一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸
专利汇可以提供一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种肝片吸虫假定蛋白基因，同时还提供了利用肝片吸虫假定蛋白基因制成的胶体金 免疫层析 试纸 ，利用肝片吸虫假定蛋白制成肝片吸虫感染检测胶体金试纸条，具有简便、易操作、具有高灵敏性、高特异性、时间短等特点，结果清晰可见，适用于临床现场检测和大规模的流行病学调查。，下面是一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸专利的具体信息内容。
1.一种肝片吸虫假定蛋白基因（Hypothetical protein D915_11650基因），其特征在于：
基因序列如SEQ No.1所示。
2. 用于扩增权利要求1所述的肝片吸虫假定蛋白基因的nest-PCR扩增引物，具有以下序列：
F: 5’-CGAGCTCATGGTTCTTGCTGAGGAACGACAG-3’
R: 5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’。
3.如权利要求1所述的一种肝片吸虫假定蛋白基因制备方法，包括以下步骤：
1）λ噬菌体插入基因的克隆
插入基因片段扩增引物序列由上海生工合成，如下：
F：5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3'；
R：5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3' ；
2）开放性阅读框 PCR 扩增
根据开放性阅读框基因序列，用 Primer5.0 软件进行引物设计，限制性内切酶分别为SacI、Hind Ⅲ：
F: 5’-CGAGCTCATGGTTCTTGCTGAGGAACGACAG-3’；
R: 5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’；
以肝片吸虫假定蛋白 D915_11650基因扩增产物为模板进行开放性阅读框的 PCR 扩增
3）肝片吸虫假定蛋白 D915_11650基因克隆载体构建
将目的片段与 pMD-18T 载体连接， 连接产物转化入感受态，对重组质粒进行鉴定以及双酶切鉴定；
4）肝片吸虫假定蛋白 D915_11650表达载体构建
目的基因基因与 pET-28a 质粒连接，连接产物转化入感受态，并进行双酶切验证。
4.一种检测肝片吸虫感染胶体金免疫层析试纸条，主要包括玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板；其特征在于：
金标垫上的金标抗体为金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA），硝酸纤维素膜上的指示线T线包被肝片吸虫假定蛋白 D915_11650、C线包被兔抗SPA抗体。
5. 如权利要求4所述的一种检测肝片吸虫感染胶体金免疫层析试纸条制备方法，通过克隆、表达纯化肝片吸虫假定蛋白 D915_11650重组蛋白，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金对金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）抗体进行标记，制备金标垫，组装试纸条，肝片吸虫假定基因 D915_11650蛋白作为检测线、兔抗SPA抗体作为质检线，包括以下步骤：
1）胶体金的烧制
利用柠檬酸三钠还原法，向99mL ddH2O中加入1mL 1%氯金酸，沸腾后加入1mL 1%柠檬酸三钠，制备40nm胶体金颗粒；
2）金标抗体pH确定
利用K2CO3梯度标记法，确定金标最佳pH，0.2mol/L K2CO3加入量为2µL；
3）金标抗体的制备
利用摸索好的最佳K2CO3加入量通过胶体金对SPA进行标记，标记后的金标抗体溶解于复溶液中4℃保存待用或直接滴加于金标垫上；
4）NC膜上T线假定蛋白 D915_11650蛋白包被浓度的确定
将T线假定蛋白 D915_11650蛋白稀释成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每个试纸条包被1µL，按照常规条件进行操作，观察结果T线的显色情况，确定T线多抗的最佳包被浓度1mg/mL；
5）NC膜上C线兔抗SPA抗体包被浓度的确定
将C线兔抗SPA抗体稀释成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每个试纸条包被1µL，按照常规条件进行操作，观察结果C线的显色情况，确定0.5mg/mL为C线最佳包被浓度。
一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸
技术领域
背景技术
发明内容
R: 5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’。
插入基因片段扩增引物序列由上海生工合成，如下：
F：5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3'；
R：5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3' ；
2）开放性阅读框 PCR 扩增
根据开放性阅读框基因序列，用 Primer5.0 软件进行引物设计，限制性内切酶分别为SacI、Hind Ⅲ：
F: 5’-CGAGCTCATGGTTCTTGCTGAGGAACGACAG-3’；
R: 5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’；
以肝片吸虫假定蛋白 D915_11650基因扩增产物为模板进行开放性阅读框的 PCR 扩增
3）肝片吸虫假定蛋白 D915_11650基因克隆载体构建
将目的片段与 pMD-18T 载体连接， 连接产物转化入感受态，对重组质粒进行鉴定以及双酶切鉴定；
4）肝片吸虫假定蛋白 D915_11650表达载体构建
目的基因基因与 pET-28a 质粒连接，连接产物转化入感受态，并进行双酶切验证。
利用柠檬酸三钠还原法，向99mL ddH2O中加入1mL 1%氯金酸，沸腾后加入1mL 1%柠檬酸三钠，制备40nm胶体金颗粒；
2）金标抗体pH确定
利用K2CO3梯度标记法，确定金标最佳pH，0.2mol/L K2CO3加入量为2µL；
3）金标抗体的制备
利用摸索好的最佳K2CO3加入量通过胶体金对SPA进行标记，标记后的金标抗体溶解于复溶液中4℃保存待用或直接滴加于金标垫上；
4）NC膜上T线假定蛋白 D915_11650蛋白包被浓度的确定
将T线假定蛋白 D915_11650蛋白稀释成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每个试纸条包被1µL，按照常规条件进行操作，观察结果T线的显色情况，确定T线多抗的最佳包被浓度1mg/mL；
5）NC膜上C线兔抗SPA抗体包被浓度的确定
将C线兔抗SPA抗体稀释成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每个试纸条包被1µL，按照常规条件进行操作，观察结果C线的显色情况，确定0.5mg/mL为C线最佳包被浓度。
图3为特异性试验结果图；
图4为敏感性试验结果图。
具体实施方式
1、λ噬菌体插入基因的克隆
插入基因片段扩增引物序列由上海生工合成，如下：
F：5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3'；
R：5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3' ；
2、开放性阅读框 PCR 扩增
根据开放性阅读框基因序列，用 Primer5.0 软件进行引物设计，限制性内切酶分别为SacI、Hind Ⅲ：
F: 5’-CGAGCTCATGGTTCTTGCTGAGGAACGACAG-3’；
R: 5’-CCCAAGCTTTCAACTGACCATATCACCGAGATC-3’；
以肝片吸虫假定蛋白 D915_11650基因扩增产物为模板进行开放性阅读框的 PCR 扩增
3、肝片吸虫假定蛋白 D915_11650基因克隆载体构建
将目的片段与 pMD-18T 载体连接， 连接产物转化入感受态，对重组质粒进行鉴定以及双酶切鉴定。
（1）胶体金的烧制
利用柠檬酸三钠还原法，向99mL ddH2O中加入1mL 1%氯金酸，沸腾后加入1mL 1%柠檬酸三钠，制备40nm胶体金颗粒；
（2）金标抗体最佳pH确定
利用K2CO3梯度标记法，通过观察颜色变化，确定金标最佳PH；
（3）金标抗体的制备
利用摸索好的最佳K2CO3加入量通过胶体金对SPA进行标记，标记后的金标抗体溶解于复溶液中4℃保存待用或直接滴加于金标垫上；
（4） NC膜上T线假定蛋白 D915_11650蛋白包被浓度的确定
将T线假定蛋白 D915_11650蛋白稀释成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每个试纸条包被1µL，按照常规条件进行操作，观察结果T线的显色情况，确定T线多抗的最佳包被浓度；
（5） NC膜上C线兔抗SPA抗体包被浓度的确定
将C线兔抗SPA抗体稀释成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每个试纸条包被1µL，按照常规条件进行操作，观察结果C线的显色情况，确定C线抗体的最佳包被浓度。
胶体金溶液颜色均匀透明，透射电镜观察颗粒大小基本一致，约40nm左右，分散均匀，没有聚集，可用于下一步试验（附图1），透射电镜观察颗粒大小基本一致，约40nm左右，分散均匀，没有聚集；
（2）金标抗体最佳pH确定
确定胶体金标记抗体的最适0.2mol/L K2CO3加入量为2µL；
（3）金标抗体的制备
通过透射电镜观察，金颗粒周围有一圈蛋白晕，分散性较好，无聚集现象，表明标记成功（附图2），通过透射电镜观察，金颗粒周围有一圈蛋白晕，分散性较好，无聚集现象；
（4）NC膜上T线假定蛋白 D915_11650蛋白最佳包被浓度的确定
蛋白浓度稀释到0.5mg/mL时T线显色仍较为明显，故选择1mg/mL为T线最佳包被浓度；
（5） NC膜上C线兔抗SPA抗体最佳包被浓度的确定
结果显示当抗体浓度稀释到0.5mg/mL包被时C线显色最明显，故选择0.5mg/mL为C线最佳包被浓度。
硝酸纤维素膜21mm，样品垫24mm、金标垫9mm、吸水纸32mm从下到上依次粘贴于PVC底板上，样品垫压金标垫2mm，金标垫压NC膜2mm，吸水纸压NC膜2mm；依次粘贴好后，用切纸机将组装的试纸板切成每条宽度为4mm的试纸条，T线包被肝片吸虫假定基因 D915_11650蛋白、C线包被兔抗SPA抗体即可。
为了测试实施例2制备的试纸条的试验性能，需要进行一系列的试验，其中包括特异性试验、敏感性试验、重复性试验、保存期试验；
（1）特异性试验
分别取肝片吸虫阳性参照样品、华支睾吸虫阳性样品，双腔吸虫阳性样品、捻转血矛线虫阳性样品、健康羊血清做阴性对照，按照常规方法进行操作，判断各种血清之间有无交叉反应，从而评价试纸条的特异性（见图3），只有肝片吸虫参照阳性样品(a) T线显色，华支睾吸虫阳性样品(b)、双腔吸虫阳性样品(c)、捻转血矛线虫阳性样品(d)健康羊血清（e） T线均无显色，表明无交叉反应，特异性良好；
（2）敏感性试验
将肝片吸虫阳性血清进行倍比稀释（1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640），按常规操作观察试纸条显色情况。当用肉眼无法观察到T线，并且C线依旧清晰可见时，此时的稀释度即为该方法的最低检出浓度（见图4），将肝片吸虫阳性血清进行倍比稀释（1：10、1：
20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640），结果1:160倍稀释时T线仍有显色，所以该试纸条敏感性为1:160；
（3）重复性试验
取肝片吸虫阳性血清及阴性血清，使用3个不同批次的试纸条按上述方法进行试验，每个样品做三次重复，根据膜片显色情况，确定该方法的重复性情况；
（4）稳定性试验
将试纸条分别于4℃密封保存，室温密封保存。分别在1个月、2个月、3个月几个时间点分别对参照阳性样品进行检测，观察两种环境各试纸条的显色情况，从而判断试纸条检测的稳定情况；
（5）试纸条检测阳性血清符合率试验
应用已经建立的胶体金试纸条检测方法，对4份肝片吸虫参照阳性样品进行检测，根据检出的阳性样品数，评价该方法阳性符合率；
（6）试纸条的初步应用
应用所组装的试纸条对25份羊血清样品（其中包括4份肝片吸虫感染参照样品，21份长春地区临床样品）进行检测，4份参照样品检出率为100%，21份临床样品结果均为阴性。
结果只有肝片吸虫参照阳性样品(a) T线显色，华支睾吸虫阳性样品(b)、双腔吸虫阳性样品(c)、捻转血矛线虫阳性样品(d)健康羊血清（e） T线均无显色，表明无交叉反应，特异性良好。（附图3）
（2）敏感性试验
结果1:160倍稀释时T线仍有显色，所以该试纸条敏感性为1:160。（附图4）
（3）重复性试验
结果阴阳性样品的三次重复效果较好，结果比较一致，表明试纸条的重复性良好；
（4）保存期试验
结果表明4°、室温存放1个月、2个月、3个月依旧能够显示正确结果， T/C线显色情况均也无太大区别，但4°存放4个月时出现金标垫释放不够完全，且释放速度变慢，但仍能指示正确结果，说明该试纸条至少可以存放四个月以上；
（5）试纸条检测阳性粪便符合率试验
应用已经建立的胶体金试纸条检测方法，对4份肝片吸虫虫参照阳性粪便进行检测，结果表明， 4份样本均检测为阳性，说明该试纸条的阳性符合率为100%；
（6）试纸条的初步应用
应用所组装的试纸条对临床25份羊血清样品（其中包括4份肝片吸虫感染参照样品，21份长春地区临床样品）进行检测，4份参照样品检出4份，检出率为100%，21份临床样品结果均为阴性。
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