技术领域
[0001] 本
发明属肉制品和动物源性
饲料检测领域，具体而言，一种同步检测驴、鸡、
牛、鹿、犬、狐狸、
马、
水貂、猪和羊十种动物源成分的液相芯片方法。
背景技术
[0002] 动物源成分真伪检测
鉴别是食品与饲料
质量安全重要内容，对维护人民健康安全、维护经济秩序和社会稳定、进出口食品与饲料监管均具有重要意义。近年来，国内外肉类产品掺杂使假违规犯罪行为屡被曝光，如国内某些不法商人采用低价值物种肉类如鸭肉、猪肉甚至狐狸肉、水貂肉等掺入甚至冒充高价值的牛、羊肉制品，并过量添加色素、香精等杂质。2013年1月，“马肉
风波”事件影响欧洲16国，迫使欧盟重新审查其食品追溯体系和标签制度，并紧急出台措施要求成员国对市场流通的牛肉制品加强DNA抽检。动物源成分检测鉴别也是饲料安全重要内容，涉及
传染性海绵状脑病(TSE)、非洲
猪瘟、高致病性禽流感等重大疫病防控。自1987年欧洲发生疯牛病以来，为防控疯牛病，世界各国家均先后制定法律、法规，严格控制饲料中动物源性成分的使用；我国对来自“非疯牛病风险可忽略”国家和地区的饲用动物产品规定禁止含
反刍动物源(牛、羊、鹿等)成分。为防控高致病性禽流感、非洲猪瘟、
口蹄疫等其他重大动物疫病，各国也制定了针对饲料中特定动物源成分的禁令。
[0003] 动物源成分的检测鉴定技术主要基于DNA和
蛋白质分析两大类别，还有少数研究采用基于
脂肪酸分子组成和结构差异的分析技术。由于蛋白质在食品和饲料加工过程中可能受到破坏，因此基于蛋白质分析技术的应用较为少见。目前国内外主要采用DNA分析技术检测鉴定动物源成分。DNA分子携带动物种属特异遗传信息，非常适合作为物种鉴别的检测靶点；DNA热
稳定性好，在食品和饲料生产过程的热加工、高压处理中仍能保留小
片段的核酸分子用于分析。基于PCR技术的不断发展，目前仅需痕量的DNA片段就能实现靶标的检测。
[0004] 迄今，国内外开展的应用于动物源成分DNA分析技术的研究应用可归纳为以下几种类型：
[0005] 1)基于PCR扩增的检测技术。包括PCR、PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-AFLP、PCR-SSCP和实时
荧光PCR技术等。常规的PCR技术由于需对扩增产物进行
电泳或测序分析，检测时间延长、操作繁琐并易引发核酸污染并造成
假阳性反应，虽然在早期建立了不少基于PCR的方法，但目前应用相对较小。近年来发展的实时荧光PCR技术技术显著提高了检测速度、检测灵敏度和特异性，但其检测成本(包括设备和
试剂)较高，尤其是多重PCR方法。多重实时荧光PCR由于现有的设备平台和可供选用的
荧光染料不能很好解决荧光
信号交叉干扰以及仪器对不同荧光基团分辨敏感性差异问题，对于混合阳性模板、其检测敏感性往往比单色法有明显下降、不同检测通道间常出现信号交叉。
[0006] 2)传统固相
基因芯片技术。基于PCR联合DNA杂交的基因芯片技术已见应用于检测鉴别多种动物种成分，欧洲研发了肉类基因芯片分析
试剂盒，可筛查8-14种动物物种。上述研究均为传统固相基因芯片技术，采用常规尺寸的片状载体(
硅片、光学载玻璃片、
纤维素膜、尼龙膜等)作为固相基质载体，能够提供高通量检测，但其缺点是需要点样仪、杂交仪、
扫描仪等多种专用设备，成本高，并且操作繁琐、造成干扰因素较多，检测稳定性、重复性效果不理想，影响临床应用。
[0007] 3)环介导等温扩增技术。国内外已见应用LAMP技术检测鉴别动物源成分，但研究报道并不多。LAMP技术是一种等温扩增方法，无需变温控制设备如PCR扩增仪，适合
基层应用。但该方法有明显的局限性，不适合进行长链DNA扩增，不适合建立
多重检测方法，扩增产物不能直接用于后续分析，且易产生假阳性反应。
[0008] 此外，数字PCR技术、
生物传感器等近年涌现的新技术也开始应用于动物源成分的检测鉴别研究。但由于设备昂贵、技术要求高、技术还不成熟等原因，这些新技术目前还主要处在实验室研究阶段。
发明内容
[0009] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一组用于同步检测十种动物源性成分的引物对，这十种动物源性成分指驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊。
[0010] 本发明的第二个目的在于提供一组用于同步检测十种动物源性成分的探针。
[0011] 本发明的第三个目的在于提供一个同步检测十种动物源性成分的方法，该方法采用xMAP液相芯片技术原理，可以一次性检测96个样品，具有快速、通量高、特异性好和灵敏度高等优点。
[0012] 为了实现上述目的，本发明提供一组用于同步检测十种动物源成分的引物对，由下述序列组成：
[0013] 检测驴成分特异的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：GCTCAACGTCACACATA；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No .2所示：
GGTTAACAATAGTCTAAATAGA；
[0014] 检测鸡成分的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：CTAACAGGAATCGTCCTTGC；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示：
GTGAATCCTGCTAGGATGGC；
[0015] 检测牛成分的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示：GCTACATTCTCTACACCAAGA；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示：
TAGTGCGTTTAAATAGGG；
[0016] 检测鹿成分的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示：CCAGTTGAATACCCCTTTA；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示：TTAGGAGGTTGTTTTCG；
[0017] 检测犬成分的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示：AACTTCGGATCCTTAC；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示：CATTTGCGTGCATATAG；
[0018] 检测狐狸成分的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示：GTGCATTACTGCTATG；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示：ACGTGCAGTCATGTATG；
[0019] 检测马成分的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示：CACACCCAGAAGTAAAGAC；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示：
GGGAAACATGATGATCAGA；
[0020] 检测水貂成分的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示：AACCAAGAACATACTCAC；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示：CTTATCTCCTCTTGCCTT；
[0021] 检测猪成分的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示：AGCCTAACTTACACTAA，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示：GTGGTAGATTGGCGTAA；
[0022] 检测羊成分的引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示：ATTTCCTYATCATTCTAGTCAT；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示：
AAGACCAGTRTATTGATTGT；
[0023] 所有下游引物的5’端标记生物素，Y，C/T简并；R，A/G简并。
[0024] 本发明还提供一组用于检测十种动物源成分的探针，由下列序列组成：
[0025] 检测驴成分的特异探针，核苷酸序列分别如SEQ ID No.21所示：CCAATAATAGACTCAGACTAACT；
[0026] 检测鸡成分的特异探针，核苷酸序列分别如SEQ ID No.22所示：GTAGTCGCCCACTTCCACTA；
[0027] 检测牛成分的特异探针，核苷酸序列分别如SEQ ID No.23所示：AGCACGAAAGTTATTATGAAA；
[0028] 检测鹿成分的特异探针，核苷酸序列分别如SEQ ID No.24所示：ATACCGATCACCAGCACAA；
[0029] 检测犬成分的特异探针，核苷酸序列分别如SEQ ID No.25所示：CACTATACATCGGACACAGC；
[0030] 检测狐狸成分的特异探针，核苷酸序列分别如SEQ ID No.26所示：GACATRCTA+TGTTTA+ATCTTACA；
[0031] 检测马成分的特异探针，核苷酸序列分别如SEQ ID No.27所示：ATAACAAAACACTCTGCCCC；
[0032] 检测水貂成分的特异探针，核苷酸序列分别如SEQ ID No.28所示：CTCAAGCAACTCATCCAAA；
[0033] 检测猪成分的特异探针，核苷酸序列分别如SEQ ID No.29所示：AAACACTTACTTAAATACGTGCTAC；
[0034] 检测羊成分的特异探针，核苷酸序列分别如SEQ ID No.30所示：ACCTCCTAAAATGAAGACA；
[0035] 所有探针的5’端C12标记
氨基，R，A/G简并；+T，+A为LNA
碱基。
[0036] 本发明还提供一种用于同步检测检测十种动物源成分的方法，包括以下步骤：
[0037] (1)样品的核酸提取；
[0038] (2)使用上述的引物对对样品核酸进行不对称多重PCR扩增；
[0039] (3)将上述的探针分别偶联到带有COOH的聚苯乙烯乳胶微球上；
[0040] (4)将步骤(3)得到的探针偶联后聚苯乙烯乳胶微球的与步骤(2)得到的不对称多重PCR扩增的产物进行杂交反应；
[0041] (5)完成杂交反应后，在每个杂交反应产物管中加入1×TMAC溶液，13000rpm离心4分钟，小心吸弃上清，收集微球沉淀，然后同样条件重复洗涤微球沉淀1-2次；
[0042] (6)用1×TMAC溶液将SAPE稀释至3.3μg/mL，制成TMAC-SAPE报告液；
[0043] (7)每管微球沉淀加入75μL的TMAC-SAPE报告液，振荡混匀，置恒温混匀仪，58℃温育6min，温育期间设振荡速度为300rpm；
[0044] (8)用液相芯片仪检测MFI值，根据检测的本底值，判定检测结果；
[0045] 其中，所述本底值的设定：同步平行设定3个空白对照进行上述步骤(2)和步骤(3)的反应，其中所述空白对照为用水取代待测样品模板，其余试剂成分与反应条件不变；计算3个空白对照的MFI值的平均值，作为本底值；结果判定：当被检样品的MFI值大于5倍本底值时，判为阳性，否则判为阴性。
[0046] 其中，步骤(2)所述不对称多重PCR反应扩增体系为：40μL反应体系中含序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示序列，引物终浓度分别为0.024μmol/L、0.08μmol/L、0.02μmol/L、0.07μmol/L、0.08μmol/L、0.4μmol/L、0.04μmol/L、0.1μmol/L、0.08μmol/L、0.24μmol/L、0.07μmol/L、0.14μmol/L、0.008μmol/L、0.03μmol/L、0.024μmol/L、0.08μmol/L、0.02μmol/L、0.08μmol/L、0.08μmol/L和0.4μmol/L；Mg2+终浓度为3.0mmol/L，dNTP终浓度为200μmol/L，10×PCR缓冲液5μL，Taq聚合酶用量1-2unit，模板5μL；PCR扩增反应条件如为：95℃预变性5分钟；第一阶段循环反应：95℃变性5秒，53℃
退火10秒，72℃延伸12秒，共进行32个循环；最后72℃延伸2分钟。
[0047] 其中，步骤(3)所述杂交反应包括如下步骤：a.用1.5×TMAC将微球稀释成微球工作液，分装微球工作液33μL/管至PCR管中，微球数达每管含每种探针偶联微球400个以上；b.每个PCR管管中加入5μL-10μL PCR产物，加1×TE(PH8.0)至总体积为50μL，涡旋振荡全速震荡30秒；c.将PCR管放入PCR仪，在PCR仪上进行杂交反应，杂交反应条件为：95℃变性5分钟，58℃杂交反应20分钟，4℃停留。
[0048] 本发明的有益效果在于：
[0049] 本发明提供一组用于同步检测驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊十种动物源成分的引物对、探针和检测方法，能够用于同时检测十种动物源成分，从而达到鉴别区分其它物种的目的。本发明相较于单一的物种检测方法或几种物种的多重检测方法，一管就可以完成10种动物源成分的PCR扩增，成本至少降低了30％-90％，同时显著降低了检测时间，节约了人
力资源和试剂成本。
具体实施方式
[0050] 液相芯片技术是20世纪90年代中期美国Luminex公司开发出的一种具有多指标同步分析(flexible Multi-Analyte Profiling，xMAP)功能的新型生物芯片技术，也称为微球悬浮芯片技术，其与传统固相芯片技术在材料方面的主要区别是采用采用直径仅为5.6μM的聚苯乙烯乳胶微球作为基质，使得反应体系由传统的液相-固相反应转变为接近生物系统内部环境的液相反应体系，使反应效率显著提高。xMAP液相芯片技术能够高通量检测核酸、蛋白等生物大分子，其检测速度、特异性和敏感性均超越传统芯片技术，具有高效、快速、稳定、准确、可同步、重复性好、抗干扰能力强等优点。xMAP液相基因芯片检测全程包括多重核酸扩增、多重微球悬浮杂交、荧光显色反应与信号检测几个步骤，可连续自动检测96个样品或通过接续编程自动检测更多样品，每个样品的上机检测时间根据检测目标的数量(单重或多重)只需十几秒至几分钟，操作简单易掌握。xMAP液相芯片技术能够从同步检测靶标数量和自动化检测样品数量两方面体现高通量快速检测，是一种性价比高的适合临床应用的技术。
[0051] 根据检验检疫工作的要求，我们
选定驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊10种动物源成分进行同步检测。
[0052] 本发明针对肉类产品等动物源食品和饲料中常见动物物种检测鉴别需求，显著提高检测鉴定的效率并降低成本，为食品和饲料质量把关、打击制假售假行为以及进出口监管工作提供重要技术
支撑，以提升监管效能、更好保护消费者权益和健康安全，并促进食品、农产品生产加工和饲料产业的健康发展。本发明经过大量实验、验证，建立了一种基于Luminex xMAP(Multi-Analyte Profile)聚苯乙烯微球悬浮芯片技术原理的十重液相基因芯片方法，实现了同步检测驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊十种动物源成分。
[0053] 为了实现同时对十种动物源成分进行检测，必须保证十种动物源成分所采用的引物对的PCR扩增特异性好，无非特异性PCR扩增产物，同时探针与扩增产物的杂交特异性强，不同的探针和PCR产物相互之间不存在交叉反应，否则，容易出现假阳性结果。我们在设计引物和探针时首先从NCBI下载了数百种动物源成分的线粒体相关基因序列，然后经过大量的生物信息学分析比对，最终选取了十种动物源性成分的特异性靶基因，然后在此
基础上进行了引物和探针的设计。引物和探针的设计遵循了严格的特异性和保守性，引物只能扩增相对应的物种的核酸，探针只能与相应的物种的PCR产物杂交，探针和引物的特异性通过碱基序列以及其溶解
温度严格控制。同时为了避免十重PCR产生由于引物间相互
配对形成引物二聚体，我们在设计引物时还要进行序列比对，避免PCR过程中形成引物二聚体，而为了提高某些引物和探针的特异性，我们还在序列中引入了简并碱基和
锁核酸修饰碱基。为了建立本发明描述的方法，我们首先需要大量的阳性样本筛选出最特异的引物和探针，然后再在此基础上进行非十重非对称PCR反应条件的优化，通过大量的实验最后筛选出最优的引物、探针浓度以及PCR反应体系和杂交体系。
[0054] 本发明提供一种用于检测实现了同步检测驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊十种动物源成分检测的核酸液相芯片方法，该方法包括：(1)样品中的核酸提取；(2)不对称十重PCR扩增；(3)十重xMAP微球悬浮基因芯片(液相基因芯片)检测。
[0055] 该方法具有快速、高通量、特异性好、灵敏度高和成本低等优势。
[0056] 为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
[0058] 线粒体基因组序列在种属中核酸序列保守，非常适合用于动物源成分的鉴别，因此首先需要筛选出检测驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊十种动物源成分的特异目标基因。首先从GenBank
数据库中分别下载十种动物源成分的线粒体基因组序列100条左右，然后采用生物信息学
软件分别进行多序列比对分析，选取特异性好的保守区序列，再将此序列进行种属间的比对，最后分别筛选出了用于十种动物源性成分检测的靶基因。其中犬、鹿和羊选取细胞色素b作为靶基因；猪和狐狸选取D-Loop作为靶基因；鸡和水貂选取12s rRNA作为靶基因；驴、马和牛分别选取16S rRNA、ATP合成酶F0亚基和28s rRNA作为靶基因。
[0059] PCR设计采用Array Designer 4.0和DNAMAN 7辅助进行，设计引物的原则主要有确保每种动物源性成分的引物3'端与其目的物种靶基因能完全匹配，而与其它物种的序列至少存在2个以上的不匹配，而且引物引物序列尽可能的短，从而PCR在严谨控制退火温度的条件下，只能特异性的扩增该目的物种的基因序列。另外，十种动物源性成分PCR特异性引物的退火温度基本一致，因此能采用相同的PCR扩增条件。而杂交探针的设计也是首先保证其与该类动物源性成分序列完全匹配，而与其它动物源性成分在探针的中间存在至少2个以上的不匹配，从而保证了杂交探针的特异性，并且设计时十种动物源性成分的特异杂交探针的退火温度基本一致，这样就可以采用同样的杂交检测条件。探针序列中掺入锁核酸可以提高探针的退火温度和特异性，我们在设计狐狸探针的过程中引入了锁核酸修饰。按照上述设计原则，通过序列分析分别设计出驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊十种动物源成分特异的引物序列和杂交探针序列，采用NCBI的Blast在线分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对拟选用的探针和引物组合进行序列同源性和适配性分析评估，并通过大量实验测试，最终筛选确定出驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊十种动物源成分的引物和杂交探针，其中狐狸的杂交探针引入两个锁核酸，所有动物源性成分的PCR引物和杂交探针序列如表1和2中所示，引物中所有下游引物的5’端标记生物素，探针的5’端C12标记氨基，其中狐狸杂交探针中的+T和+A表示锁核酸。
[0060] 表1 PCR引物组成及浓度
[0061]
[0062] 注：Y，C/T简并；R，A/G简并；下游引物5’端采用生物素标记。
[0063] 表2 杂交探针序列
[0064]物种名称 引物名称 引物序列
驴 SEQ ID No.21 CCAATAATAGACTCAGACTAACT
鸡 SEQ ID No.22 GTAGTCGCCCACTTCCACTA
牛 SEQ ID No.23 AGCACGAAAGTTATTATGAAA
鹿 SEQ ID No.24 ATACCGATCACCAGCACAA
犬 SEQ ID No.25 CACTATACATCGGACACAGC
狐狸 SEQ ID No.26 GACATRCTA+TGTTTA+ATCTTACA
马 SEQ ID No.27 ATAACAAAACACTCTGCCCC
水貂 SEQ ID No.28 CTCAAGCAACTCATCCAAA
猪 SEQ ID No.29 AAACACTTACTTAAATACGTGCTAC
羊 SEQ ID No.30 ACCTCCTAAAATGAAGACA
[0065] 注：R，A/G简并；+T，+A为LNA碱基，5’端标记氨基。
[0066] 实施例2液相芯片检测方法的建立和优化
[0067] 本发明提供的包括驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊十种动物源成分的液相芯片检测方法主要包括核酸提取、多重PCR不对称扩增和微球杂交检测三个步骤。其中核酸提取可以采用商业化的核酸提取试剂盒，如QIAGEN公司的核酸提取试剂盒。因此不对称多重PCR扩增和微球杂交方法的建立和优化是关键。
[0068] 1、不对称多重PCR扩增，主要是优化引物的序列以及用量、PCR反应体系和扩增条件。通过对引物的序列筛选、引物浓度的优化、Taq和Mg2+浓度的优化以及退火温度和时间的筛选，我们建立最优的不对称十重PCR反应体系和PCR扩增条件，优化后的PCR反应体系和PCR扩增条件分别如表3和表4所示。
[0069] 表3 优化后的PCR反应体系
[0070]
[0071] 表4 优化后的PCR扩增条件
[0072]
[0073] 2、微球杂交，主要进行杂交温度和时间、洗涤条件以及SAPE报告液工作浓度和时间的最佳参数摸索。根据本
发明人的技术经验和大量的比对试验，建立了最佳的杂交反应条件，具体如下进行：
[0074] 1)将带有氨基的寡核苷酸探针偶联到带有COOH的聚苯乙烯乳胶微球。
[0075] 将如表2所示的十种寡核苷酸探针分别偶联到不同编码微球上，序列分别如SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示，5’端标记氨基，其中狐狸杂交探针中的+T和+A表示锁核酸。
[0076] 这一步骤按Luminex公司提供的标准程序进行探针偶联，偶联好探针的微球可在4℃保存1年以上，可随时取出进行后续微球杂交检测。
[0077] 2)对上述十重不对称PCR扩增产物进行十重微球悬浮杂交检测。
[0078] 主要过程包括：配制十种偶联微球
混合液，加入5-10μL上述的PCR扩增产物，在PCR仪上按以下优化的微球杂交反应条件进行杂交反应；反应结束后，加入TMAC-SAPE报告液，温育。
[0079] 优化的微球杂交反应条件如下：
[0080] a.用1.5×氯化四甲铵(Tetramethylammonium chloride，TMAC)缓冲液将微球稀释成微球工作液，分装微球工作液33μL/管至PCR管中，包含上述10种偶联了不同通用探针的微球，微球数达每管含每种探针偶联微球400个以上；
[0081] b.每管中加入10μL PCR产物，加1×TE(PH8.0)至总体积为50μL，涡旋振荡全速震荡30秒，按下列条件进行杂交反应；
[0082] c.将PCR管放入PCR仪，在PCR仪上进行杂交反应，杂交反应条件为：95℃变性5分钟，58℃杂交反应20分钟，4℃停留；
[0083] d.杂交反应结束，取出反应管，每管加入100μL 1×TMAC溶液，然后，置离心机，13000rpm离心4分钟，小心吸弃上清，收集微球沉淀；
[0084] f.用1×TMAC洗涤微球1-2次，每次加入100μL 1×TMAC，振荡混匀，13000rpm离心4分钟，小心吸弃上清；同时用1×TMAC将链亲和素藻红蛋白(Streptavidin-phycoerythrin，SAPE)稀释至3.3μg/mL，配制TMAC-SAPE报告液；
[0085] g.在每管微球沉淀中，加入75μL的TMAC-SAPE报告液，振荡混匀；
[0086] h.置恒温混匀仪，58℃温育6min，温育期间设振荡速度为300rpm；
[0087] i.上机检测：取完成上述杂交反应的微球反应液，用LuminexTM 200system液相芯片仪或其他等效设备测量MFI值。
[0088] g.检测结果的判定
[0089] g-1本底值的测定：每次检测同时设3个空白对照样品，对空白对照样品同步进行不对称十重PCR扩增和十重微球悬浮杂交，在空白样品反应体系中，以扩增反应用水取代核酸模板，其余试剂成分与反应条件与检测样品一致；计算3个空白对照样品的MFI值平均值，作为本底值；
[0090] g-2结果判定：设被检样品的MFI值大于5倍本底值为判定
阈值；被检样品检测结果达到判定阈值判为阳性，否则判为阴性。
[0091] 实施例3十重液相基因芯片方法的灵敏度和特异性试验
[0092] 1、灵敏度试验
[0093] 采用本发明实施例2中建立的十重液相基因芯片方法对驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊十种动物源性成分样品的基因组核酸分别进行了灵敏度检测，检测结果详见下表5。
[0094] 表5 灵敏度试验结果
[0095]
[0096] 备注：1，鸡为白鸡、乌鸡和火鸡基因组DNA的等量混合；2，牛为牦牛、水牛和黄牛基因组DNA的等量混合；3，羊为
绵羊和山羊基因组DNA的等量混合。
[0097] 从表5可以看出，本
申请提供的十重液相基因芯片方法对于这十种动物均具有明显大于阈值的MFI值，说明该十重液相基因芯片方法对于上述动物具有足够高的灵敏性。
[0098] 2、特异性试验
[0099] 采用本发明实施例2中建立的十重液相基因芯片方法对驴、15种阳性物种的生肉样本(黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、鹿、驴、犬、猪、狐狸、水貂、白鸡、乌鸡、火鸡)以及3种阳性物种的标准物质分别进行了特异性检测，详细检测结果详见下表6。
[0100] 表6 特异性试验结果
[0101]
[0102]
[0103] 备注：1，贝类混样为扇贝，蛤蜊和象拔蚌的肉组织；2，
植物蛋白粉为大豆，小麦和豌豆蛋白
[0104] 从表6可以看出，该十重液相基因芯片方法对于阳性动物的MFI值都远远超过阈值，而其他动物则低于阈值，说明本发明提供的检测方法的对于这十种动物的检测特异性高。
[0105] 实施例4对临床样品的检测
[0106] 采用本发明实施例2中建立的十重液相基因芯片方法对对商品化的55份饲料样品和69份肉食品进行检测，结果显示共有38份样品检测结果与标签成分不一致：55份饲料样品中有19份样品与所标注的成分不完全相同，69份肉食品中有19份样品与所标注的成分不完全相同。对上述38份样品，我们进一步用以下现行标准检测方法进行检测：其中，牛羊成分用现行国标GB/T20190-2006中普通PCR方法进行验证；鸡源性成分用现行行业标准SN/T2978-2011中普通PCR方法进行验证；猪源性成分用现行行业标准SN/T2051-2008中的荧光PCR方法进行验证。检测结果见表7。
[0107] 表7 临床样品检测及与标签成分不一致情况
[0108]
[0109]
[0110] 如表7所示，上述38份样品中，采用标准方法对37份样品的检测结果与本发明方法的检测结果一致，仅有1份样品采用标准方法未能检出鸡成分，这可能是因为本发明方法对鸡成分的检出限高于标准方法的灵敏度(为0.1％)。根据对临床样品的检测方法比对情况，充分说明本发明方法真实可信，灵敏度更高。
[0111] 现行标准中的普通PCR法通常需要3-4h能得出结果，荧光PCR法通常需要2h可得出结果。但是当样本中同时存在两种或以上的动物源性成分时，每份样本则需要进行至少2次及以上的反应，因此至少需要4-6h才能得出结果，而本研究所建立的10重xMAP方法，利用一个反应就可同时检测鉴定样本中10种动物源性成分信息，并且在3h内即可完成。
[0112] 应用本发明方法对上述124份临床样品的检测结果表明，本发明提供的十重液相基因芯片方法能够高效准确检出食品和饲料中各种动物源性成分，可精准鉴别产品中掺假造假动物源成分，能够应用于食品与饲料质量监督把关。
[0113] 相对于常用的国标或其它多重PCR方法，基本上都是单重PCR和二重PCR，而在实际应用中如检测饲料和食品掺假，需要检测多种动物源性成分，以确定是否掺假，掺假哪种动物源成分，而单重PCR和二重PCR在检测多种动物源性成分时，要么需要花费大量的时间要么需要购置大量PCR设备，而现在打击制假售假以及进出口监管工作任务繁重，需要成本更低，速度更快，
精度更高地进行动物源性成分的检测，这为监管部
门提供了更高的要求。
[0114] 本发明提供同步检测十种动物源成分的引物体系、探针及检测方法，可同时检测驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊十种动物成分，可以一次性检测96个样品，具有快速、通量高、特异性好和灵敏度高等优点。
