【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物体又は植物の培養組織及び／又は細胞を用いて、医薬、化粧品、食品添加物、農薬など又はこれらの原料として有用な植物二次代謝産物の生産を促進する技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、産業上価値のある植物二次代謝産物は栽培又は野生植物から抽出されているが、これら植物体の二次代謝産物を選択的に高めうる方法はほとんど知られていない。

【０００３】また、バイオテクノロジーの一手段である組織及び／又は細胞培養においても、ムラサキ培養細胞による創傷治癒薬原料シコニンの生産、薬用ニンジン培養細胞によるジンセノシド等含有エキスの生産など少数の例を除けば、植物組織又は細胞培養を用いて工業的に生産した例は知られていない。

【０００４】培養組織及び／又は細胞によるこれら有用二次代謝産物の生産については、20年以上も前から、大学、公的研究機関又は企業で精力的に研究が進められてきたにもかかわらず、実用化に結びついた例は極めて少ない。 その原因の一つに、培養物に含まれる二次代謝産物の含量が低いことが挙げられる。 この二次代謝産物の含量を増加させる有力な戦略の一つに、培地組成の最適化が挙げられるが、含量の増加に適した培地組成は植物種及び二次代謝産物ごとに異なるのが普通であり、また長期間の検討を要する割には、実用化に充分なレベルにまで二次代謝産物の含量を増加させることが困難であるケースが多かったため、効率よく実用化研究を進める上での障害になっていた[J. Berlin, Biotechnology 2 ^nd
Edition,eds. HJ Rehm and G. Reed, volume eds. H.
Kleinkauf and H. von Dhren, VCH, Weinheim, German
y, 1997, pp. 593-640]。

【０００５】近年、汎用的に二次代謝産物の生産性を向上させる一つの手段として、微生物の培養物などのエリシターを培養組織又は細胞に添加する方法が提案されたが、普遍的に使用できる菌種を見いだすことができず、
また生産性向上にも限界があったため、実用化には至らなかった。 このような背景のもと、特定の植物種では、
前記のエリシターで処理した細胞中で、植物ホルモンの一種であるジャスモン酸のレベルが高まり、これが二次代謝産物の生産性向上に寄与することが明らかにされ、
この原理に基づいた植物二次代謝産物の生産促進物質に関する特許が出願されている（DE 4122208、特開平5-18
4355、特開平8-33490 、特開平7-308196、特開平7-3081
97、特開平8-198863）。

【０００６】しかしながら、ジャスモン酸又はその誘導体類が二次代謝産物の生産性を向上させうる場合でも、
実用化の観点からはその効果は不十分であることが多く、より効果的な生産性向上策の考案が望まれていた。

【０００７】以上の背景のもと、本発明者らは、植物二次代謝に対するジャスモン酸の効果の解析を通して、ジャスモン酸及びジャスモン酸と実質的に同じ作用を有する類縁化合物を植物体、植物組織又は細胞培養に処理するにあたって、それら化合物の効果を高めうる方法を考案し本発明を完成した。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物体、植物組織及び／又は培養細胞を用いて、各親植物に含まれる二次代謝産物の含量を高めることを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】ファイトアレキシンやアルカロイド、テルペノイドなど植物二次代謝産物生産において、ジャスモン酸が生合成関連の遺伝子発現に関わるシグナル物質であることを示唆する研究が数多く報告されているが、ジャスモン酸の下流におけるレセプターを介した別のシグナル伝達機構の存在、あるいはジャスモン酸の直接的な遺伝子発現機構など、ジャスモン酸がいかにしてその作用を発現しているかについては依然不明である。

【００１０】ジャスモン酸やその典型的な誘導体であるジャスモン酸メチルを外部から植物体に与えたときに植物が二次代謝産物生産を開始するまでには、多くの場合長いタイムラグが必要である。 更に、これら二次代謝産物生産を引き起こすために必要なジャスモン酸は比較的高濃度である。 これらの結果は、外部から投与されたジャスモン酸が直接的に二次代謝産物の生産性向上を引き起こしているのではなく、この生産性向上に至る過程には更に二次的な制御因子が存在することを示唆している。 そこで、前記タイムラグはジャスモン酸の働きを阻害する物質がジャスモン酸処理時にすでに細胞内に存在し、この阻害物質がジャスモン酸の活性発現を遅らせていると仮定して研究を進めた。 その結果、ジャスモン酸の活性は植物ホルモンであるサイトカイニンによって完全に打ち消されることを見いだした。 即ち、研究材料として用いたイネ葉においては、ジャスモン酸をカイネチンやゼアチンと同時に処理すると、ジャスモン酸のエリシター活性（イネの二次代謝産物であり、ファイトアレキシンの一種であるサクラネチンの生産性向上）は完全に阻害された。

【００１１】サイトカイニンがフリーラジカルの消去機能を有するという報告[Frimer, AA et al., J. Org.
Chem. 48, 1700-1705 (1983)、Beckman, KB and Ingr
am,DS, Physiol. Mol. Plant Pathol. 45, 229-246
(1994)] や、フリーラジカルの消去剤のタイロンがジャスモン酸の活性を阻害したことから、ジャスモン酸によって引き起こされる二次的なシグナル伝達機構に活性酸素の生成が関与していると推測される。

【００１２】植物体内において、活性酸素はクロロプラストやミトコンドリアで恒常的に生成しているが、植物体に対して強い毒性を示すため、クロロプラストではアスコルビン酸、アスコルビン酸ペルオキシダーゼによって消去されている。 アスコルビン酸自体も活性酸素消去剤として機能することが知られており、本発明者らは、
前記イネ葉を用いた実験から、カイネチンほど顕著ではないが、アスコルビン酸もジャスモン酸のエリシター活性を阻害することを見いだしている。 しかし、本発明者らは、このとき高濃度のアスコルビン酸が存在すると、
驚くべきことにジャスモン酸のエリシター活性がかえって強められることを見いだした。 アスコルビン酸が過剰に存在すると、その還元作用によって3 価鉄イオンが2
価鉄イオンに還元され、次いでFenton反応によって活性酸素の生成が促進されることが知られており[Witerbour
n, CC, Biochemical J. 198, 124-131 (1981) 、Fee,
JA, Trends Biochem. Sci. 7, 84-86 (1982)]、同様のメカニズムによってジャスモン酸のエリシター活性が促進されたものと結論づけられる。

【００１３】ジャスモン酸の作用機構に活性酸素が関与しているなら、活性酸素を発生させうるラジカル発生剤のような化合物が存在すれば、ジャスモン酸を外部から投与しなくとも、二次代謝産物の生産が誘導されると考えられる。 そこで、ニトロソ化合物を用いた反応で発生した活性酸素を前記イネ葉に処理したところ、顕著なサクラネチンの生産が確認され、ラジカル発生剤そのものもジャスモン酸と同様エリシター活性を有することを見いだした。

【００１４】即ち、本発明は、植物体の一部又は全体あるいは培養組織及び／又は細胞をラジカル発生剤で処理することを特徴とする当該植物体あるいは培養組織及び／又は細胞に含まれる二次代謝産物含有量の増加方法、
並びに前記の方法により二次代謝産物含有量が増加された植物体の一部又は全体あるいは培養物から当該二次代謝産物を回収することを特徴とする植物二次代謝産物の製造方法に関する。

【００１５】本発明に用いるラジカル発生剤とは、生体内に存在するアスコルビン酸などの還元剤と反応してラジカルを生成する化合物をいい、例えばニトロソ化合物のようなＮ−オキシド化合物、チトクロームｂ及びｃ、
セルロプラスミン誘導体、フェリシアナイド誘導体、ジクロロインドフェノール誘導体などがあげられる。 本発明に用いるラジカル発生剤としては、例えば、分子内に一般式（Ｉ）：

【００１６】

【化４】

【００１７】で示される構造を含むＮ−オキシド誘導体、具体的には、キノリンN-オキシド類、イミダゾール
N-オキシド類、ピラゾールN-オキシド類、イソチアゾールN-オキシド類、イソキサゾールN-オキシド類、ピリジンN-オキシド類、ピラジンN-オキシド類、ピリミジンN-
オキシド類、ピリダジンN-オキシド類、インダゾールN-
オキシド類、プリンN-オキシド類、イソキノリンN-オキシド類、ナフタラジンN-オキシド類、ナフチリジンN-オキシド類、キノキサリンN-オキシド類、キナゾリンN-オキシド類、シノリンN-オキシド類、プテリジンN-オキシド類、フェナンスリジンN-オキシド類、アクリジンN-オキシド類、ペリミジンN-オキシド類、フェナンスロリン
N-オキシド類、フェナジンN-オキシド類、β−カルボリンN-オキシド類（但し、各化合物の環に結合する水素原子がニトロ基、水酸基、炭素数１〜12のアルキル基、炭素数１〜12のアルコキシ基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基、アミノ基及び炭素数１〜12のアルキルアミノ基から選ばれる少なくとも１つで置換されていてもよい）が例示される。

【００１８】ここで、各化合物の環に結合する置換基としては、次の置換基を例示することができる。 即ち、炭素数１〜12のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、
sec-ブチル基、tert- ブチル基、n-ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、
ウンデシル基、ドデシル基等があげられ、炭素数３以上のアルキル基の中には、環状アルキル基、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等を含むアルキル基が包含される。

【００１９】また、炭素数１〜12のアルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、
イソプロポキシ基、n-ブトキシ基、イソブトキシ基、se
c-ブトキシ基、tert- ブトキシ基、ペンチルオキシ基、
ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基、ウンデシルオキシ基、ドデシルオキシ基等があげられ、炭素数３以上のアルコキシ基の中には、環状アルコキシ基、例えばシクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等を含むアルコキシ基が包含される。

【００２０】また、アリール基又は置換基を有するアリール基としては、例えばフェニル基、p-メトキシフェニル基、p-クロロフェニル基、p-フルオロフェニル基、ナフチル基等があげられ、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基としては、例えばベンジル基、p-メトキシベンジル基、p-クロロベンジル基、p-フルオロベンジル基等があげられる。

【００２１】また、炭素数１〜12のアルキルアミノ基としては、例えばメチルアミノ基、エチルアミノ基、n-プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、n-ブチルアミノ基、sec-ブチルアミノ基、tert- ブチルアミノ基、n-
ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基、ヘプチルアミノ基、オクチルアミノ基、ノニルアミノ基、デシルアミノ基、ウンデシルアミノ基、ドデシルアミノ基等があげられ、炭素数３以上のアルキルアミノ基の中には、環状アルキルアミノ基、例えばシクロプロピルアミノ基、シクロブチルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基等を含むアルキルアミノ基が包含される。

【００２２】これらのN-オキシド誘導体の中でも、キノリンN-オキシド類が好ましく、更に4-ニトロキノリンN-
オキシドが特に好ましい。 また、本発明に用いるラジカル発生剤としては、前記の分子内に前記一般式（Ｉ）で示される構造を有する化合物群の他に、一般式（II）又は一般式(III) ：

【００２３】

【化５】

【００２４】

【化６】

【００２５】（式中、R ¹ 、R ²及びR ³はそれぞれ独立に炭素数１〜12のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基を表す）で示されるN-オキシド誘導体をあげることができる。 ここで、R ¹ 、R ²及びR ³で示される置換基としては、それぞれ独立に次の置換基を例示することができる。

【００２６】即ち、炭素数１〜12のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert- ブチル基、n-ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等があげられ、炭素数３以上のアルキル基の中には、環状アルキル基、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等を含むアルキル基が包含される。

【００２７】また、アリール基又は置換基を有するアリール基としては、例えばフェニル基、p-メトキシフェニル基、p-クロロフェニル基、p-フルオロフェニル基、ナフチル基等があげられ、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基としては、例えばベンジル基、p-メトキシベンジル基、p-クロロベンジル基、p-フルオロベンジル基等があげられる。

【００２８】以上に示した一般式（Ｉ）で示される構造を分子内に有するN-オキシド誘導体及び一般式（II）又は一般式(III) で示されるN-オキシド誘導体は、水溶液又はメタノールなどの有機溶媒−水混合液、Tween などの界面活性剤を含む水溶液に溶解又は懸濁した後、植物体に噴霧又は塗布又はそれらに類する方法で投与するか、あるいは組織及び／又は細胞培養用の培地に溶解又は懸濁して投与することができる。 これらの投与処理における当該N-オキシド誘導体の濃度としては、0.001 mM
〜50 mM が好ましく、中でも0.01 mM 〜20 mM が特に好ましい。

【００２９】また、本発明にかかるラジカル発生剤の使用にあたっては、ラジカル発生促進剤、即ち、生体内又は当該処理液中で、酵素的又は非酵素的に酸化され、ラジカル化合物に変化しうる化合物を併用することによって更にその効果を高めることができる。 本発明で使用できるラジカル発生促進剤としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、トコフェロール及びグルタチオン等の活性酸素発生剤をあげることができる。 ここで、アスコルビン酸誘導体としては、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、パルミチン酸、ステアリン酸等との脂肪酸エステル及びそれらのアルカリ又はアルカリ土類金属塩、硫酸エステル又はその金属塩、リン酸エステル又はその金属塩を例示することができる。

【００３０】アスコルビン酸以下、以上に示したラジカル発生促進剤は、水溶液又はメタノールなどの有機溶媒−水混合液、Tween などの界面活性剤を含む水溶液に溶解又は懸濁した後、植物体に噴霧又は塗布又はそれらに類する方法で投与するか、あるいは組織及び／又は細胞培養用の培地に溶解又は懸濁して投与することができる。 これらの投与処理における、植物体の一部又は全部に対する当該ラジカル発生促進剤の濃度としては、1 mM
〜50 mM が好ましく、中でも2 mM〜30 mM が特に好ましい。 また、培養組織及び／又は細胞に対する当該ラジカル発生促進剤の処理濃度としては、0.01 mM 〜50 mM が好ましく、中でも0.02 mM 〜30 mM が特に好ましい。 この対象となる植物形態の違いによる好ましい処理濃度の差は、主として植物体表面のワックスなどの有無による浸透性に起因するものであり、本発明に用いるラジカル発生促進剤の機能の差によるものではない。

【００３１】また、本発明に用いるラジカル発生剤は、
前記のジャスモン酸又はその類縁化合物と併せて使用することにより、更にその効果を高めることができる。 ここで、ジャスモン酸又はその類縁化合物としては、以下に述べるジャスモン酸類化合物ならびにコロナチン類化合物をあげることができる。

【００３２】本発明で使用されるジャスモン酸類化合物としては、グループ１）ジャスモン酸に代表されるジャスモン酸類、グループ２）チュベロン酸に代表されるチュベロン酸類、及びグループ３）ククルビン酸に代表されるククルビン酸類を例示することができる。 グループ１）ジャスモン酸類の具体例としては、一般式（IV）：

【００３３】

【化７】

【００３４】［式中、Ｒ ^1a 、Ｒ ^1b 、Ｒ ^1c 、Ｒ ^1d 、Ｒ ^1e及びＲ ^1fは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ
² 、Ｒ ³ 、Ｒ ⁴ 、Ｒ ⁵及びＲ ⁶は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；Ｃ ¹ −Ｃ ² −Ｃ ³
−Ｃ ⁴ −Ｃ ⁵ −Ｃ ⁶からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；Ｒ ⁷は水酸基、ＯＭ
（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ ₄を表す。）、ＮＲ ^8a Ｒ ^8b （ここで、Ｒ ^8a及びＲ ^8bは、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ ⁹ （ここで、Ｒ ⁹は炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；ｎは１〜７の整数を表し；前記５員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ］で示される化合物が挙げられる。 グループ２）
チュベロン酸類の具体例としては、一般式（Ｖ）：

【００３５】

【化８】

【００３６】［式中、Ｒ ^1a 、Ｒ ^1b 、Ｒ ^1c 、Ｒ ^1d 、Ｒ ^1e及びＲ ^1fは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ
² 、Ｒ ³ 、Ｒ ⁴ 、Ｒ ⁵及びＲ ^6aは、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；Ｃ ¹ −Ｃ ² −Ｃ ³
−Ｃ ⁴ −Ｃ ⁵ −Ｃ ⁶からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；Ｒ ^6bは水酸基又は−Ｏ
−炭水化物残基を表し；Ｒ ⁷は水酸基、ＯＭ（ここで、
Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ
₄を表す。 ）、ＮＲ ^8a Ｒ ^8b （ここで、Ｒ ^8a及びＲ ^8bは、
それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。 ）、
ＯＲ ⁹ （ここで、Ｒ ⁹は炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；ｎは１〜７の整数を表し；前記５員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ］で示される化合物が挙げられる。 グループ３）ククルビン酸類としては、一般式（VI）：

【００３７】

【化９】

【００３８】［式中、Ｒ ^1a 、Ｒ ^1b 、Ｒ ^1c 、Ｒ ^1d 、Ｒ ^1e及びＲ ^1fは、それぞれ水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ
² 、Ｒ ³ 、Ｒ ⁴ 、Ｒ ⁵及びＲ ⁶は、それぞれ水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；Ｃ ¹ −Ｃ ² −Ｃ ³
−Ｃ ⁴ −Ｃ ⁵ −Ｃ ⁶からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；Ｒ ⁷は水酸基、ＯＭ
（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ ₄を表す。）、ＮＲ ^8a Ｒ ^8b （ここで、Ｒ ^8a及びＲ ^8bは、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ ⁹ （ここで、Ｒ ⁹は炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；ｎは１〜７の整数を表し；前記５員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ］で示される化合物が挙げられる。

【００３９】前記一般式（IV）、（Ｖ）及び（VI）において、Ｒ ^1a 、Ｒ ^1b 、Ｒ ^1c 、Ｒ ^1d 、Ｒ ^1e 、Ｒ ^1f 、Ｒ ² 、Ｒ
³ 、Ｒ ⁴ 、Ｒ ⁵ 、Ｒ ⁶ 、Ｒ ^6a 、Ｒ ⁷ 、Ｒ ^8a 、Ｒ ^8b又はＲ
⁹で表される炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、ｔ−
ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基が挙げられる。

【００４０】前記一般式（IV）、（Ｖ）及び（VI）において、Ｒ ^1a 、Ｒ ^1b 、Ｒ ^1c 、Ｒ ^1d 、Ｒ ^1e又はＲ ^1fで表される炭素数１〜６のアルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基が挙げられる。

【００４１】Ｒ ⁷がＯＭである場合において、Ｍで表されるアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムが挙げられる。 Ｒ ⁷がＮＲ ^8a Ｒ ^8bである場合において、Ｒ ^8a又はＲ ^8bで表される炭素数１〜６のアシル基は、直鎖、分岐鎖のいずれでもよく、例えばホルミル基、アセチル基、
プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基が挙げられる。

【００４２】Ｒ ⁷がＮＲ ^8a Ｒ ^8bである場合において、Ｒ
^8a又はＲ ^8bで表されるアミノ酸残基としては、イソロイシル基、チロシル基、トリプトフィル基が挙げられる。
Ｒ ⁷がＯＲ ⁹である場合において、Ｒ ⁹で表される炭水化物残基、及び前記一般式（Ｖ）においてＲ ^6bが−Ｏ−
炭水化物残基である場合における炭水化物残基としては、グルコピラノシル基が挙げられる。

【００４３】また、前記一般式（IV）、（Ｖ）又は（V
I）で示される化合物においては、５員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 前記一般式（IV）、（Ｖ）又は（VI）で示される化合物の好ましいものとしては、Ｒ ^1a 、Ｒ ^1b 、Ｒ ^1c 、Ｒ ^1d 、Ｒ ^1e 、
Ｒ ^1f 、Ｒ ² 、Ｒ ³ 、Ｒ ⁴ 、Ｒ ⁵及びＲ ⁶が水素原子であり、Ｒ ⁷が水酸基又はメトキシ基であり、Ｃ ¹ −Ｃ ² −
Ｃ ³ −Ｃ ⁴ −Ｃ ⁵ −Ｃ ⁶からなる側鎖が、二重結合を含まないか、あるいはＣ ¹とＣ ² 、Ｃ ²とＣ ³又はＣ ³とＣ ⁴の間で二重結合を含む化合物が挙げられる。

【００４４】本発明で使用されるジャスモン酸類化合物は、ジャスモン酸、チュベロン酸又はククルビン酸と実質的に同様の生理活性を有する誘導体であれば、特に制限はなく、例えば、ジャスモン酸、チュベロン酸又はククルビン酸の、アルキル部分の炭素数が１〜６であるアルキルエステル、あるいはジャスモン酸もしくはチュベロン酸の環上オキソ基のイミノ置換体又はククルビン酸の環上水酸基のアミノ置換体を用いることもできる。

【００４５】本発明で使用される前記一般式（IV）、
（Ｖ）又は（VI）で示される化合物には種々の立体異性体（シストランス異性体、光学異性体）が存在するが、
それぞれの異性体を単独で用いても、混合物の形で用いてもよいが、シス体化合物を用いることが特に好ましい。

【００４６】以上のジャスモン酸類の中でも前記一般式（IV）、（Ｖ）及び（VI）において、Ｒ ^1a 、Ｒ ^1b 、
Ｒ ^1c 、Ｒ ^1d 、Ｒ ^1e 、Ｒ ^1f 、Ｒ ² 、Ｒ ³ 、Ｒ ⁴ 、Ｒ ⁵及びＲ ⁶が水素原子であり、Ｒ ⁷が水酸基又はメトキシ基であり、ｎが１であり、Ｃ ³とＣ ⁴の間で二重結合を含んでいる化合物であるジャスモン酸又はジャスモン酸メチル、チュベロン酸又はチュベロン酸メチル、及びククルビン酸又はククルビン酸メチルが特に好ましい。 また、
本発明で使用されるコロナチン類化合物としては、一般式(VII) ：

【００４７】

【化１０】

【００４８】又は一般式(VIII)：

【００４９】

【化１１】

【００５０】［式中、Ｒ ¹⁰は、水酸基、ＯＲ ¹¹ （ここで、Ｒ ¹¹は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）、ＯＭ ¹ （ここで、Ｍ ¹は、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ ₄を表す。）又はＮＲ ^12a Ｒ ^12b （ここで、Ｒ ^12a及びＲ ^12bは、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１
〜６のアルキル基、アミノ酸残基又は一般式（IX）：

【００５１】

【化１２】

【００５２】（ここで、Ｒ ¹³は、水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基又は次式 −ＣＯ−Ｒ ¹⁶ （式中、Ｒ ¹⁶は、水酸基、ＯＭ ² （ここで、Ｍ ²は，アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ ₄を表す。）、ＮＲ ^17a Ｒ ^17b （ここで、Ｒ ^17a及びＲ
^17bは、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。 ）又はＯＲ ¹⁸ （ここで、Ｒ ¹⁸は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）を表す。 ）で示される基を表し；Ｒ ^14a 、Ｒ ^14b 、Ｒ ^15a及びＲ ^15bは、
それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。 ）で示される基を表す。 ）を表し；Ｒ ^19a 、Ｒ ^19b 、Ｒ ^20a 、
Ｒ ^20b 、Ｒ ²¹ 、Ｒ ²² 、Ｒ ^23a 、Ｒ ^23b 、Ｒ ^24a 、
Ｒ ^24b ，Ｒ ^25a 、Ｒ ^25b 、Ｒ ²⁶及びＲ ²⁸は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ ²⁷は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表し；式中の五員環及び六員環は、隣接する炭素原子間で二重結合を形成してもよい。 ］で示される化合物等が挙げられる。

【００５３】前記一般式(VII) 、(VIII)及び（IX）において、Ｒ ¹¹ 、Ｒ ^12a 、Ｒ ^12b 、Ｒ ¹³ 、Ｒ ^14a 、Ｒ ^14b 、
Ｒ ^15a 、Ｒ ^15b 、Ｒ ^17a 、Ｒ ^17b 、Ｒ ¹⁸ 、Ｒ ^19a 、Ｒ
^19b 、Ｒ ^20a 、Ｒ ^20b 、Ｒ ²¹ 、Ｒ ²² 、Ｒ ^23a 、Ｒ ^23b 、
Ｒ ^24a 、Ｒ ^24b ，Ｒ ^25a 、Ｒ ^25b 、Ｒ ²⁶ 、又はＲ ²⁷で表される炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ
−ブチル基、イソブチル基、sec −ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基等が挙げられる。

【００５４】前記一般式(VII) 、(VIII)及び（IX）において、Ｒ ¹³ 、Ｒ ^14a 、Ｒ ^14b 、Ｒ ^15a 、Ｒ ^15b 、
Ｒ ^19a 、Ｒ ^19b 、Ｒ ^20a 、Ｒ ^20b 、Ｒ ²¹ 、Ｒ ²² 、
Ｒ ^23a 、Ｒ ^23b 、Ｒ ^24a 、Ｒ ^24b ，Ｒ ^25a 、Ｒ ^25b 、又はＲ ²⁶で表される炭素数１〜６のアルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、sec −ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基等が挙げられる。

【００５５】Ｒ ¹⁰又はＲ ¹⁶が、ＯＭ ¹又はＯＭ ²である場合において、Ｍ ¹又はＭ ²で表されるアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム等が挙げられる。

【００５６】Ｒ ¹⁰又はＲ ¹⁶が、ＮＲ ^12a ＮＲ ^12b又はＮ
Ｒ ^17a Ｒ ^17bである場合において、Ｒ ^12a 、Ｒ ^12b 、Ｒ
^17a又はＲ ^17bで表される炭素数１〜６のアシル基は、
直鎖、分岐鎖のいずれでもよく、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、
ヘキサノイル基、アクリロイル基等が挙げられる。

【００５７】Ｒ ¹⁰又はＲ ¹⁶が、ＮＲ ^12a ＮＲ ^12b又はＮ
Ｒ ^17a Ｒ ^17bである場合において、Ｒ ^12a 、Ｒ ^12b 、Ｒ
^17a又はＲ ^17bで表されるアミノ酸残基としては、例えばイソロイシル基、バリル基、グルタミル基、リジル基等が挙げられる。

【００５８】Ｒ ¹⁰又はＲ ¹⁶が、ＯＲ ¹¹又はＯＲ ¹⁸である場合において、Ｒ ¹¹又はＲ ¹⁸で表される炭水化物残基としては、例えばグルコピラノシル基が挙げられる。 前記一般式(VIII)において、Ｒ ²⁷で表される炭水化物残基としては、例えばグルコピラノシル基が挙げられる。 コロナチン類化合物の好ましい化合物としては、次式（Ｘ）：

【００５９】

【化１３】

【００６０】で示されるコロナチン、又は次式（XI）：

【００６１】

【化１４】

【００６２】で示されるコロナファシック酸が挙げられる。 前記ジャスモン酸類化合物又はコロナチン類化合物は、前記のラジカル発生剤同様、水溶液又はメタノールなどの有機溶媒−水混合液、Tween などの界面活性剤を含む水溶液に溶解又は懸濁した後、植物体に噴霧又は塗布又はそれらに類する方法で投与するか、あるいは組織及び／又は細胞培養用の培地に溶解又は懸濁して投与することができる。 これらの投与処理の際の濃度は、ジャスモン酸類化合物については0.01μM 〜1000μM 、好ましくは 0.1μM 〜700 μM を例示でき、コロナチン類化合物については、0.001 μM 〜1000μM 、好ましくは0.
01μM〜100 μM を例示できる。

【００６３】本発明において、植物体への前記ラジカル発生剤及びジャスモン酸類化合物又はコロナチン類化合物の処理時期に特に制限はないが、通常植物体収穫の1
日〜2 週間前に処理することが好ましい。 また、ラジカル発生剤とジャスモン酸類化合物又はコロナチン類化合物は同時に処理してもよいし、時期をずらせて処理してもよい。

【００６４】また、培養組織及び／又は細胞への前記ラジカル発生剤及びジャスモン酸類化合物又はコロナチン類化合物の処理時期についても特に制限はないが、培養開始時から対数増殖期の間に処理することが好ましい。
このとき、前記植物体への処理の場合と同様、ラジカル発生剤とジャスモン酸類化合物又はコロナチン類化合物は同時に処理してもよいし、時期をずらせて処理してもよい。

【００６５】本発明の対象となる植物種としては、下等植物から高等植物に至るあらゆる植物種があげられ、例えば、イチョウ科イチョウ属のイチョウ(Ginkgo bilob
a) ；イチイ科植物、好ましくはタキサス・メディア(Ta
xus media) を含むTaxus 属植物などのタキサン型ジテルペン産生植物；ヒノキ科植物、好ましくはニオイヒバ
(Thuja occidentalis)などを含むThuja 属植物；キンポウゲ科植物、好ましくはオウレン(Coptis japonica) などを含むCoptis属植物ならびにアキカラマツ(Thalictru
m minus)などを含むThalictrum属植物；メギ科植物、好ましくはメギ(Berberis thunbergii) などを含むBerber
is属植物ならびにPodophyllum peltatumなどを含むPodo
phyllum 属植物；ツヅラフジ科植物、好ましくはタマサキツヅラフジ(Stephania cepharantha) などを含むStep
hania 属植物；ケシ科植物、好ましくはケシ(Papaver s
omniferum)などを含むPapaver 属植物；ウリ科植物、好ましくはヘチマ(Luffa cylindrica)などを含むLuffa 属植物ならびにメロン(Cucumismelo)などを含むCucumis
属植物ならびにスイカ(Citrullus vulgaris)などを含む
Citrullus 属植物；マメ科植物、好ましくはダイズ(Gly
cine max) などを含むGlycine 属植物ならびにソラマメ
(Vicia faba)などを含むVicia 属植物ならびにインゲンマメ(Phaseolus vulgalis)などを含むPhaseolus 属植物；ニッサ科植物、好ましくはキジュ(Camptotheca acu
minata) などを含むCamptotheca 属植物；トウダイグサ科植物、好ましくはハナキリン(Euphorbia millii)などを含むEuphorbia 属植物；ウコギ科植物、好ましくはオタネニンジン(Panax ginseng) などを含むPanax 属植物；ヤマゴボウ科植物、特に好ましくはヨウシュヤマゴボウ(Phytolacca americana)などを含むPhytolacca属植物；アカザ科植物、好ましくはビート(Beta vulgaris)
などを含むBeta属植物；キョウチクトウ科植物、好ましくはインドジャボク(Rauworfia serpentina)などを含む
Rauworfia 属植物ならびにニチニチソウ(Catharanthus
roseus) などを含むCatharanthus属植物ならびにツルニチニソウ(Vinca major) などを含むVinca 属植物ならびにストロファンツス(Strophanthus gratus) などを含む
Strophanthus属植物；ナス科植物、好ましくはズボイシア(Duboisia myopoloides)などを含むDuboisia属植物ならびにアメリカチョウセンアサガオ(Datura innoxia)などを含むDatura属植物ならびにトウガラシ(Capsicum an
nuum) などを含むCapsicum属植物；ゴマノハグサ科植物、好ましくはジギタリス(Digitalis purpurea)などを含むDigitalis 属植物；ムラサキ科植物、好ましくはムラサキ(Lithospermum erythrorhizon)などを含むLithos
permum属植物ならびにマクロトミア；オイクローマ(Mac
rotomia euchroma) などを含むMacrotomia属植物ならびにセイヨウムラサキ(Echium lycopsis) などを含むEchi
um属植物；キキョウ科植物、好ましくはロベリア(Lobel
ia inflata) などを含むLobelia 属植物；アカネ科植物、好ましくはアカネ(Rubia akane) などを含むRubia
属植物；ヨモギ科植物、好ましくはクソニンジン(Artem
isia annua)などを含むArtemisia 属植物；ユリ科植物、好ましくはイヌサフラン(Colchicumautumnale) などを含むColchicum 属植物；ヤマノイモ科植物、好ましくはDioscorea composita などを含むDioscorea 属植物ならびにオニドコロ(Aspidistraelatior)などを含むAsp
idistra属植物；イネ科植物、好ましくはイネ(Oryza sa
tiva)などを含むOryza 属植物が例示され、これらの中でも、Taxus 属植物などのタキサン型ジテルペン産生植物及びOryza 属植物が特に好ましい。 また、Ｔａｘｕｓ
属植物としては、セイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ ｂａｃ
ｃａｔａ ＬＩＮＮ）、イチイ(T. cuspidataSIEB. et
ZUCC.) 、キャラボク(T. cuspidata SIEB. et ZUCC. va
r nana REHDER) 、タイヘイヨウイチイ(T. brevifolia
NUTT)、カナダイチイ(T. canadensis MARSH) 、チュウゴクイチイ(T. chinensis)、ヒマラヤイチイ(T. wallic
hiana)、タキサス・メディア(T. media)などをあげることができ、中でもセイヨウイチイ及びタキサス・メディアが好ましい。

【００６６】また、本発明はあらゆる二次代謝産物に適用可能であり、例えば前記の植物が産生する二次代謝産物が挙げられ、イチョウが生産するギンコリドＡ（血管障害改善薬）などのギンコリド類及びビロバリド類、Ta
xus 属植物などが生産するタキソール（制ガン剤）などのタキサン類、Thuja 属植物などが生産するヒノキチオール（抗菌剤）などのトロポロン誘導体類、Coptis属植物やThalictrum属植物、Berberis属植物などが生産するベルベリン（健胃整腸剤）などのイソキノリンアルカロイド類、Podophylum属植物などが生産するポドフィロトキシン（制ガン剤中間体）などのフェニルテトラリン型リグナン類、Stephania 属植物などが生産するアロモリン、セファランチン（円形脱毛症治療薬）などのビスベンジルイソキノリンアルカロイド類、Luffa 属植物、Cu
cumis 属植物、Citrullus 属植物などが生産するブリオノール酸（抗アレルギー剤）などのトリテルペン類、Gl
ycine 属植物やVicia 属植物、Phaseolus 属植物などが生産するマメ科ファイトアレキシン類（抗菌剤）、Camp
totheca 属植物などが生産するカンプトテシン（制ガン剤中間体）などのキノリンアルカロイド類、Euphorbia
属植物などが生産するアントシアニン類（色素）、Pana
x 属植物などが生産するジンセノシド（強壮剤）などのジンセンサポニン類、Phytolacca属植物、Beta属植物などが生産するベタニン（色素）などのベタシアニン類、
Rauworfia 属植物などが生産するレセルピン（血圧降下剤）や、Catharanthus属植物などが生産するカサランチン、ビンドリン、ビンブラスチン（制ガン剤又は制ガン剤中間体）、Vinca 属植物などが生産するビンカミン（脳機能改善薬）などのインドールアルカロイド類、St
rophanthus属植物やDigitalis 属植物などが生産するストロファンチン、ジゴキシン（強心剤）などのステロイド配糖体類、Duboisia属植物、Datura属植物などが生産するヒヨスチアミン、スコポラミン（鎮痙剤）などのトロパンアルカロイド類、Capsicum属植物などが生産するカプサイシン（辛み成分）などのフェニルプロパノイド類、Lithospermum属植物、Macrotomia属植物、Echium属植物などが生産するシコニン、アルカニン（創傷治療剤）などのナフトキノン類、Lobelia 属植物などが生産するロベリン（呼吸興奮剤）などのロベリアアルカロイド類、Rubia 属植物などが生産するプルプリン（色素）
などのアントラキノン類、Artemisia 属植物などが生産するアルテミシニン（抗マラリア剤）などのセスキテルペンラクトン類、Colchicum 属植物などが生産するコルヒチン（痛風薬）などのコルヒクムアルカロイド類、Di
oscorea 属植物、Aspidistra属植物などが生産するジオスゲニン（ステロイドホルモン中間体）などのステロイド類、Oryza 属植物などが生産するサクラネチン、モミラクトン（抗菌剤）などのイネファイトアレキシン類が例示される。 これらの中でも、イネファイトアレキシン及びタキサン型ジテルペンが好ましい。

【００６７】また、タキサン型ジテルペンとしては、タキソール、10- デアセチルタキソール、7-エピタキソール、バッカチンIII 、10- デアセチルバッカチンIII 、
7-エピバッカチンIII 、セファロマニン、10- デアセチルセファロマニン、7-エピセファロマニン、バッカチン
VI、タキソールC 、タキシシンＩ、タキシシンIII 、タキシンＩ、タキシンII、タキサギフィン、タキサン1a、
キシロシルタキソール及びキシロシルセファロマニンなどを例示することができる。

【００６８】

【発明の実施の形態】前記植物の栽培又は組織及び／又は細胞培養は、本発明によりラジカル発生剤等の存在下に行うこと以外は、従来から知られている方法によって行うことができる。 また、生産された二次代謝産物は、
得られた植物体又はその一部、培養組織及び／又は細胞及び／又は培地等の培養物から、メタノール等の有機溶媒による抽出によって回収することができる。 また、組織及び／又は細胞培養の場合には、培地中に適当な吸着剤や有機溶媒を共存させ、連続的に回収することもできる。 本発明における組織及び／又は細胞培養の好ましい例としては、次の方法が挙げられる。

【００６９】前記植物の一部、例えば根、生長点、葉、
茎、種子などから採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたムラシゲ；スクーグ培地などの固体培地上に置床し、10〜35℃で14〜60日程度経過させて組織片の一部から、苗条、培養根又はカルスを生成させる。 このようにして得られた培養体を継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化した培養体が得られる。 ここで、安定化した培養体とは、培養中に目的外の器官分化やカルス化が起こらない状態を保持する性質をもち培養体の生育速度が均質であるものをいう。

【００７０】この安定化した培養体を増殖に適した液体培地、例えばムラシゲ；スクーグの液体培地に移して増殖させる。 液体培地において更に生育速度が高められる。 本発明では、この安定化した培養体は、前記ラジカル発生剤等の存在下で固体培地又は液体培地で培養される。

【００７１】本発明における培養のための温度としては、通常は約10〜約35℃、特に約23〜28℃が増殖速度が大きいので好適である。 また、培養期間としては、７〜
42日間が好適である。 また、培養体が苗条である場合、
又は二次代謝産物の生成に光が必要な場合には、培養体を蛍光灯など、1,000 〜10,000ルックスの照明下で行うことも可能である。

【００７２】本発明における培養方法において液体培地を用いた場合には、培養終了後に培養体をデカンテーション又は濾過等の方法によって培地から分離し、培養細胞及び／又は培地から目的とする二次代謝産物を有機溶媒による抽出等の方法によって分離することができる。
以上のようにして生産された二次代謝産物は、得られた培養体からメタノール等の有機溶媒による抽出によって分離することができる。

【００７３】

【実施例】以下、実施例及び参考例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 （参考例１）10葉期のイネ葉の長辺中央部15 cm を切り取り、短辺中央部に20ヶ所病菌移植パンチで直径2 〜3
mmの傷を付けた。 傷の上面に250 μM の濃度になるように調製したジャスモン酸溶液を25μl 滴下し、組織内へ浸透させた。 同様の操作により、更に4 枚のイネ葉についてもジャスモン酸を組織内に浸透させた。 合計5 枚のイネ葉をプラスチック容器内で26℃、24〜96時間ジャスモン酸処理した後、傷を付けた各部を含む直径5 mmの葉をコルクボーラーにて打ち抜くことでジャスモン酸処理組織片100 枚を調製した。

【００７４】このようにして得られたジャスモン酸処理組織片100 枚を、70% メタノールで3 分間煮沸し、得られたメタノール抽出物を濃縮した後、ジエチルエーテル抽出を3 回繰り返した。 ジエチルエーテル相は窒素下濃縮乾固し、残渣はメタノールに再溶解して粗抽出物を得た。

【００７５】粗抽出物は水で希釈後、Bond Elut C ₁₈カートリッジにのせ、80% メタノールを用いてサクラネチンを含む画分を溶出した。 溶出液は濃縮した後、溶離液にベンゼン−酢酸エチル−蟻酸（10:1:1）を用いたHPLC
カラム（Nova-pak column, 8NVC18, 8x100mm, Waters）
に導入し、溶出されるサクラネチンをUV検出器を用いて、285 nmにおける吸光度で検出した。 その結果を図１、図２[A] 、図３[A] に示す。

【００７６】（参考例２）参考例１において、イネ葉への処理溶液が250 μM ジャスモン酸＋5 μM カイネチン溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図１に示す。 （参考例３）参考例１において、イネ葉への処理溶液が
250 μM ジャスモン酸＋10 mM 又は100 mMタイロン（ラジカル消去剤）溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図２[B,C] に示す。

【００７７】（参考例４）参考例１において、イネ葉への処理溶液が250 μM ジャスモン酸＋250 μM 又は500
μM アスコルビン酸溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図２[D, E]に示す。 （参考例５）参考例１において、イネ葉への処理溶液が
250 μM ジャスモン酸＋5 mMアスコルビン酸溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図２
[F]に示す。

【００７８】（参考例６）参考例１において、イネ葉への処理溶液が5 mMアスコルビン酸溶液又は250 μM ジャスモン酸＋5 mMアスコルビン酸＋250 μM カイネチン溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図２[G,H] に示す。 （参考例７）参考例１において、イネ葉への処理溶液が蒸留水であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図２[I] 及び図３[I] に示す。

【００７９】（参考例８）参考例１において、イネ葉への処理溶液が250 μM ジャスモン酸＋7.8 μM 又は31μ
M 又は62μM 又は125 μM 又は250 μM カイネチン溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図３[B〜F]に示す。

【００８０】（参考例９）参考例１において、イネ葉への処理溶液が250 μM ジャスモン酸＋250 μM アデニン又は250 μM ゼアチン溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図３[G,H] に示す。 サイトカイニン活性を持たないアデニンにジャスモン酸のエリシター活性を阻害する効果がなく、サイトカイニンであるゼアチンに該阻害効果が認められたことから、該阻害効果はプリン誘導体に共通して認められるものではなく、サイトカイニンに共通したものであることが認められた。

【００８１】（参考例10）参考例１において、ジャスモン酸の処理濃度が0.5 mM (500 μM ) であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図４[A] に示す。 （参考例11）参考例１において、イネ葉への処理溶液が
500 μM ジャスモン酸及び5 mMアスコルビン酸溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図４[B] に示す。

【００８２】（実施例１）参考例１において、イネ葉への処理溶液が1.25 mM の4-ニトロキノリンN-オキシド溶液又は1.25 mM の4-ニトロキノリンN-オキシド＋5 mMアスコルビン酸溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図４[C,D] に示す。

【００８３】（参考例12）参考例１において調製した25
0 μM ジャスモン酸処理組織片1 g を14 mM メルカプトエタノール、5 mM EDTA-2Na、10% グリセロール（w/v
）、10％ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）及び
0.1 g 海砂を含む0.2 M トリス−塩酸緩衝液4 mlを用いてホモジナイズした。 ホモジナイズ液を18,500×g で5
分間遠心分離した後の上清を50μm ナイロンメッシュで濾過し、ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ（以下「NOMT」と略記する）を含む粗酵素液を得た。

【００８４】粗酵素液（約200 μg プロテイン）に375
μM ナリンゲニン、0.1 M グリシン-NaOH （pH 9.5；5
mM DTT及び1 mM EDTA を含む）、及び92.5 Bq ／μl S-
[ ¹⁴ C]アデノシルメチオニンを加え、全容量を160 μl
として、これをメチルトランスフェラーゼアッセイの反応液とした。 27℃で20分間インキュベーションした後、
25μl の6N塩酸を用いて酵素反応を停止し、1 mlの0.4
％2,5-ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）シンチレーショントルエン溶液を加えた。 2 相分離後、非極性画分の放射活性をBeckman Liquid Scintillation Analyzer (L
S1701)を用いて測定し、NOMT活性とした。 その結果を図５[I][A]に示す。

【００８５】（参考例13）参考例12において、イネ葉への処理溶液が250 μM ジャスモン酸＋250 μM カイネチン又は250 μM ゼアチン溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図５[I][B,C]に示す。 （参考例14）参考例12において、イネ葉への処理溶液が
250 μM ジャスモン酸＋5 mMアスコルビン酸溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図５
[I][D]に示す。

【００８６】（参考例15）参考例12において、イネ葉への処理溶液が250 μM ジャスモン酸＋5 mMアスコルビン酸＋250 μM カイネチン溶液であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図５[I][E]に示す。 （参考例16）参考例12において、イネ葉への処理溶液が蒸留水であること以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図５[I][F]に示す。

【００８７】（参考例17）参考例12において、NOMT活性測定に精製酵素液を用いた以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図５[II][A] に示す。 （参考例18）参考例17において、NOMT活性測定の際に50
0 μM カイネチン、500 μM ゼアチン、又は5 mMアスコルビン酸を反応液に添加した以外は該参考例と同様に操作した。 その結果を図５[II][B〜D]に示す。 いずれにおいても、酵素活性に有意な差は認められず、サイトカイニン及びアスコルビン酸の効果が当該酵素の活性促進又は阻害によるものではないことがわかった。

【００８８】

【発明の効果】本発明によれば、植物体の一部又は全体あるいは培養組織及び／又は細胞をラジカル発生剤で処理することにより、当該植物体あるいは培養組織及び／
又は細胞に含まれる、医薬、化粧品、食品添加物、農薬等として有用な二次代謝産物の含有量を増加させることが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】イネ葉におけるジャスモン酸のサクラネチン生産促進作用に対するカイネチンの阻害効果を継時的に示す図である。

【符号の説明】

● 250 μM ジャスモン酸処理 ○ 250 μM ジャスモン酸＋5 μM カイネチン処理

【図２】イネ葉におけるジャスモン酸のサクラネチン生産促進作用に対するタイロン及びアスコルビン酸の効果（各々48時間処理）を示す図である。

【符号の説明】

[A] 250 μM ジャスモン酸処理 [B] 250 μM ジャスモン酸＋10 mM タイロン処理 [C] 250 μM ジャスモン酸＋100 mMタイロン処理 [D] 250 μM ジャスモン酸＋250 μM アスコルビン酸処理 [E] 250 μM ジャスモン酸＋500 μM アスコルビン酸処理 [F] 250 μM ジャスモン酸＋5 mMアスコルビン酸処理 [G] 5 mMアスコルビン酸処理 [H] 250 μM ジャスモン酸＋500 μM アスコルビン酸＋250 μM カイネチン処理 [I] コントロール（蒸留水処理）

【図３】イネ葉におけるジャスモン酸のサクラネチン生産促進作用に対するカイネチンの阻害効果（72時間処理）を示す図である。

【符号の説明】

[A] 250 μM ジャスモン酸処理 [B] 250 μM ジャスモン酸＋7.8 μM カイネチン処理 [C] 250 μM ジャスモン酸＋31μM カイネチン処理 [D] 250 μM ジャスモン酸＋62μM カイネチン処理 [E] 250 μM ジャスモン酸＋125 μM カイネチン処理 [F] 250 μM ジャスモン酸＋250 μM カイネチン処理 [G] 250 μM ジャスモン酸＋250 μM アデニン処理 [H] 250 μM ジャスモン酸＋250 μM ゼアチン処理 [I] コントロール（蒸留水処理）

【図４】イネ葉におけるジャスモン酸のサクラネチン生産促進作用に対するアスコルビン酸の効果（各々48時間処理）を示す高速液体クロマトグラムである。

【符号の説明】

Ａ） 0.5 mMジャスモン酸処理 Ｂ） 0.5 mMジャスモン酸処理＋5 mMアスコルビン酸処理 Ｃ） 1.25 mM 4-ニトロキノリンN-オキシド処理 Ｄ） 1.25 mM 4-ニトロキノリンN-オキシド＋5 mMアスコルビン酸処理

【図５】イネ葉のナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ（NOMT）活性に対するカイネチン及びアスコルビン酸処理又は酵素反応液への添加の効果を示す図である。

【符号の説明】

[I]/[A] 250 μM ジャスモン酸処理 [I]/[B] 250 μM ジャスモン酸＋250 μM カイネチン処理 [I]/[C] 250 μM ジャスモン酸＋250 μM ゼアチン処理 [I]/[D] 250 μM ジャスモン酸＋5 mMアスコルビン酸処理 [I]/[E] 250 μM ジャスモン酸＋250 μM アスコルビン酸処理＋250 μM カイネチン処理 [I]/[F] コントロール（蒸留水処理） [II]/[A] 精製した酵素標品の活性 [II]/[B] 精製酵素標品＋500 μM カイネチンの活性 [II]/[C] 精製酵素標品＋500 μM ゼアチンの活性 [II]/[D] 精製酵素標品＋5 mMアスコルビン酸の活性

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 多葉田 誉 山口県玖珂郡和木町和木六丁目１番２号 三井石油化学工業株式会社内