒的引物和探针，初步建立牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测方法，并应用Taguchi方法进行优化，找出引物、探针、Mg2+浓度的最佳范围，根据最佳范围进行相应的调整，最终获得引物、探针、Mg2+的具体浓度，从而确定该检测方法的最适条件：
[0085] 反应体系共25μL，包括荧光PCR反应液、Taq DNA聚合酶、模板三部分。其中，一个检测的反应液由2μL的dNTP Mixture(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶脱氧核苷酸混合物)(2.5mmol/L)、2.5μL的引物LSDVF(10μmol/L)、2.5μL的引物LSDVR(10μmol/L)、0.3μL的探针LSDVP(10μmol/L)、5μL的5×PCR缓冲液、2μL的MgCl2(25mmol/L)及5.7μL的焦碳酸二乙酯处理水组成；一个检测的Taq酶由0.5μL的Taq DNA聚合酶(5U/μL)组成；最终确定牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测方法的扩增条件是94℃/3分钟；94℃/15秒，60℃/1分钟共40个循环，每个循环60℃结束时收集荧光。当无Ct值，且无特征性扩增曲线，判定样品为阴性；当Ct值≤32.0，且出现典型的扩增曲线，判定样品为阳性。当Ct值大于32.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
[0086] 牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒的组装
[0087] 将荧光PCR反应液、TaqDNA聚合酶、阴性对照、阳性对照按照表3要求数量，用外包装盒包装，加贴签(包含标识名称、批号、生产日期、保存期和生产单位信息等)。
[0088] 表3牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒组成清单
[0089]
[0090] 牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒敏感性试验
[0091] 用DEPC处理水将pMD20-T-GPCR重组质粒(DNA含量为105copies/μL)作1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000稀释，作为灵敏度质控样品。经检测和判定1:10、1:100、1:
1000质控样品的检测结果均为阳性，1:10000为阳性，1:100000为阴性，表明试剂盒的检测极限可以达到1:10000，即101copies/μL，见图2；检测32份经临床确诊为牛结节性皮肤病病毒阳性的样品，样品类型包括牛唾液、血液、皮肤结节、皮肤痂皮，结果试剂盒检出32份阳性样品，检出率为100％。
1000质控样品的检测结果均为阳性，1:10000为阳性，1:100000为阴性，表明试剂盒的检测极限可以达到1:10000，即101copies/μL，见图2；检测32份经临床确诊为牛结节性皮肤病病毒阳性的样品，样品类型包括牛唾液、血液、皮肤结节、皮肤痂皮，结果试剂盒检出32份阳性样品，检出率为100％。
[0092] 牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒特异性试验
[0093] 采用牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒，检测山羊痘病毒、口蹄疫病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、绵羊痘病毒、正常牛血液的核酸，均无阳性交叉反应，见图3。检测60份经临床诊断并鉴定为牛结节性皮肤病病毒阴性的样品，包括牛唾液、血液，结果全部为阴性，特异性为100％。
[0094] 牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒临床样品试验
[0095] 采用牛结节性皮肤病病毒荧光PCR检测试剂盒，对126份已知背景的样品核酸进行检测。结果显示建立的方法可检出其中所有的牛结节性皮肤病病毒阳性样品，而且未出现假阳性结果，详细的样品背景信息以及检测结果见表4。表明建立的方法可靠实用。
[0096] 表4临床样品背景信息及检测结果
[0097]
[0098] 应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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