技术领域
[0001] 本
发明涉及食品检验技术领域，具体涉及一种鉴别奶营养品质的方法。
背景技术
[0002]
氨基酸是
生物体内的一类重要物质，是构成
蛋白质的基本单位；它们参与了生物体内脂肪、糖类等代谢，对人和动物有着重要的生理功能，氨基酸的缺乏会干扰人体的正常代谢。其中，
色氨酸为人体所需的八种必需氨基酸之一，不能在体内产生，它不仅参与了生物体内蛋白质的合成，对精神稳定和缓解抑郁也有一定的作用。另外，色氨酸在生物体内有三条代谢通路，分别是血清素代谢通路、犬尿氨酸通路和吲哚丙
酮酸通路。色氨酸在血清素代谢通路上可进一步代谢为五羟色胺(血清素)，这个物质能改善睡眠，减少急躁情绪，给人带来愉悦感和幸福感；在犬尿氨酸通路上产生的犬尿酸具有神经保护作用,可对抗喹啉酸过度兴奋引发的神经毒性，而这条途径上的终产物烟酸，具有促进体内
铁的吸收和血细胞的生成、维持
皮肤的正常功能和消化腺的分泌等功能。另外，极少受人们关注的吲哚
丙酮酸途径产生的吲哚甲
醛和吲哚乙酸，对人体的健康也产生着重要的作用。
[0003] 近年来，我国高端乳品的消费需求在不断上升，消费者购买乳品时更加关注其中营养物质的种类和含量。由于色氨酸及其
代谢物这类小分子营养物质在乳品中含量较低，导致行业在生产中忽略了这类营养成分。但是，这类物质的功能却不容小觑，因此，从色氨酸及其代谢物的
角度出发，建立乳品中这类营养成分的含量和种类的检测方法，一方面可以对乳品进行营养学评价提供新的思路和方法，另一方面，也可为行业上生产高品质、多种类的乳品提供思路和建议。
[0004] 高效液相色谱-质谱联用技术在食品成分安全检测中发挥着重大作用，与传统检测色氨酸和五羟色胺的
荧光色谱法相比，该技术前处理方法简便，可实现对乳品中色氨酸各代谢物的全面分析，检测定量限低，定量准确。可为乳品的营养学评价提供强有
力的技术
支撑。
发明内容
[0005] 针对
现有技术中存在的
缺陷和不足，本发明提供了一种(利用高效液相色谱-质谱联用技术)鉴别奶营养品质的方法。本发明旨在解决现有奶营养价值评价体系中侧重于蛋白质及
脂肪酸等主要营养物质的评估，利用高效液相色谱-质谱联用技术，建立对奶中色氨酸等小分子营养物质的检测方法，实现对不同奶的营养品质鉴别。为学界和产业提供奶中小分子营养物质的评价指标。
[0006] 本发明中，色氨酸为人体所需的八种必需氨基酸之一，不能在体内产生，不仅参与了生物体内蛋白质的合成，对精神稳定和缓解抑郁也有一定的作用。另外，色氨酸在生物体内有三条代谢通路，产生的各种生物活性物质对人体有着重要的生物学功能，如血清素能改善睡眠，减少急躁情绪，烟酸具有促进体内铁的吸收和血细胞的生成、维持皮肤的正常功能和消化腺的分泌等功能。除色氨酸外，
牛奶中还含有这些微量的生物活性物质，因此，本发明从色氨酸及其代谢物的角度出发，建立乳品中此类营养成分的检测方法，以期为乳品营养学评价提供新的思路和方法，同时，为乳品工业中生产高品质、多种类的乳品提供思路和建议。
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种鉴别奶营养品质的方法，包括如下步骤：
[0008] 包括如下步骤：
[0009] 步骤1)，对奶样进行色氨酸及其代谢物的提取，得提取物；
[0010] 步骤2)，对步骤1)中所述提取物进行色谱分离-质谱扫描，对所述奶样中的色氨酸及其代谢物进行定量分析，测定定量限和回收率；
[0011] 步骤3)，根据步骤2)中所述奶样中色氨酸及其代谢物的含量数据，对所述奶样品进行分析。
[0012] 根据本发明的一些优选实施方式，所述色氨酸及其代谢物选自褪黑素、5-羟色氨酸、血清素、吲哚-3-乙胺、色胺、3-羟基邻氨基苯
甲酸、烟酸、黄尿酸、色氨酸、犬尿氨酸、犬尿酸、吲哚甲醛和吲哚乙酸中的一种或多种，优选为5-羟色氨酸、吲哚-3-乙胺、色胺、3-羟基邻氨基
苯甲酸、烟酸、黄尿酸、犬尿氨酸、犬尿酸、吲哚甲醛和吲哚乙酸。
[0013] 根据本发明的一些优选实施方式，步骤1)中，所述奶样包括巴氏杀菌奶、超高温灭菌奶、复原乳样品和酸奶样品；优选所述复原乳样品为全脂奶粉，按
照蛋白质含量为3.0g/100mL配制而得；和/或，所述酸奶样品经过1:1稀释后再进行后续处理。
[0014] 根据本发明的一些优选实施方式，步骤1)中，向奶样中加入甲酸乙腈，涡旋；再加入萃取盐包，涡旋、离心，转移上层溶液，再加入
净化试剂，涡旋、离心，取上层溶液用氮气吹干；加入复溶液进行
水浴超声，涡旋混匀重新溶解，离心取上层溶液过膜，供下一步检测；优选的，取5～10份奶样，每份奶样体积为5～10ml；所述奶样、所述甲酸乙腈和所述复溶液的体积比为(5～10):(5～15):(0.5～3)优选为5:10:1。
[0015] 根据本发明的一些优选实施方式，步骤1)中，所述甲酸乙腈为甲酸和乙腈的混合溶液，甲酸和乙腈的体积比为3～8:97～92优选为5:95；和/或，所述复溶液为10％的乙腈水溶液；和/或，离心条件为8000～10000rpm离心8～10min；和/或，水浴超声的条件为20～30℃水浴超声8～10min。
[0016] 根据本发明的一些优选实施方式，所述萃取盐包选自
硫酸钠、
氯化钠、
硫酸镁中的一种或多种所述萃取盐包选自硫酸钠、氯化钠、硫酸镁中的一种或多种，优选为2～8g硫酸钠和0.5～3g氯化钠，更优选为4g硫酸钠和1g氯化钠。
[0017] 根据本发明的一些优选实施方式，所述净化试剂选自硫酸钠、硫酸镁、C18和PSA中的一种或多种，优选为200～1500mg硫酸钠和50～300mg C18；更优选为900mg硫酸钠和150mg C18。
[0018] 根据本发明的一些优选实施方式，步骤2)中，所述色谱分离的条件为：采用的流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的甲醇溶液；和/或，所述色谱分离-质谱扫描包括一级扫描和二级离子碎片扫描。
[0019] 根据本发明的一些优选实施方式，步骤2)中，采用梯度洗脱，优选的，洗脱梯度为:
[0020]
[0021] 根据本发明的一些优选实施方式，步骤2)中，质谱的条件为：多反应检测(MRM)正离子模式，气帘气(CUR)35psi，喷撞气(CAD)10psi，
离子化电压(IS)5500V，
温度(TEM)500℃；
喷雾器(GS1)50psi；
辅助加热器(GS2)50psi。
[0022] 根据本发明的一些优选实施方式，步骤3)中，根据所述奶样中各代谢物的含量数据，对所述奶样进行方差分析和偏最小二乘判别分析，确定出不同奶样中含量存在差异的化合物。
[0023] 本发明的有益效果至少在于：本发明提供的方法回收率好、定量限低、操作简单易行，能够快速检测出奶品中色氨酸及其代谢物的含量，并提供一种对奶品质进行营养学评价的方法，还可为生产高品质的奶及奶制品提供思路，另外，也为生产相关食品保健品提供参考。
附图说明
[0024] 图1为各表征因子在巴氏杀菌奶、UHT奶、复原奶和酸奶中的含量柱形图。
[0025] 图2为巴氏杀菌奶、UHT奶、复原奶和酸奶的偏最小二乘判别分析二维图(a)和三维图(b)。
[0026] 图3为偏最小二乘判别分析的交叉验证结果图；图中R2、Q2分别是判定系数和交叉验证系数。
[0027] 图4为基于判别模型的样品层次聚类结果图。
具体实施方式
[0028] 为使本发明
实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029] 本发明中，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品
说明书进行。所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。本发明中所用的化工原料均可在国内化工产品市场方便买到，所用C18、PSA为本领域常用净化试剂，购自安捷伦公司，所用复溶液为10％的乙腈水溶液。
[0030] 根据本发明的一些优选实施方式，具体步骤如下：
[0031] 步骤1)中预处理的具体方法为：
[0032] 取5～10份奶样，向5体积份的样品中加10体积份的甲酸乙腈，涡旋；再加入4g硫酸钠和1g氯化钠，涡旋、离心；转移上层溶液；再加入900mg硫酸钠和150mgC18，涡旋、离心；取上层溶液用氮气吹干；加入1体积份复溶液进行水浴超声，涡旋混匀重新溶解样品，离心取上层溶液过膜，供下一步检测。
[0033] 其中，复原乳样品是用全脂奶粉，按照蛋白质含量为3.0g/100mL配制而得；酸奶样品经过1:1稀释后再进行后续处理。
[0034] 其中,甲酸乙腈含5％的甲酸；复溶液为0.1％甲酸乙腈。
[0035] 其中,离心条件为8000～10000rpm离心8～10min。
[0036] 其中,水浴超声的条件为20～30℃水浴超声8～10min。
[0037] 步骤2)中所述色谱分离的条件为：
[0038] 采用的流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的甲醇溶液。
[0039] 更优选地，洗脱梯度为:
[0040]
[0041] 进一步地，步骤3)包括:
[0042] Ⅰ.奶中的色氨酸及其代谢物定量限
[0043] 根据化合物峰的
信噪比(S/N)确定各个物质的
检测限(LOD)和定量限(LOQ)。(表1)[0044] 表1不同奶中色氨酸及其代谢物的检测限及定量限(单位:ng/ml)
[0045]
[0046] Ⅱ.奶中的色氨酸及其代谢物检测方法的回收率
[0047] 表2不同奶中色氨酸及其代谢物的检测方法的回收率
[0048]
[0049]
[0050] 进一步地，步骤4)包括：
[0051] Ⅰ.利用单因素方差法(one-way ANOVA法)分析四种奶中色氨酸及其代谢物含量差异的显著性(表3)，找出四种奶的表征因子。根据各表征因子的含量原始数据，对四种奶进行偏最小二乘判别分析，结果表明前三个主成分对样本的方差累积贡献率达78.6％，且巴氏杀菌奶、UHT奶、复原乳及酸奶可以完全区分开。
[0052] 表3四种牛奶中色氨酸及其代谢物含量及显著性分析
[0053]
[0054]
[0055] 表中，含量以“平均值±标准差”表示，字母a,b,c,d表示基于方差分析和邓肯检验的数据，在95％的置信区间内各值的显著性不同。
[0056] 实施例1
[0057] 1)样品的预处理
[0058] 5个品牌的巴氏杀菌奶，10个品牌的UHT奶，10个品牌的奶粉和10个品牌的酸奶分别购自北京的各大超市，其中，复原乳样品是用所购奶粉，按照蛋白质含量为3.0g/100mL配制而得，酸奶样品经过1：1稀释后进行后续处理；分别取上述各奶样5ml，加入10ml含5％甲酸的乙腈溶液(甲酸和乙腈体积比为5:95)，涡旋；再加入4g硫酸钠和1g氯化钠，涡旋、10000rpm离心10min后；转移7ml上层溶液，加入900mg硫酸钠和150mgC18，涡旋、10000rpm离心5min；取6ml上层溶液用氮气吹干；加入1ml复溶液，水浴超声5min，涡旋混匀重新溶解样品，离心取上层溶液过膜，供下一步检测，每个样品重复实验3次。如图1所示为部分色氨酸代谢物在巴氏杀菌奶、UHT奶、复原奶和酸奶中的含量柱形图。
[0059] 2)不同种类奶中各表征因子的定性和定量分析：
[0060] Ⅰ.利用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测：
[0061] 实验所用的质谱仪型号为UPLC-QTRAP 4500(AB SCIEX)，采用的色谱柱型号为安捷伦ZORBAX Eclipse plus C18(150mm×3.0mm，粒径1.8μm)，柱温箱温度为30℃。
[0062] 将样品前处理后，利用高效液相色谱-质谱对样品进行检测。采用的流动相A、流动相B分别为含0.1％甲酸的水溶液、含0.1％甲酸的甲醇溶液，洗脱梯度如下所示:
[0063]
[0064] 质谱的条件为：多反应检测(MRM)正离子模式，气帘气(CUR)35psi，喷撞气(CAD)10psi，离子化电压(IS)5500V，温度(TEM)500℃；喷雾器(GS1)50psi；辅助加热器(GS2)
50psi。
[0065] II.不同奶中色氨酸及其代谢物的定量分析：
[0066] 由于色氨酸及其代谢物在奶中有不同的基质效应，利用基质标准曲线，对不同奶中的色氨酸及其代谢物进行定量分析。
[0067] 3)one-way ANOVA分析与偏最小二乘法判别分析
[0068] 基于不同奶中色氨酸及其代谢物的含量数据，进行one-way ANOVA分析和偏最小二乘判别分析处理，提取出偏最小二乘判别分析图见图2。如图3所示为偏最小二乘判别分析的交叉验证结果图,结果显示进行偏最小二乘判别分析的代谢物没有被过度拟合；如图4所示为基于判别模型的样品层次聚类结果图，结果表明具有显著差异的代谢物对四种奶进行明显的区分。从图中可得前三种主成分可将巴氏杀菌奶、UHT奶、复原乳及酸奶可以完全区分开。由此表明，十种因子(5-羟色氨酸、吲哚-3-乙胺、色胺、3-羟基
邻氨基苯甲酸、烟酸、黄尿酸、犬尿氨酸、犬尿酸、吲哚甲醛、吲哚乙酸)在四种奶的分类中差异显著。基于九种表征因子在不同奶中的含量数据，对偏最小二乘判别模型进行7折交叉验证和置换检验，准确率达100％。
[0069] 实施例2
[0070] 本实施例采用的方法同实施例1，区别仅在于所使用的提取
溶剂为纯乙腈溶剂。经检验，褪黑素、血清素、吲哚-3-乙胺、色胺、吲哚甲醛、吲哚乙酸、3-羟基邻氨基苯甲酸的回收率为60％-120％。色氨酸、5-羟色氨酸、烟酸、黄尿酸、犬尿氨酸、犬尿酸的回收率仅为2％-30％。
[0071] 实施例3
[0072] 本实施例采用的方法同实施例1，区别仅在于所使用的提取溶剂为含2％甲酸的乙腈溶剂。经检验，色氨酸、烟酸、黄尿酸、犬尿氨酸、褪黑素、血清素、吲哚-3-乙胺、色胺、吲哚甲醛、吲哚乙酸、3-羟基邻氨基苯甲酸的回收率为64％-121％；而5-羟色氨酸、犬尿酸的回收率仅为3％-40％。
[0073] 对比例1
[0074] 该对比例采用的方法具体为：分别取上述各奶样5ml，使用含有1％三氯乙酸(TCA)的水溶液沉淀蛋白，离心后调pH＝7，利用C18或HLB固相萃取小柱提取溶液中的色氨酸及其代谢物，并用6ml甲醇洗脱，接收洗脱液用氮气吹干；加入1ml复溶液，水浴超声5min，涡旋混匀重新溶解样品，离心取上层溶液过膜，供LC-MS检测。该方法回收率仅为5％-50％。
[0075] 通过该对比例1与实施例1进行对比，可以发现，实施例1中的色氨酸及其代谢物回收率更高，定量的准确率更高。
[0076] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明
基础上，可以对之作一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
