专利汇可以提供一种氯丙嗪衍生物及其制备方法与氯丙嗪检测试剂专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用于人体 生物 样本中氯丙嗪含量检测的氯丙嗪衍生物及其制备方法。利用本发明的新型氯丙嗪衍生物研制的系列抗氯丙嗪特异性 抗体 可以用于制备多种灵敏度高、特异性强、检测效果好的氯丙嗪免疫学检验 试剂 。本发明还提供了3种氯丙嗪免疫检验试剂的制备方法及相应的使用方法。本发明提供的3种氯丙嗪免疫检测方法操作方便、检测快速、结果准确、灵敏度高、特异性强,能够对人体 血液样本 中的氯丙嗪含量进行定量检测。克服了 现有技术 中氯丙嗪检测方法存在的操作复杂、自动化程度低等 缺陷 ,能有效指导临床个体化合理用药。,下面是一种氯丙嗪衍生物及其制备方法与氯丙嗪检测试剂专利的具体信息内容。
1.一种氯丙嗪衍生物,其特征在于,其结构式如式Ⅰ所示:
式Ⅰ。
2.一种如权利要求1所述的氯丙嗪衍生物的合成方法,其特征在于,所述合成方法的具体路线如下所示:
。
3.一种氯丙嗪均相酶免疫检测试剂,其特征在于,由R1试剂与R2试剂组成,所述R1试剂包含抗氯丙嗪特异性抗体1与R1缓冲液,所述R2试剂包含氯丙嗪葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与R2缓冲液;所述抗氯丙嗪特异性抗体1为氯丙嗪鸡卵清白蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯丙嗪鸡卵清白蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯丙嗪衍生物与鸡卵清白蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅱ所示:
式Ⅱ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述的R1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及Tris缓冲液,所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸,所述的辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型;
所述的氯丙嗪葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由权利要求1所述的氯丙嗪衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成;其结构式如式Ⅲ所示:
式Ⅲ;
所述的R2缓冲液为含有牛血清白蛋白的Tris缓冲液。
4.一种如权利要求3所述的氯丙嗪均相酶免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包含以下步骤:
(1)将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/L葡萄糖-6-磷酸及50mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型依次加入50mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液,再将抗氯丙嗪特异性抗体1以1∶500-1∶5000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀,再用6 mol/L的盐酸调节pH至
8.0,制成R1试剂;
(2)将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液,再将氯丙嗪葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000-1∶8000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀,再用6 mol/L的盐酸调节pH至7.6,制成R2试剂;
所述抗氯丙嗪特异性抗体1的制备方法,包含以下步骤:
1)使用磷酸盐缓冲液将氯丙嗪鸡卵清白蛋白免疫原稀释至终浓度为0.5-5.0mg/mL;
2)使用弗氏佐剂法对实验动物进行免疫注射,注射3-8次后抽取动物血液,分离纯化抗血清,得到抗氯丙嗪特异性抗体1;
所述的氯丙嗪鸡卵清白蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
①将100-300mg的鸡卵清白蛋白溶解于10-100ml浓度为0.2 mol/L,pH为8.5的磷酸盐缓冲液中制成载体蛋白溶液;
②用1.0-5.0ml的有机溶剂A溶解50-500mg的权利要求1所述的氯丙嗪衍生物,通过偶联活化剂进行活化并与步骤①中制备的载体蛋白溶液进行偶联反应,反应结束后经透析纯化得到具有免疫原性的氯丙嗪鸡卵清白蛋白免疫原;
所述的有机溶剂A为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、异丙醇、甲醇或乙醇中的任意一种;
所述的氯丙嗪葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:
<1>称取葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,在室温条件下溶解于pH为8.0的磷酸缓冲液中,使其终浓度为2-6 mg/mL,制成酶溶液;
<2>使用上述的有机溶剂A溶解权利要求1所述的氯丙嗪衍生物,使其终浓度为10-
50mg/mL,通过偶联活化剂进行活化,并与步骤<1>中制备的酶溶液进行偶联反应,反应结束后经透析纯化得到氯丙嗪葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物;
所述的偶联活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N,N′-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、三丁胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二卤化二硝基苯中的任意一种。
5.一种如权利要求3所述的氯丙嗪均相酶免疫检测试剂的使用方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
(一)在全自动生化分析仪中加入校准品、R1试剂,混匀,37℃温育3-5分钟;加入R2试剂,混匀,37℃恒温5-10分钟后,340nm主波长/405nm次波长进行检测,连续监测3分钟内的吸光度变化率,由全自动生化分析仪制作校准曲线;
(二)在全自动生化分析仪中加入待测样本、R1试剂,混匀,37℃温育3-5分钟;加入R2试剂,混匀,37℃恒温5-10分钟后,340nm主波长/405nm次波长进行检测,连续监测3分钟内的吸光度变化率,由全自动生化分析仪根据步骤(一)中制作的校准曲线自动计算待测样本中氯丙嗪的含量;
所述试剂R1与试剂R2按1:1~4:1的体积比使用;所述的待测样本为血清、血浆、尿液、唾液、组织液或脑脊液中的任意一种。
6.一种氯丙嗪ELISA检测试剂,其特征在于,该检测试剂含有:抗氯丙嗪特异性抗体2、氯丙嗪辣根过氧化物酶标记偶联物及反应底物;
所述抗氯丙嗪特异性抗体2为氯丙嗪牛血清白蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯丙嗪牛血清白蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯丙嗪衍生物与牛血清白蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅳ所示:
式Ⅳ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述的氯丙嗪辣根过氧化物酶标记偶联物由权利要求1所述的氯丙嗪衍生物与辣根过氧化物酶偶联而成;其结构式如式Ⅴ所示:
式Ⅴ;
所述的反应底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺;
所述抗氯丙嗪特异性抗体2的制备方法,包含以下步骤:
A.使用磷酸盐缓冲液将氯丙嗪牛血清白蛋白免疫原稀释至终浓度为0.5-5.0mg/mL;
B.使用弗氏佐剂法对实验动物进行免疫注射,注射3-8次后抽取动物血液,分离纯化抗血清,得到抗氯丙嗪特异性抗体2;
所述的氯丙嗪牛血清白蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.将100-300mg的牛血清白蛋白溶解于10-100ml浓度为0.2 mol/L,pH为8.5的磷酸盐缓冲液中制成载体蛋白溶液;
b.用1.0-5.0ml的有机溶剂A溶解50-500mg的权利要求1所述的氯丙嗪衍生物,通过偶联活化剂进行活化并与步骤a中制备的载体蛋白溶液进行偶联反应,反应结束后经透析纯化得到具有免疫原性的氯丙嗪牛血清白蛋白免疫原;
所述的有机溶剂A为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、异丙醇、甲醇或乙醇中的任意一种;
所述的氯丙嗪辣根过氧化物酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:
(a)称取辣根过氧化物酶,在室温条件下溶解于pH为8.0的磷酸缓冲液中,使其终浓度为2-6 mg/mL,制成酶溶液;
(b)使用上述的有机溶剂A溶解权利要求1所述的氯丙嗪衍生物,使其终浓度为10-
50mg/mL,通过偶联活化剂进行活化,并与步骤(a)中制备的酶溶液进行偶联反应,反应结束后经透析纯化得到氯丙嗪辣根过氧化物酶标记偶联物;
所述的偶联活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N,N′-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、三丁胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二卤化二硝基苯中的任意一种。
7.一种如权利要求6所述的氯丙嗪ELISA检测试剂的使用方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
(ⅰ)将抗氯丙嗪特异性抗体2用磷酸盐缓冲液按1∶1000-1∶20000的比例进行稀释,制成抗体溶液,将抗体溶液按 100μL/孔的用量包被在96孔酶联板上,4℃过夜;
(ⅱ)用磷酸盐缓冲液洗涤3次后,加入200μL/孔的0.5%的牛血清白蛋白溶液,4℃封闭过夜,磷酸盐缓冲液洗涤3次;
(ⅲ)加入20μL/孔的校准品及待测样本;
(ⅳ)加入100μL/孔工作浓度的氯丙嗪辣根过氧化物酶标记偶联物;
(ⅴ)室温下孵育30分钟,磷酸盐缓冲液洗板5次;
(ⅵ)每孔加入100μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺,室温孵育30分钟;
(ⅶ)每孔加入100μL 的浓度为2mol/L的硫酸,终止反应;
(ⅷ)使用酶标仪测定450nm波长的吸光值;
(ⅸ)根据不同浓度校准品的吸光值制作校准曲线,并根据校准曲线与待测样本的吸光值计算待测样本中氯丙嗪的含量;
所述的待测样本为血清、血浆、尿液、唾液、组织液或脑脊液中的任意一种。
8.一种氯丙嗪胶乳增强免疫比浊检测试剂,其特征在于,包括:L1试剂与L2试剂;
所述的L1试剂由抗氯丙嗪特异性抗体3、pH=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、促凝剂以及防腐剂组成;
所述的L2试剂由氯丙嗪-人血清白蛋白复合体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒、pH=8.0的缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸以及防腐剂组成;
所述的抗氯丙嗪特异性抗体3为氯丙嗪血蓝蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯丙嗪血蓝蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯丙嗪衍生物与血蓝蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅵ所示:
式Ⅵ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述的氯丙嗪-人血清白蛋白复合体由权利要求1所述的氯丙嗪衍生物与人血清白蛋白偶联而成,其结构式如式Ⅶ所示:
式Ⅶ;
所述的聚苯乙烯胶乳颗粒直径范围为50-250nm;
所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或巴比妥缓冲液中的任意一种;
所述促凝剂为PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000或硫酸葡聚糖钠中的任意一种;
所述防腐剂为叠氮钠、硫柳汞、苯酚或乙基汞硫代硫酸钠中的任意一种。
9.一种如权利要求8所述的氯丙嗪胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包含以下步骤:
将0.5mg/mL的抗氯丙嗪特异性抗体3溶解于50mmol/L pH=8.0的磷酸盐缓冲液中,然后添加质量分数为0.5%-2.5%的牛血清白蛋白、0.25%-1.0%的氯化钠、0.1%-0.5%的吐温-20、
1.0%-5.0%的丙三醇、0.1%-1.0%的乙二胺四乙酸、0.5%-2.5%的PEG-4000以及0.01%-0.1%的叠氮钠,搅拌均匀,调节pH=7.5,制成L1试剂;
将0.5mg表面带有羧基的直径为150nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入4.5mL 0.05mol/L pH=
6.2的MES缓冲液中,然后加入5mg 碳二亚胺,在37℃下反应1小时,制成胶乳颗粒溶液,再将
0.5mg氯丙嗪-人血清白蛋白复合体用4.5mL 0.05mol/L pH=9.2的硼酸盐缓冲液稀释后,立即加入到上述胶乳颗粒溶液中,在37℃下反应12小时,然后加入1mL 0.1 mol/L pH=8.5的甘氨酸缓冲液搅拌2小时,反应终止后离心去除上清液,再将沉淀物用10mL 50mmol/L pH=
8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤3次,再用25mL 50mmol/L pH=8.5的甘氨酸缓冲液稀释成胶乳悬浊液,最后加入质量分数为0.5%-2.5%的牛血清白蛋白、0.25%-1.0%的氯化钠、0.1%-0.5%的吐温-20、1.0%-5.0%的丙三醇、0.1%-1.0%的乙二胺四乙酸以及0.01%-0.1%的叠氮钠,搅拌均匀,制成L2试剂;
所述抗氯丙嗪特异性抗体3的制备方法,包含以下步骤:
(A)使用磷酸盐缓冲液将氯丙嗪血蓝蛋白免疫原稀释至终浓度为0.5-5.0mg/mL;
(B)使用弗氏佐剂法对实验动物进行免疫注射,注射3-8次后抽取动物血液,分离纯化抗血清,得到抗氯丙嗪特异性抗体3;
所述的氯丙嗪血蓝蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
将100-300mg的血蓝蛋白溶解于10-100ml浓度为0.2 mol/L,pH为8.5的磷酸盐缓冲液中制成载体蛋白溶液;
用1.0-5.0ml的有机溶剂A溶解50-500mg的权利要求1所述的氯丙嗪衍生物,通过偶联活化剂进行活化并与步骤中制备的载体蛋白溶液进行偶联反应,反应结束后经透析纯化得到具有免疫原性的氯丙嗪血蓝蛋白免疫原;
所述的有机溶剂A为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、异丙醇、甲醇或乙醇中的任意一种;
所述的氯丙嗪-人血清白蛋白复合体的制备方法,包含以下步骤:
将10mg人血清白蛋白用5mL 0.1 mol/L pH=7.8的磷酸盐缓冲液稀释,然后加入100mg权利要求1所述的氯丙嗪衍生物,再加入50mg的偶联活化剂,在4℃下反应12 小时,再用0.1 mol/L pH=7.8的磷酸盐缓冲液在4℃下透析18小时,得到氯丙嗪-人血清白蛋白复合体;
所述的偶联活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N,N′-二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、三丁胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二卤化二硝基苯中的任意一种。
10.根据权利要求5或7中任一项所述的校准品,其特征在于,所述校准品是由浓度分别为0ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml、320ng/ml的氯丙嗪,质量分数为0.1-1.0%的氯化钠、0.2-2.0%的牛血清白蛋白、0.25-1.5%的乙二胺四乙酸、0.01%-0.1%的叠氮钠,
50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液组成。
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