技术领域
[0001] 本
发明涉及一种新型的复合生物组织修复材料及其制备方法和用途，属于
生物材料领域。
背景技术
[0002] 羊膜是胎膜的最内层，属于
生物膜中的一种，是一类天然细胞外基质类生物膜材。羊膜由滋养细胞层分化而来，表面光滑，半透明，有韧性及弹性，厚度为0.02-0.50mm，主要由I、III型
纤维胶原蛋白构成，含有少量的VI、V型胶原，其中含有多种生长因子，如
成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)、转移生长因子-β(transforming growth-β,TGF-β)、促进血管生成的血管内皮生长因子(VEGF)，还含有纤维连接蛋白(fibronectin,FN)等。羊膜不表达HLA-A、B、C及DR
抗原或β2微球蛋白，不含血管、淋巴和神经组织，其抗原性远低于普通组织。大量研究表明，羊膜具有良好的细胞相容性和组织相容性，并具有部位特异的组织再生能
力，是生物性能良好的新型生物材料。
[0003] 羊膜作为生物材料在
基础研究及临床应用中已经有多年的使用历史。早在20世纪初期就有用含羊膜的胎膜供体移植于烧伤和溃疡创面的报道，随后羊膜在颅脑外科、
腹腔外科、妇产科及眼科均有应用。具体来说其主要用途有：①用于眼睛表面
疾病如
角膜修复、先天性
青光眼、角膜溃疡等的
治疗；②用于鼓膜损伤的修补；③用于外科手术后的粘连
预防；④用于难愈合创面等的修复治疗。
[0004] 然而，
单层羊膜存在机械性能不足以及降解周期较短等
缺陷，限制了其临床应用范围。根据临床报道，由于羊膜较薄，
抗拉强度不足，抗
张力强度弱，降解时间较快等，不能用于需要承受一定力学负荷的组织缺损的修复，如各种类型的外伤性缺损、先天性缺损、医源性缺损等、管道器官部分缺损、周围神经缺损、韧带缺损等。因此，有必要采用适当的方法对羊膜进行改良，既能改善抗酶解性能，增强其机械性能，又能保持其生物活性，以满足更多的临床需求。
发明内容
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的复合生物组织修复材料及其制备方法和用途。
[0006] 本发明复合生物组织修复材料，它是多层羊膜，羊膜与羊膜之间通过
粘合剂粘合。
[0007] 其中，所述粘合剂是羧甲基
纤维素、胶原蛋白溶液、透明质酸钠、
硫酸软骨素和α-氰基
丙烯酸酯类医用粘合剂。
[0008] 其中，所述
羧甲基纤维素的浓度为1～10％；
[0009] 所述胶原蛋白溶液的浓度是1～50％；优选浓度为10～40％；
[0010] 所述透明质酸钠的浓度是0.1～3％；优选浓度为1～2％；
[0011] 所述硫酸软骨素的浓度是0.5～4％；优选浓度为1～3％。
[0012] 其中，所述粘合剂的使用量为：单层羊膜每平方厘米喷洒或涂抹粘合剂0.1ml～0.4ml。
[0013] 其中，所述修复材料的形状是平面结构、弧面结构、管状结构。
[0014] 本发明还提供了前述修复材料的方法，所述材料按照如下方法制备：
[0015] (1)取羊膜，经
脱脂、病毒灭活、去垢、脱细胞、冻干处理，得单层羊膜；
[0016] (2)将单层羊膜复合；
[0017] (3)加压、
冷冻干燥，
包装、灭菌，即可。
[0018] 其中，所述方法的步骤如下：
[0019] Ⅰ、取羊膜，经脱脂、病毒灭活、去垢、脱细胞、冻干处理，切分成为羊膜单元；
[0020] Ⅱ、取一片羊膜单元，铺于平面模具上，在羊膜表面涂抹或喷洒粘合剂，取另一片羊膜单元，重合叠放，去除两层羊膜单元间的气泡，重复前述步骤至所需层数；
[0021] Ⅲ、加压、冷冻干燥，包装、灭菌，得平面结构的修复材料。
[0022] 其中，所述方法的步骤如下：
[0023] a、取羊膜，经脱脂、病毒灭活、去垢、脱细胞、冻干处理，切分成为羊膜单元；
[0024] b、在羊膜表面涂抹或喷洒粘合剂，将羊膜包裹于柱状模具上，一层一层包裹至所需羊膜层数；
[0025] c、加压、冷冻干燥，包装、灭菌，得管状结构的修复材料。
[0026] 其中，所述方法的步骤如下：
[0027] ①取羊膜，经脱脂、病毒灭活、去垢、脱细胞、冻干处理，切分成为羊膜单元；
[0028] ②取一片的羊膜单元铺于弧面模具的凹面或凸面，在羊膜表面涂抹或喷洒粘合剂，取另一片羊膜单元，重合叠放，去除两层羊膜单元间的气泡，重复前述步骤至所需层数；
[0029] ③加压、冷冻干燥，包装、灭菌，得弧面结构的修复材料。
[0030] 其中，所述干燥是
真空冷冻干燥或常温减压干燥；所述灭菌方法是采用环
氧乙烷灭菌或Co-60辐照灭菌。
[0031] 本发明还提供了前述修复材料在制备缺损修复材料中的用途。
[0032] 本发明制备修复材料时，使用的模具的材质包括但不限于带医用
滤纸的高
硼酸玻璃、不锈
钢、聚四氟乙烯。
[0033] 本发明制备的新型的复合生物组织修复材料中既去除了羊膜中抗原物质，免疫反应进一步降低，又保留的羊膜的天然
支架结构和部分
生物活性成分，从而保留了羊膜的固有特性，如促进创面愈合、防粘连、减少
炎症反应等。同时采用安全有效的粘合方法，使两个单元层的羊膜紧密结合，从而提高了羊膜的抗拉及抗张力强度，延长了降解时限、消除了静电现象，具有广阔的临床应用和市场前景。
[0034] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的
修改、替换或变更。
[0035] 以下通过
实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0036] 图1平面状多层材料示意图。
[0037] 图2管腔状多层材料示意图。
[0038] 图3弧面多层材料示意图。
[0039] 图4实验组A细胞相容性实验的观察结果。其中：A：接种第1天细胞的生长情况；B：接种第3天细胞的生长情况；C：接种第5天细胞的生长情况。
具体实施方式
[0040] 实施例1本发明复合生物组织修复材料的制备
[0041] 1.1实验组A的制备：
[0042] (1)取健康产妇胎盘羊膜，经脱脂、病毒灭活、去垢、脱细胞、冻干处理(可按照公开号为CN1618954A的实施例1制备)，再将冻干后的脱细胞羊膜分切为2cm×4cm尺寸的矩形单元。
[0043] (2)取一个
不锈钢材质的平板平放于操作台，先将第一个矩形单元平铺于平板上，在材料上表面均匀涂抹5％胶原蛋白溶液(每平方厘米涂抹0.2～0.3ml)，再将第二个矩形单元与第一个矩形单位重合叠放，并排除各单元层间的气泡，使其紧密贴合。
[0044] (3)重复上述步骤(2)重叠至5层。
[0045] (4)另取一个相同材质的平板
覆盖于上述重叠好的材料上，加压、冷冻干燥，包装、15kGy辐照灭菌，即得尺寸为2cm×4cm，层数为5层的实验组A(图1)。
[0046] 1.2对照组A的制备：
[0047] (1)取健康产妇胎盘羊膜，经脱脂、病毒灭活、去垢、脱细胞，即得中间品脱细胞羊膜。
[0048] (2)取一个不锈钢材质的平板平放于操作台，先将第一张中间品脱细胞羊膜平铺于平板上，再将第二张与第一张重合叠放，并排除各单元层间的气泡，使其紧密贴合。
[0049] (3)重复上述步骤(2)重叠至5层。
[0050] (4)另取一个平板覆盖于上述重叠好的脱细胞羊膜材料上，加压、冷冻干燥，分切为2cm×4cm、包装、15kGy辐照灭菌，即得尺寸为2cm×4cm，层数为5层的对照组A。
[0051] 1.3对照组B的制备：
[0052] 取健康产妇胎盘羊膜，经脱脂、病毒灭活、去垢、脱细胞，冷冻干燥，并分切为2cm×4cm、包装、15kGy辐照灭菌，即得单层脱细胞羊膜成品。
[0053] 1.4细胞相容性检测
[0054] 将实验组A材料用培养液预湿，植入人成纤维细胞，种植
密度为10万，DMEM/HamsF12培养液，pH 7.2，5％CO2饱和湿度培养，每2天换液1次，倒置相差
显微镜下观察细胞的黏附、生长情况。
[0055] 结果：加入培养液继续培养10小时后观察，成纤维细胞已经伸展，有多个突起。24小时后细胞大多呈梭形。培养3天后，贴附于材料的细胞数量增加。培养5天后细胞两侧突起伸长细胞数量且形态无明显变化。说明：成纤维细胞能在实验组A材料上正常生长、增殖(如图4)。
[0056] 1.5物理性能检测
[0057] 力学性能：抗拉强度、剥离力的测定采用智能
电子力学试验机检测。
[0058] 静电现象：分别测试实验组A、对照组A、对照组B与取用器具
接触后是否产生静电。
[0059] 分层测试：将实验组A与对照组A用生理盐
水，35～37℃下浸泡24h，观察其是否存在分层现象。
[0060] 表1物理性能测定结果
[0061]
[0062] 注：“/”表示不适用。
[0063] 测试结果：实验组A的抗拉强度较对照组A、对照B有显著提高；实验组A与对照组A复水后均未发生分层，但实验组A的剥离力指标明显优于对照组A，说明实验组A单元层间结合更为紧密；实验组A与对照组A均无明显的静电现象。
[0064] 实验结果说明，本发明复合修复材料的力学性能优良，抗拉及抗张力强度强，使用过程中无明显静电现象，复水后不分层。
[0065] 实施例2本发明复合生物组织修复材料的制备
[0066] 实验组B的制备：
[0067] (1)取健康产妇胎盘羊膜，经脱脂、病毒灭活、去垢、脱细胞、冻干处理(可以按照公开号为CN1618954A的实施例1制备)，再将冻干后的脱细胞羊膜分切为4cm×8cm规格的矩形单元。
[0068] (2)包裹前，在每个单元的其中一侧均匀喷洒α-氰基丙烯酸酯类医用粘合剂(每平方厘米涂抹0.1～0.15ml)，记为Y面，未喷洒粘合剂的一侧记为N面。
[0069] (3)取一个直径为1mm的柱状模具，将第一个矩形单元N面朝向模具表面，沿短边环向包裹模具，排除各层间的气泡，使其紧密贴合。第二个矩形单元依照上述操作与第一个矩形单位重合叠放。
[0070] (4)重复步骤(2)至(3)重叠包裹至4个单元。
[0071] (5)另取一个空心圆柱模具覆盖于上述材料上，加压、冷冻干燥，包装、环氧乙烷灭菌，即得成品材料(图2)。
[0072] 实施例3本发明复合生物组织修复材料的制备
[0073] 实验组C的制备：
[0074] (1)取健康产妇胎盘羊膜，经脱脂、病毒灭活、去垢、脱细胞，即得中间品脱细胞羊膜(可以按照公开号为CN1618954A的实施例1制备)。
[0075] (2)取一个凹面模具，将第一层中间品平铺于模具，并在中间品上表面均匀涂抹2％的透明质酸钠溶液(每平方厘米涂抹0.3～0.4ml)；将第二层中间品平铺于第一层材料重合叠放，并排除各层间的气泡，使其紧密贴合。
[0076] (4)重复步骤(2)重叠包裹至4个单元。
[0077] (5)另取一个凸面模具覆盖于上述材料上，加压、冷冻干燥，裁切、包装、15kGy辐照灭菌，即得成品材料(图3)。
[0078] 实施例4本发明复合生物组织修复材料的制备
[0079] (1)取健康产妇胎盘羊膜，经脱脂、病毒灭活、去垢、脱细胞、冻干处理，再将冻干后的脱细胞羊膜分切为2cm×4cm尺寸的矩形单元。
[0080] (2)取一个不锈钢材质的平板平放于操作台，先将各组第一个矩形单元平铺于平板上，在各测试组表面均匀涂抹本发明筛选的粘合剂，粘合剂对照组涂抹羟丙甲纤维素，空白对照组涂抹注射用水，再将第二个矩形单元与第一个矩形单位重合叠放，并排除各单元层间的气泡，使其紧密贴合。
[0081] (3)重复上述步骤(2)重叠至4层。
[0082] (4)另取一个相同材质的平板覆盖于上述重叠好的材料上，加压、冷冻干燥，包装、15kGy辐照灭菌，即得尺寸为2cm×4cm，层数为4层的各实验组。
[0083] (5)分层测试：将各组材料分别用生理盐水，35～37℃下浸泡(复水)24h，观察其是否存在分层现象。
[0084] (6)采用智能电子力学试验机检验各实验组及对照组的剥离力，结果如下表所示：
[0085]
[0086] 按照双尾异方差统计分析可得：羧甲基纤维素组(1～15％)、胶原蛋白溶液组(1～55％)、透明质酸钠组(0.1～3％)、硫酸软骨素组(0.5～5％)、α-氰基丙烯酸酯类医用粘合剂组与羟丙甲纤维素组、空白对照组均存在显著性差异，显差水平p＜0.05。
[0087] 实验结果说明，采用本发明羧甲基纤维素、胶原蛋白溶液、透明质酸钠、硫酸软骨素和α-氰基丙烯酸酯类医用粘合剂可制备得到力学性能优良的复合羊膜，其中以胶原蛋白溶液与α-氰基丙烯酸酯类医用粘合剂的效果更佳。
[0088] 综上，本发明
复合材料的力学性能优良，
生物相容性好，临床应用前景优良。
