自然杀伤细胞专利检索-蠕虫病畜牧业专利检索查询-专利查询网

自然杀伤细胞

阅读：594发布：2020-05-12

专利汇可以提供自然杀伤细胞专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及自然杀伤(NK)细胞群，其制备方法及其治疗应用。更具体地，本发明涉及通过增加与NK细胞产生相关的特定转录因子的表达来扩增NK细胞。，下面是自然杀伤细胞专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于扩增NK细胞群的离体方法，包括步骤：
a)将从个体获得的包含造血祖细胞(HPC)的样品与抑制REV-ERB作用的化合物一起培养；
b)在Notch配体存在下培养所述细胞；和
c)体外扩增所述细胞以产生NK细胞群。
2.根据权利要求1所述的方法，其中培养HPC的容器用Notch配体包被。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中Notch配体是δ样配体4(DLL4)，或其保留DLL4功能的片段。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述化合物通过降低REV-ERB活性来增加E4bp4的表达。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述化合物降低REV-ERB-α和/或REV-ERB-β的活性，优选REV-ERB-β的活性。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述化合物降低REV-ERB-α和REV-ERB-β的活性。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述化合物是REV-ERB拮抗剂，优选REV-ERB-α和REV-ERB-β的拮抗剂。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述化合物选自小分子、PROTAC 试剂、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA、反义RNA、适体、抗体、核酶、肽或肽模拟物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述化合物是小分子。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述化合物是SR8278、ARN5187、2-(5-甲基呋喃-2-羰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸乙酯、4-((4-氯苄基)((5-硝基噻吩-2-基)甲基)氨基)-N-苯基哌啶-1-甲酰胺、4-(((1-(4-氟苯基)环戊基)氨基)甲基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯酚、1-(2-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺或1-(4-氟苯基)-N-(3-((l-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺，优选SR8278。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在分离权利要求5(a)的样品中的HPC后不迟于2天加入所述化合物，并且任选地在分离所述HPC后4天或之后存在所述Notch配体。
12.一种用于扩增自然杀伤(NK)细胞群的离体方法，包括：
a)在δ样配体4(DLL4)，或其保留DLL4功能的片段存在下培养从个体获得的包含造血祖细胞(HPC)样品；和
b)在IL-15存在下培养步骤(a)产生的细胞；从而产生扩增的NK细胞群。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在步骤(a)中培养HPC的容器用DLL4配体或其片段包被。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中在步骤(a)中，HPC也在IL-7、Flt3L和/或干细胞因子(SCF)，优选IL-7、Flt3L和SCF的存在下培养。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中步骤(a)和/或步骤(b)在无基质支持细胞存在下进行，优选其中步骤(a)和步骤(b)均在无基质支持细胞存在下进行。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中HPC样品获自骨髓、脐带血和/或外周血。
17.通过权利要求1-16中任一项所述的方法获得的扩增的NK细胞群，其中至少85％的NK细胞是CD56+和CD45+。
18.一种组合物，其包含权利要求17所述的扩增的NK细胞群和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
19.含有抑制REV-ERB作用的化合物和Notch配体作为组合制剂的产品，同时、分别或相继用于通过增加患者体内自然杀伤(NK)细胞的产生的治疗方法中。
20.根据权利要求19所用的产品，其中：
a)所述化合物是根据权利要求2-10中任一项所定义的化合物；和/或
b)所述Notch配体是δ样配体4(DLL4)，或其保留DLL4功能的片段。
21.根据权利要求19或20所用的产品，其中所述治疗方法是治疗选自癌症、传染病(急性或慢性)、自身免疫疾病或与女性不育或妊娠有关的疾病或病症的疾病或病症的方法。
22.根据权利要求19-21中任一项所用的产品，其中所述治疗方法是治疗病毒感染、细菌感染、原生生物感染、真菌感染和/或蠕虫感染的方法。
23.根据权利要求19-22中任一项所用的产品，其与抗体介导的免疫疗法组合使用。
24.根据权利要求23所用的产品，其中所述化合物用于在给予抗体介导的免疫疗法之前、同时或之后给予。
25.根据权利要求19-24中任一项所用的产品，其中化合物是SR8278、ARN5187、2-(5-甲基呋喃-2-羰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸乙酯、4-((4-氯苄基)((5-硝基噻吩-2-基)甲基)氨基)-N-苯基哌啶-1-甲酰胺、4-(((1-(4-氟苯基)环戊基)氨基)甲基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯酚、1-(2-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺或
1-(4-氟苯基)-N-(3-((l-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺，优选SR8278。
26.通过增加有需要的患者中NK细胞数量的治疗方法，包括给予所述患者治疗有效量的如权利要求2-10中任一项所定义的抑制REV-ERB作用的化合物和Notch配体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述Notch配体是δ样配体4
(DLL4)，或其保留DLL4功能的片段。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述化合物和Notch配体与抗体介导的免疫疗法组合使用。
29.一种用于扩增NK细胞群的离体方法，包括步骤：
a)培养从个体获得的包含HPC的样品；
b)使所述样品与导致E4bp4翻译后修饰的化合物接触，从而引起E4bp4活性的增加；和c)体外扩增所述细胞以产生NK细胞群。
30.根据权利要求29所述的方法，其中E4bp4的翻译后修饰是E4bp4的SUMO化和/或磷酸化的减少。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述化合物：
a)减少E4bp4的残基K10、K116、K219、K337和/或K394中的一个或多个，或与其对应的残基，或其任何组合的SUMO化；和/或
b)减少残基S286、S301和/或S454中的一个或多个，或与其对应的残基，或其任何组合的磷酸化。

说明书全文

自然杀伤细胞

技术领域

[0001] 本发明涉及扩增的自然杀伤(NK)细胞群，其制备方法及其治疗应用。更具体地，本发明涉及通过增加与NK细胞产生相关的特定转录因子的表达来扩增NK细胞。

[0002] 发明背景

[0003] 人们对自然杀伤(NK)细胞的兴趣增加，因为其对癌细胞、病原体感染细胞和其他受损细胞具有细胞毒性。NK细胞是固有淋巴细胞(ILC)，特别是大颗粒细胞毒性淋巴细胞，其桥接免疫应答的固有和适应性臂。其占外周血中循环淋巴细胞的10-15％。NK细胞在免疫系统内也具有最高水平的细胞毒活性。因此，改变的NK细胞功能或数量会影响免疫系统对抗感染和癌症的功能。例如，日本的一项大规模研究表明，40岁以上人群中NK细胞水平的降低与癌症发病率显着增加有关。

[0004] 与B细胞和T细胞类似，这些NK细胞源自共同淋巴祖细胞(CLP)，其又来自造血干细胞(HSC)。然而，NK细胞与B细胞和T细胞不同，因为其缺乏特异性细胞表面抗原受体。因此，NK细胞可以在没有事先致敏的情况下杀死癌细胞和病原体感染细胞，使其成为固有免疫应答的一部分。其还通过直接影响适应性免疫应答在肿瘤免疫监视中发挥关键作用。

[0005] NK细胞的活化触发其释放含有颗粒酶的穿孔素和细胞质颗粒。穿孔素在Ca2+存在下聚合以在靶细胞上形成孔。颗粒酶可以使这些孔进入靶细胞，导致DNA片段化和细胞凋亡。NK细胞也可以分泌细胞因子，其引发免疫的适应性臂中的其他免疫细胞的作用。

[0006] 由于NK细胞在针对病原体感染细胞和癌细胞的免疫应答中的重要性，多项临床试验已经测试了NK细胞在过继转移方案中的功效。在过继转移中，从供体血液中分离的NK细胞在体外扩增并在输入受体之前成熟为健康和功能性NK细胞。然而，为了有效，必须筛选NK细胞供体的KIR基因型，其中供体必须与受体具有适当的KIR等位基因多态性以允许识别靶细胞以进行破坏。无论如何，研究发现扩增产物的临床成功率低于预期，杀死癌细胞或感染细胞的能力较低。因此，当前的过继转移方案存在重大障碍。

[0007] 另一种治疗方法是增加内源性NK细胞的数量。一种方法是给予NK细胞发育必需的细胞因子。预测给予IL-2和IL-15可增强NK细胞的发育。IL-2促进NK细胞的增殖和细胞毒性，而IL-15促进NK细胞的发育和扩增。然而，在体内研究中，发现细胞因子仅刺激NK细胞的最小扩增，即使在非常高的剂量下也具有降低的半衰期。此外，由于免疫应答的不适当活化和NK细胞凋亡的诱导，给予的细胞因子常常导致全身毒性。

[0008] 因此，使用常规方法和技术，难以产生大量NK细胞，并且产生具有高细胞毒性的全功能NK细胞甚至更难。目前没有可选择性增加NK细胞数量的药物。因此，需要开发NK细胞产生的新方法；既能离体产生又能在体内产生大量功能性NK细胞用于治疗和研究用途。

[0009] 发明概述

[0010] 自然杀伤(NK)细胞在免疫系统中起关键作用，其可以破坏癌细胞、病原体感染细胞或受损细胞。预计增加NK细胞数量或功能会增加这些细胞的杀伤。现有疗法如NK细胞过继转移和内源性NK细胞的细胞因子增强在其功效方面不是非常成功。

[0011] NK细胞从骨髓中的HSC分化并分布在淋巴组织和非淋巴组织中，包括淋巴结、脾、外周血、肺和肝。需要特定的细胞因子和转录因子来促进HSC发育成NK细胞。每种细胞因子和转录因子必须以精确的时间和浓度存在，以推动从HSC分化成NK细胞。然而，仍然不完全了解控制NK细胞成熟的细胞因子和转录因子的精确等级。

[0012] 本发明人已经表明，Notch 信号传导的消除阻碍了NK细胞产生，并且通过短时间暴露于Notch肽配体，特别是δ样配体4(DLL4)，可以完全挽救来自E4bp4-/-祖细胞的NK细胞发育的完全缺乏。基于这项工作，本发明人开发了一种离体扩增来自造血祖细胞(HPC)的NK细胞的方法，该方法使耗尽降至最低并产生大量功能性NK细胞。

[0013] 本发明人先前已经表明抑制REV-ERB的作用增加了NK细胞的产生。特别地，本发明人证明抑制REV-ERB的作用(例如使用REV-ERB拮抗剂SR8278)增加E4bp4表达，这反过来增加NK细胞的产生。发明人现在已经表明，组合这两种独立机制(使用Notch配体和REV-ERB抑制)导致用于增强NK细胞产生的令人惊讶的有效手段，与现有方法相比，可以更快地产生适合体内治疗用途的大量功能性NK细胞。

[0014] 此外，本发明人现在还表明，E4bp4的翻译后修饰可以调节E4bp4活性。特别地，本发明人已经表明，磷酸化和SUMO化降低E4bp4活性，并且相反地降低E4bp4的磷酸化和/或SUMO化可以增加E4bp4活性。因此，E4bp4的转录后修饰可用于增加E4bp4活性，并因此增加NK细胞产生。

[0015] 因此，本发明提供了用于扩增NK细胞群的离体方法，包括步骤：a)培养从个体获得的包含造血祖细胞(HPC)的样品和抑制REV-ERB作用的化合物；b)在Notch配体存在下培养该细胞；c)体外扩增所述细胞以产生NK细胞群。在一些实施方案中，培养HPC的容器用Notch配体包被。Notch配体可以是δ样配体4(DLL4)，或其保留DLL4功能的片段，或模拟DLL4功能/活性的分子。该化合物可通过降低REV-ERB活性来增加E4bp4表达。在一些实施方案中，该化合物降低REV-ERB-α和/或REV-ERB-β，优选REV-ERB-β的活性。在一些实施方案中，该化合物优选降低REV-ERB-α和REV-ERB-β的活性。该化合物可以是REV-ERB拮抗剂，优选REV-ERB-α和REV-ERB-β的拮抗剂。该化合物可选自小分子、PROTAC 试剂、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA、反义RNA、适体、抗体、核酶、肽或肽模拟物。在一些实施方案中，优选化合物是小分子。该化合物可以是SR8278、ARN5187、2-(5-甲基呋喃-2-羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸乙酯、4-((4-氯苄基)((5-硝基噻吩-2-基)甲基)氨基)-N-苯基哌啶-1-甲酰胺，4-(((1-(4-氟苯基)环戊基)氨基)甲基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯酚、1-(2氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺或1-(4-氟苯基)-N-(3-((l-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺，优选SR8278。可以在分离样品中的HPC后不迟于2天加入化合物，并且任选地在分离该HPC后4天或之后存在Notch配体。

[0016] 本发明进一步提供了用于扩增自然杀伤(NK)细胞群的离体方法，其包括：a)在δ样配体4(DLL4)或其保留DLL4功能的片段，或模拟DLL4活性/功能的分子存在下培养从个体获得的包含造血祖细胞(HPC)的样品，；和b)在IL-15存在下培养步骤(a)产生的细胞；从而产生扩增的NK细胞群。其中在步骤(a)中培养HPC的容器可以用DLL4配体或其片段包被。在一些实施方案中，在步骤(a)中，HPC也在IL-7、Flt3L和/或干细胞因子(SCF)，优选IL-7、Flt3L和SCF的存在下培养。步骤(a)和/或步骤(b)可以在无基质支持细胞存在下进行，在一些优选的实施方案中，步骤(a)和步骤(b)均在无基质支持细胞存在下进行。

[0017] HPC样品得自骨髓、脐带血和/或外周血。

[0018] 本发明还提供了通过任何本发明的方法获得的扩增的NK细胞群，其中至少85％的NK细胞是CD56+和CD45+。

[0019] 本发明进一步提供了一种组合物，其包含本发明的扩增的NK细胞群和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

[0020] 本发明进一步提供含有抑制REV-ERB作用的化合物和Notch配体的产品作为组合制剂，通过增加患者体内自然杀伤(NK)细胞的生产，用于同时、分别或相继用在治疗方法中。在一些实施方案中：a)该化合物是如本文所定义的化合物；和/或b)该Notch配体是δ样配体4(DLL4)、其保留DLL4功能性片段、或模拟DLL4的功能/活性的分子。该治疗方法可以是治疗选自癌症、传染病(急性或慢性)、自身免疫疾病或与女性不育或妊娠有关的疾病或病症的疾病或病症的方法。该治疗方法可以是治疗病毒感染、细菌感染、原生生物感染、真菌感染和/或蠕虫感染的方法。用于本发明的产品可以与抗体介导的免疫疗法组合使用。在用于本发明的产品的一些实施方案中，该化合物和/或Notch配体用于在给予抗体介导的免疫疗法之前、同时或之后给予。该化合物可以是SR8278、ARN5187、2-(5-甲基呋喃-2-羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸乙酯、4-((4-氯苄基)((5-硝基噻吩-2-基)甲基)氨基)-N-苯基哌啶-1-甲酰胺，4-(((1-(4-氟苯基)环戊基)氨基)甲基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯酚、1-(2-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺或1-(4-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺，优选SR8278。

[0021] 本发明还提供了通过增加有需要的患者中NK细胞数量的治疗方法，包括给予该患者治疗有效量的抑制REV-ERB(如本文所定义)的作用的化合物和Notch配体。Notch配体可以是δ样配体4(DLL4)，或其保留DLL4功能的片段。在这些方法中，化合物和Notch配体可以与抗体介导的免疫疗法组合使用。

[0022] 本发明进一步提供了一种扩增NK细胞群的离体方法，包括以下步骤：a)培养从个体获得的包含HPC的样品；b)使所述样品与导致E4bp4翻译后修饰的化合物接触，从而引起E4bp4活性的增加；和c)体外扩增该细胞以产生NK细胞群。所述E4bp4的翻译后修饰通常是E4bp4的SUMO化和/或磷酸化的减少。在一些实施方案中，该化合物：a)在E4BP4的残基K10、K116、K219、K337和/或K394中的一个或多个或与其对应的残基或其任何组合处减少SUMO化；和/或b)在残基S286、S301和/或S454中的一个或多个或与其对应的残基或其任何组合处减少磷酸化。

[0023] 附图简要说明

[0024] 图1：NK细胞发育途径。NK细胞从造血干细胞(HSC)分化。NK细胞从HSC发育成共同淋巴祖细胞(CLP)、NK祖细胞(NKP)、未成熟NK(iNK)细胞、成熟NK(mNK)细胞并最后成为在血流中循环的常规NK(cNK)细胞。在该途径图下方是NK细胞发育所需的细胞因子和转录因子。IL-15是NK细胞发育所需的主要细胞因子之一。其他是图中所示转换所需的转录因子。

[0025] 图2：(A)E4bp4在稳定表达6His-SUM01，6His-SUM02或6His-SUM03的HeLa细胞中表达。在变性条件下通过Ni2+亲和色谱纯化蛋白质提取物，并通过蛋白印迹法分析。将输入样品在Laemlli样品缓冲液中裂解并直接比较。(B)FLAG-E4bp4在6His-SUM01，6His-SUM02和6His-SUM03HeLa细胞中表达，并且抗-FLAG抗体用于在蛋白印迹法分析之前免疫沉淀
E4bp4。灰色箭头表示未修饰的E4bp4，黑色箭头表示具有较高分子量的SUMO修饰形式的E4bp4。两者都代表三个独立实验。

[0026] 图3：(A)基于Ψ-K-x-E基序存在的潜在E4bp4 SUMO修饰位点。星号突出显示完全保守的残基，点突出显示部分保守的残基。指示序列中最后一个氨基酸的位置。(B)在6His-SUM02HeLa细胞中表达缺乏SUMO化位点的E4bp4的突变形式(赖氨酸至精氨酸点突变)，并且在变性条件下通过Ni2+亲和层析纯化蛋白质提取物，并通过蛋白印迹法分析。灰色箭头突出显示未修饰的E4bp4，黑色箭头突出显示具有更高分子量的SUMO修饰形式的E4bp4，代表三个独立实验。(C)在K219处修饰的E4bp4肽SUM02/3的质谱鉴定。FLAG-E4bp4在293T细胞中表达，使用抗FLAG免疫沉淀从全细胞裂解物中纯化，并通过胰蛋白酶和Glu-C连续消化。纯化E4bp4肽并通过LC-MS/MS分析，并且通过在赖氨酸侧链上存在GGTQQQFV修饰来鉴定SUMO化的肽。在m/z 853.95处+2离子的注释CID串联质谱，图中显示了鉴定的肽的示意图，其中检测到的b和y离子由E4bp4肽和SUMO标签的片段化标记。

[0027] 图4：从E4bp4-/-(A)或E4bp4+/+(C)小鼠BM中分离Lin-BM细胞，并在IL-7、Flt3-L和SCF存在下培养两天，然后用MSCV-IRES-hCD2构建体进行逆转录病毒转导。将转导的细胞培养3天，然后转移到OP9基质细胞上并在IL-15存在下培养7天。(A，C)流式细胞术分析鉴定了hCD2+(转导的)细胞和NK1.1+CD19-NK细胞的存在。(B，D)归一化为WT形式E4bp4(B)或空载体(D)的E4bp4突变体之间NK细胞产生的相对水平。数据代表每种突变体的四个独立实验。误差条显示SEM。*，P＜0.05。

[0028] 图5：(A)E4bp4蛋白质的示意图，显示通过LC-MS/MS鉴定的磷酸化位点的位置。显示了E4bp4的保守结构域结构(未按比例)，已通过序列同源性和突变研究鉴定50。(B，D)从E4bp4-/-(B)或E4bp4+/+(D)小鼠BM中分离Lin-BM细胞，并在IL-7、Flt3-L和SCF存在下培养2天，然后用MSCV-IRES-hCD2构建体进行逆转录病毒转导。将转导的细胞培养3天，然后转移到OP9基质细胞上并在IL-15存在下培养7天。流式细胞术分析鉴定了hCD2+(转导的)细胞和NK1.1+CD19-NK细胞的存在。(C，E)归一化为WT-型E4bp4(C)或空载体(E)的E4bp4突变体之间NK细胞产生的相对水平。数据代表每种突变体的三个独立实验。误差条显示SEM。*，P＜0.05。

[0029] 图6：在m/z 699.77处+2离子的注释CID串联质谱，证实了在S286处E4bp4的磷酸化。使用来自纯化的FLAG-E4bp4的电喷雾电离LTQ/Orbitrap质谱仪获得串联质谱。FLAG-E4bp4在HEK-293T细胞中表达，并通过用抗FLAG M2亲和树脂免疫沉淀纯化，并使用3X FLAG肽竞争性洗脱纯化的蛋白质。用胰蛋白酶消化纯化的E4bp4，并使用TiO2珠进行磷酸肽富集以减少来自未磷酸化的E4bp4肽的背景。突出显示光谱的某些区域的放大率。光谱是具有标记的鉴定离子的片段化肽的示意图。

[0030] 图7：在m/z 656.83处+2离子的注释CID串联质谱，证实了在S301处E4bp4的磷酸化。方法的细节如图6所示。

[0031] 图8：在m/z 526.76处+2离子的注释CID串联质谱，证实了在S301处E4bp4的磷酸化。方法的细节如图6所示。

[0032] 图9：(A)将稳定表达E4bp4、5X-SUMO和S286-353A的3T3细胞用环己酰亚胺(CHX，50μg/ml)处理指定的时间。蛋白印迹法用于比较核提取物。(B)使用密度计从蛋白印迹法信号中定量相对E4bp4表达。在信号相对于组蛋白H3的标准化归一化后，E4bp4的水平以任意单位表示。(C，D)使用E4bp4共有结合位点下游的萤火虫萤光素酶基因的转录报告基因测定。在用MSCV-E4bp4-IRES-hCD2和萤火虫荧光素酶构建体转染的3T3细胞48小时后测量相对萤光素酶活性。数据代表每种突变体的10个独立实验。(E)用载体对照、E4bp4、5X-SUMO或S286-353A转导MNK-1细胞。通过QPCR测定Eomes、Gata3、Tbet和Notch1的表达。数据代表每种突变体的三个独立实验。误差条显示SEM。*，P＜0.05。

[0033] 图10：Notch1是NK细胞中E4bp4的转录靶标。(A)Notch1基因座，其显示通过E4bp4最小共有结合序列TTA(T/C)(G/A)TAA(C/T)的存在鉴定的预测的E4bp4结合位点的位置。填充盒＝外显子；透明框＝UTR区(B)在用FLAG-E4bp4稳定转导的MNK-1细胞的染色质中Notch1基因座处的E4bp4结合的ChIP分析。E16是针对E4bp4的多克隆抗体，M2是针对FLAG的单克隆抗体。Per2B用作阳性对照，基因沙漠用作阴性对照。数据代表三个生物学重复。误差条显示SEM。*，P＜0.05。(C)在Lin-BM细胞中Notch1表达的QPCR分析。数据代表六个生物学重复。误差条显示SEM。*，P＜0.05。

[0034] 图11：早期的Notch信号传导可以在无E4bp4存在下诱导NK细胞发育。(A)用于诱导-Notch信号传导并促进来自Lin BM细胞的NK细胞发育的培养系统的示意图。(B)在指定的OP9或OP9-DL1基质细胞组合上培养后NK细胞产生的流式细胞术分析，或(C)在空板或用重组rDLL1/rDLL4包被的板上。首先将Lin-BM细胞在IL-7、Flt3L、SCF中培养7天，然后转移到新平板上用于在IL-15中培养。数据代表四个(B)或两个(C)生物学重复。(D)慢病毒转导后-
Cre介导的Rbpj基因缺失后来自LinBM细胞的NK细胞发育的两阶段培养的示意图。(E)源自从Rbpj floxed小鼠分离并用空的或Cre表达的慢病毒载体转导的Lin-BM的NK细胞产生的流式细胞术分析。将细胞单独在OP9基质细胞上培养或在rDLL4包被的平板上培养，然后如图所示转移至OP9。显示的数据是针对hCD2表达门控的细胞。

[0035] 图12：REV-ERB拮抗作用和Notch配体rDLL4之间的协同作用。(A)用指定的SR8278和rDLL4组合培养后NK细胞产生的流式细胞术分析。(B)该图显示了针对不同条件的成熟(NK1.1+NKp46+)NK细胞的百分比。

[0036] 图13：测试REV-ERB拮抗剂SR8278和重组Notch配体rDLL4对NK细胞产生是否存在协同作用的实验设计。

[0037] 图14：REV-ERB拮抗作用和Notch配体rDLL4之间的协同作用。该图显示了针对各种条件成熟(NK1.1+NKp46+)NK细胞的百分比(如图13所示)。条件f显示最强的效果。误差条显示SEM。*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001；****，P≤0.0001。这些数据代表生物学重复的技术一式三份。

[0038] 图15：暴露于Notch配体极大地加速了来自人CD34+脐带血的表型成熟的人NK细胞的产生。该图显示了在对照条件下(浅灰色条)或在rDLL4上(深灰色条)培养的人CD34+细胞的成熟(CD46+/CD56+)NK细胞相对于时间的百分比。

[0039] 发明详述

[0040] 自然杀伤细胞

[0041] 自然杀伤(NK)细胞在免疫系统内具有最高水平的细胞毒活性。NK细胞与B细胞和T细胞相似，但缺乏特异性细胞表面抗原受体。相反，NK细胞具有识别基序的活化和抑制受体。

[0042] NK细胞在血液和外周淋巴器官如淋巴结和脾脏中循环。其可被细胞因子或遇到靶细胞活化。靶细胞的识别和消除基于抑制和活化信号之间的平衡。活化信号由与配体结合的活化受体(NKG2D，NKp46，NKp30)产生，配体不仅存在于癌细胞、病原体感染细胞和受损细胞上，而且还存在于健康细胞上。另一方面，当NK细胞上的抑制性受体(KIR，CD94/NKG2A)与通常存在于所有健康细胞上的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子结合时，产生抑制信号。靶细胞上的MHC I类分子不存在或极度下调，使其成为理想的NK细胞靶标。这使得NK细胞能够区分靶细胞和健康细胞。为了使NK细胞识别并杀死靶细胞，总体活化信号必须大于抑制信号。

[0043] NK细胞识别并杀死癌细胞、病原体感染细胞和受损细胞，而无需事先致敏，使其成为固有免疫应答的一部分。例如，NK细胞提供对病毒感染的早期应答，在T细胞杀死感染细胞之前发生。NK细胞可以在几分钟内杀死靶细胞。NK细胞还分泌细胞因子并“武器化”免疫系统的其他部分。例如，NK细胞促进T细胞效应子功能并增强抗体导向细胞的细胞毒性(ADCC)。

[0044] NK细胞通过图1所示的途径与造血干细胞(HSC)分化。更详细地，NK细胞从HSC发育成共同淋巴祖细胞(CLP)、前身NK祖细胞(前身NKP)细胞、NK祖细胞(NKP)细胞、未成熟NK(iNK)细胞、成熟NK(mNK)细胞并最后成为常规NK(cNK)细胞，其在血流中循环。尽管该术语源自小鼠中的NK细胞发育，但是相应的途径发生在人NK细胞发育中。例如，在发育成成熟NK细胞(阶段4和5)之前，HSC通过前体的多个阶段(阶段1，2和3)发育。为了一致性，本文使用参考HSC、CLP、前身NKP、NKP、iNK、mNK、cNK和NK细胞。然而，在本发明的上下文中，这些术语可与人类命名法的阶段1-5互换。在图1中的途径图下方是NK细胞发育必需的细胞因子和转录因子。IL-15是NK细胞发育所需的主要细胞因子之一。其他外部因素，例如特定的基质细胞，也是NK细胞发育和成熟所必需的。根据本发明，造血祖细胞(HPC)是包含多潜能祖细胞的异源群体，例如HSC、CLP以及NKP。HPC被称为谱系阴性细胞，因为其尚未致力于发育途径。因此，在本发明的上下文中，HSC、CLP细胞和NKP细胞都是HPC，并且对HPC的提及是对任何HSC、CLP细胞和/或CLP细胞或其任何组合的提及，除非本文明确说明。

[0045] 由于NK细胞在免疫应答中的重要性，多项临床试验已经测试了NK细胞在过继转移方案中的功效。通常这是同种异体转移，NK细胞从健康供体中分离并扩增。然而，靶细胞上MHC I类分子的下调是部分的，来自供体和受体的KIR基因型可能是相似的。因此，即使来自不同个体的NK细胞输入受体，如果其KIR识别MHC I类分子，也可能不附着靶细胞。因此，必须筛选NK细胞供体的KIR基因型，其中供体对受体必须具有适当的KIR等位基因多态性以允许识别靶细胞以进行破坏。此外，发现扩增产物的临床成功率低于预期，杀死癌细胞或感染细胞的能力较低。

[0046] 可以根据其标记物表达，其功能/活性或其组合来定义NK细胞。这些定义是本领域的标准，并且已知可以评估标记物表达和/或NK细胞活性的方法。因此，本领域技术人员将能够使用标准方法和定义容易地将细胞分类为NK细胞。

[0047] 例如，mNK和cNK细胞可以通过其表面标记物CD16(FcγRIII)和/或CD56(通常是人类中的CD16和CD56)和一些小鼠品系中的NK1.1或NK1.2的表达来识别。NKp46是mNK和cNK细胞的另一种标记物，并且在人和几种小鼠品系中表达。因此，NKp46可用作NK细胞的标记物，其具有或不具有CD16和/或CD56(在人中)或具有或不具有NK1.1或NK1.2(在小鼠中)。可用于鉴定/定义根据本发明的NK细胞的标记物的其他实例包括Ly49、天然细胞毒性受体(NCR)、CD94、NKG2、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，和/或白细胞抑制受体(ILT或LIR)，或其任何组合，包括与CD16和/或CD56(在人中)或NK1.1/NK1.2(在小鼠中)的组合。在一些优选的实施方案中，根据本发明的成熟NK细胞(即mNK和cNK细胞)是CD56+和CD45+，并且也可以是CD16+。如本文所用，术语成熟人NK细胞包括CD56bright(阶段4)和CD56dim(阶段5)的NK细胞，两者都是CD56+。成熟NK细胞还可以通过不存在标记物(例如CD34)和淋巴细胞标记物CD3和/或CD19来定义。因此，本发明的成熟NK细胞可以是CD56+、CD45+、CD16+、CD3-和/或CD19-、或其任何组合，例如CD56+、CD45+、CD16+、CD3-和CD19-。

[0048] 另外或或者，NK可以通过其活性来识别/根据其活性来定义。例如，NK细胞可以通过其细胞质内溶细胞颗粒的存在，通过其分泌抗微生物分子如α-防御素的能力和/或其分泌细胞因子如TNF-α，IL-10，IFN-γ和TFG-β的能力来鉴定/定义。

[0049] 除非本文另有说明，否则提及的NK细胞包括iNK、mNK和cNK细胞。通常HSC、CLP细胞和NKP将如此提及。

[0050] 扩增的NK细胞群

[0051] 如本文所公开的，本发明提供了产生扩增的NK细胞群的方法(在本文中可互换地称为扩增的NK细胞群或NK细胞群)。本文关于本发明的NK细胞的任何公开内容也可以应用于本发明的扩增的NK细胞群。

[0052] 因此，本发明提供了扩增的NK细胞群。通常，本发明的扩增的NK细胞群包含iNK细胞、mNK细胞和/或cNK细胞、或其组合。该群可包含HPC，例如HSC、CLP细胞和/或NKP、或其组合，尽管此类细胞的数量通常相对于NK细胞的数量较低，因为这些HPC中的大多数已分化成NK细胞。该群可包含其他免疫细胞和/或非免疫细胞。同样，任何此类细胞的数量通常相对于该群中存在的NK细胞的数量较低。

[0053] 作为非限制性实例，至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多，至多100％本发明的扩增的NK细胞群的细胞可以是NK细胞。通常，至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、或甚至更优选至少95％本发明的扩增的NK细胞群的细胞是NK细胞。

[0054] 在一些实施方案中，至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多，至多100％本发明的扩增的NK细胞群的细胞是成熟的NK细胞(即mNK细胞和/或cNK细胞)。优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少98％或更多本发明的扩增的NK细胞群的细胞是成熟的NK细胞。

[0055] HPC(包括HSC、CLP细胞和/或NKP)的数量可小于扩增的NK细胞群的细胞的40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％。
通常，HPC(包括HSC、CLP细胞和/或NKP)的数量小于扩增的NK细胞群的细胞的20％，优选小于15％，更优选小于10％，甚至更优选小于5％，甚至更优选小于2％或更少。

[0056] 其他免疫细胞和/或非免疫细胞的数量可小于扩增的NK细胞群的细胞的40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％。
通常，其他免疫细胞和/或非免疫细胞的数量小于扩增的NK细胞群的细胞的20％、优选小于
15％、更优选小于10％、甚至更优选小于5％、甚至更优选小于2％或更少。

[0057] 如本文所述，与通过常规过继转移方法制备的NK细胞群相比，通过本发明方法制备的扩增的NK细胞群具有若干优点。特别地，与常规方法相比，本发明的方法能够产生具有更多NK细胞的扩增细胞群。此外，与通过常规方法获得的细胞群相比，其中大量NK细胞“耗尽”，本发明细胞群中更大比例的NK细胞是功能性的，优选是全功能性的。

[0058] 如本文所用，在NK细胞的情况下，术语“耗尽”是指NK细胞或扩增的NK细胞群丧失其至少一些效应子功能，例如细胞毒性功能、细胞因子产生和/或ADCC。因此，耗尽的NK细胞或扩增的NK细胞群可能表现出存活受损、细胞毒性功能受损、细胞因子产生改变或受损和/或ADCC受损。例如，耗尽的NK细胞或耗尽的NK细胞群的效应子功能之一可能减少至少50％。例如，细胞因子分泌减少至少50％，ADCC减少至少50％和/或细胞毒活性减少至少50％。可以相对于本文所定义的任何适当对照来量化这些值。可以使用任何适当的技术来确定效应子功能，并因此对其进行量化和减少。合适的技术是本领域已知的。或者和/或另外，耗尽的NK细胞的标记物表达可改变，例如一种或多种抑制性受体的表达增加(如本文所述)和/或一种或多种活化性受体的表达降低(如本文所述)。在一些实施方案中，NKG2A和/或Tim3的表达增加可用作NK细胞耗尽的标记物。同样，这些标记物的表达可以相对于本文所定义的任何适当对照进行定量。

[0059] 相反，在NK细胞的情况下，术语“功能性”和“全功能性”是指当对给定的免疫挑战应答时，NK细胞或扩增的NK细胞群具有所有预期的效应子功能。因此，(全)功能性NK细胞或扩增的NK细胞群通常具有细胞毒性功能、细胞因子产生和/或ADCC，如当NK细胞应答免疫挑战被活化时在体内观察到的，并且与使用常规方法产生的NK细胞相比，通常表现出增强的存活率。或者和/或另外，(全)功能性NK细胞的标记物表达可改变，例如一种或多种活化性受体的表达增加(如本文所述)和/或一种或多种抑制性受体的表达减少(如本文所述)。作为非限制性实例，功能性(成熟)人NK细胞可以是CD56+和/或CD45+，优选CD56+和CD45+。

[0060] 作为非限制性实例，在与‘靶细胞’共同温育的NK细胞中可以使用脱粒测定法来确定NK细胞的细胞毒性。脱粒测定法包括分析NK细胞群内CD107a的表达。CD107a的量与细胞因子分泌和NK细胞介导的靶细胞裂解相关。还可以分析NK细胞的干扰素-γ(IFN-γ)的表达，其是功能性NK细胞被活化时分泌的主要细胞因子。与对照相比，功能性NK细胞应表达相似或更高的CD107a以及IFN-γ。

[0061] 可以将通过本发明的方法制备的扩增的NK细胞群中NK细胞数/功能的任何增加与从如本文所述的对照方法获得的NK细胞群的NK细胞数/功能进行比较。对照方法可以是本领域已知的用于产生NK细胞群的任何标准方法。例如，对照方法可以使用常规的过继转移技术，而不是使用根据本发明的REV-ERB抑制剂的方法。通过此对照/标准方法产生的NK细胞和NK细胞群可用作本文所述的对照细胞和细胞群。

[0062] 由于与常规制备的NK细胞群相比，本发明的扩增的NK细胞群包含显著更少的耗尽的NK细胞，反而包含更高比例的全功能性NK细胞，这有利地允许使用更少数量的细胞来治疗患者。

[0063] 如本文所述，与常规方法相比，本发明的方法产生具有更高比例的(全)功能性NK细胞的扩增的NK细胞群，常规方法产生具有大量“耗尽的”NK细胞的细胞群。通常，在本发明的扩增的NK细胞群中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多，至多100％的本发明的扩增的NK细胞群的NK细胞是(全)功能性的。根据本文的任何定义(例如标记物和/或效应子功能定义)，通常至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少98％或更多的本发明的扩增的NK细胞群的NK细胞是全功能性的。

[0064] 本发明的扩增的NK细胞群可以通过本文所公开的任何方法产生。通常，本发明的扩增的NK细胞群通过本文所公开的离体方法产生。

[0065] Notch配体

[0066] Notch信号传导途径主要与促进T细胞发育和抑制伴随B细胞发育有关。哺乳动物有四种类型的Notch受体-Notch1、Notch2、Notch3和Notch4，它们都是单向异二聚跨膜蛋白。哺乳动物有两种类型的典型Notch配体-Delta型和Jagged型，统称为DSL配体。存在三个δ样配体(DLL)、DLL1、DLL3和DLL4以及两个锯齿状(JAG)配体JAG1和JAG2。DLL和JAG配体通常包含以下结构域：Notch配体(MNNL)结构域的N末端的模块和Delta/Serrate/Lag-2(DSL)结构域，以及许多EGF重复序列。DLL3包含六个EGF重复序列。DLL1和DLL4包含8个EGF重复序列。JAG1和JAG2包含16个EGF重复序列。还有许多非典型配体，其可以是膜结合的或分泌的。

[0067] 除非本文明确说明，否则本文提及的Notch配体是指任何Notch配体，例如Notch1、Notch2、Notch3和/或Notch4的配体，优选至少Notch1的配体。人Notch1的蛋白质序列在SEQ ID NO：51中给出(GenBank登录号CR 457221，版本CR457221.1)。通常，本发明中使用的Notch配体是典型的Notch配体。在一些优选的实施方案中，Notch配体是DLL，更优选DLL4。人DLL4的蛋白质序列在SEQ.ID NO：2中给出(GenBank登录号AF253468，版本AF253468.1)。

[0068] 本文提及的Notch配体也包括其片段，条件是该片段保留其衍生的Notch配体的Notch结合和活化活性。作为非限制性实例，本发明的Notch配体片段可包含长度为170个或更多个连续氨基酸残基或由其组成(例如至少170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、
450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、560、600、610、620、630、
640、650、660、670、680或更多个连续的氨基酸残基长度，至多Notch配体如DLL4的总长度。
通常，Notch配体的功能性片段包含至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％或更多的全长Notch配体，例如DLL4。作为非限制性实例，Notch配体的片段可包含该Notch配体例如DLL4的MNNL结构域和/或DSL结构域。在一些优选的实施方案中，Notch配体片段包含(或由其组成)目标Notch配体的MNNL结构域和DSL结构域，例如DLL4的MNNL结构域和DSL结构域。此类片段的实例包括但不限于以下：(i)Notch配体片段，其包含(或由其组成)目标Notch配体的一部分，其起始于N末端并终止于第一EGF重复末端，也称为Notch配体(N-EGF1)，例如DLL4(N-EGF1)；(ii)Notch配体片段，其包含(或由其组成)目标Notch配体的一部分，其起始于N末端并终止于第二EGF重复末端，也称为Notch配体(N-EGF2)，例如DLL4(N-EGF2)；(iii)Notch配体片段，其包含(或由其组成)目标Notch配体的一部分，其起始于N末端并终止于第三EGF重复末端，也称为Notch配体(N-EGF3)，例如DLL4(N-EGF3)；(iv)Notch配体片段，其包含(或由其组成)目标Notch配体的一部分，其起始于N末端并终止于第四EGF重复末端，也称为Notch配体(N-EGF4)，例如DLL4(N-EGF4)；(v)Notch配体片段，其包含(或由其组成)目标Notch配体的一部分，其起始于N末端并终止于第五EGF重复末端，也称为Notch配体(N-EGF5)，例如DLL4(N-EGF5)；(vi)Notch配体片段，其包含(或由其组成)目标Notch配体的一部分，其起始于N末端并终止于第六EGF重复末端，也称为Notch配体(N-EGF6)，例如DLL4(N-EGF6)；或(vii)Notch配体片段，其包含(或由其组成)目标Notch配体的一部分，其起始于N末端并终止于第七EGF重复末端，也称为Notch配体(N-EGF7)，例如DLL4(N-EGF7)。相比之下，全长DLL4可以称为DLL4(N-EGF8)。
Notch配体片段的优选实例包括Notch配体(N-EGF1)和Notch配体(N-EGF2)，例如DLL4(N-EGF1)和DLL4(N-EGF2)。

[0069] 或者或另外，Notch配体，其片段或模拟Notch配体(例如DLL4)的效应(例如功能/活性)的分子可包含修饰，例如改变(通常增加)其Notch受体的配体/片段/模拟物的亲和力的氨基酸突变。用于鉴定此类修饰的技术在本领域中是已知的。例如，可以使用酵母表面展示来鉴定增加Notch配体/片段/模拟物的亲和力的氨基酸。作为非限制性实例，在目标Notch配体是DLL4的情况下，本发明的DLL4配体、其片段或模拟物可以在以下一个或多个位置包含氨基酸取代：(G)28、(F)107、(N)118、(I)143、(H)194、(L)206和/或(K)215，或其任何组合。在一些优选的实施方案中，本发明的DLL4配体，其片段或模拟物在(G)28、(F)107和(L)206位置，更优选在(G)28、(F)107、(N)118、(I)143、(H)194、(L)206和(K)215位置包含氨基酸取代。作为进一步的非限制性实例，在目标Notch配体是DLL4的情况下，本发明的DLL4配体，其片段或模拟物可以是以下氨基酸取代中的一个或多个：G28S、F107L、N118I、I143F、H194Y、L206P和/或K215E，或其任何组合。在一些优选的实施方案中，本发明的DLL4配体，其片段或模拟物包含氨基酸取代G28S、F107L和L206P，更优选G28S、F107L、N118I、I143F、H194Y、L206P和/或K215E。

[0070] 作为进一步的非限制性实例，DLL4的功能性片段包含至少全长DLL4的残基65-114和179-219，优选保持在正确的构象中以允许与Notch配体相互作用。

[0071] 此外，本发明包括使用模拟Notch配体的效应(例如活性/功能)的分子(本文也称为模拟物)。例如，本发明包括使用模拟所需Notch配体(如DLL4)效应的肽、钉合肽、拟肽和肽模拟物。产生合成肽和肽模拟物(例如拟肽)的方法是本领域已知的，经典和非经典Notch配体的序列也是已知的。因此，对于本领域技术人员来说，使用已知技术并基于已知的Notch配体序列产生合适的分子来模拟所需Notch配体的效应是常规的。作为非限制性实例，肽模拟物可以设计为与Notch(例如Notch1)的关键残基相互作用，其已知参与与DLL4的结合，例如Notch(Notch1)的残基415(E415)、418(L418)、420(A420)、421(N421)、422(P422)、424(E424)、425(H425)、436(F436)、447(P447)、448(R448)、540(E450)、452(D452)、469(D469)、477(I477)、480(P480)中的一个或多个，或其任何组合。

[0072] 本文描述了与REV-ERB抑制剂有关的肽模拟物。该公开内容同样且独立地应用于Notch配体的肽模拟物。

[0073] 本发明的方法可以包括使用能够增加NK细胞产生的任何Notch配体或其片段或模拟其效应的分子，特别是本文所公开的可以与抑制REV-ERB活性的本发明化合物协同作用的分子，或导致E4bp4的翻译后修饰，并因此导致E4bp4活性增加的如本文所公开的化合物。

[0074] 本发明人已经表明E4bp4在体内直接结合Notch1基因的调节区，因此可以增强-/-
Notch的转录调节，并且Notch1表达E4bp4 小鼠显着降低。由此，本发明人发现即使在无关键转录因子E4bp4存在下，Notch配体短期暴露于鼠HSC和非常早期的祖细胞也可促进NK细胞发育。此外，本发明人已经表明Notch配体δ样配体4(DLL4)在刺激NK细胞的扩增方面特别有效。

[0075] 因此，本发明涉及通过将HPC暴露于Notch配体来扩增NK细胞。在本发明的离体或体外方法中，这可包括在Notch配体存在下培养HPC。对于体内方法，这可包括将化合物与Notch配体一起给药。在优选的实施方案中，Notch配体是DLL4，或其保留DLL4功能的片段或变体。

[0076] 在一些实施方案中，本发明的方法包括将HPC暴露于DLL4，或其保留DLL4功能的片段或变体。例如，在本发明的离体或体外方法中，HPC可以在DLL4或其保留DLL4功能的片段或变体的存在下培养。对于本发明的离体和体外方法，通过用Notch配体(例如DLL4或其功能性片段或变体)包被培养HPC的容器(即培养容器)，可以实现NK细胞扩增的增加。

[0077] 本文描述了与REV-ERB抑制剂有关的变体序列。该公开内容尤其适用于Notch配体及其片段/模拟物的变体。本发明的变体Notch配体/片段/模拟物通常至少保留本发明的相应Notch配体/片段/模拟物的活性。因此，例如，本发明的变体DLL4配体或其片段保留了相应的DLL4分子与Notch1结合和/或增强NK细胞产生的能力。因此，变体DLL4配体/片段/模拟物可保留本发明的未修饰的DLL4配体/片段/模拟物的活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至多并包括100％。在一些实施方案中，变体DLL4配体/片段/模拟物具有比相应的未修饰的DLL4配体/片段/模拟物更高的活性。例如，至少110％、至少
120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％或更高活性，与相应的未修饰的DLL4配体/片段/模拟物相比。例如，与相应的未修饰的DLL4配体/片段/模拟物相比，变体DLL4配体/片段/模拟物与Notch1结合的KD值可低至少10倍、低至少15倍、低至少
20倍、低至少25倍、低至少30倍或更低。例如，变体DLL4配体/片段/模拟物与Notch1结合的KD值为小于1μM、小于900nM、小于800nM、小于700nM、小于600nM、小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于200nM、小于100nM、小于90nM、小于80nM、小于70nM、小于60nM、小于50nM或更小，优选小于500nM、小于400nM、小于300nM或更小。在一些实施方案中，相对于相应的未修饰的DLL4配体/片段/模拟物，变体DLL4配体/片段/模拟物可以增加NK细胞的数量，或使NK细胞产生增加至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少3倍或更多倍。与相应的未修饰的DLL4配体/片段/模拟物相比，变体DLL4配体/片段/模拟物可使NK细胞的数量增加至少
10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或更多。这同样适用于本发明的其他Notch配体/片段/模拟物的任何变体。

[0078] 可以标记(labelled/tagged)本发明的Notch配体/片段/模拟物。可以使用任何适当的标签。合适的标签在本领域中是已知的。

[0079] E4bp4

[0080] E4bp4(也称为Nfi13)是基本的亮氨酸拉链蛋白转录因子，其参与调节IL-3表达，并参与协调生物钟。人E4bp4基因的基因组DNA序列在SEQ ID NO：3(Genbank登录号X64318，版本X64318.1)中给出。如图1所示，E4bp4在CLP中表达，并且对于从血液干细胞祖细胞产生NK细胞至关重要。缺失E4bp4基因的小鼠不具有功能性NK细胞，但具有正常数量的T和B细胞。相反，体外HSC中E4bp4的过表达增加了NK细胞的产生。因此，E4bp4是一种谱系承诺因子，控制着来自HSC的NKP的发展(图1)。E4bp4在NK细胞中的关键功能特异于发育途径的早期阶段，因为外周mNK细胞中E4bp4的特异性消除不影响NK细胞数量或对巨细胞病毒感染的应答。此外，E4bp4调节NK细胞发育中必需的其他转录因子，例如Id2和Eomes。

[0081] 尽管已经表明IL-7和IL-15调节E4bp4表达，但关于外在或内在刺激如何影响E4bp4通常知之甚少。由于其结构和功能，转录因子如E4bp4可能难以靶向。例如，其通常缺乏酶活性或辅因子结合位点。本发明人先前已经证明，使用抑制REV-ERB活性的化合物可以增加E4bp4的表达，并且这导致NK细胞数量的增加(参见GB申请号1703476.0，其全部内容通过引用并入本文)。不希望受理论束缚，REV-ERE与卟啉血红素结合，并且正是这种特征被认为使REV-ERB成为可用药物控制的靶标(见下文)。总之，本发明人已经表明，通过靶向REV-ERB并抑制其活性，可以增加E4bp4表达并因此增加NK细胞数量。因此，本发明涉及抑制REVERB作用的化合物，以及其在增加E4bp4表达和因此增加NK细胞数中的用途。

[0082] E4bp4表达的增加

[0083] 因此，本发明提供了用于产生扩增的NK细胞群的离体方法，以及用于在有此需要的患者中增加NK细胞数的治疗方法和应用。如本文所公开的，该方法和应用可涉及使用抑制REV-ERB作用的化合物。通常，该化合物通过增加E4bp4表达起作用。

[0084] 可以相对于对照测量E4bp4表达的增加。因此，可以将HPC样品、扩增的NK细胞群或从根据本发明待治疗的个体/患者获得的样品中E4bp4的表达与对照中E4bp4的表达进行比较。表达可以根据基因和/或蛋白质表达进行定量，并且可以与对照(例如持家基因或蛋白质)的表达进行比较。可以对HPC、扩增的NK细胞群的样品中或从根据本发明待治疗的个体/患者获得的样品中的E4bp4基因、mRNA转录物和/或蛋白质的实际量，例如E4bp4基因、mRNA转录物和/或蛋白质的质量、摩尔量、浓度或摩尔浓度，或每个细胞中mRNA分子的数量进行评估并与来自对照的相应值进行比较。或者，可以将HPC、扩增的NK细胞群的样品中或从根据本发明待治疗的个体/患者获得的样品中的E4bp4基因和/或蛋白质的表达与没有定量一种或多种基因和/或蛋白质的质量、摩尔量、浓度或摩尔浓度的对照的那些进行比较。

[0085] 通常，对照是等效群或样品，其中E4bp4表达没有增加。作为非限制性实例，在用抑制REV-ERE活性的化合物治疗个体/患者以增加E4bp4表达的情况下，合适的对照将是未给予化合物的不同个体或在给予化合物之前的同一个体。用于离体扩增NK细胞的常规方法，包括已知方法，可以认为是根据本发明的对照方法。

[0086] 在本发明的上下文中，提及的增加E4bp4表达可以理解为表示与对照相比E4bp4的表达增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少200％。通常，与对照相比，E4bp4表达增加至少50％、优选至少70％，更优选至少80％、甚至更优选至少90％或更多。

[0087] 提及的增加E4bp4表达可以理解为表示相对于对照E4bp4的表达增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更多。通常，与对照相比，E4bp4基因表达增加至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍或更多。通常，与对照相比，E4bp4蛋白表达增加至少2倍、至少3倍、优选至少5倍、更优选至少6倍或更多。

[0088] 根据本发明的E4bp4基因和/或蛋白质的表达可以通过定量和/或定性分析来确定。通常，基因表达可以用mRNA水平表示。

[0089] 根据本发明的E4bp4基因和/或蛋白质的表达水平包括E4bp4mRNA转录物和/或蛋白质的质量，E4bp4基因、mRNA转录物和/或蛋白质的摩尔量，E4bp4基因和/或蛋白质的浓度，和E4bp4基因和/或蛋白质的摩尔浓度。该表达水平可以以任何适当的单位给出。例如，E4bp4基因和/或蛋白质的浓度可以以pg/ml、ng/ml或μg/ml给出。

[0090] 可以直接或间接测量根据本发明的E4bp4基因和/或蛋白质的表达水平。

[0091] 可以使用任何合适的技术确定根据本发明的E4bp4基因和/或蛋白质相对于对照的相对表达。合适的标准技术是本领域已知的，例如蛋白印迹法，酶联免疫吸附测定(ELISA)和RT-qPCR。

[0092] 与对照相比，E4bp4基因和/或蛋白质的表达水平可以增加至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时、至少42小时、至少48小时、至少54小时、至少60小时、至少72小时、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周。优选地，E4bp4基因和/或蛋白质的表达水平增加至少12至72小时。通常，这是相对于抑制REV-ERB活性的化合物的最后一次给予来评估的。

[0093] 与对照相比，E4bp4基因和/或蛋白质的表达水平可以增加至少1代、至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少10代、至少20代、至少30代、至少40代或更多代培养物中NK细胞前体的传代。E4bp4基因和/或蛋白质的表达水平可以无限地改变。

[0094] REV-ERB

[0095] REV-ERB蛋白是细胞内转录因子核受体家族的成员。人REV-ERBα基因(Nrld1)的mRNA序列在SEQ ID NO：5(Genbank登录号NM_021724，版本NM_021724.4)中给出。人REV-ERBβ基因(Nrld2)的mRNA序列在SEQ ID NO：7(Genbank登录号AB307693，版本AB307693.1)中给出。REV-ERB调节生物钟，并且还涉及软骨破坏的调节。

[0096] 本发明人先前已经证明，抑制REV-ERB活性足以引起E4bp4表达的显着增加，并且这反过来引起NK细胞的扩增，导致NK细胞数量的增加(参见GB申请号1703476.0，其全部内容通过引用并入本文)。抑制REV-ERB活性可以引起NK细胞数量的增加，并且通常所得NK细胞是如本文所定义的(全)功能性的。REV-ERB抑制效应以E4pb4依赖性方式介导。不希望受理论束缚，据信抑制REV-ERB活性导致E4bp4表达增加(E4bp4表达通常被REV-ERB抑制)，并且E4bp4用于刺激NK细胞的产生(如图1所示)。特别地，本发明人先前已经证明小分子SR8278能够结合REV-ERB的卟啉血红素基团，导致REV-ERB活性的抑制和NK细胞数量的增加。

[0097] 因此，在一些实施方案中，本发明涉及抑制REV-ERB作用的化合物，以及其在增加E4bp4表达并因此增加NK细胞数中的用途。

[0098] 抑制REV-ERB活性

[0099] 在一些实施方案中，本发明涉及化合物抑制REV-ERB作用的用途，即抑制REV-ERB活性的化合物。可以通过任何适当的方法抑制REV-REB活性。合适的标准技术是本领域已知的。抑制可以通过任何合适的机制进行，这取决于所用化合物的性质(见下文)，例如，对REV-ERB的任何直接或间接相互作用或抑制的空间干扰。在本发明的上下文中，REV-ERB抑制剂(在本文中可互换地称为REV-ERB拮抗剂)是抑制、降低、抑制或消除REV-ERB作用(无论是部分还是完全)的任何化合物。

[0100] 可以相对于对照测量REV-ERB活性的降低。因此，可以将NK前体或祖细胞、扩增的NK细胞群的样品中或从根据本发明待治疗的个体/患者获得的样品中REV-ERB的活性与对照中REV-ERB的活性进行比较。活性可以用任何合适的术语量化，例如REV-ERB与E4bp4基因的结合，或根据本文所定义的E4bp4表达。可以使用任何适当的技术或方法来定量REV-ERB活性。合适的技术是本领域已知的，例如用于定量报告基因表达的荧光素酶测定法。

[0101] 通常，对照是其中未添加REV-ERB抑制性化合物的等效群或样品，例如从未给予化合物的不同个体获得的样品，或在给予化合物之前的同一个体。用于离体扩增NK细胞的常规方法，包括已知方法，可以认为是根据本发明的对照方法。

[0102] 在本发明的上下文中，提及抑制REV-ERB活性可以理解为表示与对照相比，REV-ERB的活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至多总(100％)抑制REV-ERB活性。与对照相比，REV-ERB活性通常降低至少50％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％或更多。

[0103] REV-ERB的活性可以通过定量和/或定性分析来确定，并且可以直接或间接测量。

[0104] REV-ERB相对于对照的活性可以使用任何适当的技术来确定。合适的标准技术是本领域已知的，例如通过定量E4bp4表达和/或荧光素酶测定。

[0105] 与对照相比，REV-ERB的活性可以被抑制至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时、至少42小时、至少48小时、至少54小时、至少60小时、至少72小时、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周。优选地，REV-ERB的活性降低至少12-72小时。通常，这是相对于抑制REV-ERB活性的化合物的最后一次给予来评估的。

[0106] 与对照相比，REV-ERB的活性可以被抑制至少1代、至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少10代、至少20代、至少30代、至少40代或更多代细胞传代(体内或离体培养或体外培养)。可以抑制REV-ERB的活性和/或可以无限地改变E4bp4基因和/或蛋白质的表达水平。

[0107] 在本发明的上下文中，任何提及的抑制REV-ERB活性可以理解为是指抑制REV-ERBα和/或REV-ERBβ的活性。在优选的实施方案中，REV-ERBα和REV-ERBβ活性受到抑制。因此，本发明涉及抑制REV-ERB活性的化合物，包括抑制REV-ERBα活性的化合物(即REV-ERBα抑制剂，也称为REV-ERBα拮抗剂)和/或抑制REV-ERBβ活性的化合物(即REV-ERBβ抑制剂，也称为REV-ERBβ拮抗剂)。在优选的实施方案中，本发明涉及抑制REV-ERBα和REV-ERBβ活性的化合物(即REV-ERBα和REV-ERBβ抑制剂，也称为REV-ERBα和REV-ERBβ拮抗剂)。

[0108] REV-ERB拮抗剂/抑制剂

[0109] 本发明的REV-ERB抑制性化合物可以对REV-ERB具有特异性。具体而言，应理解该化合物与REV-ERBα和/或REV-ERBβ结合，与任何其他分子，特别是任何其他蛋白质没有显着的交叉反应性。例如，对REV-ERBα和/或REV-ERBβ特异的调节剂将不显示与人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的显着交叉反应性。可以通过任何合适的方法评估交叉反应性。如果抑制剂与另一分子的结合强度为与REV-ERBα和/或REV-ERBβ结合强度的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％，则REV-ERBα和/或REV-ERBβ抑制剂与REV-ERBα和/或REV-ERBβ以外的分子的交叉反应可被认为是显着的。对REV-ERBα和/或REV-ERBβ特异的抑制剂可以以低于其与REV-ERBα和/或REV-ERBβ结合的强度的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、
35％、30％、25％或20％结合另一分子，例如人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶。优选地，抑制剂以低于其结合REV-ERBα和/或REV-ERBβ的强度的20％、低于15％，低于10％或低于5％，低于
2％或低于1％与另一分子结合。

[0110] 本发明的REV-ERB抑制性化合物可具有脱靶效应。脱靶效应是针对除REV-ERB之外的靶标的活性。通常，如果针对非REV-ERB靶标的活性与针对REV-ERB的活性相比不显著，则本发明包括具有脱靶效应的化合物。脱靶效应是否显著可取决于化合物的预期用途。作为非限制性实例，可以对中枢神经系统发挥脱靶效应的化合物对于本文所公开的离体方法中使用的化合物不是显著的，但可能对于本文所公开的体内治疗适应症是显著的(取决于脱靶效应的程度)。可以使用本领域已知的标准方法容易地评估任何可能的脱靶效应的存在和程度。

[0111] 根据本发明可以使用任何合适的抑制剂，例如小分子、PROTAC试剂、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA、反义(单链)RNA、肽和肽模拟物、抗体、适体和核酶。优选的抑制剂包括小分子和PROTAC试剂。

[0112] 小分子

[0113] 如本文所述，小分子可用于抑制REV-ERB活性。如本文所定义，小分子是低分子量化合物，通常是有机化合物。通常，小分子的最大分子量为900Da，可以快速扩散穿过细胞膜。在一些实施方案中，小分子的最大分子量是500Da。通常，小分子的大小为1nm。

[0114] 根据本发明，小分子可以通过与REV-ERB的卟啉血红素部分结合而对REV-ERB活性发挥抑制作用。因此，在一些优选的实施方案中，抑制根据本发明的REV-ERB作用的化合物是与REV-ERB的卟啉血红素部分结合的化合物，因此抑制REV-ERB的活性。或者，小分子可以通过不同的机制起作用，例如，通过结合REV-ERB的非血红素部分。本领域已知用于产生小分子的标准技术，其可以容易地测试如本文所述的REV-ERB抑制活性。

[0115]

[0116] 卟啉血红素的结构

[0117] 在一个优选的实施方案中，本发明涉及小分子1，2，3，4-四氢-2-[[5-(甲硫基)-2-噻吩基]羰基]-3-异喹啉羧酸乙酯，在此称为SR8278作为REV-ERB抑制剂。

[0118]

[0119] SR8278的结构

[0120] 本发明还包括SR8278的变体的用途，其保留了SR8278的REV-ERB抑制功能。

[0121] 任何对REV-ERB活性发挥抑制作用的小分子都可以用作本发明的REV-ERB抑制剂。这种小分子抑制剂也可以与REV-ERB结合。可用作根据本发明的REV-ERB抑制剂的其他小分子的实例包括4-[[[1-(2氟苯基)环戊基]氨基]甲基]-2-[(4-甲基哌嗪-1-基))甲基]苯酚(本文也称为ARN5187)、2-(5-甲基呋喃-2-羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸乙酯、4-((4-氯苄基)((5-硝基噻吩-2-基)甲基)氨基)-N-苯基哌啶-1-甲酰胺、4-(((1-(4-氟苯基)环戊基)氨基)甲基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯酚、1-(2-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺、和1-(4-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺。

[0122]

[0123] ARN5187的结构

[0124]

[0125] 2-(5-甲基呋喃-2-羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸乙酯的结构

[0126]

[0127] 4-((4-氯苄基)((5-硝基噻吩-2-基)甲基)氨基)-N-苯基哌啶-1-甲酰胺的结构

[0128]

[0129] 4-(((1-(4-氟苯基)环戊基)氨基)甲基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯酚的结构

[0130]

[0131] 1-(2-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺的结构

[0132]

[0133] 1-(4-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺的结构

[0134] 本发明还包括ARN5187、2-(5-甲基呋喃-2-羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸乙酯、4-((4-氯苄基)((5-硝基噻吩-2-基)甲基)氨基)-N-苯基哌啶-1-甲酰胺、4-(((1-(4-氟苯基)环戊基)氨基)甲基)-2-((4甲基哌嗪-1-基)甲基)苯酚、1-(2-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺、和1-(4-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺的变体的用途，其变体分别保留ARN5187、2-(5-甲基呋喃-2-羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸乙酯、4-((4-氯苄基)((5-硝基噻吩-2-基)甲基)氨基)-N-苯基哌啶-1-甲酰胺、4-(((1-(4-氟苯基)环戊基)氨基)甲基)-2-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯酚、1-(2氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺、和1-(4-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺的REV-ERB抑制功能。

[0135] PROTAC试剂

[0136] 蛋白水解靶向嵌合体(也称为PROTAC或PROTAC试剂)可用于抑制如本文所述的REV-ERB活性。PROTAC是异双功能小分子，其同时结合靶蛋白和泛素连接酶，从而实现靶的泛素化和降解。更详细地，PROTAC试剂通常包含靶蛋白的配体(在本发明的情况下，REV-ERB)和E3连接酶识别结构域的配体。通过使用这种PROTAC，E3连接酶被募集到PROTAC结合的REV-ERB，诱导泛素从E3连接酶复合物转移到靶蛋白(在本发明的情况下，REV-ERB)。一旦PROTAC诱导了足够程度的靶标泛素化，其就会被蛋白酶体识别和降解。

[0137] 作为非限制性实例，PROTAC试剂可以通过经由接头将E3连接酶的配体与本文所述的小分子抑制剂(优选SR8278)缀合来产生。在一个优选的实施方案中，PROTAC试剂包含E3 RING Cullin连接酶von-Hippel Lindau蛋白(VHL)或cereblon的配体(CRL4E3 RING Cullin连接酶复合物的一部分)其经由接头与本发明的小分子抑制剂连接。在一些特别优选的实施方案中，PROTAC试剂包含经由接头连接的与SR8278连接的E3 RING Cullin连接酶von-Hippel Lindau蛋白(VHL)的配体。在其他特别优选的实施方案中，PROTAC试剂包含经由接头连接的cereblon(CRL4E3 RING Cullin连接酶复合物的一部分)和SR8278。

[0138] 由于其作用机制，PROTAC试剂仅需要靶蛋白的任何配体。在无接头和E3连接酶配体存在下，配体的功能药理学是不重要的。因此，在一些实施方案中，本发明的REV-ERB抑制性PROTAC试剂可包含小分子REV-ERB激动剂作为配体，例如GSK4112(1，1-二甲基乙基N-[(4-氯苯基)甲基]-N-[(5-硝基-2-噻吩基)甲基])甘氨酸酯，SR6452)。

[0139] 双链RNA

[0140] 如本文所述，双链RNA(dsRNA)分子可用于抑制REV-ERB活性。dsRNA分子可用于RNAi中以抑制REV-ERB活性。

[0141] 使用已知技术并基于REV-ERB序列的知识，可以设计dsRNA分子以通过基于序列同源性的相应RNA序列靶向来拮抗REV-ERB。此类dsRNA通常是小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)或微RNA(miRNA)。此类dsRNA的序列将包含与编码REV-ERB的mRNA的一部分的部分相对应的部分。该部分通常与从REV-ERB基因转录的mRNA内的靶部分100％互补，但也可以使用较低水平的互补性(例如90％或更高，或95％或更高)。通常，在一段连续的核酸残基上确定％互补性。例如，本发明的dsRNA分子可以与REV-ERB基因转录的mRNA内的靶部分具有至少80％的互补性，测量至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、或更多个核酸残基，dsRNA分子至多在dsRNA分子全长与本发明的REV-ERB基因转录的mRNA具有至少80％的互补性。

[0142] 在优选的实施方案中，dsRNA是shRNA。可以通过任何适当的方式将ShRNA递送至NK细胞前体。合适的技术是本领域已知的，包括使用质粒、病毒和细菌载体来递送shRNA。通常，使用病毒载体递送系统递送shRNA。在优选的实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。

[0143] 通常，一旦将shRNA递送至NK前体细胞，其便在细胞核中转录和加工。得到的前-shRNA从细胞核输出，然后通过切丁酶进行加工并加载到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。有义(过客)链被降解。反义(引导)链将RISC导向具有互补序列的mRNA。在完全互补的情况下，RISC切割mRNA。在不完全互补的情况下，RISC抑制mRNA的翻译。在此两种情况下，shRNA导致靶基因沉默。

[0144] 在任何合适的序列长度上测量，变体序列可以与本发明的shRNA序列具有至少80％的序列同一性。通常，在一段连续的核酸或氨基酸残基上确定％序列同一性。例如，在至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少
90个、或更多个核酸或氨基酸残基上测量，本发明的变体序列可以与本发明的序列具有至少80％的序列同一性。

[0145] 例如，在至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、或更多个核酸残基上测量，本发明的变体shRNA分子可以与本发明的shRNA分子具有至少80％的序列同一性，变体shRNA分子至多在变体shRNA分子的全长与本发明的shRNA分子具有至少80％的序列同一性。

[0146] 反义RNA

[0147] 单链DNA(ssDNA)分子，也称为反义RNA，可用于抑制如本文所述的REV-ERB活性。

[0148] 使用已知技术并基于REV-ERB基因序列的知识，可以设计反义RNA分子以通过基于序列同源性的相应RNA的靶向来拮抗REV-ERB基因。此反义序列将包含与从REV-ERB基因转录的mRNA的一部分相对应的部分。该部分通常与转录mRNA内的靶部分100％互补，但也可使用较低水平的互补性(例如90％或更高、或95％或更高)。

[0149] 适体

[0150] 适体通常是结合特定靶分子的核酸分子。适体可以在体外完全工程化、易于通过化学合成产生、具有所需的储存性能、并且在治疗应用中引起很少或没有免疫原性。这些特征使其特别适用于药物和治疗用途。

[0151] 如本文所用，“适体”通常是指单链或双链寡核苷酸或此类寡核苷酸的混合物，其中寡核苷酸或混合物能够特异性结合靶标。这里将讨论寡核苷酸适体，但是技术人员将理解，也可以使用具有等同结合特征的其他适体，例如肽适体。

[0152] 通常，适体可包含长度为至少5个、至少10个或至少15个核苷酸的寡核苷酸。适体可包含长度至多40个、至多60个或至多100个或更多个核苷酸的序列。例如，适体可以是5-100个核苷酸、10-40个核苷酸、或15-40个核苷酸长。在可能的情况下，优选较短长度的适体，因为其通常会导致较少的其他分子或材料的干扰。

[0153] 适体可以使用常规方法产生，例如指数富集(SELEX)配体的系统进化技术。SELEX是一种体外进化核酸分子的方法，具有与靶分子的高度特异性结合。其描述于例如US5654151，US5503978，US 5567588和WO96/38579中。

[0154] SELEX方法涉及从寡核苷酸集合中选择核酸适体，特别是能够结合所需靶标的单链核酸。在有利于结合的条件下使单链核酸(例如DNA、RNA、或其变体)的集合与靶标接触，将与混合物中的靶标结合的那些核酸与不结合的靶标分离。将核酸-靶复合物解离，将与靶结合的那些核酸扩增，得到富含具有所需结合活性的核酸的集合或文库，然后根据需要重复这一系列步骤，产生对相关靶标具有特异性结合亲和力的核酸(适体)文库。

[0155] 肽模拟物

[0156] 肽模拟物是模拟天然肽或蛋白质的化合物，其具有与生物靶标相互作用并产生相同生物学效应的能力。在与天然肽相关的稳定性和生物利用度方面，肽模拟物可能优于肽。肽模拟物可以具有为生物功能设计的亲本肽的主链或侧链修饰。肽模拟物类的实例包括但不限于拟肽和β-肽、以及掺入D-氨基酸的肽。

[0157] 抗体

[0158] 如本文所述，抗体可用于抑制REV-ERB活性。

[0159] 如本文所用，术语抗体包括使用单克隆抗体或多克隆抗体，以及单克隆或多克隆抗体的抗原结合片段，或特异性结合REV-ERB的肽。抗体可以是Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd或dAb。

[0160] 变体序列

[0161] 至少80％的序列同一性包括至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、和100％的序列同一性(与本文所提出的每个序列和/或本文所提出的每个SEQ ID NO)。

[0162] 可以使用多种序列比对方法中的任何一种来确定百分比同一性，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如分段逼近法。确定百分比同一性的方案是在本领域技术人员的范围内的常规程序。全局方法从分子的开始到结束对齐序列，并通过将各残基对的总得分相加并通过施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，参见例如Julie D.Thompson等人，CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting，Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice，22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和iterative refinement，参见例如，Osamu Gotoh，Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments，264(4)J.MoI.Biol.823-838
(1996)。局部方法通过鉴定所有输入序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括例如Match-box，参见例如Eric Depiereux and Ernest Feytmans，Match-Box：
A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several
Protein Sequences，8(5)CABIOS 501-509(1992)；Gibbs sampling，参见例如
C.E.Lawrence et al.，Detecting Subtle Sequence Signals：A Gibbs Sampling
Strategy for Multiple Alignment，262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见例如Ivo Van WaIIe et al.，Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of
Highly Divergent Sequences，20(9)Bioinformatics：1428-1435(2004)。因此，自分比序列同一性通过常规方法确定。参见例如Altschul et al.，Bull.Math.Bio.48：603-16，
1986and Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-19，1992。

[0163] 上文提供的特定序列的变体也可以通过列举变体序列和上文提供的特定参考序列之间不同的核苷酸或氨基酸的数目来定义。因此，在一个实施方案中，序列可包含(或由以下组成)核苷酸序列，其在不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个核苷酸位置，例如，在不超过1个核苷酸位置与上文提供的特定序列不同。保守取代是优选的。

[0164] 本发明的变体核酸分子和肽通常仍保留本发明相应分子的活性。因此，例如，本发明的变体shRNA分子保留相应shRNA分子抑制REV-ERB表达的能力。变体shRNA分子可以保留本发明的shRNA分子的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至多且包括100％的调节活性。这同样适用于本发明抑制剂的任何其他变体。

[0165] 可以标记(labelled/tagged)本发明的化合物。可以使用任何适当的标签。合适的标签在本领域中是已知的。

[0166] E4bp4的翻译后修饰

[0167] 如实施例中所示，本发明人已经证明E4bp4的翻译后修饰可以增加E4bp4活性。此外，通过翻译后修饰增加E4bp4活性导致NK细胞数量的增加(如本文所定义)。

[0168] 因此，本发明提供扩增NK细胞群的方法，包括步骤：a)培养从个体/患者获得的包含造血祖细胞(HPC)的样品；b)使该样品与导致E4bp4翻译后修饰的化合物接触，从而引起E4bp4活性的增加；和c)体外扩增该细胞以产生NK细胞群。该方法可以与本文所公开的涉及通过降低REV-ERB活性来增加E4bp4表达的方法，和/或通过在Notch配体存在下培养HPC来增加NK细胞数量的方法一起使用，或独立于本文所公开的方法使用。

[0169] 本发明还提供了一种化合物，其通过增加患者体内NK细胞的产生，导致E4bp4的翻译后修饰用于治疗方法，其中该化合物增加E4bp4活性。本发明进一步提供了通过增加有需要的患者中NK细胞数量来治疗的方法，包括给予该患者治疗有效量的导致E4bp4翻译后修饰的化合物，其中该化合物增加E4bp4活性。同样，该治疗适应症可以与本文所公开的涉及通过降低REV-ERB活性来增加E4bp4表达的适应症，和/或通过在Notch配体存在下培养HPC来增加NK细胞数量的适应症一起使用，或独立于本文所公开的适应症使用。

[0170] 本文关于增加NK细胞数量的方法、在抑制REV-ERB作用和/或Notch配体的化合物的情况下扩增NK细胞的方法、通过该方法产生的扩增的NK细胞群和涉及该化合物和群的治疗适应症的任何公开内容尤其适用于增加E4bp4活性以增加NK细胞数量的公开方法。作为非限制性实例，饲养细胞层、生长因子和/或其他培养条件以及待治疗的疾病在翻译后修饰方面可以与本文所公开的用于REV-ERB抑制和/或Notch配体方面的相同。

[0171] 翻译后修饰的类型

[0172] 所述方法包括任何翻译后修饰，其导致E4bp4活性的增加。翻译后修饰的非限制性实例包括磷酸化、SUMO化、添加疏水基团(例如豆蔻酰化、棕榈酰化)、添加辅因子、添加小化学基团(例如酰化、烷基化、酰胺化、糖基化)、糖化、氨基甲酰化、羰化、化学修饰(例如脱酰胺)和/或结构变化。通常，所述翻译后修饰导致野生型(未修饰的)E4bp4内的一个或多个磷酸化位点处的磷酸化减少和/或野生型(未修饰的)E4bp4内的一个或多个SUMO化位点处的SUMO化减少，或其组合。如本文实施例中所示，野生型(未修饰的)E4bp4通常在残基K10、K116、K219、K337和/或K394中的一个或多个或与其对应的残基或其任何组合处进行SUMO化。通常，野生型(未修饰的)E4bp4至少在残基K219(或相应的残基)处进行SUMO化。或者或另外，野生型(未修饰的)E4bp4通常在残基S286、S301和S353、或与其对应的残基或其任何组合处进行磷酸化。因此，在一些优选的实施方案中，本发明化合物减少、抑制或消除残基K219(或其对应残基)处的SUMO化，和/或减少、抑制或消除残基S286、S301和S353(或对应残基)或其任何组合处的磷酸化。因此，根据本发明，化合物可用于(a)减少E4bp4的残基K10、K116、K219、K337和/或K394中的一个或多个、或其对应残基、或其任何组合处的SUMO化；和/或减少残基S286、S301和/或S454中的一个或多个、或其对应残基、或其任何组合处的磷酸化。

[0173] 本发明包括能够引发E4bp4的翻译后修饰的任何化合物，其中该修饰增加E4bp4的活性。在一些优选的实施方案中，该化合物抑制、减少或消除在野生型(未修饰的)E4bp4中发生的磷酸化和/或SUMO化。任何合适的激酶抑制剂可用于抑制、减少或消除E4bp4的磷酸化。合适的激酶抑制剂是本领域已知的，并且其选择对于本领域技术人员来说是常规的。合适的激酶抑制剂的非限制性实例包括4-(4-(2，3-二氢苯并[1，4]二氧杂环己-6-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺(D4476)和4，5，6，7-四溴-2-氮杂苯并咪唑，4，5，6，7-四溴苯并三唑(TBB)。

[0174] E4bp4活性的增加

[0175] 本发明涉及翻译后修饰E4bp4并因此增加E4bp4活性的化合物的用途。E4bp4活性的增加可以相对于对照来测量。因此，可以将NK前体或祖细胞、扩增的NK细胞群的样品中或从根据本发明待治疗的个体/患者获得的样品中的E4bp4活性与对照中E4bp4的活性进行比较。活性可以以任何适当的术语量化，例如E4bp4的任何下游靶标的表达的增加。可以使用任何适当的技术或方法来量化E4bp4活性。合适的技术是本领域已知的，例如用于定量报告基因表达的荧光素酶测定法。

[0176] 通常，对照是等同的群或样品，其中没有添加化合物用于翻译后修饰E4bp4，例如从未给予化合物的不同个体获得的样品，或者在给予化合物之前的同一个体。用于离体扩增NK细胞的常规方法，包括已知方法，可以认为是根据本发明的对照方法。

[0177] 在本发明的上下文中，提及增加E4bp4活性可以理解为是指相对于对照，E4bp4的活性增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2-倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更多。通常，与对照相比，E4bp4活性至少增加2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍或更多。可以间接测量E4bp4活性，确定NK细胞数量的增加。因此，相对于对照，NK细胞的数量可以增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更多。通常，与对照相比，NK细胞的数量增加至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍或更多。

[0178] E4bp4的活性可以通过定量和/或定性分析来确定，并且可以直接或间接测量。E4bp4相对于对照的活性可以使用任何适当的技术来确定。合适的标准技术是本领域已知的。

[0179] 与对照相比，E4bp4的活性可以增加至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时、至少42小时、至少48小时、至少54小时、至少60小时、至少72小时、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周。优选地，E4bp4的活性增加至少12-72小时。通常，这是相对于最后一次给予翻译后修饰E4bp4的化合物来评估的。

[0180] 与对照相比，E4bp4的活性可以增加至少1代、至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少10代，至少20代，至少30代，至少40代或更多代培养的细胞传代。E4bp4的活性可以无限增加。

[0181] 扩增NK细胞的方法

[0182] 本发明涉及扩增NK细胞群的方法。通常该方法涉及在Notch配体存在下培养NK细胞前体(HPC)。该方法可以是体外、体内或离体的。通常，本发明的方法是离体的。该方法包括含有具有Notch配体的HPC并扩增该细胞以产生NK细胞群。本发明的方法允许NK细胞的快速扩增，减少其培养所需的时间，并因此减少耗尽的风险，当输入患者时增强NK细胞的细胞毒性。

[0183] 当所述方法在体内进行时，该方法是如本文所述的治疗方法。在此类实施方案中，本文关于本发明的治疗适应症和应用的所有公开内容适用于该方法。

[0184] 如本文所公开的，本发明人已经表明Notch配体，特别是DLL4，可用于增强NK细胞的产生。因此，本发明提供了用于扩增NK细胞群的离体方法，其包括：(a)在Notch配体存在下培养从个体/患者得到的包含HPC的样品，其保留该Notch配体功能的片段，或模拟该Notch配体功能的分子；和(b)在IL-15存在下培养步骤(a)产生的细胞；从而产生扩增的NK细胞群。

[0185] 步骤(a)和(b)可以同时或以任何顺序进行。例如，可以首先进行步骤(a)，然后进行步骤(b)，使得细胞首先暴露于Notch配体，然后暴露于IL-15。或者，可以首先进行步骤(b)，然后进行步骤(a)，使得细胞首先在IL-15存在下培养，然后在Notch配体存在下培养。或者，步骤(a)和(b)可以同时进行，使得细胞在Notch配体和IL-15存在下同时培养。优选首先进行步骤(a)，然后进行步骤(b)。

[0186] Notch配体可以是如本文所定义的任何Notch配体(包括其功能片段和模拟目标Notch配体的作用/功能/效应的分子)。通常，Notch配体是DLL4，其保留DLL4功能的片段，或模拟DLL4功能的分子(如本文所定义)。

[0187] 通常在步骤(a)中，在无外源IL-15存在下培养HPC，仅在步骤(b)中添加外源11-15。作为非限制性实例，IL-15可以以约1ng/ml-约100ng/ml、约1ng/ml-约50ng/ml、约1ng/ml-约40ng/ml、约1ng/ml-约30ng/ml、约1ng/ml-约20ng/ml、约1ng/ml-约10ng/ml或更低的浓度使用。在一些实施方案中，IL-15以约50ng/ml、约40ng/ml、约35ng/ml、约30ng/ml、约
25ng/ml、约20ng/ml或约10ng/ml，优选约30ng/ml的浓度使用。

[0188] 额外的外部刺激，例如生长因子和/或细胞因子，可用于进一步增强NK细胞的产生。该外部刺激可以适当地存在于步骤(a)和/或步骤(b)中。合适的外部刺激的非限制性实例包括IL-7、Flt3L、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、IL-3和/或IL-6、或其任何组合。在一些优选的实施方案中，使用IL-7、Flt3L和/或SCF、或其任何组合。更优选使用IL-7、Flt3L和SCF。

[0189] 作为非限制性实例，IL-7可以以约1ng/ml-约100ng/ml、约1ng/ml-约50ng/ml、约1ng/ml-约25ng/ml、约1ng/ml-约10ng/ml或更低的浓度使用。在一些实施方案中，IL-7以约
50ng/ml、约25ng/ml、约20ng/ml、约15ng/ml、约10ng/ml或约5ng/ml，优选约10ng/ml的浓度使用。作为非限制性实例，Flt3L可以以约1ng/ml-约100ng/ml、约1ng/ml-约50ng/ml、约
1ng/ml-约25ng/ml、约1ng/ml-约10ng/ml或更低的浓度使用。在一些实施方案中，Flt3L以约50ng/ml、约25ng/ml、约20ng/ml、约15ng/ml、约10ng/ml或约5ng/ml，优选约10ng/ml的浓度使用。作为非限制性实例，SCF可以以约1ng/ml-约200ng/ml、约1ng/ml-约150ng/ml、约
1ng/ml-约100ng/ml、约1ng/ml-约50ng/ml或更低的浓度使用。在一些实施方案中，SCF以约
150ng/ml、约125ng/ml、约120ng/ml、约110ng/ml、约100ng/ml、约90ng/ml、约80ng/ml或约
75ng/ml，优选约100ng/ml的浓度使用。

[0190] 通常，IL-7、Flt3L和SCF仅在步骤(a)、步骤(b)中或在步骤(a)和(b)中一起使用。在一些优选的实施方案中，在步骤(a)中，在IL-7、Flt3L和/或SCF，更优选IL-7、Flt3L和SCF存在下培养HPC。

[0191] Notch配体(例如DLL4)可以存在于溶液中(例如在培养基中)或用于涂覆培养HPC的容器。优选Notch配体(例如DLL4)用于涂覆培养HPC的容器。作为非限制性实例，Notch配体(例如DLL4)可以以约1μg/ml-约100μg/ml、约1μg/ml-约50μg/ml、约1μg/ml-约25μg/ml、约1μg/ml-约10μg/ml或更低的浓度使用。在一些实施方案中，Notch配体(例如DLL4)以约50μg/ml、约25μg/ml、约20μg/ml、约15μg/ml、约10μg/ml或约5μg/ml，优选约10μg/ml的浓度使用。另外的底物和/或接头可用于促进Notch配体(例如DLL4)与培养容器表面的附着。此类底物的实例是本领域已知的，例如聚-L-赖氨酸。

[0192] 本发明方法的步骤(a)和/或步骤(b)可包括在存在或不存在基质支持细胞或饲养细胞或其群的情况下培养该细胞。如本文所用，术语基质细胞、饲养细胞和基质支持细胞是同义的并且可以互换使用。这种支持/饲养细胞的实例包括但不限于OP9细胞和/或EL08-1D2细胞。通常，步骤(a)在不存在基质支持细胞或其群的情况下进行。在一些优选的实施方案中，步骤(a)和步骤(b)均在不存在基质支持细胞或其群的情况下进行。换句话说，可以进行这些步骤，将本发明的Notch配体(例如DLL4)直接涂覆在组织培养塑料上。

[0193] 步骤(a)和(b)可以具有任何适当的持续时间以尽可能多产生NK细胞。作为非限制性实例，步骤(a)可包括在Notch配体(例如DLL4)存在下培养HPC至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时、至少42小时、至少48小时、至少54小时、至少60小时、至少72小时、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周，即，步骤(a)的持续时间可以是这些中的任何一个。通常，步骤(a)的持续时间为72小时至1周。作为非限制性实例，步骤(b)可以包括在IL-15存在下培养步骤(a)产生的细胞至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时、至少42小时、至少48小时、至少54小时、至少60小时、至少72小时、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周或更长，直到产生所需数量的NK细胞。因此，步骤(b)的持续时间可以是这些中的任何一个。通常，步骤(b)的持续时间为1周或更长，在一些优选的实施方案中，步骤(b)的持续时间为7-9天，在甚至更优选的实施方案中，步骤(b)的持续时间为约2周。

[0194] 或者，步骤(a)和/或步骤(b)的持续时间可以根据细胞传代的数量来测量。例如，步骤(a)和/或步骤(b)可以是至少1代、至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少10代、至少20代、至少30代、至少40代或更多代细胞传代(体内、或离体或体外培养)。

[0195] 步骤(a)和步骤(b)的持续时间是独立的，并且上述步骤(a)的任何持续时间可以与上述步骤(b)的任何持续时间组合使用。在一些优选的实施方案中，步骤(a)持续72小时-1周，步骤(b)持续1周(或更长)。

[0196] 本发明人还证明，结合使用Notch配体(例如DLL4)和REV-ERB抑制导致用于增强NK细胞产生的令人惊讶的有效手段，可以比现有方法更快地产生适合体内治疗用途的大量功能性NK细胞。令人惊讶的是，这两种独立机制(Notch配体和REV-ERB抑制)可以一起使用以证明NK细胞数量的增加比单独提供的任一机制更大。

[0197] 因此，本发明提供了使用Notch配体和REV-ERB抑制的组合来扩增NK细胞的体外、体内和离体方法。当该方法在体内进行时，该方法是如本文所述的治疗方法。在此类实施方案中，本文关于本发明的治疗适应症和应用的所有公开内容适用于该方法。通常，本发明的方法是离体的。

[0198] 因此，本发明提供了用于扩增NK细胞群的离体方法，其包括以下步骤：(a)用抑制REV-ERB作用的化合物培养获自个体/患者的包含HPC的样品(如本文所述)；(b)在Notch配体(例如DLL4)存在下培养该细胞；和(c)在体外扩增该细胞以产生NK细胞群。步骤(a)和(b)可以同时或以任何顺序进行。例如，可以首先进行步骤(a)，然后进行步骤(b)，使得细胞首先暴露于REV-ERB抑制化合物，然后在Notch配体存在下培养。或者，可以首先进行步骤(b)，然后进行步骤(a)，使得细胞首先在Notch配体存在下培养，然后在REV-ERB抑制化合物存在下培养。或者，步骤(a)和(b)可以同时进行，使得细胞在REV-ERB抑制化合物和Notch配体存在下同时培养。

[0199] 在一些优选的实施方案中，步骤(a)可以首先进行，然后进行步骤(b)，使得细胞先在REV-ERB抑制化合物存在下培养，然后在Notch配体存在下培养。因此，在此类实施方案中，本发明提供了用于扩增NK细胞群的离体方法，其包括以下步骤：(a)用抑制REV-ERB作用的化合物培养获自个体/患者的包含HPC的样品(如本文所述)；(b)在Notch配体(例如DLL4)存在下培养该细胞；和(c)在体外扩增该细胞以产生NK细胞群。

[0200] 该化合物可以是如本文所述的本发明的任何REV-ERB抑制化合物。通常，所述化合物通过降低如本文所述的REV-ERB活性来增加E4bp4表达。Notch配体可以是如本文所述的本发明的任何Notch配体。在一些优选的实施方案中，REV-ERB抑制化合物是SR8278。在一些优选的实施方案中，Notch配体是DLL4、其功能片段或模拟DLL4活性/功能的分子。在一些特别优选的实施方案中，REV-ERB抑制化合物是SR8278，并且Notch配体是DLL4、其功能片段或模拟DLL4活性/功能的分子。

[0201] Notch配体(例如DLL4)可以存在于溶液中(例如在培养基中)或用于包被培养HPC的容器。优选Notch配体(例如DLL4)用于包被培养HPC的容器。可以使用任何合适浓度的Notch配体。本文描述了合适的Notch配体浓度的非限制性实例。换句话说，可以进行这些步骤，将本发明的Notch配体(例如DLL4)直接包被在组织培养塑料上。

[0202] 可以在存在或不存在基质支持细胞或饲养细胞或其群的情况下培养HPC。可以使用任何合适的基质细胞，包括但不限于OP9基质细胞和/或EL08-1D2基质细胞。在一些优选的实施方案中，在无基质支持细胞或其群存在下培养细胞。

[0203] 或者和/或另外，HPC可以在与NK细胞分化途径中细胞发育相关的细胞因子和生长因子的存在下培养，包括HPC生长所需的因子和/或NK细胞生长和/或分化所需的因子。此类因子的非限制性实例包括IL-3、IL-7、F1t3L、干细胞因子(SCF)、TPO、IL-3、IL-6、和/或IL-15、或其任何组合。可以使用任何适当浓度的此类因子。本文描述了此类因子的合适浓度的非限制性实例。

[0204] 在一些实施方案中，离体方法包括单个阶段，其中通常在基本上恒定的培养条件下，将获自个体/患者的样品中的HPC培养、与本发明化合物和Notch配体接触并扩增以形成NK细胞群(即该方法的步骤(a)和(b)同时进行)。通常，这涉及将HPC与诸如IL-3、IL-7、SCF、Flt3L和/或IL-15等因子(优选所有这些因子)一起孵育。可在存在或不存在基质细胞/细胞层例如EL08-1D2基质细胞的情况下培养HPC。

[0205] 在一些实施方案中，离体方法包括两个阶段。首先是淋巴产生阶段，其中培养获自个体/患者的样品中的HPC。通常，这涉及将HPC与淋巴产生相关的细胞因子和生长因子(例如Flt3L、IL-7和/或SCF)一起孵育。该阶段可持续至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、或更多天。在一些优选的实施方案中，该阶段持续2天。

[0206] 接下来是NK细胞扩增阶段。通常，这涉及在与NK细胞发育相关的细胞因子和生长因子(例如IL-15)中培养细胞，并且可以包括将培养的HSC转移至合适的基质(支持)细胞层，例如OP9基质细胞。第2阶段持续离体培养期的剩余时间(如本文所定义)。在第2阶段期间，可以根据需要经常更换培养基，以促进NK细胞扩增。

[0207] 在一些实施方案中，本发明的REV-ERB抑制化合物在第1阶段(淋巴产生)添加，Notch配体在第2阶段(NK细胞扩增)添加。在其他实施方案中，Notch配体在第1阶段(淋巴产生)添加，REV-FB抑制化合物在第2阶段(NK细胞扩增)添加。在其他实施方案中，REV-ERB抑制化合物和Notch配体都在第1阶段(淋巴产生)添加。在进一步的实施方案中，REV-ERB抑制化合物和Notch配体都在第2阶段(NK细胞扩增期阶段)添加。如果REV-ERB抑制化合物和Notch配体在相同阶段(第1阶段或第2阶段)添加，则该阶段可以进一步分成：(i)在Notch配体之前添加REV-ERB抑制化合物；或(ii)在REV-ERB抑制化合物之前添加Notch配体。或者，Notch配体和REV-ERB抑制化合物可以在同一阶段同时添加。

[0208] 通常在第1阶段期间添加REV-ERB抑制化合物，并且在第2阶段期间添加Notch配体，优选在第2阶段开始时添加。

[0209] 包含HPC的样品可以离体培养至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天或更长时间。通常将所述样品培养至少9天以产生扩增的NK细胞群。此培养期是离体方法的总培养期，即如果有两个阶段，则此培养期是总计(第1阶段加第2阶段)。

[0210] 本发明的REV-ERB抑制化合物可以在分离样品中的HPC的一周内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内，1天内加入到包含HPC的样品中，或在分离NK细胞前体的当天加入到包含HPC的样品中。通常，这是从患者获得样品的同一天。优选地，在分离样品中的HPC的2天内，例如在分离HPC的当天，将本发明的REV-ERB抑制化合物加入到样品中。最优选地，在分离HPC后2天将本发明的REV-ERB抑制化合物加入到样品中。

[0211] 本发明的Notch配体可以在分离样品中的HPC的一周内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内，1天内加入到包含HPC的样品中，或在分离NK细胞前体的当天加入到包含HPC的样品中。通常，这是从患者获得样品的同一天。优选地，在分离样品中的HPC的4天内，例如在分离HPC的后2天，将本发明的Notch配体加入到样品中。最优选地，在分离HPC后2天或4天将本发明的Notch配体加入到样品中。

[0212] 本发明的优选实施方案包括(i)在分离HPC的当天向样品中加入REV-ERB抑制化合物和Notch配体；(ii)在分离HPC的当天将REV-ERB抑制化合物加入样品中，并在分离HPC后第2天将Notch配体加入样品中；或者(iii)在分离HPC后第2天将REV-ERB抑制化合物加入到样品中，并在分离HPC后第4天将Notch配体加入样品中；选项(iii)是特别优选的。如实施例中所证明的，这些特定条件使REV-ERB抑制和Notch配体之间的协同作用最大化，并因此使NK细胞的扩增最大化。

[0213] 本发明的方法可以进一步包括调节(增加或降低HPC中一种或多种另外的基因和/或蛋白质的表达和/或活性，以增强NK细胞的扩增。该调节可以由本发明的化合物引发，包括与用于抑制REV-ERB活性的本发明相同的化合物。或者，可以使用一种或多种另外的化合物来调节一种或多种另外的基因和/或蛋白质的表达和/或活性。所述调节可以直接或间接发生。间接调节包括由抑制REV-ERB活性的本发明化合物引起的下游效应。

[0214] 本发明的任何方法可以单独使用或与本发明的其他方法组合使用。例如，涉及抑制REV-ERB的作用和在Notch配体存在下培养HPC的本发明方法可以与涉及在DLL4或其功能片段(即Notch配体是DLL4或DLL4片段)存在下和在IL-15存在下培养的本发明相结合和/或涉及E4bp4的翻译后修饰以增加E4bp4活性的本发明相结合。本发明设想了本文所公开的方法的任何组合。

[0215] 在本发明的所有方法中，包含从个体/患者获得的HPC的样品可以是从骨髓、脐带血和/或外周血获得的样品。因此，样品可以是脐带或外周血样品，或骨髓样品或活组织检查。样品可以从用本发明方法产生的NK细胞群治疗的个体(即患者)获得。或者，样品得自健康个体。

[0216] 根据本发明，包含HPC的样品是来自个体的任何样品，其包含足够数量的HPC(如本文所述)，使得扩增的NK细胞群可通过使该样品与根据本发明的化合物接触而获得。通常，样品包含HSC。优选地，该样品富含HSC，例如本文所述的脐带或外周血样品或骨髓样品或活组织检查。

[0217] 本发明的方法可以导致NK细胞的数量相对于对照增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更多倍。通常，NK细胞的数量与对照相比增加至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3倍或更多倍。

[0218] 本发明的方法可以加速表型成熟NK细胞的产生。换句话说，本发明的方法可以减少到达成熟NK细胞群所花费的时间。该方法的运行时间的减少提供了超过本领域已知的用于NK细胞扩增的常规方法的进一步优势。作为非限制性实例，用于扩增NK细胞的当前临床程序可花费超过两周的时间来产生包含约20％成熟NK细胞的NK细胞群。相反，本发明的方法可以在10天或更短的时间内，优选在一周或更短的时间内达到相等的细胞群。本发明的方法可以达到至少40％成熟NK细胞的群，优选至少45％、至少46％、至少47％、至少48％或至少49％的成熟NK细胞，甚至更优选在三周或更短、20天或更短、19天或更短、18天或更短、17天或更短、16天或更短、15天或更短、两周或更短、13天或更短、或12天或更短时间内达到至少50％成熟NK细胞。优选地，本发明的方法可以在两周或更短时间内达到至少45％成熟NK细胞的群。

[0219] 通常，本发明的任何离体方法包括纯化扩增的NK细胞群的最后步骤。这确保了如本文所述的用于治疗给药的纯种群。扩增的NK细胞群的纯化可以通过任何适当的方法进行。标准细胞纯化方法是本领域已知的，例如细胞分选，包括荧光活化细胞分选(FACS)和磁性活化细胞分选(MACS)。在本发明的一些方法中，特别是涉及Notch配体和REV-ERB抑制化合物组合的那些方法中，最终细胞群中NK细胞的百分比可能非常高(通常大于85％，优选大于90％，更优选大于95％，并且可能接近100％)。在这种情况下，可任选地省略最后的纯化步骤。

[0220] 治疗适应症

[0221] 本发明提供了含有抑制REV-ERB作用的化合物和Notch配体的产品，作为组合制剂同时、单独或相继用于通过增加患者体内NK细胞的产生的治疗方法中。

[0222] 用于所述治疗方法的Notch配体可以是如本文所述的任何Notch配体。在一些优选的实施方案中，Notch配体是DLL4或其保留DLL4功能的片段。

[0223] 用于所述治疗方法中的REV-ERB拮抗剂可以是如本文所述的任何REV-ERB拮抗剂。通常，用于所述方法中的REV-ERB拮抗剂通过降低REV-ERB活性来增加E4bp4表达。

[0224] 本文中所提及的本发明产品是指如本文所述的REV-ERB拮抗剂和Notch配体的组合(用于同时、单独或顺序使用)。

[0225] 本发明的任何REV-ERB拮抗剂和任何Notch配体可以组合使用。作为非限制性实例，DLL4或其功能片段可以与SR8278、ARN5187、2-(5-甲基呋喃-2-羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸乙酯、4-((4-氯苄基)((5-硝基噻吩-2-基)甲基)氨基)-N-苯基哌啶-1-甲酰胺、4-(((1-(4-氟苯基)环戊基)氨基)甲基)-2-((4甲基哌嗪-1-基)甲基)苯酚、1-(2-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺或-1-(4-氟苯基)-N-(3-((1-甲基哌啶-4-基)甲基)苄基)环戊-1-胺，优选SR8278组合使用。

[0226] 通常，治疗方法包括将产品(如本文所述)给予患者或受试者。Notch配体和REV-ERB拮抗剂可以同时、单独或顺序给药。对于单独或顺序给药，可以首先给予Notch配体，然后给予REV-ERB拮抗剂，反之亦然。

[0227] 顺序给药可能意味着两种产品一个接一个地立即给药，或者第二种产品在第一种产品给药后1分钟内、2分钟内、3分钟内、4分钟内、5分钟内、10分钟内、15分钟内、20分钟内、25分钟内、30分钟内、45分钟内、1小时内、或更长时间内给药。

[0228] 单独给药可能意味着第二种产品在第一种产品给药后1小时内、2小时内、3小时内、6小时内、12小时内、24小时内、2天内、3天内、4天内、5天内、6天内、7天内或更长时间内给药。

[0229] 如本文所用，术语“增加NK细胞的数量”和“增加NK细胞的产生”可以理解为意指本发明的化合物或产品引起患者体内NK细胞数量的显着增加。可以相对于对照测量NK细胞数量的这种增加(如本文在增加E4bp4表达和抑制REV-ERB活性的上下文中所述)。

[0230] 提及的增加NK细胞数量和/或增加NK细胞产生可以根据相对于对照的倍数增加来量化。通常，本发明的化合物可以增加NK细胞的数量，或者使NK细胞的产生相对于对照增加至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少3倍或更多倍。

[0231] 或者，提及的增加NK细胞数量和/或增加NK细胞产生可以理解为表示NK细胞数量与对照相比增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或更多。通常，NK细胞的数量与对照相比增加至少50％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％或更多。

[0232] 在一些实施方案中，NK细胞数量的增加和/或NK细胞产生的增加可以根据样品或患者中NK细胞的绝对数量，例如NK细胞的百分比，例如NK细胞在循环淋巴细胞群中的百分比来定义。例如，本发明的化合物可引起NK数量的增加，导致NK细胞的百分比为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或更多。

[0233] NK细胞的数量可以通过定量和/或定性分析来确定，并且可以直接或间接测量。可以使用任何适当的技术确定相对于对照的NK细胞的数量。合适的标准技术，例如流式细胞术、FAGS和MACS，是本领域已知的。

[0234] NK细胞的数量与对照相比可以增加至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时、至少42小时、至少48小时、至少54小时、至少60小时、至少72小时、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月或更长时间。通常，这是相对于最后一次给予抑制REV-ERB活性的化合物和/或Notch配体来评估的。

[0235] NK细胞的数量可以根据来自个体/患者的样品或培养样品(来自本发明的离体方法)中的NK细胞的总数来定量。

[0236] 在本发明的治疗用途和方法的上下文中，“受试者”或“患者”(该类术语在本文中可互换使用)是将受益于NK细胞数量增加的任何动物患者。典型的动物患者是哺乳动物，例如灵长类动物。优选地，患者是人。

[0237] 因此，本发明提供了通过增加有需要的患者中NK细胞数量的治疗方法，包括给予该患者治疗有效量的抑制REV-ERB作用的化合物(如本文所述)和Notch配体(如本文所述)。

[0238] 另外，本发明提供了抑制REV-ERB作用的化合物和Notch配体在药物制备中的用途。该药物增加患者体内NK细胞的数量。

[0239] 本发明的治疗用途或方法可包括将治疗有效量的本发明化合物或产品(如本文所定义)单独或与其他治疗剂组合给予受试者或个体。

[0240] 如本文所用，术语“治疗”(treatment/treating)包括治疗或预防(preventative/prophylactic)措施。

[0241] 本发明的化合物或产品也可用作预防性疗法。如本文所用，术语“预防”包括预防与可通过增加NK细胞数量和/或降低该症状的严重性或强度来治疗的疾病或病症相关的症状的发作。术语“预防”包括诱导或提供针对此类疾病或病症(特别是如本文所述的感染性疾病)的保护性免疫。免疫可以使用任何适当的技术来量化，其实例是本领域已知的。

[0242] 可以将本发明的化合物或产品给予已经患有可以通过增加NK细胞数来治疗的疾病或病症的患者。例如，患者可能怀疑患有如本文所述的传染病或癌症，并且可能显示或可能不显示所述疾病或病症的症状。当给予此患者时，本发明的化合物或产品可以治愈、延迟、减轻一种或多种症状的严重程度、或改善一种或多种症状，和/或延长受试者超过在没有这种治疗的情况下预期的存活时间。

[0243] 或者，本发明的化合物或产品可以给予最终可能感染特定传染病，或者患上如本文所述疾病或病症的患者，以便治愈、延迟、减轻一种或多种症状的严重程度、或改善一种或多种症状，和/或延长受试者超过在没有这种治疗的情况下预期的存活时间，或者，在传染病的情况下有助于防止该患者传播该疾病。

[0244] 本发明的治疗和预防性治疗适用于不同年龄的各种不同受试者。在人类的情况下，治疗适用于儿童(例如婴儿、5岁以下儿童、大龄儿童或青少年)和成人。在其他动物受试者(例如哺乳动物如灵长类动物)的情况下，该治疗适用于未成熟受试者和成熟/成人受试者。

[0245] 本发明涉及通过增加患者中NK细胞的数量来有益治疗的任何疾病或病症的治疗。此类疾病和病症包括癌症、传染病(急性和慢性)、自身免疫疾病和与女性不育或妊娠有关的疾病或病症。可根据本发明治疗的传染病包括病毒感染、和其他病原体的感染，包括细菌、原生生物、真菌或蠕虫病原体。通常，该病原体是细胞内病原体，其在其生命周期中具有至少一个胞内期。特别关注的感染包括病毒感染和从公共卫生角度来看特别重要的人畜共患感染。可根据本发明治疗的癌症包括膀胱癌、血癌、白血病、骨癌、肠癌、脑肿瘤、乳腺癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌和子宫癌。可根据本发明治疗的自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化和肥胖诱导的胰岛素抵抗。如本文所用，术语与女性不育或妊娠有关的疾病或病症包括但不限于胎儿生长受限、早产、子宫血管重塑和先兆子痫的缺陷。

[0246] 本发明的化合物或产品可以与一种或多种另外的治疗剂或治疗组合使用，其通常可以选自对待治疗的疾病或病症的常规治疗。作为非限制性实例，如果本发明的化合物或产品用于治疗癌症，例如肺癌，则该化合物或产品可与肺癌的常规治疗组合使用，例如放射治疗、化疗或手术。当与一种或多种另外的治疗剂或治疗组合使用时，本发明的化合物或产品可以在给予一种或多种另外的治疗剂或治疗之前、同时或之后给予。

[0247] 在一些优选的实施方案中，本发明的化合物或产品与抗体介导的免疫疗法组合使用。抗体介导的免疫疗法涉及向患者给予抗体以靶向疾病特异性抗原。此类抗体可用于增加NK细胞的特异性并杀伤NK细胞的活性，NK细胞表达IgG抗体Fc区域的受体。此类Fc受体的活化导致NK细胞活化，导致活化的NK细胞分泌细胞因子并释放细胞毒颗粒，导致表达疾病抗原的细胞裂解。此组合治疗特别优选用于治疗癌症(使用针对肿瘤特异性抗原的抗体)。用于免疫疗法的任何抗体可以与本发明的化合物组合使用。此类抗体的非限制性实例包括抗CD20mAb(非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞淋巴瘤)、抗神经节苷脂D2(抗GD2)mAb(神经母细胞瘤、黑素瘤)、抗人表皮生长因子(抗-HER2)mAb(乳腺癌和胃癌)、抗表皮生长因子受体(抗EGFR)mAb(结肠直肠癌和头颈癌)。

[0248] 本发明还提供了导致E4bp4的翻译后修饰的化合物的用途，从而导致如本文所述的治疗用途或方法中E4bp4活性(如本文所述)的增加。根据本发明，本文关于本发明化合物或产品的治疗适应症的任何和所有公开内容可同等且独立地应用于导致E4bp4的翻译后修饰的化合物的治疗应用。作为非限制性实例，本发明提供了一种导致E4bp4的翻译后修饰，从而导致E4bp4活性增加(如本文所述)化合物用于治疗方法，例如治疗癌症、传染病、自身免疫性疾病或与女性不育或怀孕有关的疾病或病症。作为另一个非限制性实例，本发明提供了通过增加有需要的患者中NK细胞数量的治疗方法，包括给予该患者治疗有效量的导致E4bp4翻译后修饰的化合物，从而导致E4bp4活性增加。

[0249] 在其他方面，本发明提供了扩增的NK细胞群(如本文所述)在如本文所述的治疗用途或方法中的用途。本文关于本发明化合物或产品的治疗适应症的任何和所有公开内容可同等且独立地应用于本发明的扩增的NK细胞群的治疗应用。作为非限制性实例，本发明提供扩增的NK细胞群(如本文所述)用于治疗方法，例如治疗癌症、传染病、自身免疫性疾病或与女性不育或怀孕有关的疾病或病症。作为另一个非限制性实例，本发明提供了通过增加有需要的患者中NK细胞数量的治疗方法，包括给予该患者治疗有效量的扩增的NK细胞群。

[0250] 药物组合物和制剂

[0251] 术语“化合物”或“产品”在本文中可与术语“治疗性/预防性组合物”、“制剂”或“药物”互换使用。

[0252] 除药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂外，本发明的化合物、产品或扩增的NK细胞群(如上定义)还可以组合或给予。或者或另外，本发明的化合物、产品或扩增的NK细胞群可进一步与盐、赋形剂、稀释剂、佐剂、免疫调节剂和/或抗微生物化合物中的一种或多种组合。

[0253] 药学上可接受的盐包括与无机酸(例如盐酸或磷酸)或与有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等)形成的酸加成盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因，等等。

[0254] 免疫原性组合物、治疗制剂、药物和预防性制剂的给药通常通过常规途径，例如静脉内、皮下、腹膜内、或粘膜途径。给药可以通过肠胃外注射，例如皮下、皮内或肌内注射。例如，包含本发明的抗体或扩增的NK细胞群的制剂可能特别适于静脉内、肌肉内、皮内或皮下给药。小分子REV-ERB抑制剂的给药可以是注射，例如静脉内、肌肉内、皮内或皮下注射，或通过口服给药(分子量小于500Da的小分子，通常表现出口服生物利用度)。

[0255] 因此，本发明的免疫原性组合物、治疗制剂、药物和预防性制剂可以制备成注射剂，可以是液体溶液或悬浮液。也可制备适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以乳化，或将肽包封在脂质体或微胶囊中。

[0256] 活性免疫原性成分(例如本发明的化合物，产品或扩增的NK细胞群)通常与赋形剂混合，赋形剂是药学上可接受的并且与活性成分相容。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，疫苗可含有少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、和/或增强疫苗有效性的佐剂。

[0257] 通常，载体是药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的非限制性实例包括水、盐水和磷酸盐缓冲盐水。然而，在一些实施方案中，当组合物包含本发明的化合物或产品时，其可以是冻干形式，在这种情况下，其可以包括稳定剂，例如BSA。在一些实施方案中，可能需要用防腐剂(例如硫柳汞或叠氮化钠)配制组合物，以促进长期储存。

[0258] 可能有效的其他佐剂的实例包括但不限于：弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)、皂苷、皂苷的纯化提取物级分如Quil A、皂苷的衍生物如QS-21、基于皂苷的脂质颗粒如ISCOM/ISCOMATRIX、大肠杆菌热不稳定毒素(LT)突变体如LTK63和/或LTK72、氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和RIBI，其含有从细菌、单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架中提取的三种组分(MPL+TDM+CWS)于2％角鲨烯/吐温80乳液，Novartis开发的MF59制剂，以及GSK Biologicais(Rixensart，Belgium)开发的AS02、AS01、AS03和AS04辅助制剂。

[0259] 缓冲剂的实例包括但不限于琥珀酸钠(pH6.5)和磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH6.5和7.5)。

[0260] 适用于其他给药方式的其他制剂包括栓剂，和(在一些情况下)适合于作为气雾剂分布的口服制剂或制剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；此类栓剂可以由含有0.5％-10％，优选1％-2％的活性成分的混合物形成。

[0261] 口服制剂包括通常使用的赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物呈溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的形式。

[0262] 给予本发明化合物或产品的剂量范围是产生所需治疗效果的剂量范围。应当理解，所需的剂量范围取决于化合物或产品的确切性质、给药途径、制剂性质、患者年龄、患者病症的性质、程度或严重程度，禁忌症(如果有的话)，以及主治医师的判断。可以使用标准经验惯例调整这些剂量水平的变化以进行优化。类似地，用于本发明方法特别是离体方法的本发明化合物或产品的剂量可由本领域技术人员容易地确定，并且是产生所需NK细胞数量增加和/或引发所需NK细胞扩增以产生扩增的NK细胞群的任何剂量。作为非限制性实例，根据本发明的S8278的剂量可以产生约2-约20μM、约2-约15μM、约5-约15μM、约5-约14μM、约4-约13μM、约5-约12μM、约5-约11μM、或优选约5-约10μM的最终浓度。

[0263] 本发明还提供了扩增的NK细胞群(如本文所述)在药物制剂中的用途。本文关于本发明化合物的制剂的任何和所有公开内容可同等且独立地应用于本发明的扩增的NK细胞群的治疗应用。

[0264] 序列表

[0265] SEQ ID NO：1-Delta样配体4基因序列(AF253468.1)

[0266]

[0267] SEQ ID NO：2-Delta样配体4氨基酸序列(AF253468.1)

[0268]

[0269] SEQ ID NO：3-E4bp4基因序列(X64318.1)

[0270]

[0271] SEQ ID NO：4-E4bp4氨基酸序列(X64318.1)

[0272]

[0273] SEQ ID NO：5-REV-ERBa基因序列(NM_021724.4)

[0274]

[0275] SEQ ID NO：6-REV-ERBa氨基酸序列(NM_021724.4)

[0276]

[0277] SEQ ID NO：7-REV-ERB基因序列(AB307693.1)

[0278]

[0279] SEQ ID NO：8-REV-ERB氨基酸序列(AB307693.1)

[0280]

[0281] SEQ ID NO：9-用于检测E4bp4野生型等位基因的正向引物A.

[0282]

[0283] SEQ ID NO：10-用于检测E4bp4的反向引物

[0284]

[0285] SEQ ID NO：11-用于检测E4bp4无效等位基因的引物

[0286]

[0287] SEQ ID NO：12-SUMO上的侧链被修饰的肽

[0288]

[0289] SEQ ID NO：13-包含潜在SUMO修饰位点的小鼠E4bp4肽

[0290]

[0291] SEQ ID NO：14-包含潜在SUMO修饰位点的大鼠E4bp4肽

[0292]

[0293] SEQ ID NO：15-包含潜在SUMO修饰位点的人E4bp4肽

[0294]

[0295] SEQ ID NO：16-包含潜在SUMO修饰位点的鸡E4bp4肽

[0296]

[0297] SEQ ID NO：17-包含潜在SUMO修饰位点的非洲爪蟾E4bp4肽

[0298]

[0299] SEQ ID NO：18-包含潜在SUMO修饰位点的小鼠E4bp4肽

[0300]

[0301] SEQ ID NO：19-包含潜在SUMO修饰位点的大鼠E4bp4肽

[0302]

[0303] SEQ ID NO：20-包含潜在SUMO修饰位点的人E4bp4肽

[0304]

[0305] SEQ ID NO：21-包含潜在SUMO修饰位点的鸡E4bp4肽

[0306]

[0307] SEQ ID NO：22-包含潜在的SUMO修饰位点的非洲爪蟾E4bp4肽

[0308]

[0309] SEQ ID NO：23-包含潜在SUMO修饰位点的小鼠E4bp4肽

[0310]

[0311] SEQ ID NO：24-包含潜在SUMO修饰位点的大鼠E4bp4肽

[0312]

[0313] SEQ ID NO：25-包含潜在SUMO修饰位点的人E4bp4肽

[0314]

[0315] SEQ ID NO：26-包含潜在SUMO修饰位点的鸡E4bp4肽

[0316]

[0317] SEQ ID NO：27-包含潜在SUMO修饰位点的非洲爪蟾E4bp4肽

[0318]

[0319] SEQ ID NO：28-包含潜在SUMO修饰位点的小鼠E4bp4肽

[0320]

[0321] SEQ ID NO：29-包含潜在SUMO修饰位点的大鼠E4bp4肽

[0322]

[0323] SEQ ID NO：30-包含潜在SUMO修饰位点的人E4bp4肽

[0324]

[0325] SEQ ID NO：31-包含潜在SUMO修饰位点的鸡E4bp4肽

[0326]

[0327] SEQ ID NO：32-包含潜在SUMO修饰位点的非洲爪蟾E4bp4肽

[0328]

[0329] SEQ ID NO：33-包含潜在SUMO修饰位点的小鼠E4bp4肽

[0330]

[0331] SEQ ID NO：34-包含潜在SUMO修饰位点的大鼠E4bp4肽

[0332]

[0333] SEQ ID NO：35-包含潜在SUMO修饰位点的人E4bp4肽

[0334]

[0335] SEQ ID NO：36-包含潜在SUMO修饰位点的鸡E4bp4肽

[0336]

[0337] SEQ ID NO：37-包含潜在SUMO修饰位点的非洲爪蟾E4bp4肽

[0338]

[0339] SEQ ID NO：38-用于扩增Notchl基因座中推定的E4bp4结合区的正向引物

[0340]

[0341] SEQ ID NO：39-用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的反向引物

[0342]

[0343] SEQ ID NO：40-用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的正向引物

[0344]

[0345] SEQ ID NO：41-用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的反向引物

[0346]

[0347] SEQ ID NO：42-用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的正向引物

[0348]

[0349] SEQ ID NO：43-用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的反向引物

[0350]

[0351] SEQ ID NO：44-用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的正向引物

[0352]

[0353] SEQ ID NO：45-用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的反向引物

[0354]

[0355] SEQ ID NO：46-用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的正向引物

[0356]

[0357] SEQ ID NO：47-用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的反向引物

[0358]

[0359] SEQ ID NO：48-用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的正向引物

[0360]

[0361] SEQ ID NO：49-用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的反向引物

[0362]

[0363] SEQ ID NO：50-人Notch1 cDNA序列(CR457221.1)

[0364]

[0365] SEQ ID NO：51-人Notch1蛋白序列(CR457221.1)

[0366]实施例

[0367] 通过以下实施例进一步阐明本发明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不是限制性的。

[0368] 实施例1-SUMOI化E4bp4

[0369] 为了研究如何调节E4bp4蛋白功能，进行酵母双杂交筛选以试图鉴定E4bp4蛋白的结合配偶体。11个蛋白质在筛选中接受多次命中，但具有最高阳性鉴定数的蛋白质是PIAS1(表1)。PIAS1是添加翻译后SUMO修饰所需的小泛素样修饰物(SUMO)F3连接酶，表明E4bp4可翻译后SUMO化。

[0370]

[0371]

[0372] 表1-来自酵母双杂交筛选的E4bp4相互作用配偶体。

[0373] SUMO蛋白质是可逆的翻译后蛋白质修饰物，并且哺乳动物表达四种SUMO同种型，命名为SUM01-SUM04。成熟的SUM02和SUM03蛋白仅相差三个氨基酸并且在功能上是同源的，而SUM04不能在哺乳动物细胞中有效地加工并且不被认为是功能性的。E4bp4在稳定表达6His-SUM01、6His-SUM02和6His-SUM03的HeLa细胞中表达，并且在通过Ni2+亲和层析富集所有SUMO化蛋白后，观察到更高分子量形式的E4bp4(图2A)。每个SUMO缀合物在蛋白质的表观分子量上增加10-15kDa，因此E4bp4的较高分子量形式对应于蛋白质的多重SUMO化形式。
FLAG标记的E4bp4也在每个6His-SUMO HeLa细胞系中表达，并使用抗FLAG亲和树脂纯化，并且在6His-SUM02和6His-SUM03存在下观察到相同的多个更高分子量形式的E4bp4(图2B)。

[0374] 检查E4bp4在其一级氨基酸序列中是否存在SUMO化共有基序ψ-κ-χ-E(图3A)。发现了五个潜在的修饰位点，这些位点在一系列物种中都是高度保守的(图3A)。为了确定这些位点中的任何位点是否被SUMO化，通过定点诱变将每个位点的中心赖氨酸残基分别突变为E4bp4 cDNA中的精氨酸。该突变消除了该位点的任何SUMO修饰，同时保持了蛋白质的结构完整性。为了评估突变的影响，每个SUMO突变体在6His-SUM02 HeLa细胞中表达(图3B)。E4bp4-K219R是唯一影响E4bp4 SUMO化的单个突变体，但它没有完全去除所有E4bp4 SUMO化(图3B)。所有多位点突变体影响E4bp4的SUMO化，特别是缺少所有5个推定的SUMO化位点的5X-SUMO突变体，没有更高分子量形式的E4bp4(图3B)。

[0375] 为了证实SUMO修饰的存在，通过质谱(MS)分析纯化的E4bp4蛋白。通过MS研究SUMO修饰是具有挑战性的，因为SUMO化形式的蛋白质通常是低丰度的并且标准胰蛋白酶切割导致长SUMO肽‘尾部’保持与靶肽缀合，使其难以在标准MS21中检测。开发了一种系统，其中FLAG表位标记的E4bp4蛋白在293T细胞中表达，通过免疫沉淀纯化并用胰蛋白酶和Glu-C依次消化。这种新型的双重消化策略旨在产生短的E4bp4肽，其在修饰的肽上具有减少的SUMO异肽侧链。使用该方法，预测SUMO修饰的肽具有与修饰的赖氨酸连接的-GGTQQQFV侧链。MS/MS分析容易鉴定出在K219处具有SUMO修饰的E4bp4肽，进一步证实了该翻译后修饰(PTM)的存在(图3C)。这些数据证明E4bp4蛋白具有SUMO修饰。

[0376] 实施例2-E4bp4的SUMO化影响NK细胞发育

[0377] 然后研究了此类SUMO修饰对E4bp4作为NK细胞发育中的转录因子的功能的潜在影响。

[0378] SUMO化可以以不同的方式影响转录因子的功能：细胞定位；与其他蛋白质的相互作用或；调节靶基因表达的能力。由于E4bp4对NK细胞的发育至关重要，因此推测SUMO化可能调节此功能。因此，比较了E4bp4在有和没有SUMO修饰的情况下促进NK细胞发育的能力。从E4bp4-/-小鼠中分离谱系阴性(Lin-)BM细胞，并用表达WT形式的E4bp4或缺少SUMO修饰位-/- -
点的E4bp4突变体之一的逆转录病毒转导。如先前报道的，WT形式E4bp4从E4bp4 Lin BM细胞中拯救NK细胞发育，然而，当细胞表达E4bp4 SUMO化突变体时，产生的NK细胞数量显着更高(图4A-C)。由于产生的NK细胞的数量可以在测定之间变化，因此将每种突变体产生的NK细胞的百分比标准化为阳性对照条件(即WT形式E4bp4)(图4B)。使用E4bp4-/-Lin-BM细胞也-/- -
进行相同的测定。在E4bp4 LinBM细胞中，与空载体相比，WT形式E4bp4的表达增加了NK细胞产生水平，但是E4bp4 SUMO突变体的表达再次导致显着更高水平的NK细胞产生(图4C，D)。这些发现表明SUMO化可以影响E4bp4的功能，并且在其不存在时，通过NK细胞输出测量，E4bp4的活性显着增加。

[0379] 实施例3-多重磷酸化E4bp4，并且此类修饰影响NK细胞的发育

[0380] 为了确定E4bp4的哪些残基被磷酸化，将在293T细胞中表达的FLAG-E4bp4纯化，并使用胰蛋白酶消化该蛋白质用于LC-MS/MS分析。串联MS最终揭示E4bp4在丝氨酸286、301和353处具有三个磷酸化位点(图5A和6-8)。这些丝氨酸残基中的每一个都突变为丙氨酸以消除任何磷酸化但保持蛋白质构象。如SUMO化所述，目的是确定磷酸化是否调节E4bp4的功能。每种磷酸化突变体在E4bp4-/-Lin-BM细胞中通过逆转录病毒表达载体表达，并且在促进NK细胞发育的条件下培养此类细胞。将磷酸化突变体拯救NK细胞发育的能力与E4bp4的WT形式进行比较，发现几种突变体促进显着更高水平的NK细胞产生(图5B、C)。特别地，S286A突变体产生的NK细胞数量是WT形式E4bp4的两倍(图5B)。磷酸化突变体也被转导到E4bp4-/-Lin-BM细胞中，与用WT形式的E4bp4特别是与用286A和S286-353A突变体转导的细胞相比，用磷酸化突变体转导的细胞中NK细胞产生大大增强(图5E，E)。当磷酸化位点突变时观察到的表型复制了上述用于SUMO化的表型。因此，翻译后修饰(PTM)均负调节E4bp4在NK细胞中的功能，并且控制E4bp4的PTM提供了控制NK细胞产生的简单机制。

[0381] 实施例4-SUMO化和磷酸化不影响E4bp4的稳定性

[0382] SUMO化和磷酸化都可以影响转录因子的稳定性并影响其蛋白酶体降解。由于缺乏此两种PTM增强了E4bp4在NK细胞发育过程中的功能，因此研究了缺乏PTM位点的突变型E4bp4是改变了稳定性。在稳定表达5X-SUMO、S286-353A突变体或WT形式的E4bp4的细胞系上使用环己酰亚胺时程测定法，比较了每种形式的E4bp4的稳定性。两种突变体具有与WT E4bp4非常相似的半衰期，在环己酰亚胺处理8小时后蛋白质水平降低了几乎一半(图9A，B)。

[0383] 实施例5-E4bp4的转录活性可通过SUMO化和磷酸化来调节

[0384] E4bp4首先被鉴定为转录抑制子，并且已显示在体内抑制许多靶基因的表达，例如TH2细胞中的11-13。然而，同样发现E4bp4反式活化各种靶基因的表达，包括NK细胞中的Id2和Eomes。推测SUMO化和磷酸化可能影响E4bp4控制靶基因表达的能力。为了分析对基因转录的影响，使用荧光素酶报告基因测定作为读数。用E4bp4表达载体和在pGL3启动子荧光素酶报告基因上游具有三个E4bp4 DNA结合序列的质粒共转染细胞。发现E4bp4在该情况下充当转录抑制子(图9C)。如先前报道的那样，E4bp4的WT形式一致导致荧光素酶表达降低50％，但是E4bp45X-SUMO突变体比E4bp4的WT形式促进甚至更大的转录抑制(图9C)。对于E4bp4磷酸化突变体，特别是那些含有S286A突变体残基的突变体，观察到类似的观察结果(图9D)。这些数据表明E4bp4PTM突变体通过游离基团环境中的E4bp4结合共有序列影响转录。基于这些发现，决定在NK细胞环境中测试E4bp4PTM突变体是否对已知强烈影响淋巴细胞发育的内源基因的表达有任何影响。

[0385] 用WT形式的E4bp4、5X-SUMO和S286-353A突变体转导小鼠NK细胞系MNK。E4bp4在这些细胞中促进Eomes表达，并且在两种E4bp4突变体的存在下都观察到相似水平的表达(图19E)。E4bp4不影响Gata3或Tbet的转录，然而，发现其促进Notch1的表达，并且显着地，用
5X-SUMO和S286-353A E4bp4突变体观察到表达的甚至更大的增加(图9E)。这提供了SUMO化和磷酸化负调节E4bp4的转录活化效应的证据。这些数据表明，去除这些PTM使E4bp4蛋白质成为更有效的转录活化因子或更有效的转录抑制子，取决于具体情况。该观察结果提供了对突变形式的E4bp4比WT形式E4bp4更大程度地增强NK细胞产生的机制的洞察，并且提示了先前未知的NK细胞发育机制，即E4bp4可能作用于Notch信号传导途径。

[0386] 实施例6-E4bp4可通过Notch起作用以促进NK细胞发育

[0387] 研究了E4bp4对Notch1表达的影响，以及这是否可能影响NK细胞的产生。先前已经说明瞬时Notch信号传导诱导来自Pax5-/-pro-B细胞和鼠HSC的NK细胞的发育。首先，检查Notch1是否是E4bp4的直接转录靶标。使用染色质免疫沉淀(ChIP)确定E4bp4是否可以在体内直接结合Notch1基因的调节区。用FLAG标记的E4bp4转导MNK-1细胞，并通过IgG、抗FLAG抗体或抗E4bp4抗体沉淀蛋白质-染色质复合物。搜索Notch1的转录起始位点(TSS)周围的调节区域，并鉴定出六个推定的E4bp4结合位点(图10A)。发现E4bp4结合在预测的位点E处高度富集，甚至比在Per2B基因中发现的先前最佳表征的E4bp4结合调节区程度更高。此外，TSS上游的位点A和B以及TSS下游的位点D和F也富集在E4bp4免疫沉淀的样品中(图10B)。这表明E4bp4结合Notch1的调节区，其可以增强其转录活化。为了进一步检验E4bp4可以调节Notch1表达的假设，假定E4bp4的缺失应该影响体内HPC中的Notch1表达。比较了Notch1在E4bp4+/+和E4bp4-/-Lin-骨髓(BM)细胞中的表达，发现在没有E4bp4的情况下，Notch1表达确实显着降低，如先前针对另一个E4bp4靶基因，Id23所示(图IOC)。

[0388] 由于E4bp4似乎调节Notch1表达，推测在早期阶段增强的Notch信号传导可能潜在地影响来自E4bp4-/-HPCs的NK细胞的发育。为了研究在存在或不存在Notch信号传导的情况下从HPC发育NK细胞，在BM9基质细胞或OP9-DL1细胞(其表达Notch配体δ样1)上培养Lin-BM细胞(图10C)。随后，将细胞转移到新鲜的OP9上并在IL-15存在下培养(图11A)。当E4bp4-/-细胞在对照OP9上生长时，没有观察到NK细胞发育，但是当在OP9-DL1上培养E4bp4-/-细胞进行第一部分培养时，显着地，NK细胞发育被拯救(图11B)。当细胞在OP9-DL1上生长进行第二部分培养时，未观察到相同的结果(图11B)。为了消除基质细胞的影响，用重组δ样配体1(rDLL1)或rDLL4蛋白包被组织培养板。此类板用于培养的第一个7天期间(图11B)。先前已经表明一些类似δ样配体在固定到塑料表面上时有效地诱导Notch信号传导。当在空板上培养时，E4bp4-/-Lin-BM细胞不会发育成NK细胞，但是当在rDLL4包被的板生长时，在无NK细胞发育的关键转录因子存在下可以完全拯救NK细胞的产生(图11C)。当细胞在rDLL1包被的板上培养时，仅观察到非常局部的拯救(图11C)。另外，当在rDLL4包被的板上培养E4bp4+/+HPCs时，与在未包被的板上生长的细胞相比，NK细胞产生水平增加(图11C)。

[0389] 然后通过使用产生Cre介导的Rbpj基因缺失的方法研究Notch信号传导的消除是否会对NK细胞发育产生任何直接影响。重组信号结合蛋白JK(RBP-J)是转录辅因子，其对于由Notch信号传导途径活化的靶基因的表达是关键的。通过共表达Cre重组酶和截短的人CD2的慢病毒转导从Rbpjflox/flox小鼠分离的HPC。人CD2表达用于标记所有转导的细胞。转导后，将HPC用IL-15在OP9细胞上培养或首先在rDLL4包被的板上培养3天，然后转移至OP9加IL-15(图11D)。从那些受Cre缺失的HPC开发的成熟NK细胞数量大大减少(图11E)。通过与rDLL4预孵育极大地加强了这种差异效应，rDLL4选择性地增强HPC的NK细胞发育(图11E)。这些数据表明Notch信号传导可以在NK细胞发育的早期阶段发挥作用，并且该作用是作为控制NK细胞产生的E4bp4介导的转录网络的组成部分。

[0390] 实施例7-SR8278和DLL4处理的组合导致离体NK细胞产生显著增加

[0391] 研究了结合REV-ERB抑制和Notch配体暴露对NK细胞产生的影响。

[0392] 除对照(未处理)条件外，HPC在四组条件下培养：(i)在培养的第2天用SR8278处理(无重组DLL4、rDLL4)；(ii)在rDLL4上培养(无SR8278)；(iii)在rDLL4上培养并在培养的第0天用SR8278处理；或(iv)在培养的第0天用SR8278处理，从第2天在rDLL4上培养。除了不同的处理之外，培养条件另外与先前描述的从HPC产生NK细胞的条件相同。

[0393] 如图12A和B所示，在无SR8278和rDLL4存在下NK细胞的百分比低(小于10％)。百分比(图12B中)是单独的一式三份实验的平均值。在培养的第2天添加SR8278使得产生的NK细胞的百分比显着增加(57.5％)，在无SR8278存在下在rDLL4上培养HPC也是如此(65.3％)。在培养的第0天用SR8278处理在rDLL4上培养HPC引起NK细胞产生的进一步增加(77％)。然而，首先在第0天将HPC与SR8278一起孵育，然后在第2天转换为在rDLL4上培养具有甚至更大的效果，平均82.5％的产生的细胞是NK细胞(并且在一些重复中，超过85％的产生的细胞是NK细胞)。

[0394] 如图13所示，用一组扩展的培养条件重复该实验。该重复实验的结果如图14所示。同样，这个重复的实验证明了SR8278和rDLL4之间的协同作用。条件f(在分离骨髓祖细胞后
2天加入SR8278，然后在2天后暴露于rDLL4)显示出最强的效应。

[0395] 这些数据显示在暴露于rDLL4之前(或同时)用SR8278处理HPC协同增强NK细胞产生。E4bp4对于NK细胞的规范产生至关重要。SR8278增加E4bp4表达。不受理论束缚，这可以通过SR8278诱导E4bp4表达来解释，SR8278随后诱导Notch受体的表达。稍后暴露于Notch配体，rDLL4将最大化对NK细胞产生的影响。

[0396] 因此，rDLL4之间的协同作用表明，在SR8278处理后由于rDLL4暴露导致的NK细胞的快速扩增可以很好地产生NK细胞，其在细胞毒性、细胞因子表达和输注给受体后的存活方面具有增强的功能。与用于产生过继转移的细胞的现有技术相比，此类NK细胞将具有显着的功能增强。

[0397] 实施例8-暴露于Notch配体极大地加速了表型成熟的人NK细胞的产生

[0398] 如图15所示，人CD34+脐带血干细胞暴露于Notch配体rDLL4，显着减少了产生大量成熟人NK细胞所需的时间。特别地，与仅有30％成熟NK细胞甚至在16天后获得的对照方法相比，暴露于rDLL4导致在12天后产生包含几乎50％成熟(CD45+/CD56+)NK细胞的NK细胞群。在输注给患者之前，用于人NK细胞产生的临床方案需要具有高百分比的成熟NK细胞的群。
因此，本发明的方法有可能大大减少任何可能的NK细胞耗竭表型，其在输血后降低人NK细胞的功能。

[0399] 材料和方法

[0400] 小鼠

[0401] 使用野生型小鼠，E4bp4杂合子小鼠(E4bp4+/-)，E4bp4敲除小鼠(E4bp4-/-)和REV--/-ERB-α敲除小鼠(Rev-erb-α )。所有小鼠均以C57BL/6为背景，6-12周龄，年龄和性别匹配。
Rbpjflox/flox小鼠以FVB为背景。所有畜牧业和实验程序均根据UK内政部法规和地方准则进行。用正向引物5’CTCTGAGCTTGGCTGATGTG3’(引物A)和用于检测野生型等位基因的反向引物5’GCTTCAAGTCTCCACCAAGC3’(引物B)或用于检测空的等位基因5’
CCATGCTCCTGTCTTGATGA3’对E4bp4小鼠进行基因分型。

[0402] 细胞和细胞培养

[0403] 在补充有20％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉亲和素(P/S)的Iscove’s Modified Dulbecco’s Media(IM DM)(Sigma Aldrich)中培养OP9-GFP基质细胞。对于在96孔板上进行的实验，将OP9基质细胞以2000个细胞/孔的浓度接种，并在加入HPC之前在37℃，5％CO2下孵育1天。对于在24孔板上进行的实验，将OP9基质细胞以4000个细胞/孔的浓度接种，并在加入HPC之前在37℃，5％CO2下孵育2天。EL08.1D2基质细胞在Minimum Essentiai Medium Eagle-Alpha Modification(Alpha-MEM)中培养，补充有50％Myelocult M5300(干细胞技术)、7.5％FBS、50μMβ-巯基乙醇、1μM氢化可的松和1％P/S(Sigma Aldrich)。对于人CD34+祖细胞实验，EL08.1D2以3000rad/30Gy照射，并以20000细胞/孔的浓度接种在96孔EmbryoMax明胶(Millipore)包被的板中。

[0404] 在CD34+细胞转移到板之前，在32℃，5％CO2下培养过夜。

[0405] 小鼠HPC分离

[0406] 通过在含有2％胎牛血清(FCS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(STEMCELL Technologies)中压碎腿骨，从小鼠骨髓中纯化谱系阴性HPC，用磁性活化细胞分选(MACS)缓冲液(PBS，2mM EDTA，0.5％BSA，无菌并过滤)加满至40ml，并以800g离心2分钟。将细胞重悬于PE缀合的混合物(20μl抗-B220(A3-6B2)、抗小鼠CD2(RM2-5，抗Ter119(TER119)和抗NK.1.1(PK136)和5μl抗CD11b(M1/70)和抗GR-1(RB6-8C5)抗体(均得自Bioscience))中在4℃下孵育5分钟，离心并在4℃下重悬于抗PE微珠中15分钟。将细胞在MACS缓冲液中洗涤并通过MACS柱。这允许负面选择HPC。谱系去除后，使用流式细胞术分析50μl细胞以检查纯度。

[0407] 从HPC体外发育NK细胞

[0408] 将HPC接种于24孔板中，以5×105HPC/孔的浓度在1ml完全细胞因子培养基(Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)(Sigma Aldrich)，10％FCS，50μMβ-巯基乙醇，10ng/ml Flt3配体(Flt3L)(R&D Systems)，10ng/ml IL-7(R&D Systems)，100ng/ml干细胞因子(SCF)(R&D Systems)和1％P/S)中在37℃，5％CO2下接种和培养2天。然后将HPC在小鼠NK细胞分化培养基(Alpha-MEM(Sigma Aldrich)加20％FCS，1％P/S和30ng/ml IL-15)以4500细胞/孔转移到OP9细胞上用于96孔板实验和3x104细胞/孔用于24孔板实验。将细胞在37℃，5％CO2培养7天，在第3天或第4天更换小鼠NK细胞分化培养基。

[0409] 人脐带血祖细胞的体外发育

[0410] CD34+脐带血祖细胞由Anthony Nolan Research Institute，University College London提供。从全脐带血中分离这些细胞，并在液氮中冷冻保存用于储存和运输。
将细胞解冻，计数，然后在人NK细胞分化培养基(Alpha-MEM加20％人AB血清(Invitrogen)、
50μMβ-巯基乙醇和1％％P/S以及5ng/ml人IL-3(Peprotech)、20ng/ml人IL-7(Peprotech)、
10ng/ml人-Flt3-L(Peprotech)、20ng/ml人-SCF(Peprotech)和10ng/ml人IL-15
(Peprotech)中以1000个细胞/孔的浓度在预先制备的EL08.1D2板上接种。注意，人IL-3仅
2
在培养的第一周需要。将细胞在37℃，5％CO下培养14或16天，在第7天和第12天更换人NK分化培养基。

[0411] 流式细胞术

[0412] 将通过流式细胞术分析的细胞通过40μm细胞过滤器以除去团块并用PBS缓冲液洗涤，以800g离心2分钟并重悬于100μl荧光活化细胞分选(FACS)缓冲液(PBS加1％BSA)和合适的荧光染料缀合的抗体中，稀释度为1/300。细胞用以下抗体染色，所有抗体均为抗小鼠并且来自eBioscience，除非另有说明：2B4(克隆m2B4(B6)458.1；BioLegend)、CD2(RM2-5)、CD3(17A2)、CD11b(Ml/70)、CD19(1D3)、CD27(LG.7F9)、CD122(TM-bl)、CD127(A7R34)、B220(RA3-6B2)、ckit(ACK2)、Flt3(A2F10)、Gr1(RB6-8C5)、NK1.1(PK136)、Seal(D7)、Terll9(TER119)、NKp46(29A1.4)抗人CD45(HI30)、抗人CD2(RPA-2.10)和抗人CD56(CMSSB)。谱系混合物含有B220、CD2、CD11b、Gr1、NK1.1和Terll9。将细胞在黑暗中在4℃染色30分钟，然后用2ml FACS缓冲液洗涤，离心并重悬于300μlFACS缓冲液加碘化丙啶(PI)中，稀释度为1/300。使用LSRFortessaTM细胞分析仪(Becton Dickinson Bioscience)进行流式细胞分析，如所示使用FACSAria(Becton Dickinson)分选，并使用FlowJo 软件进行完整数据分析。

[0413] 聚合酶链反应(PCR)

[0414] 单独的PCR反应含有200μMdNTPS，1μM正向引物(引物A)，1μM反向引物(引物B或C)和0.5U Taq聚合酶。PCR反应设定为以下条件：94℃3分钟(1个循环)；94℃30秒，59℃3秒，72℃45秒(40个循环)；72℃3分钟(1个循环)；保持在4℃。

[0415] DNA电泳

[0416] 使用溶于TAE缓冲液加500ng/ml溴化乙锭(Sigma)的1％琼脂糖(Sigma)进行DNA电泳。通过凝胶电泳分析从PCR反应获得的DNA，在100伏特下进行约45分钟。使用EC3成像系统(Ultra Violet Products Ltd)对凝胶成像。

[0417] RNA纯化

[0418] 使用Qiagen RNeasy MiCro Kit根据制造商的方案(Qiagen)提取RNA。以8000g离心15秒，并弃去流出物。简言之，将350μl缓冲液RLT+10％β-巯基乙醇加入到收获的细胞中。使用300μl 70％乙醇进一步沉淀RNA，并转移至RNeasy MinElute Spin Column并离心。接下来，将350μl缓冲液RW1加入MinElute Spin Column并离心。然后加入10μl DNaseI(Qiagen)和70μl缓冲液RDD(Qiagen)，并在室温下放置15分钟。加入350μl缓冲液RW1以洗去DNase I并离心。然后将500μl缓冲液RPE加入柱中并离心，然后加入500μl 80％乙醇并离心
2分钟。最后，加入14μl不含RNase的水以洗脱RNA，并将柱以全速旋转1分钟。使用Nanodrop测量每个样品中RNA的浓度，并将所有样品稀释至相同的工作浓度。

[0419] 逆转录(将RNA转化为eDNA)

[0420] 使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis试剂盒(Roche)进行逆转录。按照制造商的方案，制备用于一个20μl反应的模板-引物混合物，其中所有试剂在试剂盒中提供：RNA(1μg至5μg)，2μlRandom Hexamer Primer，向反应中注入水(PCR级)达至多13μl。
接下来，通过在65℃下加热管10分钟使模板-引物混合物变性以除去RNA二级结构。向该模板-引物混合物中加入4μlTranscriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer，0.5μl Protector RNase Inhibitor，2μl Deoxynycleotide Mix和0.5μl Transcriptor Reverse Transcriptase。将试剂混合并置于具有以下设置的热循环仪中：25℃，10分钟；55℃，30分钟；85℃，5分钟，并在4℃储存。

[0421] 使用实时qPCR定量靶向表达的RNA

[0422] 温度(℃) 时间95 20分钟
95 3秒
96 30秒

[0423] 用于RT-qPCR的条件

[0424] 使用稀释至1，1∶10，1∶100，1∶1000和1∶10000的脾细胞cDNA构建标准曲线。向前一步骤中产生的2μl cDNA，5μl Taqman master mix(Applied Biosystem)，0.5μl Hprt、Nfil3、Id2或Eomes的Taqman基因表达测定试剂盒(AppliedBiosystem)和2.5μl不含RNase的水。使用的程序如表1所示，反应进行47个循环。

[0425] 使用6His-SUMO HeLa细胞分析体内SUMO化

[0426] 用pCMV-E4BP4或pCMV(空载体)转染HeLa细胞系6His-SUMO-1、6His-SUMO-2、6His-SUMO-3和亲本HeLa细胞。除去输入样品后，在Ni2+亲和纯化之前，将剩余的细胞在6M胍-HCl2+
中裂解。将Ni NTA琼脂糖珠(Qjagen)与细胞裂解物在4℃下孵育过夜(O/N)。用8M尿素洗涤样品，用200mM咪唑洗脱His-标记的蛋白质。

[0427] FLAG-E4bp4的免疫沉淀

[0428] 使用引物将E4bp4 cDNA克隆到pCMV-script vector(Promega)中，以在起始密码子后掺入5’FLAG标签。用pCMV-FLAG-E4bp4或pCMV(空载体)转染HeLa细胞系6His-SUM01、6His-SUM02和6His-SUM03。使用两步裂解方案裂解细胞，并将裂解物与抗FLAG M2亲和凝胶(Sigma Aldrich)O/N在4℃下孵育。离心样品并除去上清液。用TBS(50mM Tris-HCl、50mM NaCl，pH7.4)洗涤各样品，然后用Laemmli样品缓冲液洗脱纯化的物质。

[0429] 蛋白质印迹法

[0430] 将细胞裂解物和蛋白质样品与Laemmli样品缓冲液1∶1混合，并通过在5％β-巯基乙醇中煮沸来还原。将样品在8％聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移至PVDF膜，并用针对以下的一抗进行探测：E4bp4(C18；Santa Cruz Biotech)，SUM02/3(AbCam)，FLAG(M2；Sigma Aldrich)，6X-His(4D11；AbCam)，α-微管蛋白(DM1A；eBioscience)，RanGAP1(AbCam)，组蛋白H3(AbCam)。将合适的HRP缀合的二抗(Abam)与Western Lightning Plus-ECL检测试剂(Perkin Elmer)一起使用以确定化学发光。使用ChemiDocTM XRS+系统(Bio-Rad)数字化获取暴露印迹的图像。

[0431] 定点突变

[0432] 使用 XL定点突变试剂盒(Agilent)和适当设计的引物，在pCMV-script表达载体中，在E4bp4 cDNA(K10R、K116R、K219R、K337R、K394R、S286A、S301A和S353A)中进行单碱基对突变。还将每种突变体克隆到pMSCV-IRES-hCD2逆转录病毒表达载体中。还将5X-SUMO和S286-353A突变体克隆到慢病毒表达载体pCSGW中。

[0433] 质谱分析

[0434] 使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)，用pCMV-FLAG-E4bp4和pCDNA3-VP35转染293T细胞。埃博拉病毒VP35蛋白的存在有助于增强重组蛋白的表达。使用抗FLAG M2亲和凝胶(Sigma Aldrich)从全细胞裂解物中免疫沉淀E4bp4。使用150ng/μl FLAG肽(Sigma Aldrich)洗脱结合的物质。使用真空离心浓缩纯化的E4bp4，并重悬于100mM碳酸氢铵(pH 8)中。用5mM二硫苏糖醇还原样品，并用14mM碘乙酰胺标记还原的半胱氨酸。蛋白质组学分级胰蛋白酶(Promega)用于在37℃下消化E4bp4蛋白6小时。对于SUMO化的肽分析，将样品在室温下用GluC(Roche)依次消化6小时。

[0435] 使用TiO2(GL科学)富集磷酸化肽，并用150mM氢氧化铵和50％乙腈(v/v)(Millipore)洗脱磷酸肽。在Ultimate 3000RS-LC-纳米系统(Dionex)上用Acclaim
PepMap100，C18固定相(Thermo Fisher)对肽进行色谱分离。在LTQ Velos Pro线性离子阱(Thermo Scientific)上获得实时串联质谱。使用Proteome发现者1.3(Thermo Fisher)中的Sequest搜索对小鼠Uniprot数据库(访问时间：19/08/14)进行LC-MS/MS数据的初始磷酸肽鉴定，包括动态侧链修饰，包括丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上的磷酸化(+79.966)。然后使用用于磷酸化位点鉴定的算法验证推定的磷酸肽并人工评估准确性。

[0436] 使用数据依赖性采集和靶向MS/MS扫描的混合物分析SUMO化肽，以基于GGTQQFV的SUMO标签搜索含有SUMO化的推定位点的肽。具体地，总是针对以下m/z值收集靶向MS/MS扫描，其对应于预测具有SUMO化赖氨酸的E4bp4肽：K10m/z 2+＝531.99；K116m/z 2+＝796.49；K219m/z 2+＝853.54；K337m/z 2+＝825.52)。

[0437] 环己酰亚胺时程

[0438] 用pMSCV-E4bp4-hCD2(或E4bp4突变体形式)稳定转导3T3细胞，48小时后对细胞进行分批以进行高hCD2表达。将转导的细胞系与50μg/ml环己酰亚胺(Sigma-Aldrich)一起孵育0-16小时。使用NE-PER提取试剂(Pierce)为所有样品制备核提取物。

[0439] 荧光素酶测定

[0440] 使用含有萤火虫荧光素酶报告基因和Dual- reporter assay system(Promega)的pGL3-E4bp4-CS载体24分析E4bp4转录活性。用pMSCV-E4bp4-hCD2、pGL3-E4bp4-CS(或空载体)和pRL-CMV(标准化对照)转染3T3细胞。48小时后，裂解细胞并使用Dual- reporter assay system测定荧光素酶活性。

[0441] 定量PCR

[0442] 用pCSGW-E4bp4(或E4bp45X SUMO或E4bp4 S286-353A突变体)转导MNK-1细胞。使用RNeasy mini试剂盒(Qjagen)分离RNA，使用第一链cDNA合成试剂盒(Roche)合成cDNA。使用TaqMan(Life Technologies)测定法对Hprt1(Mm00446968_ml)、E4bp4(E4bp4；Mm00600292_s1)、Eomes(Mm01351985_ml)、Gata3(Mm00484683_ml)、Notch1(Mm00435249_ml)和T-bet(Tbx21；Mm00450960_ml)进行QPCR。使用Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR system分析样品。将来自样品的Ct值与由已知浓度的质粒DNA(Eomes、T-bet、Gata3)或来自已知数量的鼠脾细胞(Notch，Hprt1)的cDNA制成的标准曲线进行比较。将所有基因的表达标准化为Hprt1。

[0443] 染色质免疫沉淀

[0444] 使用Matlnspector(Genomatix)在Notch1的调节区域中搜索推定的E4bp4结合位点(T(T/G)A(T/C)GTAA)。用表达FLAG-E4bp4的慢病毒转导MNK-1细胞并进行ChIP免疫沉淀。简而言之，用IgG(EM DMillipore)，针对FLAG的M2抗体(Sigma-Aldrich)或针对E4bp4的多克隆F16抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)免疫沉淀蛋白质-DNA复合物。使用SYBR Select master mix(Life Technologies)和设计用于识别推定的E4bp4结合区域的引物扩增纯化的DNA(表2)。

[0445] 区域正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’) 扩增子(bp)Notch1 A CTATATTTTTGCCTTGACAGCTAAAG GAAGTACGAAGCATGCTTGC 168
Notch1 B CACATCTGTGAGCTATTTTTGG GACTGACTAAACTAACATTCCCAC 170
Notch1 C CTCAGAAACTGGCCTCAAGC CACTTGCAGTCAGGCGTTC 144
Notch1 D CACGCCATCTTAAAGAGCTC GTAACCAACTGCACTCTTCTCC 135
Notch1 E CACCAAGAATTCCCAGGAG GAGTGCAGTCACGTGCTGAC 144
Notch1 F CTCAGACTCTCTCGGTAAGTGTC CGTGTGGAGCTACTCTGGC 160

[0446] 表2：用于扩增Notch1基因座中推定的E4bp4结合区的引物

[0447] 从转导谱系阴性骨髓细胞体外发育NK细胞

[0448] 从小鼠腿骨中分离Lin-BM细胞，并在补充有10％FCS(Stemcell Technologies)、50μMβ-巯基乙醇(Gibco)、10ng/ml Flt3L(PeproTech)、10ng/ml IL-7(PeproTech)和
100ng/ml SCF(PeproTech)的DMEM中培养。48小时后，用8μg/ml Polybrene在700g和20℃下通过旋转感染转导细胞45分钟。对于阳性对照，用含有WT E4bp4的pMSCV-1RES-hCD2转导细胞。将转导的细胞培养72小时，然后重悬于补充有20％FCS、β-巯基乙醇和30ng/mlIL-15(PeproTech)的α-MEM中，并重新接种在OP9基质细胞上再培养7天。。

[0449] 为了研究Notch1信号传导，将Lin-BM细胞培养在OP9、OP9-DL1或预包被有rDLL1(R&D Systems)或rDLL4(R&D Systems)的板上。将板用10μg/ml rDLL1/rDLL4在室温下预包被3小时。将细胞在补充有10％FCS、β-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠、25mM HEPES的α-MEM中孵育，并在前7天用Flt3L、IL-7和SCF孵育。在IL-15存在下，在OP9或OP9-DL1上将细胞再培养7天。

[0450] Rbpjflox/floxLin-BM细胞在分离当天用共表达hCD2的pCSGW-Cre(或空载体)进行慢病毒转导。通过旋转感染转导细胞，并在Flt3L、IL-7和SCF存在下培养两天。将细胞转移到rDLL4包被的板上再培养3天或直接转移到OP9上。用IL-15在OP9上培养细胞7天。对于流式细胞术分析，对所有细胞进行门控以进行hCD2表达以鉴定用慢病毒转导的群。

[0451] 统计分析

[0452] 使用GraphPad Prism 7中的Mann-Whitney检验进行统计学分析。

[0453] 讨论

[0454] NK细胞是能够产生细胞因子，影响其他免疫细胞以及直接杀死癌细胞、病原体感染细胞或受损细胞的淋巴细胞。由于这些特性，研究人员有兴趣增加NK细胞的数量，以增强对癌细胞或病原体感染细胞的细胞毒性。NK细胞从骨髓中的HSC发育，并受到涉及各种转录因子和细胞因子的严格调节过程的控制。E4bp4是调节NK细胞发育的最关键基因。尽管在NK细胞发育过程中E4bp4mRNA水平仅有相对较小的增加，但E4bp4对NK细胞的产生具有深远的影响。关于控制E4bp4蛋白活性的任何手段知之甚少。控制E4bp4表达的能力将对NK细胞的发育和产生具有非常重要的意义。

[0455] 本发明先前已经证明，在施用SR8278后，NK细胞产生测定中NK细胞的产生增加超过2倍。在进行的测定中，将SR8278添加至用于体外NK细胞产生的HPC培养物的最佳时间是在第2天，并且最佳剂量是10μM。还发现添加SR8278显着增加体外培养的人HPC的人NK细胞发育。

[0456] 本发明人已经证明E4bp4蛋白具有多个SUMO修饰并且主要被SUM02/3同种型修饰。K219作为SUMO修饰的内源位点。E4bp4蛋白的MS分析也显示它在三个位点：S286、S301和S353被磷酸化。

[0457] E4bp4在NK细胞发育中起重要作用，其在CLP中的表达需要将发育中的细胞送入NK细胞谱系。本发明人已经表明，E4bp4的SUMO化和磷酸化位点对E4bp4的活性和NK细胞发育具有显着影响。当比较WT形式的E4bp4与缺乏SUMO化或磷酸化位点的突变体形式的活性时，发现突变体形式一致地促进更高水平的NK细胞产生。本文报道的两种类型的翻译后修饰以类似的方式起作用以在NK细胞产生期间负调节E4bp4的活性。先前已证实E4bp4是NK细胞发育的限制因子，因为用E4bp4转导E4bp4+/+Lin-BM细胞导致NK细胞产生水平增加3，5。用突变形式的E4bp4转导E4bp4+/+细胞也增加了NK细胞的产生，但是比WT形式的E4bp4程度更大。这表明SUMO化和磷酸化均负调节E4bp4的活性，因为去除这些修饰的位点增加了E4bp4活性并最终增加了NK细胞的产生。由于E4bp4对NK细胞发育至关重要，因此其活性很可能受到多种机制的严格控制，因为异常活性可能导致造血功能缺陷。没有其他充分表征的实例，其中单个转录因子的PTM可以对复杂的生物过程如谱系发育具有如此显著的效果。

[0458] 发现SUMO化和磷酸化均抑制E4bp4的转录活性，无论其是否活化或抑制转录。比较了WT形式的E4bp4和PTM突变体形式对已知调节淋巴承诺的转录因子的表达的影响。该比较的显著结果是Notch1表达在WT形式的E4bp4存在下被上调，但是在E4bp45X-SUMO突变体和S286-353A磷酸化突变体的存在下该表达显著进一步增强。

[0459] 之前已经提出由外部配体活化的Notch信号传导在鼠和人NK细胞的发育中起作用。其必须在NK细胞发育的早期阶段短暂起作用，因为延长的信号传导诱导T细胞发育。发明人已经显示Cre介导的HPC中Rbpj的缺失导致NK细胞发育受损，这是Notch在NK细胞发育中的内在作用的首次报道。特别地，本文的数据证明Notch信号传导显着增强NK细胞发育。
特别地，在其造血细胞中具有条件性缺失Notch1的小鼠没有显着减少的NK细胞数量。这可能是因为条件性敲除细胞中的E4bp4介导的转录网络保持完整并且可以补偿Notch1的缺乏。Notch1缺失可能会使NK细胞发育的早期阶段受到一定程度的损害，但稳态过程可能导致正常数量的外周NK细胞在稳态条件下积累。

[0460] 与Notch一样，E4bp4在早期淋巴细胞发育期间是需要的，并且必须在CLP中表达以将其送入NK谱系，然而其对于成熟NK细胞的成熟和功能是不必要的。E4bp4和Notch1对于其他先天淋巴细胞类型的发育也很重要，例如，淋巴组织诱导(LTi)细胞，其中Notch信号传导需要参与LTi发育途径但需要稍后关闭以避免转移至T细胞命运。本发明人发现E4bp4转录调节Notch1，因为其直接结合Notch1基因的调节区，并且在不存在E4bp4的情况下，HPC中Notch1表达降低。E4bp4最显着地与Notch1的TSS上游1.8Kb的区域结合，其方式与已知调节Notch1表达的其他转录因子如DLX5和ERβ相似。引人注目的是，仅在NK细胞发育的早期部分期间增加的Notch信号传导足以完全拯救从E4bp4-/-祖细胞发育NK细胞。这有力地表明Notch1在NK细胞发育期间作用于E4bp4的下游。只有在NK细胞发育早期存在Notch配体时才能实现这种拯救。使用表达DLL1的OP9基质细胞和固定在塑料板上的rDLL1和rDLL4蛋白实现对E4bp4-/-祖细胞的拯救。rDLL4比rDLL1对NK细胞发育具有更大的效应，因为DLL4以比DLL1高得多的亲和力结合Notch1。

[0461] 由于Notch1配体在骨髓微环境中表达，似乎Notch信号传导在适当时间的可用性可以驱动NK细胞发育。与E4bp4类似，还发现Notch1调节Eomes48的表达，这可能是Notch1通过E4bp4调节的途径增强NK细胞发育的另一种手段。因此，此处显示的NK细胞数据表明通过E4bp4将外在信号与所有ILC产生的直接转录对照相关联的中心机制。

[0462] 总之，通过外源刺激如Notch配体控制E4bp4表达和/或活性对于用于免疫疗法的人NK细胞的产生具有重要意义。从各种来源(例如诱导多能干细胞和脐带血干细胞)产生NK细胞的常规方法涉及使用细胞因子和基质细胞使细胞进入NK谱系，但影响E4bp4表达和/或活性和/或Notch信号传导可以提供简单的策略来增强该过程。因此，单独地，特别是组合地控制E4bp4活性和/或表达和/或Notch信号传导在未来NK细胞免疫治疗产品的产生中具有潜在用途，包括在体内直接调动NK细胞产生作为免疫疗法。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种非线性动力学P2P网络蠕虫免疫预测方法	2020-05-17	589
一种蠕虫病毒的检测和防御方法和系统	2020-05-08	881
使用APRIL-TACI相互作用的调节剂调节调控性T细胞、调控性B细胞和免疫响应的方法	2020-05-08	651
用于提高废水流出物和生物固体的质量的系统、方法和设备	2020-05-12	471
新的二环吡唑衍生物	2020-05-14	960
養子免疫療法における抗原特異的T細胞と組み合わせた免疫チェックポイント調節剤の使用	2020-05-11	818
皮膚接触接着剤並びにその調製方法及び使用	2020-05-14	458
インターロイキン−1活性の阻害剤としての化学化合物	2020-05-11	198
Sbiタンパク質を含む免疫原性組成物およびその使用	2020-05-12	389
抗原に対する防御免疫の誘導	2020-05-11	239

自然杀伤细胞

自然杀伤细胞

技术领域

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：