单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂及其制备方法和应用
阅读：875发布：2024-01-03
专利汇可以提供单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种单载体耐低温降解多环芳 烃 混合菌剂及其制备方法和应用。其由冻融 土壤 中筛选得到的假单胞菌SDR4和高山被孢霉JDR7按照体积1：1的比例混合而得的混合菌剂和作为载体的玉米芯组成。本发明单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂具有良好的 生物 活性，成本低，制备工艺简单，不会引入二次污染，不需要回收，能有效屏蔽土著菌、 噬菌体 和毒性物质对 微生物 的恶性竞争、吞噬和毒害，使其在复杂环境中也可稳定地发挥高效能。本发明对寒冷地区多环芳烃污染的冻融土壤的修复效果明显。，下面是单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂，其特征在于，于玉米芯、麦麸和豆饼混合制得的载体上，采用吸附法固定混合菌剂；所述的混合菌剂由保藏编号为CGMCC NO.14048的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4和保藏编号为CGMCC NO.15183的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，按体积比1:1混合组成。
2.根据权利要求1所述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂，其特征在于，按重量比，玉米芯：麦麸：豆饼＝1：(0.05～0.08)：(0.05～0.10)。
3.权利要求1所述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)混合菌剂的制备：将保藏编号为CGMCC NO.14048的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4和保藏编号为CGMCC NO.15183的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，按体积比1:
1，接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床混合培养3d，制得混合菌剂；
2)载体预处理：将玉米芯粉碎，加入到生石灰水溶液中，浸透拌匀，盖上薄膜闷24h；过滤取玉米芯，将处理后的玉米芯与麦麸和豆饼混合均匀，调节含水量40～50％，pH为6.5～
7.0，得预处理的载体；
3)吸附固定：将预处理的载体121℃高温灭菌60min，按1.0ml/g的固液比，用增殖培养液浸润预处理的载体，培养12～24h后；按10％接种量加入步骤1)制备的混合菌剂，15℃恒温培养，每24h补加一次增殖培养液，连续补加3次后，再继续15℃恒温培养4～5d，得单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂。
4.根据权利要求3所述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂的制备方法，其特征在于，所述的完全培养基是牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1 000mL，pH为7.1～7.2，121℃灭菌20min。
5.根据权利要求3所述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂的制备方法，其特征在于，所述的增殖培养液是蔗糖4g，酵母膏3g，KH2PO4 0.5g，(NH4)2HPO4 2g，MgSO4·H2O
0.25g，pH 6.0～6.5，121℃灭菌20min。
6.权利要求1或2所述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂在降解冻融土壤中多环芳烃污染物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，方法如下：于含有多环芳烃污染物的冻融土壤中，加入权利要求1或2所述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂，补加或不补加水，使土壤含水量为20～30％。
8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的多环芳烃是由2个或2个以上的苯环稠合在一起组成的有机化合物。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的多环芳烃是菲、芘和苯并[a]芘。
单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
[0002] 本发明中所称假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4，已于2017年4月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.14048。
[0003] 本发明中所称高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，已于2018年1月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.15183。
背景技术
[0004] 多环芳烃是(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)一类由2个或2个以上的苯环稠合在一起组成的有机化合物，常见的18种PAHs中已被美国环保局(USEPA)列入优控污染物的有16种。PAHs具有长期残留性，容易出现生物富集、生物放大现象，在环境中难降解；具有“二半”特点，即较长半衰期，半挥发性；“三高”，即高稳定性、高蓄积性、高毒性。由于该类化合物辛醇-水分配系数高，水溶性差，常被吸附于土壤颗粒上。因此，土壤成为PAHs的主要载体，通过土壤-植物系统迁移，PAHs经食物链进入人体，进而影响到人类健康。由于苯环数越高，脂溶性越大，水溶性越低，生物可降解性越低，所以能降解高分子量PAHs的微生物较少。
[0005] 微生物的降解是PAHs去除的主要途径。有研究表明，加入到修复现场中的游离微生物可能由于土著菌的恶性竞争或难以适应环境而导致应用结果与实验结果差异较大，使之不能很好地应用于原位污染土壤的修复。已有研究表明，在微生物修复PAHs污染土壤中，菌种的种内联合或种间联合降解往往优于单个菌种的降解能力，但能否将高效降解菌的降解能力淋漓尽致的发挥出来是关键。微生物在载体表面附着生长可增加微生物与吸附态PAHs的接触机会，从而促进微生物对PAHs的降解作用。土壤修复中的载体材料不仅是微生物的附着剂，同时，载体提供的微环境还是一个良好的缓冲体系，可以屏蔽土壤不利条件的侵害，最重要的是，载体可以为外源微生物提供充足的营养，提高土壤微生物的密度和活性。所以，在大规模推广和应用微生物固定化技术修复北方寒冷地区受PAHs污染的冻融土壤中，耐低温高效PAHs降解菌的筛选和固定化载体的选择是关键，其次是固定化方法的选择。
发明内容
[0006] 为解决上述问题，本发明的目的是筛选耐低温高效PAHs降解菌，将真菌与细菌联合固定在生物质可降解载体材料玉米芯上，构建固定化噬低温真菌-细菌共生体系，为冻融交替条件下PAHs污染土壤微生物原位修复提供最佳技术途径。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂，于玉米芯、麦麸和豆饼混合制得的载体上，采用吸附法固定混合菌剂；所述的混合菌剂由保藏编号为CGMCC NO.14048的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4和保藏编号为CGMCC NO.15183的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，按体积比1:1混合组成。
[0008] 上述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂，按重量比，玉米芯：麦麸：豆饼＝1：(0.05～0.08)：(0.05～0.10)。
[0009] 上述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
[0010] 1)混合菌剂的制备：将保藏编号为CGMCC NO.14048的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4和保藏编号为CGMCC NO.15183的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，按体积比1:1，接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床混合培养3d，制得混合菌剂；
[0011] 2)载体预处理：将玉米芯粉碎，加入到生石灰水溶液中，浸透拌匀，盖上薄膜闷24h；过滤取玉米芯，将处理后的玉米芯与麦麸和豆饼混合均匀，调节含水量40～50％，pH为
6.5～7.0，得预处理的载体；
6.5～7.0，得预处理的载体；
[0012] 3)吸附固定：将预处理的载体121℃高温灭菌60min，按1.0ml/g的固液比，用增殖培养液浸润预处理的载体，培养12～24h后；按10％接种量加入步骤1)制备的混合菌剂，15℃恒温培养，每24h补加一次增殖培养液，连续补加3次后，在继续15℃恒温培养4～5d，得单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂。
[0013] 上述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂的制备方法，所述的完全培养基是牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1 000mL，pH为7.1～7.2，121℃灭菌20min。
[0014] 上述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂的制备方法，所述的增殖培养液是蔗糖4g，酵母膏3g，KH2PO4 0.5g，(NH4)2HPO4 2g，MgSO4·H2O 0.25g，pH 6.0～6.5，121℃灭菌20min。
[0015] 上述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂在降解冻融土壤中多环芳烃污染物中的应用。方法如下：于含有多环芳烃污染物的冻融土壤中，加入上述的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂，补加或不补加水，使土壤含水量为20～30％。
[0016] 所述的多环芳烃是由2个或2个以上的苯环稠合在一起组成的有机化合物。优选的，所述的多环芳烃是菲、芘和苯并[a]芘。
[0017] (一)本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4的筛选方法如下：
[0018] 从沈抚灌渠采集3点土样，采样深度约为50cm，经碾碎，过2mm筛，将土样混合后装入试剂袋密封，放入冰箱4℃保存备用，并测定其PAHs浓度。模拟该地区冬季低温的冻结土样，将其置于-20℃冰箱内冷冻20d，并于15℃培养箱内融化10d后备用。称取适量土样，编号分别为SR(未冻结土样)、SD(冻结土样)，置于营养培养基中自然富集培养4d，然后取上述富集培养液10mL接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，采用定时定量转接逐步提高碳源浓度法进行驯化，于15℃，120r·min－1摇床富集培养7d。选择培养基中Phe、Pyr与BaP初始－1 －1浓度为10、10与5mg·L ，第2次转接浓度增加至20、20与10mg·L ，第3次转接浓度增加至
30、30与15mg·L－1。将菌泥悬液用无菌水稀释制成10－2、10－3、10－4、10－5和10－6稀释度的菌泥悬液。吸取0.2mL分别涂布于加PAHs膜的固体营养培养基平板上，15℃倒置培养至有肉眼可见的明显菌落长出，平板连续划线转板3次，挑取菌落大，生长较快的单菌株接入喷涂PAHs的营养培养基斜面，分别于28、15、4℃下倒置培养10d左右，观察生长状况，对低温PAHs降解菌进行初筛。初筛出4株细菌，记为SDR2-SDR5，将初筛得到的菌种按10％量按种其菌悬液到实验模拟土壤中，其菌浓度为6×108CFU/mL，Pyr与BaP的浓度分别为30mg/kg、15mg/kg。随时补加无菌水，使土壤水分为30％，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，分别在0，15，30，45和60d取样，提取纯化处理进行液相色谱分析，测定土壤中PAHs的残留量，结果SDR4效果显著。
30、30与15mg·L－1。将菌泥悬液用无菌水稀释制成10－2、10－3、10－4、10－5和10－6稀释度的菌泥悬液。吸取0.2mL分别涂布于加PAHs膜的固体营养培养基平板上，15℃倒置培养至有肉眼可见的明显菌落长出，平板连续划线转板3次，挑取菌落大，生长较快的单菌株接入喷涂PAHs的营养培养基斜面，分别于28、15、4℃下倒置培养10d左右，观察生长状况，对低温PAHs降解菌进行初筛。初筛出4株细菌，记为SDR2-SDR5，将初筛得到的菌种按10％量按种其菌悬液到实验模拟土壤中，其菌浓度为6×108CFU/mL，Pyr与BaP的浓度分别为30mg/kg、15mg/kg。随时补加无菌水，使土壤水分为30％，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，分别在0，15，30，45和60d取样，提取纯化处理进行液相色谱分析，测定土壤中PAHs的残留量，结果SDR4效果显著。
[0020] 菌株SDR4基因的提取、PCR扩增、测序由上海生工生物技术有限公司完成。将测序结果在NCBI网站上的GenBank中用Blast对基因序列进行同源性比较，以确定该菌种属。应用MEGA 5.0软件(MoleculaEvolutionary Genetics Analysis)计算遗传距离，采用邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树，用Bootstrap分析评估数的稳定性。由图1可见，SDR4菌与假单胞菌属的16S rDNA序列自然聚类，与其相似度在99％，因此菌株SDR4归属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
[0021] 无机盐液体培养基包括：K2HPO41.0g，(NH4)2SO4 5g，MgSO4﹒7H2O 0.5g，pH 7.0～7.2，蒸馏水1L定容，121℃灭菌25min，营养培养基(CM培养基)：蛋白胨10.0g，葡萄糖10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化钠5g，pH 7.0～7.2，以蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌25min，固体培养基另加琼脂粉20g/L。
[0022] (二)本发明提供的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7的筛选
[0023] 从鸡西污染地采集3点土样，采样深度约为50cm，经碾碎，过2mm筛，将土样混合后装入试剂袋密封，放入冰箱4℃保存备用，并测定其PAHs浓度。模拟该地区冬季低温的冻结土样，将其置于-20℃冰箱内冷冻20d，并于15℃培养箱内融化10d后备用。称取适量土样，编号分别为SR(未冻结土样)、SD(冻结土样)，置于营养培养基中自然富集培养4d，然后取上述富集培养液10mL接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，采用定时定量转接逐步提高碳源浓度法进行驯化，于15℃，120r·min－1摇床富集培养7d。选择培养基中Phe、Pyr与BaP初始浓度为10、10与5mg·L－1，第2次转接浓度增加至20、20与10mg·L－1，第3次转接浓度增加至30、30与15mg·L－1。将菌泥悬液用无菌水稀释制成10－2、10－3、10－4、10－5和10－6稀释度的菌泥悬液。吸取0.2mL分别涂布于加PAHs膜的固体营养培养基平板上，15℃倒置培养至有肉眼可见的明显菌落长出，平板连续划线转板3次，挑取菌落大，生长较快的单菌株接入喷涂PAHs的营养培养基斜面，分别于28、15、4℃下倒置培养10d左右，观察生长状况，对低温PAHs降解菌进行初筛。初筛出真菌3株，记为JDR6-JDR8，将初筛得到的菌种按10％量按种其菌悬液到实验模拟土壤中，其菌浓度为6×108CFU/mL，Pyr与BaP的浓度分别为30mg/kg、15mg/kg。随时补加无菌水，使土壤水分为30％，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，分别在0，15，30，45和60d取样，提取纯化处理进行液相色谱分析，测定土壤中PAHs的残留量，结果JDR7效果显著。
[0024] 菌株JDR7，在牛肉膏蛋白胨平板上呈白色，生长初期成花瓣状，后期菌丝发达.生长繁密，在扫描电镜下观察呈管状，是一种具有良好的食品安全评估记录的工业产油好氧真菌。
[0025] 菌株JDR7基因的提取、PCR扩增、测序由上海生工生物技术有限公司完成。将测序结果在NCBI网站上的GenBank中用Blast对基因序列进行同源性比较，以确定该菌种属。应用MEGA 5.0软件(MoleculaEvolutionary Genetics Analysis)计算遗传距离，采用邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树，用Bootstrap分析评估数的稳定性。由图2可见，JDR7菌与被孢霉的ITS序列自然聚类，与其相似度在99％，因此菌株JDR7归属于被孢霉。
[0026] 本发明具有以下优点：本发明，应用的菌为耐低温高效PAHs降解菌，在寒冷地区其活性不会受到抑制，另外，所用玉米芯表面形状疏松，内部组织均匀、孔隙发达，成本低，制备工艺简单，不会引入二次污染，不需要回收。此外，玉米芯固定化混合菌的微环境能有效屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生物的恶性竞争、吞噬和毒害，使其在复杂环境中也可稳定地发挥高效能。经SEM(扫描电镜)观察到，载体玉米芯可提高微生物的浓度，60d后，对Phe、Pyr和BaP的去除率分别为58.49％、45.91％和37.07％。附图说明
[0027] 假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。保藏日期为2017年4月19日，保藏编号为CGMCC NO.14048。
[0028] 高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。保藏日期为2018年1月5日，保藏编号为CGMCC NO.15183。
[0029] 图1是基于16S rDNA序列和Neighbor-Joining法构建SDR4的系统进化树。
[0030] 图2是基于ITS序列和Neighbor-Joining法构建JDR7的系统进化树。
[0031] 图3为玉米芯固定化混合菌的×2000扫描电镜照片。
[0032] 图4为三种降解方法降解菲(Phe)的比较图。
[0033] 图5为三种降解方法降解芘(Pyr)的比较图。
[0034] 图6为三种降解方法降解苯并[a]芘(Bap)的比较图。
具体实施方式
[0035] 实施例一种降解冻融土壤中多环芳烃污染物的方法
[0036] (一)假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4的培养
[0037] 完全培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为7.1～7.2，121℃灭菌20min。
[0038] 取保存于斜面培养基上的、保藏编号为CGMCC NO.14048的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4，按5％的接种量接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床培养30～40h，至细菌密度为6×108CFU·mL－1，得假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4细菌菌悬液。
[0039] (二)高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7的培养
[0040] 完全培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为7.1～7.2，121℃灭菌20min。
[0041] 取保存于斜面培养基上的、保藏编号为CGMCC NO.15183的高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7，按5％的接种量接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床培养30～40h，至孢子悬浊液中孢子密度6×108CFU·mL－1，得被高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7真菌菌悬液。
[0042] (三)混合菌剂
[0043] 完全培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，酵母粉5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH为7.1～7.2，121℃灭菌20min。
[0044] 按体积比1:1，取假单胞菌(Pseudomonas sp.)SDR4细菌菌悬液和高山被孢霉(Mortierella alpine)JDR7真菌菌悬液，分别按10％的接种量接种于完全培养基中，15℃，120r/min摇床混合培养3d，得混合菌剂。
[0045] (四)载体预处理
[0046] 将新鲜干燥的玉米芯粉碎至粒度为1.5～2cm，加入到0.1mol·L-1生石灰水溶液中，浸透拌匀，盖上薄膜闷24h；过滤取玉米芯，将处理后的玉米芯与麦麸和豆饼混合均匀，调节含水量45％，pH为6.5～7.0，得预处理的载体；按重量比，玉米芯：麦麸：豆饼＝1：(0.05～0.08)：(0.05～0.10)。
[0047] (五)吸附固定
[0048] 增殖培养液是：蔗糖4g，酵母膏3g，KH2PO4 0.5g，(NH4)2HPO4 2g，MgSO4·H2O 0.25g，pH 6.0～6.5，121℃灭菌20min。
[0049] 将步骤(四)制备的预处理的载体121℃高温灭菌60min，按1.0ml/g的固液比，用增殖培养液浸润预处理的载体，培养12～24h后；按10％接种量加入步骤(三)制备的混合菌剂，15℃恒温培养，每24h补加一次增殖培养液，连续补加3次后，再继续15℃恒温培养4～5d，在培养过程中，随着混合菌的生长，部分微生物自然固定于载体上，培养结束后用去离子水洗涤固定化混合菌细胞数次，制得单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂，记为Y-SDR4+JDR7。
[0050] (六)降解
[0051] 降解实验用土壤：采自中国科学院沈阳生态试验站0～20cm表层清洁土，土壤为草甸棕壤，其基本理化性状：pH为6.72，有机碳为17.8g/kg，全氮为1.1g/kg，全磷为0.35g/kg，交换量(CEC)为45.04mg/kg。土壤过2mm筛后，分装培养瓶中，每瓶20g，121℃高温灭菌60min，冷却后每瓶定量加入Phe、Pyr和Bap的丙酮溶液，混合均匀，使Phe、Pyr和Bap的初始浓度分别为120mg/L、120mg/L、60mg/L，放置过夜，得含有Phe、Pyr和Bap污染物的土壤样品。
[0052] 本发明：按2％接种量，将本发明的单载体耐低温降解多环芳烃混合菌剂(Y-SDR4+JDR7)加入到含有Phe、Pyr和Bap污染物的土壤样品中，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，随时补加无菌水，使土壤水分为20％，分别在0、15、30、45、60d取样。
[0053] 对比例1：按2％接种量，直接将步骤(三)制备的混合菌剂(SDR4+JDR7)加入到含有Phe、Pyr和Bap污染物的土壤样品中，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，随时补加无菌水，使土壤水分为20％，分别在0、15、30、45、60d取样。
[0054] 对比例2：按2％接种量，将无菌水(CK)加入到含有Phe、Pyr和Bap污染物的土壤样品中，置冻融循环箱中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，随时补加无菌水，使土壤水分为20％，分别在0、15、30、45、60d取样。
[0055] (七)结果
[0056] 称取20g处理后土样过筛60目，倒入100ml离心管中，用移液枪加30ml二氯甲烷超声2次，每次超声2h，超声时保持超声仪内水温在30℃以下。将超声后的离心管放入离心机，以4000r/min的转速离心10min，离心完成后将上清液倒入相应编号的鸡心瓶中进行旋转蒸发。吸取2ml正己烷溶解样品，将其转移到净化柱(1g中性A12O3+1g硅胶+1g无水硫酸钠)中净化，用30mL正己烷、二氯甲烷(体积比为1:1)淋洗，收集滤出液，浓缩至约1mL，用柔和氮气吹干，1mL乙腈定容用液相色谱测定PAHs。
[0057] 污染土壤的待检测样品均使用荧光及紫外检测器进行检测，色谱条件：色谱柱为多环芳烃分析专用柱ZORBAX EclipsePAH(4.6m×250mm×5um)；柱温25℃；流动相为色谱纯乙腈和水，乙腈:水＝60％:40％，流速1.000mL/min；进样量为10μL，各种PAHs以色谱峰保留时间定性，外标法定量，方法回收率79.56％～92.48％。
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