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使用促性腺激素释放激素(GNRH)组合的变体作为免疫原的药物组合物

阅读：703发布：2020-05-28

专利汇可以提供使用促性腺激素释放激素(GNRH)组合的变体作为免疫原的药物组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且药物组合物，其包含通过氨基或羧基末端无差别地与载体分子结合的天然GnRH 激素和/或其一种模拟物的组合，在一种情况下通过其羧基末端结合，在另一种情况下通过其氨基末端结合，产生针对内源性GnRH分子的迅速且有力的免疫应答，最终引起GnRH以及参与GnRH/LH-FSH/甾酮 -(雌激素)级联的其余激素的消除，并促进向GnRH或其模拟物的多个表位的免疫系统的暴露，因此使载体产生的空间位阻最小化。本发明直接应用于宠物和具有经济利益的动物的阉割，人类能育性的控制以及激素敏感性肿瘤例如前列腺、乳腺、卵巢、子宫内膜、睾丸、垂体、唾液腺肿瘤以及其它种类的人类肿瘤的治疗。，下面是使用促性腺激素释放激素(GNRH)组合的变体作为免疫原的药物组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.包含天然GnRH或其模拟物GnRHm1的2种变体的药物组合物，其中一种变体为通过羧基末端结合了载体分子的羧基末端变体，并且另一种变体为通过氨基末端结合了相同的载体分子或另一种载体分子的氨基末端变体，其中羧基末端变体和氨基末端变体之比是
10:90至80:20（重量/重量）。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中，所述载体分子是破伤风类毒素。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述载体分子是脑膜炎奈瑟氏菌P64K蛋白、乙肝核心抗原、KLH、卵白蛋白、BSA或源自那些在人和动物中产生感染的微生物的其它蛋白和肽。
4.根据权利要求2的组合物，其中载体分子是序列为SEQ ID NO:2的830-844破伤风类毒素。
5.根据权利要求3的组合物，其中载体分子是序列为SEQ ID NO:3的脑膜炎奈瑟氏菌的P48-P64K肽。
6.根据权利要求1的药物组合物，其中通过化学结合、通过合成、缀合或克隆获得GnRH或其模拟物GnRHm1的氨基和羧基末端变体的混合物。
7.根据权利要求1的药物组合物，其中使用D氨基酸化学地合成GnRH或其模拟物GnRHm1，并且通过化学缀合或在相同的过程中使用载体分子直接合成来进行与载体分子的结合。
8.根据权利要求1的药物组合物，其中最佳组合为这样的组合：其中羧基末端变体占
50%并且氨基末端变体占50%；或，羧基末端变体占70%并且氨基末端变体占30%。
9.根据权利要求1的药物组合物，其包含以10:90至80:20（重量/重量）混合的SEQ ID NO:4和5之一与SEQ ID NO:6和7之一。
10.药物组合物，其包含由按照权利要求1-9任一项的GnRH变体混合物产生的多克隆或单克隆抗体，和/或嵌合抗体，或人源化抗体或抗体片段的混合物。
11.根据权利要求1-9任一项的GnRH变体混合物用于制备药物的用途，所述药物作为哺乳动物中的免疫原，用于使驯化的动物绝育，用于控制啮齿类物种的能育性，用于牛、猪、山羊的阉割。
12.权利要求11的用途，其中所述药物用于免疫阉割以避免未阉割的动物的肉和脂肪的令人不悦的气味，以及此类动物中的生理浓度的雄甾酮和粪臭素。
13.权利要求11的用途，其中所述驯化的动物选自狗和猫。
14.根据权利要求1-9任一项的GnRH变体混合物用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于控制良性和恶性疾病，所述疾病是性激素依赖性癌症，其中所述癌症选自前列腺、乳腺、卵巢、子宫内膜和睾丸癌。

说明书全文

使用促性腺激素释放激素(GNRH)组合的变体作为免疫原

的药物组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及免疫学、内分泌学、肿瘤学、生殖学领域，特别是基于同时产生针对所有GnRH分子的强烈免疫应答；主要是针对该激素的羧基和氨基末端，因此利用向GnRH分子的免疫系统的最佳暴露，所述GnRH分子可以是其天然形式或其模拟物形式，包括基于D氨基酸的变体(当它们结合至载体分子时)；在一种情况下，通过羧基末端进行，在另一种情况下，通过氨基末端进行，从而形成2种不同的免疫分子。以下将分别称作羧基末端变体和氨基末端变体。现有技术

[0002] 促性腺激素释放激素(GnRH)，也称作黄体生成素释放激素(LHRH)，是下丘脑的十肽，其作用于垂体前叶，引起卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)释放进入血液。同时，这会刺激幼年以及成年雄性中的睾丸类固醇合成以及雄性性腺发育。就雌性而言，该激素刺激卵巢、卵泡的发育和卵巢类固醇的合成以及排卵。

[0003] LHRH在调节能育性中的作用是熟知的。因此，有很多疾病与促性腺激素和性腺类固醇激素相关，尤其是与雌激素和睾酮相关。此类疾病包括乳腺癌、子宫和其它类型的妇科癌症或疾病，例如子宫内膜、子宫纤维化、前列腺癌和良性前列腺增生。

[0004] 阉割，也称作性腺切除术，可以通过手术或化学方式进行，是了激素依赖性肿瘤形成的治疗性干预的最有效的方法之一(Huggins C，Hodges CV.Studies on prostatic cancer.I.The effect of castration，of estrogen and of androgen injection on serum phosphatases in metastatic carcinoma of the prostate.Cancer Research1941；1：293-7)。在畜牧业生产上，实施阉割以避免来自经济上具有重要意义的成年雄性动物的肉发出令人不悦的气味和味道(Proc.Soc.Exp.Biol.Med 175：259-281，1984.Meloen RH等人Efficient immunocastration of male piglets by immunoneutralization of GnRH using a new GnRH-like peptide.Vaccine 1994；12：741-747.C rowley WF，Vale WW，Rivier J，MacArthur JW：LHRH in hypogonadotropic hypogonadism.In ZatuchniGL，Shelton JD，Sciarra JJ(编)：“LHRH Peptides as Female and Male Contraceptives”.Philadelphia：Harper and Row Publishers，1981，第321-333页)。

[0005] GnRH的类似物是用于治疗前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌的最有用的药物。它们通过雌激素剥夺或雄性激素剥夺和/或直接对癌细胞产生效应来发挥其作用(Schally，Comaru-Schally AM，Redding TW：Anti-tumor effects of analogues of hypothalamic hormones in endocrine-dependent cancers)。当长期给药时，这些GnRH类似物和拮抗剂发挥其作用的直接机理与GnRH受体的脱敏和失调相关。不同的研究者已经报道了数种此类强有力的类似物和拮抗剂(WaxmanJH，Wass JAH，Hendry WF，Whitfield HN，Besser GM，Malpas JS，Oliver RTD：Treatment with gonadotropin releasing hormone analogue in advanced prostate cancer.Br.Med.J.286：1309-1312，1983.Allen JM，O′Shea JP，Mashiter K，Williams G，Bloom SR：Advanced carcinoma of the prostate：Treatment with a gonadotropin releasing hormone agonist.Br.Med.J.286：1607-1609，1983.Couillard S.Labrie C.Belanger A.Candas B.Pouliot F.Labrie F.“Effect of dehydroepiandrosterone and the antiandrogen EM-800 on growth of human ZR-75-1breast cancer xenografts”.J.Nat.Cancer Inst.，May 20，772-778，1998；Kolle S.等人：“Expression of growth hormone receptor in human prostatic carcinoma and hyperplasia”.Int.J.Oncol.，vol.14，No.5，p 911-916，1999)。

[0006] 当使用GnRH/LHRH的类似物时，一种替代性变体是使用天然激素或使用其模拟肽进行免疫，当它们与免疫原性更强的分子结合时，它们可作为疫苗，所述免疫原性更强的分子是例如破伤风类毒素、白喉类毒素或其表位、KLH(钥孔血蓝蛋白)或BSA(牛血清白蛋白)等(Gual C，Garza-Flores J，Menjivar M，Gutierrez-Najar A，Pal R，Talwar GP.Ability of an anti-Luteinizing hormone-releasing hormone vaccine to inhibit gonadotropins in postmenopausal women.Fertil Steril 1997；67：404-7)。

[0007] 已经发表了不同的关于使用GnRH/LHRH作为合适的抗原进行接种的报道，例如US5,897,863；US 6,132,720。然而，从该做法一开始即与其相伴的一个问题是引发有力的免疫应答以产生有效水平的抗-GnRH抗体的能力不足。这主要是由于，在所有的哺乳动物中，这种十肽的大小较小以及自体同源性质。这就是为何从第一次尝试开始，以类似分子积累的经验以及载体(其增加该肽对于免疫系统的可见性)的使用带来了巨大的帮助。

[0008] 已经在雄性猪、啮齿类和灵长类中使用基于与破伤风类毒素的载体分子结合的GnRH或其模拟肽的疫苗候选物进行了临床试验。这些试验显示出睾丸、前列腺萎缩以及雌性中的卵巢的萎缩(Talwar GP，Raina K，Gupta J.C，Ray R，Wadhwa S，Ali MM.A recombinant Luteinizing-hormone-releasing hormone immunogen bioeffective in causing prostatic atrophy.Vaccine 2004；22：3713-372.Millar RP，King JA，Davidson JS，Milton RC.Gonadotropin-releasing hormone-diversity of functions and clinical applications.S Afr Med J1987；72：748-755)。在经免疫的组中不同个体之间观察到结果的极大的差异，即使是使用大剂量时也是这样，这是当使用基于GnRH/LHRH的免疫原作为针对宠物和具有经济效益的动物的能育性的疫苗时的另一个不利方面。高度反应原性的佐剂例如氟氏完全佐剂的有问题的使用使以上问题更加复杂化(Hoskinson等人，Austr.J.Biotech；4，166-170(1990)；Bonneau等人，J.Anim.Sci.72，14-20(1994)；美国专利号4,608,251；国际专利申请号WO 88205109；Caraty等人，C.R.Acad.Sc.Paris，t.303，Serie III，No.16，673-676(1986)；Falvo等人；J.Anim.Sci.63，986-994(1986))。

[0009] 类似地，R.Bringas等人的专利WO 98/27111“Preparado vacunal para la inmunocastración reversible de mamíferos”描述了关于发育期前的猪的免疫阉割的阳性结果，其中使用在合成过程中与破伤风类毒素(TT)结合的突变的GnRH并加以氟氏完全佐剂(CFA)的佐剂化处理。然而，该疫苗制剂在发育的动物中的深入使用未显示出所观察到的匀质性。

[0010] 在具有末期前列腺癌的患者中以及在绝经后的妇女中进行的首项临床试验是为了研究促性腺激素抑制，其是在上世纪90年代首次进行的，由Talwar GP等人发表 (Talwar GP.Vaccines for control of fertility and hormone-dependent cancers.Immunology and Cell Biology 1997；75：184-189.Gual C，Garza-Flores J，Menjivar M，Gutierrez-Najar A，Pal R，Talwar GP.Ability of an anti-Luteinizing hormone-releasing hormone vaccine to inhibit gonadotropins in post-menopausal women.Fertil Steril 1997；67：404-7)。除了上文提及的已经使用的候选物，与作为载体的破伤风类毒素(TT)和白喉类毒素(DT)化学缀合的LHRH通常产生抗-半抗原性的免疫抑制(Schutze M-P，Leclerc C，Jolivet M，Audibert F，Chedid L.Carrier-induced epitopic suppression，a maj or issue for future synthetic vaccines.J immunol1985；135：2319-22.Gaur A，Arunan K，Singh OM，Talwar GP.By pass by an alternate carrier of acquired unresponsiveness to HCG upon repeated immunization with tetanus conjugated vaccine.Int Immunology 1990；2(2)：151-5.Sad S，Gupta HM，Talwar GP，Raghupathy R.Carrier induced suppression of the antibody response to self hapten.Immunlogy 1991；74：223-7)，以及在缀合过程中报道的损失(Gual C，Garza-Flores J，Menjivar M，Gutierrez-Najar A，Pal R，Talwar GP.Ability of an anti-Luteinizing hormone-releasing hormone vaccine to inhibit gonadotropins in postmenopausal women.FertilSteril 1997；67：404-7)。

[0011] 最近报道：一组北美科研人员使用了引起经常性感染性婴儿疾病的源自微生物抗原的T辅助表位。在化学合成过程中，它们通过GnRH的氨基末端与GnRH结合，以发现更强烈和普遍的应答(Finstad C.L，Wang C.Y，Kowalsky J，Zhang M，Li M，Li X，Xia W，Bosland M，Murthy k.k，Walfield A，Koff W.C，Zamb T.J.Synthetic Luteinizing hormone releasing hormone(LHRH)vaccine for effective androgen deprivation and its application to prostate cancer immunotherapy.Vaccine 2004；22：1300-1313)。然而，虽然由于在同一免疫原中使用了4种T辅助表位而获得了良好的免疫应答，但是必须使用油性佐剂进行反复免疫。所述配制是难以再现的过程、非常昂贵并且不容易在主要工业过程中执行。在该例中，特别是基于载体分子的多样性而开发免疫应答的潜力，忽视了混合物(其中存在来自GnRH或其模拟物的游离氨基和羧基末端)将提供的免疫应答的潜力。

[0012] 最后，必须指出的是，有一些文献报道了GnRH或其模拟物的不同免疫缀合物的免疫原性能力，以及不同的作者使用通过羧基和氨基末端缀合的GnRH的免疫分子所获得的不同结果，包括使用促进缀合的另外的氨基酸。类似地，还有关于使用与其两个末端之一结合的不同载体分子的报道，其是通过常规合成肽或通过重组DNA，或通过“串联”和MABS形式的复合分子而获得的。然而，关于使用与载体分子偶联的GnRH的2个变体制剂(一个通过氨基末端，另一个通过羧基末端，二者用于同一药物制剂中)，目前尚未发现关于其对免疫应答以及性激素水平的协同效应以及对靶器官(前列腺、睾丸、乳腺、卵巢)的效应的报道。

[0013] 本文提出的分子的构建方法包括，通过合成进行化学结合，GnRH或其模拟物与载体分子的融合蛋白的缀合或克隆。所述载体分子可以是完整蛋白或其片段或表位，例如破伤风类毒素、脑膜炎奈瑟氏菌(Nisseria Meningitidis)P64K蛋白、乙肝表面抗原、肝炎病毒核心抗原等。

[0014] 在同一制剂中施用的本文的药物制剂产生协同免疫应答，其靶向GnRH的游离的氨基和羧基末端。结果是，获得了雄性和雌性的性激素(分别是雄性激素和雌激素)的迅速和显著的消除，其产生了有力的免疫阉割。该制剂将直接应用于宠物和具有经济效益的动物的免疫阉割，以及人类能育性的控制，并用于治疗激素敏感性肿瘤，例如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌和子宫内膜癌，以及垂体和唾液腺以及其它肿瘤。该制剂的显著效应有：靶器官体积减小、肿瘤质量减小和个体的生存延长。

[0015] 本发明的新颖性和优点

[0016] 本发明基于在同一个免疫方案中组合GnRH/LHRH激素(天然的或其模拟物)的2个变体，所述变体可以包括倒转变体(retro-inverse)，通过D氨基酸合成。在本文中，GnRH变体这样产生的：通过化学合成、缀合或使用GnRH DNA嵌合体(通过氨基和羧基末端与TT类型的载体分子或其表位的不易区分的结合)。明显的目标是找寻针对内源性GnRH的更快捷且更强的免疫应答。在本例中，可以在同一个制剂中同时施用羧基和氨基末端变体(就GnRH与载体分子的结合位点而言)，或者在同一免疫方案中按照顺序或交替方式单独施用所述羧基和氨基末端变体。

[0017] 本发明的新颖性在于，使用上文提及的2种GnRH变体进行主动免疫之后，对于免疫系统所产生的协同效应，所述2种变体称作羧基末端变体(载体与GnRH或其模拟物的羧基末端结合的变体)和氨基末端变体(载体与GnRH或其模拟物的氨基末端结合的变体)。一旦作为同一制剂的一部分来使用这些变体，它们会产生雄性和雌性的性激素(分别是雄性激素和雌激素)的迅速且有力的消除，产生有力的免疫阉割作用。因此在宠物和具有经济效益的动物中进行有效的免疫阉割。另一方面，其还可用于人类能育性的控制，并用于治疗激素人类的激素敏感性肿瘤；前列腺、乳腺、卵巢、子宫内膜、睾丸、垂体、唾液腺和其它的肿瘤。治疗的效果在于靶器官体积减小、肿瘤质量减小和个体的生存延长。

[0018] 按照上述的组合施用之后，所描述的组合不仅代表2种变体(羧基和氨基末端变体)的作用之和，而且，在靶器官上类似地产生对于免疫系统的协同效应。

[0019] 作为相对于之前描述的处理具有的优点，本发明显示了对靶器官(睾丸、前列腺、卵巢等)；和/或对于性激素依赖性肿瘤(前列腺、乳腺、卵巢、子宫内膜、唾液腺、睾丸等)的更快和更有力的作用；这是由于通过羧基和氨基末端变体的混合物实现了协同性。

[0020] 本发明的变体的组合显示出所获得的抗-GnRH抗体的效价与性激素(雄性激素和雌激素)降低至阉割水平之间的密切关系。这继而与对于靶器官产生的效应相关联。除了通过使用油性佐剂(Montanide)实现的效应之外，这些结果允许使用其它的反应原性较低的(无毒的)佐剂；例如铝盐。上述方面提供了GnRH氨基和羧基末端变体相对于迄今所报道的任何其它的基于GnRH激素的免疫原的显著优势。

[0021] 发明详述

[0022] 通过使用在同一制剂或疫苗候选物中的GnRH羧基和氨基末端肽变体免疫健康成年大鼠而产生的免疫应答允许获得相对于其它免疫方案而言更好的效果，所述其它免疫方案是仅使用独立的一种变体(羧基或氨基末端)。所描述的结果显示了引发免疫阉割以及治疗激素剥夺敏感性的良性增殖性疾病(例如子宫内膜异位)或恶性癌症(前列腺、乳腺、子宫内膜、卵巢、睾丸、颔下腺体癌症)和其它癌症的协同性。

[0023] 与之前应用的技术不同，天然GnRH分子或其模拟物，尤其是GnRHm1，可以在肽合成过程中直接与载体蛋白结合，或与高免疫原性的分子化学缀合或以融合蛋白形式克隆，以形成2种不同变体：羧基和氨基末端变体。这些变体可以与一些最常用的报道过的载体蛋白或其表位(破伤风类毒素、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟氏菌P64K蛋白、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原等)结合，以达到具有协同效应的迅速且有力的免疫应答，引起GnRH消除和参与GnRH/LH-FSH/睾酮/雌激素级联的激素的消除。

[0024] 羧基和氨基末端变体可按照不同的比例应用于同一制剂中，其中羧基末端变体和氨基末端变体之比可以是10∶90至80∶20(重量/重量)。按照这种方式，通过羧基末端结合的GnRH分子在所有的情形中占总混合物质量的比例小于10％，并且同时氨基末端变体占总混合物的至少20％。

[0025] 当每种变体以50％(重量/重量)的比例混合时，羧基和氨基末端组合获得了最佳结果。

[0026] 类似地，GnRH分子的羧基和氨基末端可以不易区别地与同一载体结合，一个通过氨基末端，另一个通过羧基末端。或者，一个变体(羧基末端)可以与一个载体蛋白结合，而另一个变体(氨基末端)与另一载体蛋白结合。因此，免疫原性组合物可以由下列组成：例如，在一种情况下，由结合于作为载体的TT或其表位之一的GnRH或其模拟物组成；在另一种情况下，由结合于脑膜炎奈瑟氏菌的P64K蛋白或乙肝核心抗原或其表位或另一种高免疫原性载体分子的GnRH或其模拟物组成。

[0027] 这种组合允许产生比其它免疫原更快且更有力的抗-GnRH免疫应答，其使用混合的GnRH羧基和氨基末端变体，并以Montanide型的油性乳液或可溶于水的铝型佐剂和QS21作为佐剂。

[0028] 所描述的制剂的潜力可以通过下列方法明显增强：加入免疫刺激剂，例如非常小的蛋白脂质体(VSSP)，其获自脑膜炎奈瑟氏菌壁脂蛋白与N-乙酰或N-羟乙酰GM3神经节苷脂的混合物；或者类似地，将其与可溶于水的佐剂例如螺旋型和藻酸盐混合。

[0029] 如上文所述，本发明可用于免疫多种脊椎动物，其在宠物(狗、猫等)、野生物种(啮齿类、松鼠等)中的哺乳动物能育性控制中的用途是特别重要的。本文提出的组合确保在猪、山羊等的免疫阉割中的较高的免疫原性百分率，以避免在那些动物的肉和脂肪中产生令人不悦的气味。该组合的另一项用途是控制经济上具有重要意义的动物例如公牛、水牛、马等的能育性和攻击性。就人类医药而言，本发明直接应用于治疗前列腺癌和乳腺癌，以及子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、颔下腺体癌症，垂体病症和其它激素敏感性肿瘤。

[0030] 作为组合物的成分之一的羧基末端型变体的免疫原性制备物

[0031] 疫苗的成分之一，羧基末端变体，在一种情况下可以由下列组成：与破伤风类毒素的T辅助表位(830-844)(QYIKANSKFIGITEL)结合或与其它载体(例如白喉类毒素、脑膜炎奈瑟氏菌的P48-P64K蛋白(IPGVAYTSPEVAWVG)、乙肝核心抗原等)结合的天然GnRH分子或其模拟物之一(例如，GnRHm1，序列为QHWSYPLRPG)，或使用用于遗传构建的表达系统以融合蛋白形式来获得。

[0032] 完整的肽QHWSYPLRPGGGQYIKANSKFIGITEL和QHWSYPLRPGGGIPGVAYTSPEVAWVG的化学合成并进行油性佐剂(Montanide型)的佐剂化处理显示出有力的睾酮消除效应，所述效应是通过对发育期前的动物仅进行2次免疫，对成年动物进行3或4次免疫。在第4次免疫达到90％血清转化之后，使用该变体获得的抗体效价对于多数个体而言是1/1000-1/2000。

[0033] 氨基末端：组合物的第二成分

[0034] 类似地，通过氨基末端与破伤风类毒素的830-844表位结合的天然GnRH分子或其模拟物之一(如上例所述的GnRHm1)的构建体，以形成分子
QYIKANSKFIGITELGGQHWSYPLRPG，或通过其氨基末端与脑膜炎奈瑟氏菌的P64K蛋白的P48肽结合形成IPGVAYTSPEVAWVGGGGQHWSYPLRP，或与上述类型的其它载体分子结合，相对于上述提及的通过羧基末端的变体而言，形成具有针对内源性GnRH的较高的免疫原性潜力的成分。值得注意的是，我们发现以TT-GnRHm1免疫的个体仅在第一次免疫后即显示出天然GnRH血清转化，在第3或4次免疫后达到1∶6000至1∶12000的抗体效价。而氨基末端变体(P48-P64K-GnRHm1)仅在第1次免疫之后即引发90％的抗体应答，在第4次免疫后达到1∶5000至1∶12000的抗体效价。考虑到GnRH是非常小的自体同源分子，在所有哺乳动物中是保守的，所以所述效价可以被认为是非常显著的。但是，与羧基末端变体相比，这种氨基末端变体对于靶器官(在雄性中为前列腺、睾丸；在雌性中为卵巢)不产生显著较强的效应。
附图说明

[0035] 图 1 显示了天然 GnRH、GnRHm1-TT、TT-GnRHm1、GnRHm1-P48-P64K 和P48-P64K-GnRHm1变体的氨基酸序列。

[0036] 图2：使用与TT载体分子结合的不同的GnRH变体免疫的动物中的平均抗-GnRH(天然)血清转化。

[0037] 图3：使用与TT载体分子结合的不同GnRH变体免疫的健康的哥本哈根大鼠中的抗-GnRH抗体效价。

[0038] 图4：处死(100天)时的睾丸重量测定。LSD Stat-Graphic统计学分析。1-安慰剂，2-GnRHm1-TT，3-TT-GnRHm1，4-2+3的组合(50/50)，5-2+3的组合(70/30)，6-交替方案。

[0039] 图5：处死(100天)时的前列腺重量测定。LSD Stat-Graphic统计学分析。1-安慰剂，2-GnRHm1-TT，3-TT-GnRHm1，4-2+3的组合(50/50)，5-2+3的组合(70/30)，6-交替方案。

[0040] 图6：检测的所有动物的睾丸和前列腺的肉眼可见方面的情况(每组n＝10)。从左至右的小组分别是：第1组-安慰剂，第2组-GnRHm1-TT(C-T)，第3组-TT-GnRHm1(A-T)，第4组-[C-T]+[A-T]的组合(50/50)，第5组-[C-T]+[A-T]的组合(70/30)；第6组-交替方案(Alt)。

[0041] 图7：与破伤风类毒素载体分子结合的不同GnRH变体的肿瘤体积的平均值。

[0042] 图8：使用与TP48-P64K载体分子结合的不同GnRH变体免疫的哥本哈根大鼠中的抗-GnRH抗体效价。

[0043] 图9：处死(100天)时的睾丸重量测定。LSD Stat-Graphic统计学分析。1-安慰剂，2-GnRHm1-P48-P64K，3-P48-P64K-GnTHm1，4-2+3的组合(50/50)，5-2+3的组合(70/30)，6-交替方案。

[0044] 图10.处死(100天)时的前列腺重量测定。LSD Stat-Graphic统计学分析。1-安慰剂，2-GnRHm1-P48-P64K，3-P48-P64K-GnTHm1，4-2+3的组合(50/50)，5-2+3的组合(70/30)，6-交替方案。

[0045] 图11：在哥本哈根大鼠中移植的Dunning R3327-H肿瘤细胞系(在动物免疫前移植)的肿瘤生长速率测定。实施例

[0046] 使用与不同载体分子结合的GnRH羧基和氨基末端变体进行的免疫原性实验和对靶器官的效应

[0047] 实施例1：使用TT作为载体分子的GnRHm1-TT羧基和氨基末端变体的免疫原性[0048] 在图1a和1b中描述了用于生物学测定中的GnRH氨基和羧基末端变体和TT合成肽的序列。

[0049] 1.1实验分组

[0050] 1-安慰剂；

[0051] 2-羧基末端(GnRHm1-TT)总共750μg肽；

[0052] 3-氨基末端(TT-GnRHm1)总共750μg肽；

[0053] 4-同一乳液中的50/50组合(w/w)：羧基末端(GnRHm1-TT)+氨基末端(TT-GnRHm1)变体；总共750μg肽(每种375μg)；

[0054] 5-同一乳液中的70/30组合(w/w)：羧基末端(GnRHm1-TT)+氨基末端(TT-GnRHm1)变体；总共750μg肽(525μg GnRHm1-TT+225μg TT-GnRHm1)；

[0055] 6-使用总共750μg肽羧基末端变体(GnRHm1-TT)在第0、30和60天进行免疫，使用总共750μg肽氨基末端变体(TT-GnRHm1)在第15和45天进行交替免疫。

[0056] 在所有5种情况下，使用Montanide佐剂通过皮下方式进行每种变体的免疫接种。

[0057] 1.2实验发展

[0058] 1.2.1免疫原性制备物、动物免疫和结果分析

[0059] 1.2.2佐剂化：将对应浓度的羧基末端肽变体GnRHm1-TT和/或氨基末端肽变体TT-GnRHm1分别重悬于用于注射的水中。然后，获得50％(v/v)的重悬的肽和油性佐剂的混合物。最后，将该混合物在机械装置中摇匀20分钟，以形成乳白色乳液备用。

[0060] 1.2.3免疫：向一次性注射器中装入1mL乳液，使用每两周一次的方案通过皮下方式注射9-12周龄的哥本哈根大鼠的背脊区域。

[0061] 1.2.4测定抗-GnRH抗体的效价：使用ELISA(酶联免疫测定)系统测定接种后产生的循环的抗-GnRH抗体。使用100mM Na2CO3(pH 9.6)中的100μL天然GnRH肽(5μg/ml)包被96孔聚苯乙烯平板，并在40C温育过夜。以1x PBS(pH 7.4)清洗之后，使用PBS中的2％的BSA封闭平板，并在370C温育1小时。将动物血清样品稀释于(稀释度为1/60-1/2000)含有1％BSA、Tween 20(0.01％，w/v)的PBS中，在370C温育3小时。将平板用PBS洗涤几次，并使其与来自大鼠的抗-IgG抗体(使用辣根过氧化物酶(SIGMA Biochemical USA)缀合)反应。再次洗涤之后，将平板与柠檬酸盐缓冲液中的邻苯二胺(OPD)与H2O2底物的混合物一起温育。效价表示为达到比测定截止值高2倍的值时的最大稀释度。

[0062] 1.2.5睾酮水平测定

[0063] 使用TESTO CT2 试剂盒(CisBio，International，France)测定睾酮水平。将25μL每种血清样品直接加入预先包被的管中。将样品按照一式两份温育。最后以蒸馏水洗涤管并使用γ计数器读数。结果以nmol/L表示。

[0064] 1.2.6.动物的处死和统计学分析

[0065] 根据良好的实验室实践，在第5次免疫后1个月时(100天)将动物麻醉并处死。使用Duncan检验(Stat-Graphic 软件)确定关于睾丸和前列腺大小的统计上的显著差异。
TM
类似地，使用相同的统计学程序(SAS Institute Inc.，SAS/STAT 使用说明书，6.03版，Cary，NC：SAS Institute Inc.，1988.第1028页)分析睾酮水平。

[0066] 1.3实验结果

[0067] 1.3.1血清转化分析

[0068] 如上所述，GnRH分子在所有哺乳动物中和很多高等脊椎动物中具有100％的同源性。其还具有很小的大小(仅10个氨基酸)，这使其具有非常低的免疫原性，但具有高耐受能力，这是由于内在性质造成的。

[0069] 在本实施例中，我们发现，以氨基末端变体(TT-GnRHm1)免疫的组在第1次免疫后达到了100％的血清转化，而以羧基末端变体(GnRHm1-TT)免疫的组仅在第3次免疫后才显示90％的血清转化。混合的氨基和羧基末端变体组合(50/50)在第2次免疫后达到100％的血清转化；混合的氨基和羧基末端变体组合(70/30)在第3次免疫后达到100％的血清转化(图2)。

[0070] 1.3.2抗-GnRH抗体效价测定

[0071] 图3中显示了每个实验组中血清样品的抗-GnRH抗体效价。如图所示，TT-GnRHm1组显示出与抗-GnRH效价的出现相关的较高的免疫应答速度，所述效价为：在实验开始后75和100天，分别是1/6000和1/12000。50/50和70/30混合变体显示出相似的抗-GnRH抗体效价，但是前者显示出较高的效价应答速度。使用GnRHm1-TT和TT-GnRHm1变体进行的交替免疫方案不能维持与50/50组合同样高的效价；但是交替方案达到了相似的引发效价的速度。在使用GnRHm1-TT变体免疫的组中，效价的出现时间晚于其它实验组(在第3次免疫后出现)，并且不能达到高于1/1000的效价水平。

[0072] 1.3.3针对不同GnRH区域产生的抗-GnRH抗体效价与对于靶器官的效应之间的关联

[0073] 进行了抗-GnRH抗体效价与对于靶器官(前列腺、睾丸)的效应之间的关联分析。如图3所示，使用氨基末端区域TT-GnRHm1进行的免疫显示出高免疫原性谱，而羧基末端变体(GnRHm1-TT)显示出较慢的血清转化和显著较低的针对GnRH的抗体效价。在处死时，显示出对于靶器官的效应是相似的。相对于使用羧基末端变体(GnRHm1-TT)免疫的组而言，使用氨基末端变体(TT-GnRHm1)免疫的组达到了高达1∶12000的效价，对靶器官(前列腺和睾丸)产生了相似的效应(图4和5)。

[0074] 在相同的免疫方案中，氨基和羧基末端变体的不同比例的混合物产生了比单独使用羧基末端肽时显著更高的免疫应答，其比单独施用2种变体时产生了显著更高的生物学效应。虽然，其没有达到使用氨基末端变体时获得的绝对效价值。当在相同的免疫方案中按照交替方式使用两种肽时，获得了相似的结果(图4、5、6)。

[0075] 实施例2：使用P48-P64K作为载体分子的GnRHm1-羧基和氨基末端变体的免疫原性

[0076] 2.1实验分组

[0077] 1-安慰剂；

[0078] 2-羧基末端(GnRHm1-P48-P64K)总共750μg肽；

[0079] 3-氨基末端(P48-P64K-GnRHm1)总共750μg肽；

[0080] 4-同一乳液中的50/50组合(w/w)：羧基末端(GnRHm1-P48-P64K)+氨基末端(P48-P64K-GnRHm1)变体；总共750μg肽(每种375μg)；

[0081] 5-同一乳液中的70/30组合(w/w)：羧基末端(GnRHm1-P48-P64K)+氨基末端 (P48-P64K-GnRHm1) 变体；总共 750μg 肽 (525μgGnRHm1-P48-P64K+225μg P48-P64K-GnRHm1)；

[0082] 6-使用总共750μg肽羧基末端变体(GnRHm1-P48-P64K)在第0、30和60天进行免疫，使用总共750μg肽氨基末端变体(P48-P64K-GnRHm1)在第15和45天进行交替免疫(2和3)。

[0083] 在所有5种情况下，使用Montanide佐剂通过皮下方式进行每种变体的免疫接种。

[0084] 2.2实验发展

[0085] 按照1.2.1至1.3.3中的描述进行免疫原性制备物、动物免疫和结果分析和统计数据处理。

[0086] 2.3实验结果

[0087] 2.3.1血清转化分析

[0088] 在本实验中，以氨基末端肽变体(P48-P64K-GnRHm1)免疫的组在第1次免疫后得到了100％的血清转化，而以羧基末端肽变体(GnRHm1-P48-P64K)免疫的组仅在第3次免疫后才显示70％-80％的血清转化。然而，混合的羧基和氨基末端变体组合(50/50)在第2次免疫后显示出100％的血清转化。另一方面，混合的羧基和氨基末端变体组合(70/30)和交替免疫方案在第3次免疫后显示出100％的血清转化(图7)。

[0089] 2.3.2抗-GnRH抗体效价测定

[0090] 图8中显示了每个实验组中血清样品的抗-GnRH抗体效价。在该图中观察到，P48-P64K-GnRHm1组显示出较快的抗-GnRH效价的出现，在实验末尾时介于1/5000和1/8000。在混合的变体中，50/50和70/30变体引发了相似的抗-GnRH抗体效价。然而，使用50/50变体时，效价显示出较快的应答。另一方面，使用GnRHm1-P48-P64K和P48-P64K-GnRHm1变体进行的交替免疫方案产生了与使用70/30变体相似的免疫原性水平。虽然不能维持与第一个同样高的效价。在使用GnRHm1-P48-P64K变体免疫的组中，效价出现的时间晚于其余的实验组，并且未达到比最佳实例中的1/1000更高的水平。

[0091] 2.3.3针对不同GnRH区域产生的抗-GnRH抗体效价与对于靶器官的效应之间的关联

[0092] 如图7和8所示，使用氨基末端变体P48-P64K-GnRHm1进行的免疫引发高免疫原性，而羧基末端变体(GnRHm1-P48-P64K)显示出较慢的血清转化和显著较低的抗-GnRH的抗体效价。在处死时，观察到的血清转化的差异与对于靶器官效应间的关联不明显。因此，使用氨基末端变体(P48-P64K-GnRHm1)免疫的组中高达1∶8000的效价产生的效应与使用羧基末端变体(GnRHm1-P48-P64K)免疫的组对于靶器官(睾丸、前列腺)的效应是相似的(图9和10)。

[0093] 在相同的免疫方案中，羧基和氨基末端变体的不同比例的混合物产生了比单独使用羧基末端肽时显著更高的免疫应答，虽然比使用氨基末端变体获得的效价低，其生物学效应相对于单独施用2种变体是显著更优的。当在相同的免疫方案中按照交替方式使用两种肽时，获得了相似的结果(图8、9和10)。

[0094] 实施例3：针对不同的GnRH区域引发的体液应答与对于靶器官的效应之间的关联。组合效应

[0095] 分析了抗体效价之后，进行了关于这些效价与对于靶器官(前列腺和睾丸)的效应二者之间的关联性分析。如图3和8所示，就免疫原性能力而言，在实验组2和3中(对应于羧基和氨基末端变体)观察到完全不同的表现。因此，氨基末端变体即TT-GnRHm1和P48-P64K-GnRHm1肽显示出在所使用的模型中较快地产生抗-GnRH抗体，并且产生针对该激素的高效价；而羧基末端变体(GnRHm1-TT和GnRHm1-P48-P64K)则产生了慢得多的血清转化和显著较低的针对GnRH的抗体效价。虽然这些血清转化和血清效价测定是不同的，但是在动物处死时对于靶器官产生的作用是相似的。因此，在以氨基末端变体免疫的组中可以观察到高达1∶12000的抗体效价，其对于靶器官(前列腺和睾丸)产生的效应与使用羧基末端变体免疫的组中是类似的(图4&5，和9&10)。然而，如果将羧基和氨基末端变体按照不同的比例在同一免疫方案中组合，则获得了比单一的羧基末端肽显著较高的免疫应答。该应答没有达到与氨基末端变体同样高的效价值，但是其产生了比单独施用2种变体显著较高的生物学效应。当在同一免疫方案中以交替方式接种两种肽时，获得了相似的结果(图4、5、9和10)。

[0096] 根据这些结果得出结论：当通过氨基末端或通过远离羧基的其它氨基酸与载体分子结合时，GnRH中的游离羧基末端强烈刺激针对该激素的免疫应答。相反，当通过羧基末端与载体分子结合时，似乎GnRHm1-TT破坏了该区域向免疫系统的暴露，并且仅暴露氨基末端。该氨基末端区域不具有与羧基末端同样高的免疫刺激能力，但是其能够产生应答，虽然该应答强度仅为1/10，但是当按照与TT-GnRHm1变体相等的剂量施用时，产生了对该激素的类似的中和。

[0097] 基于这些发现，我们可以确定：在GnRH的情形中，免疫原性最高的区域不一定是免疫中和区域。对其它蛋白和肽而言也是这样。

[0098] 以上结果使我们得出结论：在同一免疫方案中同时使用2种与载体分子结合的GnRH或其模拟物的变体的混合物(一种是通过氨基末端结合；另一种是通过羧基末端结合)产生了抗-GnRH免疫应答的协同性。在该例中，免疫应答效应高于未组合的变体的预期效应的加和。

[0099] 当使用肽的混合物用于免疫过程时，使用50/50和70/30变体组合观察到了对于减小前列腺和睾丸大小的显著的协同效应。交替和连续方案也产生了组合效应，但是比同时使用的效应弱。该效应主要在于睾丸和前列腺的萎缩。

[0100] 处理效应(E处理)计算为单位1减掉经处理的动物中的靶器官(前列腺和睾丸)的平均重量(P处理)与安慰剂动物中靶器官的平均重量(P安慰剂)之比：

[0101] E处理＝1-(P处理/P安慰剂)(1)

[0102] 如表1a和1b所示，羧基和氨基末端变体的50/50组合对于前列腺和睾丸的实验效应高于预期的理论效应，因此证明了使用图1所描述的任意分子时，该组合对于减小靶器官大小的协同效应。在两种肽的70/30组合的情况下，结果与羧基+氨基末端的50/50组合是非常相似的。使用交替免疫方案时，就对于靶器官(前列腺和睾丸)的生物学效应而言，仅观察到效应的加和，虽然达到的效价比使用单独变体免疫时要高。

[0103] 表1a和1b显示了，当免疫健康成年动物时，相对于单独使用每种肽的单独的变体，使用组合免疫所获得的总体协同效应。

[0104] 表1：关于对睾丸和前列腺的效应的理论和实验值的总结：使用GnRHm1与2种不同载体分子的羧基和氨基末端变体。A)GnRHm1-TT和TT-GnRHm1分子的效应；B)GnRHm1-P48-P64K和P48-P64K-GnRHm1分子的效应。

[0105] A)

[0106]

[0107] B)

[0108]

[0109]

[0110] 实施例4：在移植了Dunning R3327-H细胞系的哥本哈根成年大鼠中使用单独的GnRHm1-TT和TT-GnRHm1变体及其组合(GnRHm1-TT+TT-GnRHm1)的治疗实验

[0111] 4.1.动物、肿瘤模型：将鼠肿瘤模型Dunning R3327-H的肿瘤片段(2x2x2mm)通过皮下方式(s.c)移植到体重为150至200g的成年哥本哈根大鼠(CENPALAB，Cuba)的右后肢的末端。这是激素依赖性的高度分化的肿瘤细胞系，体积加倍时间为17天。为了测定肿3
瘤生长速率，每周一次常规测定肿瘤。使用公式4/3πr 计算肿瘤体积，其中r是均径。将动物维持在随意获取商售食物和新鲜水源的环境中。

[0112] 4.2实验设计

[0113] 实验组：

[0114] 1.安慰剂动物(以Montanide ISA 51中的PBS免疫)；

[0115] 2.手术阉割的动物；

[0116] 3.GnRHm1-TT肽免疫的动物；

[0117] 4.以肽GnRHm1-TT+TT-GnRHm1的混合物(50/50)免疫的动物；

[0118] 5.以GnRHm1-P48-P64K肽免疫的动物；

[0119] 6.以GnRHm1-P48-P64K+P48-P64K-GnRHm1的混合物(50/50)免疫的动物。

[0120] 4.3动物处理

[0121] 使用治疗模型进行动物处理，按照3.1.1段中的描述接种DunningR3327-H肿瘤细胞系的片段。当肿瘤直径达到大约10mm时，开始治疗干预(免疫)。每两周进行一次免疫。对于第3至第7实验组所用的剂量与1.1段中描述的相同。

[0122] 4.4实验结果

[0123] 移植了Dunning R3327-H肿瘤细胞系的哥本哈根大鼠中的肿瘤生长速率测定[0124] 如图11所示，在安慰剂组观察到肿瘤的急剧生长，在阉割的和经免疫的组中，达到了显著的肿瘤生长抑制。在所有变体中，阉割的动物和GnRHm1-TT+TT-GnRHm1(50/50)以及GnRHm1-P48-P64K+P48-P64K-GnRHm1(50/50)组合变体显示出最大的抑制能力。这三种实验变体产生的抑制是非常相似的，并且与安慰剂和其它组具有显著差异。

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