技术领域
[0001] 本
发明涉及两株厚垣孢普克尼亚菌真菌及其应用，属于
微生物菌种技术领域。
背景技术
[0002]
植物病原
线虫是一种危害严重的植物病害，据报道的植物病原线虫达200多属5000余种。植物病原线虫病害给全世界农业每年带来近1250亿美元的经济损失，仅次于
真菌病害。线虫
生物防治引起了人们的关注，各国政府也给予了极大支持，第一代线虫
生物防治剂的活菌剂如捕食线虫真菌、内寄生真菌和寄生性细菌应运而生，但它受环境因素影响大、
稳定性较差、
货架期短等问题，使其应用受到限制。为克服这一弊病，国内外研究者更加关注第二代线虫生防因子即菌株代谢产物研究开发。真菌的次生代谢产物作为第二代线虫生防因子，以直接作用于
农作物线虫的方式发挥作用，有着作用快、药效高、环境相容性好、不容易造成二次污染等优点。前期研究我们发现真菌菌株能够通过产生金轮霉素(aurovertins)类次生代谢产物来作为毒
力因子杀死线虫，因此寻找和筛选能够高效产生金轮霉素类化合物的真菌菌株，为制备高效的杀线虫
毒力真菌制剂的研发奠定
基础。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供两株厚垣孢普克尼亚菌真菌及其应用。
[0004] 本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0005] 本发明分离筛选的厚垣孢普克尼亚菌Pochonia chlamydosporia YMF1.00615和厚垣孢普克尼亚菌Pochonia chlamydosporia YMF1.00111，已于2014年09月04日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号分别为CGMCC No.9586和CGMCC No.9585。
[0006] 本发明分离筛选的厚垣孢普克尼亚菌Pochonia chlamydosporia YMF1.00615和厚垣孢普克尼亚菌Pochonia chlamydosporia YMF1.00111在制备抗线虫活性物质aurovertins及抗植物病原线虫制剂中的应用。
[0007] 与
现有技术相比，本发明有以下的有益效果在于：
[0008] 厚垣孢普克尼亚菌Pochonia chlamydosporia YMF1.00615和厚垣孢普克尼亚菌Pochonia chlamydosporia YMF1.00111中的PDB
发酵液中含有达到800-1500μg/mL含量的抗线虫活性物质金轮霉素，具有很强的毒杀线虫活性，能够在制备毒杀植物病原线虫制剂中应用。
附图说明
[0009] 图1显示TLC检测Pochonia chlamydosporia发酵液乙酸乙酯部(C)及菌丝体甲醇粗提物(M)的结果。其中：化合物1：金霉素I(aurovertin I)、化合物2：金霉素E(aurovertin E)、化合物3：金霉素F(aurovertin F)、化合物4：金霉素D(aurovertin D)。
[0010] 图2为化合物1–4结构。
[0011] 图3为HPLC检测两株真菌Pochonia chlamydosporia YMF1.00615和YMF1.00111与已报道的YMF1.00613发酵液金轮霉素类含量的对比结果。横坐标为时间，纵坐标为吸收峰丰度，菌株YMF1.00615和YMF1.00111的金霉素D的吸收峰丰度均达到400mAU,已报道的YMF1.00613的吸收峰丰度则为250mAU。
具体实施方式
[0013] (1)菌株Pochonia chlamydosporia YMF1.00615和YMF1.00111的培养：
[0014] 将在PDA固体培养基中的YMF1.00615和YMF1.00111分别常规活化3天，在无菌条件下，将2x2cm2大小的菌
块接种于装有250mL PDB培养基的500mL三
角瓶中，28℃，160r·min-1摇床培养7天。
[0015] PDA固体培养基为：去皮
马铃薯200g，切成小块后煮沸30min，4层纱布过滤，在滤液中加入20g
葡萄糖，加
水定容至1L，加入1.5％(m/v)的琼脂，121℃灭菌20分钟后待用；
[0016] PDB液体培养基：去皮马铃薯200g，切成1x 1x 1cm小块后煮沸30min，4层纱布过滤，在滤液中加入20g葡萄糖，加水定容至1L，121℃灭菌20分钟后待用。
[0017] 实施例2菌株Pochonia chlamydosporia YMF1.00615和YMF1.00111的发酵液的提取和TLC检测
[0018] 将上述实施1的菌种发酵液过滤，滤液即发酵原液减压浓缩后，用等体积乙酸乙酯萃取三次，然后合并乙酸乙酯减压蒸干。菌丝体用
乙醇或丙
酮浸泡12小时后，将甲醇提取液
真空蒸干。用100mL的丙酮分别浸泡发酵液乙酸乙酯部和菌丝体甲醇粗提物，
超声波20min，进行薄层层析TLC板检测，以氯仿：甲醇＝15:1为展板体系时，UV检测时在365nm下显示黄绿色
荧光，在254nm下显示暗斑，10％H2SO4酒精溶液喷洒并加热显色时为紫色，检测到几个相似的条带(见下图1)，其中在菌丝体甲醇提取物中(图1中的M)化合物4含量最高，在发酵液乙酸乙酯部(图1中的C)化合物3含量最高。四种金轮霉素类代谢产物化合物1-4的结构如图2所示。
[0019] 实施例3菌株Pochonia chlamydosporia YMF1.00615和YMF1.00111的发酵液的金轮霉素aurovertins含量分析
[0020] HPLC检测样品制备方法为：将实施1的PDB发酵液，经0.22μm滤
膜过滤并装入HPLC样品瓶，放于4℃备用。应用高效液相色谱仪HP 1200unit(Agilent,Waldbronn,Germany)，配以CAPCELL PAK C18，5μm，4.6×250mm(Shiseido)反相柱。流动相为色谱纯乙腈和去离子水(10％乙腈-95％乙腈。洗脱流速为1mL/min。柱温40℃，上样量25μL。以金轮霉素(aurovertins)D，E，I，F为对照，检测发酵液中金轮霉素含量，洗脱体系如表1所示，UV检测波段为220-400nm。
[0021] 表1.HPLC检测厚垣孢普克尼亚菌PDB发酵液中金轮霉素的洗脱体系
[0022]
[0023] 如图3所示，发现与已报道的生产金轮霉素的菌株Pochonia chlamydosporia YMF1.00613相比，本发明中的两株菌株YMF1.00615和1.00111的PDB发酵液中含有更高含量的抗线虫活性物质金轮霉素，含量超出将近一倍，总含量达到800-1500μg/mL。其中YMF1.00615中的金轮霉素D的比例含量最高。
[0024] 实施例4菌株Pochonia chlamydosporia YMF1.00615和YMF1.00111的发酵液的杀线虫能力的测试
[0025] 将实施例1的菌丝体过滤：使用0.22μm滤膜将菌液与菌丝体分离，将菌液在120℃灭菌20min。用液体浸入法测试菌株发酵液的杀线虫活性：根结线虫Meloidogyne incognita(race 3)培养在
温室中(25℃)番茄根部。采集带有根结线虫卵块的番茄病株，将病根剪切成约2cm小段，用灭菌的解剖针挑取成熟卵块并将其置于40μm细胞筛网。将筛网和卵块置于2％
次氯酸钠溶液中1min，期间轻微晃动筛网。无菌水冲洗卵块5–7次后将筛网放置于装有15mL无菌水的6cm培养皿中28℃恒温
培养箱中孵化24小时即获得二龄幼虫(J2)用于毒性测试。
[0026] 使用24孔细胞培养板，在每孔中加入1mL发酵滤液和10μL线虫悬液(平均500头线虫/10μL)，20℃(C.elegans)或28℃(M.incognita)静置24小时后，在
显微镜下统计线虫死亡率。鉴定线虫死亡的方法为，死亡线虫僵直或呈“J”型，活线虫则卷曲扭动。用针尖拨动静止线虫身体各部，线虫仍未做出任何反应则鉴定为死亡。
[0027] 死亡率＝(死亡线虫数/(死亡线虫数+活线虫数))×100％
[0028] 校正死亡率＝供试样品死亡率-对照组死亡率
[0029] 以未接种真菌的PDB液体培养基为对照，整个实验重复三次，取三次平均值，计算出平均死亡率和校正死亡率。
[0030] 实验结果如下：
[0031] 表2供试菌株发酵液处理线虫24小时毒性测试结果
[0032]
[0033] 如表2所示，菌株Pochonia chlamydosporia YMF1.00615和YMF1.00111的发酵液菌株的PDB发酵液处理植物寄生线虫M.incognita 24小时后，线虫的死亡率均高于95％，说明株菌的发酵液表现出很强毒杀线虫活性。
