能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv
专利汇可以提供能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及医疗领域，尤其涉及能够 治疗 肾脏间质 纤维 化的DR-scFv。小鼠的免疫；ScFv 基因的构建及扩增； 噬菌体 抗体 库的筛选及富集；ELISA 检测；DR-scFv基因序列鉴定。采用如上技术方案的本发明，相对于 现有技术 有如下有益效果：本项研究引入了分子 质量 小，免疫原性弱，容易进入组织，易大批量制备，不易引起超敏反应和排斥反应的DR-scFv。，下面是能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv专利的具体信息内容。
1.能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv，其特征在于，其采用如下方法制备而成，小鼠的免疫：将人工合成的KLH耦合的DR区多肽100μg加等体积弗氏完全佐剂（Freunds complete adjuvant,FCA），充分混匀成乳剂（200μl），碘酒、酒精消毒，分别于8周龄BALB/c雌鼠背部靠后左右四个部位皮下注射免疫；随后加强免疫为50μg的KLH耦合的DR区多肽免疫加等体积弗氏不完全佐剂（Freunds incomplete adjuvant,FIA），充分混匀，间隔一周加强免疫2次，免疫部位同上；用ELISA法检测抗体效价；
ScFv 基因的构建及扩增：脾总RNA的提取，第3次免疫后的第5天,选效价最高的3只小鼠提取脾脏组织混合，并抽提细胞总RNA；RNA的提取按试剂盒操作；ScFv 基因的构建及扩增按BALB/c鼠scFv构建试剂盒操作；扩增时在scFv 基因的5’端引入 SfiⅠ位点，3’端引入NotⅠ位点；ScFv 基因和pCANTAB/5E 噬菌体载体分别经SfiⅠ、NotⅠ酶切后，经T4 DNA 连接酶连接，CaCl2 法转化入TG1，转化产物铺于SOB琼脂平板，30 ℃过夜至长出克隆；
噬菌体抗体库的筛选及富集：2×YT 洗SOB琼脂板上的转化克隆，稀释，37 ℃摇培1小时，加入M13K07(4×1010 pfu/L) ，37 ℃1 小时，4,000 r/ min 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37 ℃过夜，4,000 r/min 离心20 分钟，取上清进行PEG/NaCl 沉淀，重悬沉淀于2×YT ，加入含防腐剂的封闭剂作用15 分钟后，加入经DR区多肽包被并经封闭的细胞培养瓶，37 ℃ 2小时，充分洗涤后，加TG1，37 ℃摇培1小时，加M13K07、Amp (100μgPml)、G(2 %)，37℃摇培1小时，4,000 r/mim 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37℃过夜；经过如此
4 轮吸附、2洗脱、2富集筛选后，稀释为各个浓度分别在SOB琼脂平板测定库容量；
ELISA 检测：随机挑取SOB琼脂板上的90个克隆进行ELISA检测，阳性克隆进行重复验证；
DR-scFv基因序列鉴定：提取阳性克隆DNA，用pCANTAB 5E 噬菌体载体特异性引物pCANTAB5-S1 (5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’) 和 pCANTAB5-S6 (5’-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3’)进行测序分析；利用BLAST对比寻找同源序列核酸蛋白。
2.DR区重组单链可变区抗体（DR-scFv）在制备治疗肾脏间质纤维化的药物中的用途。
3.一种DR区重组单链可变区抗体（DR-scFv）的对肾脏纤维化影响的判定模型，其特征在于，包含如下步骤，
(1)大鼠移植肾慢性损伤间质纤维化模型的建立
SD 大鼠，10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，行左肾5/6切除，一周后行右肾切除，观察8周建立大鼠移植肾慢性损伤间质纤维化模型；
(2) 实验分组
实验分为3组，每小组10只大鼠；
假手术组(Sham组)；肾脏纤维化组(RF组)；DR-scFv治疗组（RF+DR-scFv）；
术后3天之内给予大鼠叔丁啡（0.006mg/kg）镇痛，7天之内给予恩诺沙星（25mg/kg）抗菌消炎；
每天观察大鼠伤口是否感染，并称量体重，及时处理感染，减轻大鼠痛苦；
实验结束后，大鼠在笼中以4.5L/min 的CO2流量保持至安乐死；
(3) 观察指标于手术后6周，12周，24周分批留取标本；
间质纤维化进展监测：移植后6周，12周，24周取各组肾脏组织，10％中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋，切成4mm厚的切片，进行HE、Masson染色，光镜下观察病理改变，计算阳性面积，参照Banff标准，进行间质纤维化严重程度评分。
4.能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv对应的抗体重链核酸序列，其特征为：序列为GAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGGCTATGGCTTGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTATAAGTGGTGGTATCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATTCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTACAAGAACCTATAGGTACGACGGGTTTGGTCACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA。
5.能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv对应的抗体重链氨基酸序列为，其特征为：序列为
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGLSWVRQTPEKRLEWVASIISGGITYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCTRTYRYDGFGHWGQGTLVTVSA。
6.能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv对应的抗体轻链核酸序列，其特征为：序列为GACATCCAGCTGACTCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGTATCTCTAGGGGAGAAGGTCACCGTGAACTGCAGGGCCAGCTCGAGTGTTAATTACATGTACTGGTACCAACAGAAGTCAGATGCCTCCCCCAAACTTTGGATTTCTTTCACATCCAACCTGGCTCCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAACTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCGTGGAGGGTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTTTACTAGTTCCCCATCCATCACGTTCGGCTCAGGGACAAAGCTGGAGCTGAAACGG。
7.能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv对应的抗体轻链氨基酸序列，其特征为：序列为DIQLTQSPAIMSVSLGEKVTVNCRASSSVNYMYWYQQKSDASPKLWISFTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSVEGEDAATYYCQQFTSSPSITFGSGTKLELKR。
8.权利要求4-7任意一项或者多项的序列在制备防止肾脏纤维化的药物中的用途。
能够治疗肾脏间质纤维化的DR-scFv
技术领域
背景技术
在AKI之后其他促进肾脏纤维化的因素包括肾脏损伤蛋白-1（Kidney injury molecule-1, KIM-1），AKI后瞬时表达的上皮磷脂酰丝氨酸受体（Epithelial phosphatidylserine receptor, EPSR），肾脏上皮细胞内调节细胞凋亡、增殖和炎症反应的肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor, TNF），都是促纤维基因因子（Profibrogenetic factors）的产生因素。
1）相对分子质量小，易通过血管壁进入组织发挥作用；2）免疫原性弱，不易引起超敏反应和排斥反应；3）无Ｆｃ段，不与非靶细胞的Ｆｃ受体结合，非特异性少；4）易于构建和表达，大批量制备。
发明内容
ScFv 基因的构建及扩增：脾总RNA的提取，第3次免疫后的第5天,选效价最高的3只小鼠提取脾脏组织混合，并抽提细胞总RNA；RNA的提取按试剂盒操作；ScFv 基因的构建及扩增按BALB/c鼠scFv构建试剂盒操作；扩增时在scFv 基因的5’端引入 SfiⅠ位点，3’端引入NotⅠ位点；ScFv 基因和pCANTAB/5E 噬菌体载体分别经SfiⅠ、NotⅠ酶切后，经T4 DNA 连接酶连接，CaCl2 法转化入TG1，转化产物铺于SOB琼脂平板，30 ℃过夜至长出克隆；
噬菌体抗体库的筛选及富集：2×YT 洗SOB琼脂板上的转化克隆，稀释，37 ℃摇培1小
10
时，加入M13K07(4×10 pfu/L) ，37 ℃1 小时，4,000 r/ min 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37 ℃过夜，4,000 r/min 离心20 分钟，取上清进行PEG/NaCl 沉淀，重悬沉淀于2×YT ，加入含防腐剂的封闭剂作用15 分钟后，加入经DR区多肽包被并经封闭的细胞培养瓶，37 ℃ 2小时，充分洗涤后，加TG1，37 ℃摇培1小时，加M13K07、Amp (100μgPml)、G(2 %)，37℃摇培1小时，4,000 r/mim 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37℃过夜；经过如此
4 轮吸附、2洗脱、2富集筛选后，稀释为各个浓度分别在SOB琼脂平板测定库容量；
ELISA 检测：随机挑取SOB琼脂板上的90个克隆进行ELISA检测，阳性克隆进行重复验证；
DR-scFv基因序列鉴定：提取阳性克隆DNA，用pCANTAB 5E 噬菌体载体特异性引物pCANTAB5-S1 (5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’) 和 pCANTAB5-S6 (5’-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3’)进行测序分析；利用BLAST对比寻找同源序列核酸蛋白。
SD 大鼠，10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，行左肾5/6切除，一周后行右肾切除，观察8周建立大鼠移植肾慢性损伤间质纤维化模型；
(2) 实验分组
实验分为3组，每小组10只大鼠；
假手术组(Sham组)；肾脏纤维化组(RF组)；DR-scFv治疗组（RF+DR-scFv）。术后3天之内给予大鼠叔丁啡（0.006mg/kg）镇痛，7天之内给予恩诺沙星（25mg/kg）抗菌消炎。每天观察大鼠伤口是否感染，并称量体重，及时处理感染，减轻大鼠痛苦。实验结束后，大鼠在笼中以
4.5L/min 的CO2流量保持至安乐死；
(3) 观察指标于手术后6周，12周，24周分批留取标本；
间质纤维化进展监测：移植后6周，12周，24周取各组肾脏组织，10％中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋，切成4mm厚的切片，进行HE、Masson染色，光镜下观察病理改变，计算阳性面积，参照Banff标准，进行间质纤维化严重程度评分。
图2. 单链抗体纯化SDS-PAGE分析，其中Line 1:单链抗体对照；Line 2：Marker；Line
3：单链抗体scfv-DR；
图3. DR-scFv对HK2细胞的保护作用；
图4为Masson's染色，DR-scFv降低肾脏脏纤维化模型大鼠肾脏纤维化面积。即肾脏组织细胞纤维化程度对比；
图5为图4的柱状图。
具体实施方式
(2) DR-scFv生物学特性的检测；
(3) 体外模拟缺血再灌注条件检测DR-scFv 对HK-2缺血再灌注损伤的保护作用；
(4) DR-scFv 对HK-2缺血再灌注损伤保护作用的机制。
(2) 检测DR-scFv对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用
(3) DR-scFv对肾脏缺血再灌注损伤保护作用的机制研究
2.1.3 DR-scFv对移植肾脏间质纤维化的影响
(1) 建立大鼠肾脏慢性损伤间质纤维化模型
(2) 研究DR-scFv对肾脏间质纤维化的影响
(3) DR-scFv影响肾脏间质纤维化的作用机制
有益效果（与已有技术比较后的）
在前期研究工组中，我们已经证实了钠钾ATP酶DR区特异性抗体（DRSAb）通过激活PI3K/Akt，PKC ε及ERK等蛋白激酶在肾缺血再灌注损伤中的保护作用。本项研究引入了分子质量小，免疫原性弱，容易进入组织，易大批量制备，不易引起超敏反应和排斥反应的DR-scFv，并且将对DR-scFv通过对IRI的保护，调节TLRs表达，DC功能，补体水平及细胞间质转型（EMT）相关信号通路蛋白（TGF-β1，HGF，BMP-7）进行深入细致的研究。本研究的完成在DR-scFv对肾脏缺血再灌注损伤，及间质纤维化的预防作用机制及产生创新性的研究成果。
小鼠的免疫：将人工合成的KLH耦合的DR区多肽100μg加等体积弗氏完全佐剂（Freunds complete adjuvant,FCA），充分混匀成乳剂（200μl），常规碘酒、酒精消毒，分别于8周龄BALB/c雌鼠背部靠后左右四个部位皮下注射免疫。随后加强免疫为50μg的KLH耦合的DR区多肽免疫加等体积弗氏不完全佐剂（Freunds incomplete adjuvant,FIA），充分混匀，间隔一周加强免疫2次，免疫部位同上。用ELISA法检测抗体效价。
摇培1小时，加入M13K07(4×10 pfu/L) ，37 ℃1 小时，4,000 r/ min 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37 ℃过夜，4,000 r/min 离心20 分钟，取上清进行PEG/NaCl 沉淀，重悬沉淀于2×YT ，加入含防腐剂的封闭剂作用15 分钟后，加入经DR区多肽包被并经封闭的细胞培养瓶，37 ℃ 2小时，充分洗涤后，加TG1，37 ℃摇培1小时，加M13K07、Amp (100μgPml)、G(2 %)，37℃摇培1小时，4,000 r/mim 离心10 分钟，重悬沉淀于2×YT-AK，37℃过夜。经过如此4 轮吸附、2次洗脱、2次富集筛选后，稀释为各个浓度分别在SOB琼脂平板测定库容量。
SD 大鼠，10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，行左肾5/6切除，一周后行右肾切除，观察8周建立大鼠移植肾慢性损伤间质纤维化模型。
假手术组(Sham组)；肾脏纤维化组(RF组)；DR-scFv治疗组（RF+DR-scFv）。术后3天之内给予大鼠叔丁啡（0.006mg/kg）镇痛，7天之内给予恩诺沙星（25mg/kg）抗菌消炎。每天观察大鼠伤口是否感染，并称量体重，及时处理感染，减轻大鼠痛苦。实验结束后，大鼠在笼中以
4.5L/min 的CO2流量保持至安乐死。
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