発明の背景

本発明は、その大部分が生物において必要不可欠である多くの生物学的現象に関与しているクラスIIIのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ−III）の分野に関する。

より具体的には、本発明はＧＰＣＲ−IIIのアロステリックレギュレーターを同定および選択するための効果的な手段の開発の分野に属する。

このような趣旨で、本発明はＧＰＣＲ−IIIのアロステリックレギュレーターとして作用する化合物を同定および選択するための方法に関する。 この方法によれば、対応する天然ＧＰＣＲ−IIIの細胞外ドメインを本質的に欠いた組換えＧＰＣＲ−III（ＧＰＣＲ−III−Δ）の、ある化合物の存在下における活性レベルが、その化合物の不在下における同ＧＰＣＲ−III−Δの活性レベルと比較される。

従って、この方法によりＧＰＣＲ−IIIの活性化剤または阻害剤の同定および選択が可能となる。

また、本発明は薬学、農業食品産業、環境学、生態学および基礎研究といった多様な分野において重要な化合物の同定および選択のためのこのような方法の使用に関する。

ＧＰＣＲの７本ヘリックス膜ドメインの配列の比較により、これを３つの主要なクラスに分類することができる(Bockaert and Pin, 1999)。

クラスＩには、カテコールアミン受容体などのロドプシン様受容体、ならびに糖タンパク質およびペプチドホルモンの受容体が含まれる。

クラスIIは、グルカゴンおよびセクレチンなどの大きなペプチドに対する受容体のみならず、Ｆｒｉｚｚｌｅｄのような他の受容体も共に含み、発生に関与している。

ＧＰＣＲクラスIIIについては、２つの主要な神経伝達物質、すなわちグルタミン酸およびγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）により活性化される受容体、カルシウムイオンセンサーである受容体、推定されるフェロモン受容体、ならびに甘味および「旨味」（アミノ酸、とりわけグルタミン酸）を感知する受容体も含む。

本発明は、とりわけＧＰＣＲ−IIIに関する。

哺乳動物において、グルタミン酸活性化ＧＰＣＲ−III（グルタミン酸代謝調節型受容体またはｍＧｌｕ受容体とも呼ばれる）をコードする８つの遺伝子が同定されている(Conn and Pin, 1997; Pin et al., 2003)。 これらのｍＧｌｕは、それらの薬効薬理、配列類似性および情報伝達に基づいて３つのグループに分類することができる。

グループＩにおいては、ｍＧｌｕ１およびｍＧｌｕ５受容体はホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を活性化し、グルタミン酸チャンネル受容体と相乗的に働くと思われる。 多くの場合、それらはグルタミン酸による情報伝達を促進する媒介物であると思われる。

従って、グループＩのｍＧｌｕレギュレーターは、記憶を促進させる特性を有すると考えられ、アルツハイマー病または精神分裂病などの疾患の処置のために有用である。

グループIIの受容体、ｍＧｌｕ２およびｍＧｌｕ３は、ｍＧｌｕ４、ｍＧｌｕ６、ｍＧｌｕ７およびｍＧｌｕ８のグループIIIの受容体のように、アデニリルシクラーゼと負の共役をしている。 それらはまた、カルシウムチャンネルおよびカリウムチャンネルの活性を調節する。 多くの場合、それらはシナプス前に位置しており、それゆえにグルタミン酸放出を阻害する。

実際、グループIIまたはIIIのｍＧｌｕのアゴニストまたは正のアロステリックレギュレーターは、抗不安、抗癲癇、抗精神病および抗パーキンソン病特性を示し、タバコおよびコカインなどの薬物依存性作用を低減させることができる (Conn and Pin, 1997)。

カルシウムイオンによって活性化される受容体をコードする単一の遺伝子が同定されている(Brown and MacLeod, 2001)。 この受容体は、パラトルモンの放出、骨によるカルシウム吸収、および腎臓におけるカルシウム排泄を制御することにより血中カルシウムレベルの調節において重要な役割を果たす。 また、この受容体は中枢におけるレベルを調節する役割も担っていると考えられている。 この遺伝子における突然変異は、家族性低カルシウム尿症、重篤な新生児副甲状腺機能亢進症（突然変異による機能喪失）(Pollak et al., 1993) 、または常染色体優性低カルシウム血症（突然変異による機能獲得）(Pollak et al., 1994) などの疾患を引き起こす。 さらに、これらの受容体により骨粗鬆症などのある種の疾患を治すことが可能となる。

今日まで、ＧＡＢＡ _Ｂ受容体をコードする遺伝子は、ＧＢ１およびＧＢ２のわずか２つしか同定されていない。 しかし、ＧＢ１およびＧＢ２を単離しても、いずれか一方だけでは機能性ＧＡＢＡ _Ｂ受容体を形成することができない。 実際、この２つのタンパク質の連携は、内因性受容体に類似する特性を有する受容体の形成のために必要である(Marshall et al., 1999)。

このＧＡＢＡ _Ｂ受容体は、ヘテロ二量体型においてのみ機能することが発見された最初のＧＰＣＲである。 従って、ＧＡＢＡはＧＢ１のみに結合することが示されており(Kniazeff et al., 2002)、また、ＧＢ２はＧＢ１の表面へのターゲッティングのために必要である(Pagano et al., 2001)。 ＧＢ２はまた、ＧＢ１上のアゴニストの高親和性のために必要である(Kaupmann et al., 1998)。 さらに、ＧＢ２はＧタンパク質共役のために不可欠である (Duthey et al., 2002)。

従って、ＧＡＢＡ _Ｂ受容体は、それらの活性化メカニズムにおけるＧＰＣＲ二量体化を研究するための優れたモデルとなる。

さらに、この受容体を制御する薬剤は、癲癇、およびある種の疼痛に対する新規治療法の開発を可能にするであろう。

また、ヘテロ二量体型におけるＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３味覚受容体の機能が示されている(Nelson et al., 2002)。 これらの受容体は、アスパルテームなどの甘味料を含む甘味分子の検出に関与している。 これらの受容体を調節する薬剤の開発は、農業食品産業において興味深いものである。

通常の意味によれば、ＧＰＣＲ−IIIの活性部位に結合する「オルトステリック」リガンドは、ＧＰＣＲ−IIIの活性部位以外の結合部位に結合できる「アロステリック」レギュレーターとは区別される。 この場合、ＧＰＣＲ−IIIの活性部位は細胞外ドメインにより担持される。 アロステリックレギュレーターはＧＰＣＲ−IIIの膜ドメインに結合する。

通常、「アゴニスト」は、それ自体、受容体の活性を増大させることができる分子である。

「アンタゴニスト」は、アゴニストの活性化作用を阻害することができる分子である。 アンタゴニストの中でも、オルトステリック部位に作用する「競合的アンタゴニスト」は、アロステリック部位に作用する「非競合的アンタゴニスト」とは区別される。

「インバースアゴニスト」は、受容体の構成的活性、すなわち、このような活性が効果的に測定できる場合に、アゴニストの不在下で測定できる活性を阻害できる分子である。 インバースアゴニストはアゴニストの作用を阻害することもできる。 従って、それはアンタゴニストでもある。

「正のアロステリックレギュレーター」は、アゴニストの作用を促進することのできる分子である。 このようなレギュレーターは、天然リガンドが結合するオルトステリック部位以外の部位に作用する。

本明細書において「アゴニストの作用を促進する」という表現は、該アゴニストの能力を増大させる（その結果、より低いアゴニスト濃度で同じ作用を引き起こすことができるようになる）、またはその効率を増大させる（すなわち、すべての受容体を占有するに十分な濃度である、アゴニストの飽和濃度により得られる最大反応を増大させる)ことを意味するものとする。

「負のアロステリックレギュレーター」は、オルトステリック部位以外の部位に作用することにより、アゴニストの作用を低下させることのできる分子である。 また、このようなレギュレーターは「非競合的アンタゴニスト」とも呼ばれる。 アンタゴニストの場合と同様に、負のアロステリックレギュレーターはインバースアゴニスト活性を有していても、有していなくともよい。

本発明において、「アゴニストの作用を阻害する」という表現と、「アゴニストの作用を低下させる」という表現は同等である。

現在知られているすべてのＧＰＣＲ−IIIは、天然リガンド（オルトステリックリガンド）の結合に関与する、「ハエジゴク」と呼ばれる細胞外ドメイン、およびＧタンパク質共役に関与し、アロステリックレギュレーターの標的である７本ヘリックス膜ドメインという、２つの異なるタンパク質ドメインから構成されるという特殊性を有する(Pin et al., 2003)（図１）。 これらの２つのドメインは高システイン領域により分離されている。

ＧＰＣＲ−IIIの第２の特徴は構成的二量体を形成する能力にあり、該二量体は、多くの場合少なくとも１つのジスルフィド架橋により互いに接続される。

その細胞外ドメインが切断された組換えカルシウム受容体の作製については、Ray and Northup (2002)により開示されている。 著者らは、ヒトＣａ ^２＋受容体のアロステリックレギュレーターとして作用することが知られている化合物を用いて、この受容体の膜貫通ドメインがリガンド結合およびそれに続く該受容体の活性化に関与する構造決定因子を包含するかどうかを詳しく調べた。 このようにして、著者らは、細胞外ドメインと同様に７本ヘリックス膜貫通ドメインが１以上のカルシウムイオン結合部位を含むことを明らかにした。 しかし、カルシウムイオンによる組換え受容体の活性化は、別のリガンドの存在下でのみ認められている。

これまでに報告されたＧＰＣＲ−IIIの正または負のアロステリックレギュレーターは、ハイスループットスクリーニング技術により同定されたものである。

「カルシミメティクス(calcimimetics)」は、カルシウム受容体活性を調節する能力を有することが明らかにされている(Nemeth et al., 1998; Hammerland et al., 1998; Hammerland et al., 1999)。

ＧＡＢＡ _Ｂ受容体の正のレギュレーター(Urwyler et al., 2001)、ｍＧｌｕ１受容体の正のレギュレーター(Knoflach et al., 2001)、さらには、ｍＧｌｕ５、ｍＧｌｕ２およびｍＧｌｕ４受容体の正のレギュレーターも、ｍＧｌｕ２００２会議の際に発表された(Taormina, Sicily, Italy, September 2002)。

今まで使用されたハイスループットスクリーニング技術によれば、ＧＰＣＲ−IIIを安定に発現する細胞系を用いて行われる機能試験を用いて、コンビナトリアルライブラリーがスクリーニングされる。 コンビナトリアルライブラリーに存在する化合物は、所定濃度のアゴニストの作用を増強する能力に関して試験される。

しかし、このようなアプローチは多数の困難に直面している。

第一に、これらの受容体を安定に発現する細胞系を入手する必要がある。 現在、とりわけグルタミン酸受容体の場合、このアミノ酸はすべての培地および血清中にも存在するために、これは難しい工程である。 さらに、それは大部分の細胞系により産生されている。 その結果、実際には、受容体が周囲のグルタミン酸により活性化されない十分低いレベルまで培地中のグルタミン酸濃度を減少させることは困難であり、不可能でさえあることがわかっている。

この問題を改善するために、Eli Lilly & Co.のグループはグルタミン酸に対して高親和性の輸送体を発現する細胞系を開発した（ＡＶ１２系をもとに確立されたＲＧＴ細胞）(Kingston et a1., 1998; Schoepp et al., 1997)。 こうして開発された細胞は、細胞外グルタミン酸濃度を制御する。 それらは、この濃度を、発現された受容体が培地中に存在するグルタミン酸により永続的に活性化されないように十分低い値に維持する。 このことは、この受容体を安定に発現する系の確立を容易にする。 しかし、このシステムには欠点がある。 実際、試験された化合物のうち、いくつかはグルタミン酸輸送体により取り込まれ、細胞中に輸送され、それらの濃度を減少させ、それらの受容体に対する正常な作用を妨げることができる。 さらに、試験されたうちのいくつかの分子のグルタミン酸輸送体阻害能は、スクリーニングテストを行う上で困難をもたらし得る。 そのような場合、グルタミン酸濃度は増加し、その結果、受容体の活性の人為的な増大がもたらされる。 このため、この化合物は、たとえそれが真の正のアロステリックレギュレーターではなくても、受容体の正のアロステリックレギュレーターであるかのように見える。 このため、二次スクリーニングが必要となる。

第二に、アロステリックレギュレーターは、かなり頻繁に、ＧＰＣＲ−IIIが低用量のアゴニストにより同時に活性化されていなければ、ＧＰＣＲ−IIIに対し何の影響も及ぼさない。 従ってアゴニストを加える必要性があるため、再現性があり、信頼できる選択試験の開発はより困難となる。 実際には、どの濃度でアゴニストを用いるべきかという疑問が生じる。 もしその濃度が十分でなければ、または逆に高すぎれば、アロステリックレギュレーターの作用はおそらく検出できないであろう。 さらに、アゴニストの存在のためにベースラインの反応が増大し、これによりアロステリックレギュレーターの反応のシグナル／ノイズ比は低下する。

本発明は、特に、その細胞外結合ドメインが除去された組換え受容体の使用により、前記のすべての問題の回避を可能にする。

実際のところ、本発明は、ＧＰＣＲ−IIIの膜ドメインが、対応する野生型の受容体を用いる際に認められた親和性に匹敵する親和性を有し、アロステリックレギュレーターの結合に十分であることを初めて実証するものである。

従って、これらの組換え受容体は、グルタミン酸に対する感受性を有していない。

本発明においては、全く驚くべきことに、アロステリックレギュレーターが組換え受容体の真のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し、この点は有利である。

実際、切断された受容体に対するある分子のアゴニスト作用の試験を行う場合、対応する野生型受容体に対する該分子の正のアロステリックレギュレーター作用の試験よりも簡単であるために、この後者の特徴は本発明に重要な利点を与える。

従って、このような組換え受容体が細胞により安定に発現され得ることは有利である。 さらに、さらなるアゴニストの存在は不必要であることがわかっている。 最後に、これらの組換え受容体を用いる本発明による方法によって、より優れたシグナル／ノイズ比を得ることが可能となる。

本発明の第一の態様によれば、ＧＰＣＲ−IIIのアロステリックレギュレーターとして作用する化合物を同定および選択するための方法が提供される。

本発明において「化合物」は、任意の種類の生物学的または化学的な、天然、組換えまたは合成分子であると定義される。 例えば、化合物は、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）、タンパク質、脂肪酸、抗体、多糖類、ステロイド、プリン、ピリミジン、有機分子、ラジカル化学物質などであってよい。 「化合物」という語はまた、ＧＰＣＲ−IIIのアロステリックレギュレーターとして作用する限りにおいて、フラグメント、誘導体、構造的類似体またはそれらの組み合わせも含む。

ＧＰＣＲ−IIIのアロステリックレギュレーターとして作用する能力は、本発明による方法を実施することにより同定および選択された化合物の重要な特性である。

この方法は、少なくとも以下に示す工程：
ａ）対応する天然ＧＰＣＲ−IIIの細胞外ドメインを本質的に欠いた組換えＧＰＣＲ−III（ＧＰＣＲ−III−Δ）を製造する工程；
ｂ）前記化合物を該ＧＰＣＲ−III−Δと接触させる工程；
ｃ）該化合物の存在下で該ＧＰＣＲ−III−Δの活性レベルＮ _１を測定する工程；
ｄ）工程ｃ）で測定されたレベルＮ _１と、該化合物の不在下におけるＧＰＣＲ−III−Δの活性レベルＮ _０とを比較する工程；およびｅ）Ｎ _１がＮ _０と有意に異なる場合に、前記アロステリックレギュレーターを同定および選択する工程を含んでなり、本方法では、前記アロステリックレギュレーターは前記ＧＰＣＲ−III−Δのアゴニストまたはアンタゴニスト（またはインバースアゴニスト）のように作用する。

前記ＧＰＣＲ−III−Δは、前記天然ＧＰＣＲ−IIIの細胞外ドメインを完全に欠いていることが有利である。

上記の方法を実施することにより、ＧＰＣＲ−IIIの７本ヘリックス膜ドメインに結合することによってアロステリックレギュレーターとして作用する化合物を同定および選択することが可能となる。

本発明による方法の第一の実態態様によれば、Ｎ _１がＮ _０よりも有意に大きい場合には、その化合物はＧＰＣＲ−III−Δのアゴニストのように作用し、該化合物は完全な受容体の正のアロステリックレギュレーターである。

本発明による方法の第二の実態態様によれば、Ｎ _１がＮ _０よりも有意に小さい場合には、その化合物はＧＰＣＲ−III−Δのインバースアゴニストのように作用し、該化合物は完全な受容体の負のアロステリックレギュレーターである。

本発明において、ＧＰＣＲ−III−Δ活性レベルの測定は、当業者に公知の任意のＧＰＣＲ−IIIの活性を測定するために好適な従来の方法を用いて行うことができる。 これらの方法のうち、例として、イノシトールリン酸産生レベルの測定（ＩＰｓ；以下の実験の項を参照；Berridge, 1983; Brandish et al., 2003)、ＧＴＰγ結合の測定 (Milligan, 2003)、Ｆｌｕｏ３またはＦｌｕｏ４などの蛍光マーカーを用いる、細胞内カルシウムシグナルの測定、およびＣＡＭＰ産生の測定が挙げられるが、後者の２つの方法は従来の方法であり当業者に十分公知である。

本発明による方法は、
ターゲティングシグナルを含まない７本ヘリックス膜ドメイン；または ターゲティングシグナルおよび７本ヘリックス膜ドメインを含んでなるＧＰＣＲ−III−Δを用いて行うことができる。

本発明において、「ターゲティングシグナル」という語は、原形質膜中への受容体の正確な挿入を可能にする、さまざまな長さの、一般に約１５〜３５残基のアミノ酸配列を意味するものとする。 特に、このようなターゲティングシグナルは、
通常の意味のシグナルペプチド；または 特にウシ由来のロドプシンのＮ−末端の最初の２０アミノ酸 (Ray and Northup, 2002)
としてもよい。

前記ターゲティングシグナルがシグナルペプチドである場合、このシグナルペプチドは、対応する天然ＧＰＣＲ−IIIのシグナルペプチド、または異なる野生型ＧＰＣＲ−IIIのシグナルペプチド、あるいは任意の公知のシグナルペプチドであってよい。 好ましくは、該シグナルペプチドは、対応する天然ＧＰＣＲ−IIIのものである。

前記方法の工程ａ）は、少なくとも以下に示す下位工程：
ａ１）前記ＧＰＣＲ−III−Δの前記膜ドメインをコードする核酸のＰＣＲ増幅；
ａ２）その増幅産物の組換え発現ベクター中へのクローニング；
ａ３）該組換えベクターの組換え宿主細胞中へのトランスフェクション；およびａ４）該組換え宿主細胞による該ＧＰＣＲ−III−Δの産生を含むことが有利である。

特に、ターゲティングシグナルを用いる場合、下位工程ａ２）では、その増幅産物が、組換え発現ベクターの、該ターゲティングシグナルをコードする核酸の下流にクローニングされる。

目的のＧＰＣＲ−IIIが、その細胞内部分中に、ＧＰＣＲ−IIIを小胞体内に保持することを担うシグナルを有する場合(Pagano et al., 2001)、ＧＰＣＲ−IIIを原形質膜にターゲティングさせるために、当業者に公知の従来の突然変異誘発法を用いて、前もって突然変異によりこのシグナルの機能を失わせておくことが望ましい。

ＧＰＣＲ−III−Δの膜ドメインをコードする核酸の発現、またはターゲティングシグナルおよびＧＰＣＲ−III−Δの膜ドメインをコードする核酸の同時発現を、組換えベクターにより担持される強力なプロモーターの制御下に置くことが有利である。

この目的のために、当業者ならば任意の公知の強力な転写プロモーターを使用することができる。 例えば、このような強力なプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ；図２参照）またはＳＶ４０ウイルスプロモーターであってよい。

ＧＰＣＲ−III−Δ 受容体を構築するために、当業者ならば多くのベクターを入手できる。 好適な従来のベクターは、とりわけ、ｐＲＫ５−ＮＨＡベクター（以下の実験の項参照）、ｐｃＤＮＡ３ベクター(Invitrogen)、およびｐＣＩベクター(Promega)である。

さらに、本発明による方法を実施するために、当業者は、組換え宿主細胞として、タンパク質の異種発現を可能にする任意の種類の細胞を使用することができる。 当業者は、とりわけ、酵母細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＯＳ細胞などの真核細胞、および細菌などの原核細胞から選択してもよい。

本発明では、前記方法を実施するために使用されるＧＰＣＲ−IIIは、
グルタミン酸活性化受容体；
ＧＡＢＡ活性化受容体；
カルシウムイオン活性化受容体；
推定されるフェロモン受容体；および 味覚受容体からなる群から選択される。

好ましくは、前記ＧＰＣＲ−IIIは、
グルタミン酸活性化受容体；
ＧＡＢＡ活性化受容体；
推定されるフェロモン受容体；および 味覚受容体から選択される。

特に、前記ＧＰＣＲ−IIIはグルタミン酸活性化受容体であり、好ましくはｍＧｌｕ１、ｍＧｌｕ２またはｍＧｌｕ５受容体である。

あるいは、前記ＧＰＣＲ−IIIはＧＡＢＡ−活性化受容体であり、好ましくはＧＢ２サブユニットである。

本発明の第二の態様によれば、多様な分野、特に薬学、生態学、および環境学、農業食品産業、研究などの分野における前記方法の使用が提供される。

第一の実態態様によれば、本発明は、ヒトをはじめとする哺乳動物において予防的および／または治療的処置を行うために有用な化合物を同定および選択するための、上記で定義された方法の使用に関する。

特に、このような化合物は以下の疾患：
アルツハイマー病、精神分裂病、神経疾患、鬱病、癲癇、精神病、薬物依存症（グルタミン酸活性化ＧＰＣＲ−III）；
骨粗鬆症（カルシウム−活性化ＧＰＣＲ−III）；
癲癇、疼痛（ＧＡＢＡ−活性化ＧＰＣＲ−III）
のうちの少なくとも１種の疾患に関する処置を行うために好適である可能性がある。

第二の実態態様によれば、本発明は、昆虫および蠕虫などの、そのゲノムが少なくとも１つのＧＰＣＲ−IIIを含む(Parmentier et al., 1996; Pin et al., 2003)生物の増殖を増大または逆に減少させることを目的とする処置において有用な化合物を同定および選択するための前記方法の使用に関する。

第三の実態態様によれば、本発明は、より具体的には味覚受容体に関する。 この点に関し、本発明は、食品添加物として有用な化合物を同定および選択するための前記方法の使用に関する。

特に、このような食品添加物は、甘味料などの甘味、もしくは旨味を賦与するか、または甘味化合物検出の感度を高めることを目的とするものである。

添付の図面は単に本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。

以下、限定するものではないが、実験の項において具体例および図を用いて本発明を説明する。

実験の項
Ａ． ｍＧｌｕ５受容体Ｉ． 切断されたＧＰＣＲ−III受容体（ｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質）をコードするプラスミドの構築
５'末端および３'末端にそれぞれＭｌｕ−ＩおよびＸｂａ−Ｉ酵素の制限部位を含む、１番目の膜貫通ドメインの１１残基前に位置するＰ５６８残基と、７番目の膜貫通ドメインの３７残基後ろに位置するＬ８６４残基の間の、ｍＧｌｕ５受容体のｃＤＮＡの７本ヘリックス膜ドメインをコードする部分を、ＰＣＲにより増幅した（プライマー配列番号１および配列番号２）（図２）。 このようにして得られたＰＣＲ産物をＭｌｕ−ＩおよびＸｂａ−Ｉ酵素で消化し、ベクターｐＲＫ５−ＮＨＡへサブクローニングし（図２）、同じ酵素で消化した。 プラスミドｐＲＫ５−ＮＨＡは、ＨＡタグの末端からＸｂａＩ制限部位までのｍＧｌｕ５ 受容体をコードする配列をＭｌｕＩ制限部位と置換することにより、プラスミドｐＲＫＧ５ａ−ＮＨＡ(Ango et al., 1999)から得た。 従って得られたプラスミドは、ｍＧｌｕ５受容体のシグナルペプチドを有し、その後ろにＨＡタグ（ＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号３）、次いでその細胞内Ｃ末端ドメインの大部分が切断されたｍＧｌｕ５受容体の７本ヘリックス膜ドメインが続くタンパク質をコードする。 このタンパク質の発現は、ＨＥＫ２９３またはＣＯＳ細胞系へのトランスフェクション後にその一時的な発現を可能にする、強力なＣＭＶプロモーターの制御下に置かれている。

II． 結果
II． １． 切断されたｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質の機能的発現：
パートＩに記載された方法に従って構築されたプラスミドをＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションした後、抗−ＨＡ抗体により認識されたタンパク質の発現は、ウエスタンブロッティング法および免疫組織化学により確認できた（結果を以下に示す）。 さらに、トランスフェクトされた細胞は、それらが透過処理されなかったとしても抗−ＨＡ抗体を用いて標識した。 このＨＡエピトープはｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質のＮ−末端に挿入されており（図２を参照）、このため細胞外に位置し、このタンパク質が正確に原形質膜をターゲットとしていることは免疫組織化学により証明された。

ＨＥＫ２９３細胞における野生型ｍＧｌｕ５ 受容体とイノシトールリン酸（ＩＰ）産生経路との共役を分析したところ、この受容体はグルタミン酸の不在下であっても部分的に活性であることが示された(Joly et al., 1995)。 ｍＧｌｕ受容体の機能のモデルによれば、この受容体の構成的活性は、受容体の７本ヘリックス膜ドメインの不活性状態と活性状態の動的均衡に由来すると提案されている (Parmentier et al., 2002)。 この仮説に一致して、ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質の発現は、対照細胞で測定されるものよりも高いＩＰベースライン産生をもたらす。 グルタミン酸は受容体の外部ドメインに結合するという事実と一致して、この受容体は野生型ｍＧｌｕ５受容体を発現している細胞におけるＩＰ産生は刺激したが、ｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質を発現している細胞におけるＩＰ産生は刺激しなかった（図３）。

II． ２． 切断されたｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質の機能に対するアロステリックレギュレーターの作用：
野生型ｍＧｌｕ５受容体を発現している細胞におけるベースラインＩＰ産生 （受容体の構成的活性に対する対照）は、負のアロステリックレギュレーターＭＰＥＰにより阻害することができ(Pagano et al., 2000)、そのＩＣ５０（その最大作用の５０％を得るために必要な負のアロステリックレギュレーターの濃度）は５．７±０．６μＭ（ｎ＝４）である（図４）。 このＭＰＥＰの作用はまた、ｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質を発現している細胞に対しても観察され、そのＩＣ５０は９．８±２．５μＭ（ｎ＝３）（図４）であったが、この値と野生型受容体で測定された値との間に有意な差はなかった。 このことより、ＭＰＥＰは受容体の７本ヘリックス膜ドメインに作用し、細胞外ドメインはその見かけの親和性に影響を及ぼさないことが確認された。 この結果はまた、ｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質を発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるＩＰ産生のベースライン活性は、実際にはこのタンパク質の細胞内経路を構成的に活性化する能力に由来するものであることを証明した。

近年、ＤＦＢはｍＧｌｕ５受容体の正のアロステリックレギュレーターとして記載されている (Williams et al., 2002)。 ｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質に対するこの作用を検討するために、F. Acher (UMR University R. Descartes, rue des Saints Peres, Paris 5)によりＤＦＢが合成された。 公開されているデータによれば、インキュベーション培地中のグルタミン酸濃度を可能な限り低く保った条件下で、グルタミン酸輸送体ＥＡＡＣ１同時発現により、そしてインキュベーション培地へＧＰＴ酵素を添加（ピルビン酸（２ｍＭ）の存在下でグルタミン酸を分解する）することにより、ＤＦＢは野生型ｍＧｌｕ５ 受容体を有意に活性化しなかった（図５）。 一方、ＤＦＢはグルタミン酸およびキスカル酸アゴニストの作用を増強し、それらのＥＣ５０値を２分の１より小さい値に減少させる (その最大作用の５０％を得るために必要なアゴニストの濃度)（表１および図５）。 低濃度のアゴニストの存在下で、ＤＦＢは用量依存的にＩＰ産生を増加させ、そのＥＣ５０値は１．８１±１．０４μＭである。

下記の表１は、グルタミン酸およびキスカル酸のｍＧｌｕ５に対する作用のＤＦＢによる増強を示す。 ＥＣ５０値は、図５に記載された実験と類似した、ＤＦＢ存在下および不在下におけるグルタミン酸およびキスカル酸を用いる用量作用実験から決定した。 データは（ｎ回の）実験の平均±標準偏差に相当する。

ｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質を発現している細胞上で、ＤＦＢはＩＰ産生を刺激し、そしてアゴニストのように作用する（図６Ａ）。 このＤＦＢの作用は、用いたＤＦＢ濃度に依存し、そのＥＣ５０値は８．０±３．０μＭ（ｎ＝３）であり、これはグルタミン酸の野生型受容体に対する作用の増強に関して測定されたＥＣ５０値と全く差はなく、ＤＦＢは受容体の７本ヘリックス膜ドメインに作用することが確認された。 さらに、ＤＦＢの野生型受容体（データは示さず）およびｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質（図６Ｂ）双方に対する作用はＭＰＥＰにより阻害され、このことによりＤＦＢの作用はｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質に対するＤＦＢの働きの結果であることが確認された。

結果として、ｍＧｌｕ５受容体の７本ヘリックス膜ドメインの部分が単独で活性立体構造状態を達成できる限りにおいては、ｍＧｌｕ５受容体の７本ヘリックス膜ドメイン（ｍＧｌｕ５ΔＳ）は単独でＧタンパク質を活性化することができる。 さらに、負のアロステリックレギュレーター（インバースアゴニスト活性を有する非競合的アンタゴニスト）ＭＰＥＰはこのｍＧｌｕ５ΔＳタンパク質のベースライン活性を阻害し、そしてＤＦＢはこのタンパク質を活性化することができる。 従って、これらの分子が働くために外部ドメインは必要とされない。

Ｂ． その他の受容体 前記のＡ． Ｉ． に記載されたｍＧｌｕ５受容体に関するプロトコールはｍＧｌｕ１およびｍＧｌｕ２受容体ならびにＧＢ２サブユニットにも準用される。

正のアロステリックモジュレーターを探索するための本発明の主題がすべてのＧＰＣＲ−IIIに適用することを示すために、デルタ５ｓ構築体（ｍＧｌｕ５ΔＳ）に関して記載されたものと同じアプローチに従って切断された受容体を作製した。

このために、正のアロステリックモジュレーターが記載されているＧＰＣＲ−IIIが選択された：ｍＧｌｕ１受容体（Ｒｏ０１−６１２８）(Knoflach et al., 2001)、ｍＧｌｕ２受容体（ＬＹ４８７３７９）(Schaffhauser et al., 2003)、およびＧＡＢＡ _Ｂ受容体のサブユニットであるＧＡＢＡ _Ｂ ２（ＧＢ２）（ＣＧＰ７９３０）(Urwyler et al., 2001)。 この細胞外および細胞内部分が切断された受容体は、それぞれデルタ１ｓ、デルタ２ｓおよびデルタＧＢ２ｓと名づけられ、それらは一時的にＨＥＫ２９３細胞において発現された。

デルタ２ｓおよびデルタＧＢ２ｓ受容体にホスホリパーゼＣを活性化させ、そしてイノシトールリン酸産生を増加させるために、これら２つの受容体を前記のキメラＧタンパク質Ｇｑｉ９と同時発現させた(Gomeza et al., 1996; Franek et al., 1999)。

この化合物Ｒｏ０１−６１２８およびＣＧＰ７９３０はF. Acher(University Rene Descarte, Laboratory of Pharmacological and Toxicological Chemistry and Biochemistry, CNRS UMR-8601, 45 rue des Saints Peres, F-75270 Paris Cedex 06)により合成され、化合物ＬＹ４８７３７９はAddex Pharmaceuticals SA社(12, Chemin Des Aulx, CH-1228, Plan Les Quates, Geneva, Switzerland)により提供された。

文献に記載されているように、化合物Ｒｏ０１−６１２８[Knoflach et al., 2001]およびＬＹ４８７３７９[Schauffhauser et al., 2003]は単独でｍＧｌｕ１およびｍＧｌｕ２受容体に適用された場合、アゴニスト作用は示さないが、アゴニストの作用を増強する。

一方、図７および８に例示されているように、これらの２つの化合物は単独で 切断型デルタ１ｓおよびデルタ２ｓを活性化する。

同様に、７回膜貫通受容体 ＧＡＢＡ _Ｂに対する非常に弱いアゴニスト活性しか持たないＣＧＰ７９３０（ＧＡＢＡ _Ｂ １またはＧＢ１、および ＧＡＢＡ _Ｂ ２またはＧＢ２サブユニットから構成される）(Urwyler et al., 2001)は、切断された構築体デルタＧＢ２ｓを強力に刺激する（図９）。

実際、この実験の項に記載された結果は、ＧＰＣＲ−III受容体の７本ヘリックス膜ドメインに相当するタンパク質が、これらの受容体のアロステリックレギュレーターを同定するための容易で効果的なツールであることを示すものである。

参照文献

ＧＰＣＲ−IIIの一般構造の図。 Ａ：オルトステリックリガンド（またはアゴニスト）の結合部位である外部「Venus flytrap（ハエジゴク）」ドメイン；Ｂ：高システイン領域；およびＣ：アロステリックレギュレーターの結合部位である７本ヘリックス膜ドメイン。

切断された受容体ｍＧｌｕ５ΔＳの発現のためのプラスミドの構造図。 ＰＳ：シグナルペプチド；ＶＦＴＭ：「Venus flytrap」モジュール；ＣＲ：高システイン領域；ＨＤ：７本ヘリックス膜ドメイン；ＣＴ：細胞内カルボキシ末端ドメイン；ＣＭＶ：サイトメガロウイルスプロモーター；ＨＡ：赤血球凝集素タグ。

ｍＧｌｕ５受容体およびｍＧｌｕ５ΔＳ受容体をコードするｃＤＮＡを用いて一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中のこれら受容体に対するグルタミン酸の作用を示すグラフ。 白いカラム：ＩＰ産生のベースライン；灰色のカラム：１００μＭのグルタミン酸存在下でのＩＰ産生。 この結果は、ＩＰ産生の、膜に残存する放射活性に対する比に相当する。 これらのデータは、典型的な実験の３重測定平均値の平均±標準偏差に相当する。

一時的にｍＧｌｕ５受容体（白四角）またはｍＧｌｕ５ΔＳ（黒三角）受容体を発現しているＨＥＫ２９３細胞中のｍＧｌｕ５受容体およびｍＧｌｕ５ΔＳ受容体に対するＭＰＥＰの用量作用を示すグラフ。 この結果は、ＩＰ産生の、膜に残存する放射活性に対する比に相当し、ＩＰのベースライン産生のパーセンテージとして表されている。 これらのデータは、典型的な実験の３重測定平均値の平均±標準偏差に相当する。

ＤＦＢの存在下（黒三角）または不在下（白四角）での、ｍＧｌｕ５受容体をコードするｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中の該受容体に対するグルタミン酸の用量作用を示すグラフ。 この結果は、ＩＰ産生の、膜に残存する放射活性に対する比に相当する。 これらのデータは、典型的な実験の３重測定平均値の平均±標準偏差に相当する。

ｍＧｌｕ５ΔＳに対するＤＦＢの用量作用およびＭＰＥＰによるその阻害を示すグラフ。 Ａ：ＤＦＢの用量増加が、ｍＧｌｕ５ΔＳ受容体を一時的に発現しているＨＥＫ２９３細胞によるＩＰの産生に及ぼす影響；Ｂ：種々の濃度のＭＰＥＰが３００μＭのＤＦＢで処理されたｍＧｌｕ５ΔＳ受容体を発現している細胞によるＩＰ産生に及ぼす影響。 この結果は、ＩＰ産生の、膜に残存する放射活性に対する比に相当する。 これらのデータは、典型的な実験の３重測定平均値の平均±標準偏差に相当する。

一時的にデルタ１ｓ受容体を発現しているＨＥＫ２９３細胞中の該受容体に対するＲｏ０１−６１２８の用量−作用を示すグラフ。 この結果は、ＩＰ産生の、膜に残存する放射活性に対する比に相当する。 これらのデータは、典型的な実験の３重測定平均値の平均±標準偏差に相当する。

一時的にデルタ２ｓ受容体、およびこの受容体とホスホリパーゼＣ活性化経路との共役を可能にするキメラＧタンパク質Ｇｑｉ９を発現しているＨＥＫ２９３細胞中の該受容体に対するＬＹ４８７３７９の用量−作用を示すグラフ。 この結果は、ＩＰ産生の、膜に残存する放射活性に対する比に相当する。 これらのデータは、典型的な実験の３重測定平均値の平均±標準偏差に相当する。

一時的にデルタＧＢ２ｓ受容体、およびこの受容体とホスホリパーゼＣ活性化経路との共役を可能にするキメラＧタンパク質Ｇｑｉ９を発現しているＨＥＫ２９３細胞中の該受容体に対するＣＧＰ７９３０の用量−作用を示すグラフ。 この結果は、ＩＰ産生の、膜に残存する放射活性に対する比に相当する。 これらのデータは、典型的な実験の３重測定平均値の平均±標準偏差に相当する。