토양으로부터 분리한 식물기생성 토양선충에 대한 포식능을 갖는 미생물 제제{Microorganism composition having predacious ability for soil nematoda parasitic on plant from soil}

본 발명은 토양으로부터 분리한 식물기생성 토양선충에 대한 포식능을 갖는 미생물 제제에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 토양, 특히 연작을 수행하는 시설재배지 등의 토양에 고밀도로 서식하며, 작물의 뿌리에 침입하여 작물의 성장을 둔화시키고 수확을 감소시켜 결국에는 작물을 고사하게 만드는 식물기생성 토양선충에 대해 특수한 포획기관을 형성하여 토양선충을 포획하는 포식능력을 가지므로써 토양선충의 방제에 이용할 수 있는 식물기생성 토양선충 천적미생물을 이용한 미생물 제제에 관한 것이다.

토양선충은 모든 흙속에 존재하는 선충강에 속하는 작은 생물체이며, 대부분의 식물기생성 토양선충은 그 크기가 매우 작아 육안으로는 확인하기 어렵고, 현미경으로 관찰이 가능하다. 식물기생성 토양선충의 형태는 일반적으로 실모양으로 가늘거나, 방추형의 모습으로 좌우대칭형이며, 그 길이는 대개 0.25∼0.45㎜로 매우 작고, 몸에는 마디가 없으나, 체표에는 주름을 가지고 있다. 체벽은 크게 표피, 진피 및 근육으로 구성되어 있으며, 중앙신경계 및 식도 주위의 신경환으로 신경계를 구성하고 있다. 이는 암컷 성충이 알을 낳는 것으로 번식하며, 자웅이체이나 동정생식을 통해 번식하기도 한다. 알에서 부화한 토양선충은 4단계의 유충기를 지난 후, 성충으로 부화하고 대략 1개월 정도 생존하는데 소화기관과 생식기관이 특징적으로 발달하였으며, 암컷의 경우 생존기간 동안 대략 50∼600개의 알을 낳는다. 이러한 식물기생성 토양선충은 입 주위에 구침을 가지고 있으며, 이를 이용하여 식물의 뿌리에 구멍을 내고, 식물조직의 영양분을 흡수하거나 뿌리조직 내로 침입한다.

식물기생성 토양선충은 식물의 종자, 잎, 줄기, 뿌리 등 모든 부분에 기생하며, 종에 따라 식물체의 외부에서 식물체를 가해하는 외부기생성, 식물조직 내부로 침입하여 가해하는 내부기생성 및 머리부분만 식물체 내에 삽입하여 영양분을 섭취하는 반내부기생성 등 다양한 생활양식을 갖는다. 또한 내부기생성 토양선충은 이동하며 가해하는 이동성인 것과 한번 가해하기 시작하면 이동하지 않는 정착성인 것도 있다.

우리나라에서 주로 발견되는 뿌리혹선충은 당근뿌리혹선충, 고구마뿌리혹선충, 자바뿌리혹선충, 땅콩뿌리혹선충 등이며, 주로 연작을 통해 시설재배지에서 재배되는 참외, 오이, 토마토, 수박, 딸기, 고추, 인삼 등에 큰 피해를 주고 있다.

식물기생성 토양선충에 의한 피해는 토양내 선충의 서식 밀도가 낮은 경우에는 경미하지만, 작물이 성장하면서 재배기간이 경과함에 따라 서식 밀도가 높아지면 기주식물은 치명적인 손상을 입거나 고사하게 된다. 기생성 토양선충에 감염된식물체는 병원균에 대한 저항력이 감소되어 병원균이 침입하였을 때 발병을 조장하거나 심화시키고, 일부 토양선충은 식물병원성 바이러스를 매개하기도 한다.

이러한 식물기생성 토양선충에 의한 피해를 경감시키고, 토양선충을 방제하기 위하여 다양한 방법들이 시도되었다.

재배적 방제법으로는 일정기간동안 경작을 하지 않는 휴경, 침수처리법, 윤작, 재식시기의 조정, 저항성 품종의 재식, 유인식물을 재식하는 방법 등이 사용되었다. 그러나, 휴경재배는 우리나라의 경작 특성상 현실적이지 못하며, 침수처리법 또한, 밭을 논으로 했다가 다시 밭으로 사용하는 등의 번거로움 때문에 널리 받아들여지지 못하는 실정이다.

전통적으로 연작에 의한 피해를 줄이는 방법으로 윤작을 시행하였으나, 작물의 재배가 고소득을 보장하는 작목으로의 변경 및 지역특성에 적합한 작목의 선택으로 변해가는 추세에서 실질적으로 윤작을 하는 경우는 매우 제한적일 수 밖에 없다. 또한, 사계절이 뚜렷하여 재배시기가 한정적인 우리나라의 기후 특성상 재식시기를 조정하는 것은 휴경방법과 마찬가지로 현실적이지 못하며, 유인식물을 재식하는 것도 마찬가지이다. 이런 재배적 방제법은 근본적인 토양선충의 방제이기 보다는 피해를 완화하고 경감시키는 정도에 지나지 않는다.

물리적 방법으로는 열탕소독법, 전열가온법, 자외선 조사 및 초음파를 사용하는 방법 등이 시도되었으나, 열탕소독법의 경우, 온도가 상승하고, 햇볕이 강한 하절기에 작물을 경작하지 않는 간기를 이용하여 제한적으로 시도할 수 밖에 없으며, 토양선충의 도피능력을 감안하면 열탕소독에 의한 방제의 효율성에 대한 확신은 부족한 실정이다. 전열가온법은 지중에 전열선을 설치하고 이를 이용하여 경작지를 가온하므로써 토양선충을 방제하는 방법이지만, 작물이 재배되지 않는 간기에 제한적으로 적용될 수 밖에 없으며, 시설 및 유지비용이 과다하게 소요되는 단점이 있다. 이런 단점은 자외선 조사방법이나 추음파 방제법에서도 동일하다.

농약을 이용한 화학적 방제법이 현재 가장 많이 시도되고 있으나, 토양선충을 방제하기 위해 사용되는 약제들은 대개의 경우 아세틸콜린에스터라제의 활성을 억제하는 유기인산계열의 화합물로써, 신경계의 신경전달물질의 일종인 아세틸콜린의 양을 증가시키는 방식으로 살충작용을 하는데, 이런 유기인산계 살충제는 대부분 유해물질로 규정되었다.

또한 이런 살충제는 토양선충뿐만 아니라 토양내에 존재하며 작물과 공생관계 등을 통해 작물의 성장에 유익한 미생물까지도 무차별적인 사멸을 초래하고 염류집적을 유발하는 등 토양환경을 파괴하여 결국 연작장해를 심화시키게 된다. 또한 수확물에 농약잔류의 폐해를 유발하므로, 오염된 농작물이 식탁에 오르므로 인해 발생되는 일반 소비자의 건강 위협문제와 동시에 농민에게는 수확물을 출하하지 못하고 폐기하게 되는 피해가 빈번하게 발생하고 있는 실정이다.

이를 해결하기 위한 대안으로 제시된 것이 천적미생물을 이용한 생물학적 방제방법이다.

식물기생성 토양선충을 방제하기 위한 생물학적 방제법에는 포식성 선충류, 포식성 곤충류, 응애, 원생동물, 세균, 곰팡이, 바이러스 등을 이용한 방법이 있으나, 이중 가장 효과적인 방법은 토양선충 포식성 또는 선충기생성 곰팡이에 의한방법이다. 이러한 곰팡이를 이용한 식물기생성 토양선충의 방제방법은 실행하기가 매우 용이하며, 적절한 토양관리를 통해 그 방제효과가 장기간 지속되는 장점을 갖고 있다. 또한 화학적 방제법과 비교하여 농약 살포시 야기되는 약해문제, 토양오염 및 잔류농약의 문제가 전혀 없다는 장점을 가지므로, 환경친화적 유기농법을 지향하는 현실과도 부합된다.

이러한 특성을 갖는 곰팡이에는 파에실로마이세스(Paecilomyces)속, 닥틸라리아( Dactylaria )속, 닥틸렐라( Dactylella )속, 아쓰로보트리스( Arthrobotrys )속, 네마톡토누스( Nematoctonus )속, 카테나리아( Catenaria )속 등이 있으나, 이들은 살충력이 떨어지거나 고농도 배양이 어려워 상품화된 예가 없는 실정이다.

이러한 단점을 극복하기 위하여 최근에는 선충류에 대한 살충제로서 바실러스( Bacillus )속 미생물을 이용한 제제가 연구되고 있다.

예를 들면, 한국특허출원 제91-9696호는 선충류에 대해 활성인 바실러스 투린지엔에 대하여 기술하고 있고, 한국특허출원 제1997-709010호는 바실러스 미생물을 이용한 살충 활성 강화제의 제조방법을 기술하고 있으며, 한국특허출원 제91-34872호는 식물병해에 길항성을 갖는 바실러스 속 미생물을 이용한 미생물 제제를 기술하고 있으나, 상기 바실러스속 미생물은 포획기관을 형성할 수 없으므로 직접적인 방법으로 식물기생성 토양선충을 제거할 수 없었다.

이에, 본 발명자들은 국내 경작지 특히, 연작을 위주로 하는 시설재배지에 고밀도로 서식하며 작물에 막대한 피해를 입히는 식물기생성 토양선충을 방제하기위한 방법으로 토양선충에 대하여 포획기관을 형성하는 미생물을 자연계로부터 순수분리하였고, 분리한 미생물이 토양선충을 포획하고 포식하는 능력이 있음을 확인하였으며, 분리된 신규한 미생물의 배양조건 및 토양선충 포획특성이 일반적인 재배환경, 즉 경작지 토양의 산도와 일반적으로 빈번하게 경작되는 계절의 온도 변화등에 대해 적합한지 여부를 시험하였으며, 그 결과 신규한 미생물의 생리적 특성이 일반적 재배환경에 부합하였므로 신규한 미생물을 이용하여 토양선충을 효과적으로 방제할 수 있음을 확인하였고, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 식물기생성 토양선충에 대한 포식능을 갖는 미생물 제제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 미생물 제제는 부형제 1000중량부에 식물기생성 토양선충에 대한 포식능을 갖는 아쓰로보트리스속 미생물 균체 1∼100중량부로 이루어진다.

이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

본 발명은 토양중에 서식하는 식물기생성 토양선충에 대한 포식능을 갖는 미생물 제제에 관한 것으로, 본 발명의 미생물은 기존에 알려진 토양선충에 대한 포식능을 갖는 미생물 중에서 매우 빠른 성장능과 포획능을 나타낸다.

본 발명의 미생물은 토양으로부터 분리하고, 사카르도 (Saccardo) 시스템 (Barnet Hunter, 1972)과 쿠크와 가드프리 (Cooke Godfrey. 1964) 및 하드 (Haard, 1968)의 검색표에 근거하여 동정한 결과, 분리된 토양선충 포획균은 아쓰로보트리스 ( Arthrobotrys sp. )속으로 확인되었으며, 분리된 토양선충 포획균은 2000년 2월 11일자로 생명공학연구소에 기탁하였다 (수탁번호 제 KCTC 8992P호). 본 발명의 균은 퉁상의 알려진 아스로보트리스 균보다 우수한 성장속도 및 포획능을 갖는다.

본 발명의 토양선충 포식성 미생물이 배양된 배지에 토양선충을 첨가하면 배양하면 세포직경 6∼8㎛정도의 고리모양 포획기관을 형성한다. 상기 고리모양의 포획기관에 토양선충이 걸려들면 선충과 접촉한 고리의 내부에서 선충의 체벽을 분해하는 효소를 분비하여 큐티클 (cuticle) 층을 소화하며, 선충체내로 침투균사를 발달시키게 되고, 이로 인해 토양선충은 결국 죽게 된다.

한편, 그 배양방법을 살펴보면, 먼저, 연작을 수행하는 시설재배지의 토양을 1.0mm 체에 거르고, 토양을 멸균증류수에 현탁시킨다. 이 현탁액을 원심분리하여 상등액과 침전물을 분리시키고, 침전물을 콘밀(Corn meal 2%)한천배지에 무균접종시키고, 약 25℃에서 약 24시간동안 무균배양시킨다. 여기에 비어만 깔대기법으로 분리한 식물 기생성 토양선충을 200∼300마리 첨가하여 약 25℃에서 약 7일간 배양하면, 배지 위에 토양선충 포획균의 포자가 형성된다. 이를 다시 콘밀한천배지에 이식하여 배양한 후 다음과 같이 다시 순수배양시킨다.

미생물의 영양원으로 1.0∼3.0중량%의 펩톤, 1.0∼3.0중량%의 우육추출물, 0.5∼1.5중량%의 효모추출물, 4.0∼7.0중량%의 포도당, 0.02∼0.05중량%의 KH ₂ PO ₄ , 0.003∼0.008중량%의 MgSO ₄ 및 0.003∼0.008중량%의 KCl을 증류수(잔여량)에 혼합한후, NH ₄ OH를 이용하여 pH를 5∼7로 조절하고, 멸균하여 사용한 배지를 사용한다. 이때, 상기 배양 pH가 5 미만이거나 7을 초과하면, 미생물의 성장속도가 현격하게 둔화된다. 그 후, 상기 배지에 미리 20∼30℃로 약 48시간 동안 배양한 배양액을 접종하여 20∼30℃에서 배양시킨다. 여기서, 상기 배양온도가 20℃ 미만이거나 30℃를 초과하면, 미생물의 성장속도가 현격히 둔화되는 현상이 발생할 수 있다.

상기 배양방법으로 배양된 배양액을 원심분리하여 얻은 균체를 부형제와 혼합, 건조시켜 본 발명의 미생물을 제제화하여 사용할 수 있다.

상기 미생물 제제는 탈지강, 누에가루 및 제오라이트를 4∼6 : 1 : 8∼12의 비율로 혼합한 부형제 1000중량부에 대하여 상기와 같은 특성을 갖는 미생물 균체를 건조중량으로 1∼100중량부와 혼합하여 제조된다. 이때, 상기 부형제에 대한 미생물 균체의 사용량이 1중량부 미만이면, 선충포획기관을 형성하여 토양선충을 포획하는데 필요로 하는 미생물의 개체수가 부족하므로 기대만큼의 방제효과를 얻을 수 없으며, 100중량부를 초과하면 기존의 토양에 서식하는 미생물 균상의 균형을 깨뜨릴 수 있다.

한편, 상기 탈지강은 미생물의 성장에 필요한 영양분 특히, 탄소원으로 사용되고, 누에가루는 질소원과 조회분 등을 공급하는 기능을 갖고, 제오라이트는 미생물의 담체기능 뿐만 아니라 토양의 보습성과 배수성을 증대시키고 토양의 산도를 보정하는 기능을 가지며, 그 혼합비가 상기 범위를 벗어나면, 제제화한 경우, 제제내 미생물의 생존성을 확보하기 어려우며 토양에 투입된 경우에도 신속하게 포획기관을 형성하는데 어려움이 있다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 하기 실시예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

토양선충의 배양

토양 중에 서식하는 토양선충을 비어만(Bearmann) 깔대기 방법으로 분리하여 니곤(Nigon)배지에 이식하고, 약 25℃로 유지되는 배양기에서 배양하였다. 토양선충이 배양된 배지 일부(25㎟)를 떼어 새로운 니곤배지에 이식하고, 선충밀도가 가장 높게 나타나는 3∼4일경 다시 비어만 깔대기 방법으로 토양선충 배양 배지로부터 선충을 추출한 후, 멸균증류수로 현탁하였다.

실시예 2

선충포획성 미생물의 분리 및 배양

여러지역에서 채집한 토양을 직경 1.0㎜ 체로 걸른 후, 50g을 멸균증류수 100㎖에 현탁하고 원심분리하여 형성된 침전물을 콘밀(Corn meal 2 %)한천배지에 무균적으로 접종하고 25℃의 배양기에서 24시간 배양하였다. 또한 분리된 상등액을 다시 원심분리하여 형성된 침전물도 콘밀(Corn meal 2 %)한천배지에 무균적으로 접종하고 25℃의 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 콘밀한천배지위에 비어만 깔대기방법으로 분리한 토양선충을 일정량 첨가하고 25℃의 배양기에서 7일간 다시 배양하였다. 7일이 지난 후부터 해부현미경으로 토양선충이 첨가된 콘밀한천배지를 관찰하며, 토양선충이 미생물의 포획기관에 포획된 지점에 형성된 토양선충 포획균의 포자를 새로운 콘밀한천배지에 이식하여 순수배양하였다.

이렇게 분리된 선충 포획기관을 형성하는 4종류의 균주(ME-9701, 9702, 9703, 9704)를 사브로드 한천배지에 접종하여 7일간 정치배양하면서 형성되는 콜로니의 크기를 비교하였으며, 초기 pH 6.0으로 조정한 GY(포도당 4%, 효모엑기스 2%)액체배지 200㎖이 포함된 플라스크에 접종하고 배양온도를 25℃로 유지하면서 5일간 배양하며 성장성을 비교하였다. 또한 콘밀한천배지 위에 토양선충을 50∼100마리 첨가하고, 각각의 분리균주를 접종한 후, 25℃의 배양기에서 7일간 배양하면서 해부현미경을 이용하여 배지상의 토양선충 주위에 형성되는 선충포획기관의 밀도 및 초기시점을 비교ㆍ관찰하였다.

그 결과 하기 표 1에 제시한 바와 같이, ME-9702균주가 콘밀한천배지상에서 가장 큰 콜로니를 형성하였고, GY액체배지에서도 가장 왕성한 성장을 보였으며, 포획기관을 형성하는 빈도도 가장 높았고, 포획기관을 형성하는 초기시점도 다른 분리균주에 비해 가장 빠르게 형성하였다.

실시예 3

분리균주의 형태

분리된 상기 4종류의 토양선충 포획균을 콘밀한천배지에 배양하면서 배지상에 형성된 콜로니의 형태를 육안으로 관찰하였다. 또한 7일간 배양한 토양선충 포획균의 콜로니(Colony) 일부를 떼어낸 후, 락토페놀피크린산 (Lactophenol picrinic acid) 용액을 떨어뜨린 슬라이드 글래스 위에 도말하여 커버글래스를 덮고, 코니디아 (conidia)와 코니디오포어 (conidiophore) 및 하이파 (hypae)의 크기와 모양을 관찰하였다.

콘밀한천배지에서 순수배양하여 형성된 콜로니는 백색 또는 연한 황색이었으며, 균사는 무색ㆍ투명하였다.

현미경으로 관찰한 결과, 코니디아의 형태는 원추형으로 그 크기가 19∼42 X 8∼15㎛ 이었으며, 약간 수축된 하나의 격막에 의해 두 개의 세포로 나뉘며, 말단세포와 기주세포의 길이의 비율이 1.5:1 정도였고, 말단세포가 기주세포보다 길고 부풀어 있었다.

분생포자병의 머리부분은 혹 모양으로 부풀어 있었고, 가지를 내지 않았으며, 마디가 형성되어 있고 마디를 따라 윤생으로 5∼30개 정도의 코니디아를 형성하였다.

분생포자병의 길이는 100∼500㎛정도였으며, 직경은 기저부가 4∼8㎛, 말단부가 2∼3㎛로 측정되었다.

클라미도스포아(chlamidospore)는 노란색을 띄며, 그 크기가 30∼50 X 13∼15㎛ 정도였고, 토양선충을 포획하는 기관은 3차원적 그물구조를 이루고 있었다.

현미경 관찰을 통해 확인된 신규한 토양선충 포획균의 형태적 특징은 하기 표 2에 제시된 바와 같다.

상기 표 2의 관찰결과를 사카르도(Saccardo) 시스템(Barnet Hunter, 1972)과 쿠크와 가드프리(Cooke Godfrey, 1964) 및 하드(Haard, 1968)의 검색표에 근거하여 동정한 결과, 분리된 토양선충 포획균들은 모두 아쓰로보트리스 ( Arthrobotrys sp.)속으로 확인되었지만, ME-9702 균주가 성장속도 및 포획력에서 상대적으로 우수하였으며, 이 토양선충 포획균 ME-9702을 2000년 2월 11일자로 생명공학연구소에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 8992P호).

실시예 4

분리균주의 토양선충 포획기관의 형성

콘밀한천배지에 분리된 토양선충 포획균(ME-9702)을 접종하여 25℃의 배양기에서 7일간 배양하고, 이 위에 상기 실시예 1에서 배양된 토양선충을 첨가하여 배양하면서 토양선충 포획기관의 발생과 형성되는 과정을 관찰하였다. 그 결과, 첨가배양을 시작한 9시간만에 처음으로 포획기관이 형성되기 시작하였으며, 24시간 경과 후 가장 많은 포획기관을 관찰할 수 있었다. 이때 형성된 포획기관을 구성하는 세포의 직경은 6∼8㎛ 정도였다.

포획기관의 형태는 복잡한 고리모양의 복합체인데, 형성단계의 초기에는 영양균사에서 포획기관 구성세포가 돌출하기 시작하고, 신장하면서 만곡하고, 세포가 어느정도 신장하면 제2 또는 제3의 세포가 계속적으로 발생하여 결국 3∼4개의 세포로 구성된 고리모양의 포획기관을 형성하는 것을 확인하였다. 보다 시간이 진행되면 3차원적 입체구조를 갖는 고리모양의 포획기관을 형성하게 되며, 각 고리모양의 포획기관에서는 3∼4개의 격막을 확인할 수 있었다.

이렇게 형성된 고리모양의 포획기관에 토양내에서 이동하던 토양선충이 걸려들면 선충과 접촉한 고리의 내부에서 선충의 체벽을 분해하는 효소를 분비하여 큐티클(cuticle)층을 소화하며, 선충체내로 침투균사를 발달시키게 되고, 이로 인해 토양선충은 결국 죽게 된다.

실시예 5

분리된 토양선충 포획균의 균체지방산 조성

분리된 토양선충 포획균의 균체지방산 분석을 위해 분리균주(ME-9702)를 사브로드-덱스트로스 액체배지 50㎖에 접종하고, 25℃에서 48시간동안 진탕배양하였다. 배양균체를 회수하여 멸균증류수로 3회 세척하고, 동결건조하였다. 건조균체 40㎎을 취하여 지방산을 분리하고, 헥산(hexane)으로 추출하여 BF ₃ 로 메칠반응을 유도한 후, 가스크로마토그래피를 이용하여 지방산 함량을 분석하였고, 그 결과를 표 3에 제시하였다.

분리된 토양선충 포획균의 균체지방산 조성을 분석한 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 일반적으로 알려진 아쓰로보트리스 속 균주의 균체지방산 조성과 동일함을 확인하였다. 균체지방산의 주성분으로는 9번째와 16번째 탄소에 시스(cis-)형 이중결합을 갖는 C 18:2를 함유하고 있었으며, C 16:0, C 18:0을 소량 함유하고 있었다.

실시예 6

분리된 토양선충 포획균 유전자의 G+C 함량 및 퀴논(quinone)계 분석

분리된 토양선충 포획균 유전자의 G+C 함량(몰%) 분석은 다마오카와 고마가타(Tamaoka Komagata, 1984)의 방법에 따라 시행하였으며, HPLC를 사용하여 하기 표 4의 조건에서 유전자의 G+C함량을 측정하였다.

분리된 토양선충 포획균의 동정을 위한 이소프레노이드 퀴논(isoprenoidquinone) 분석은 야마다 등(Yamada et al, 1973)의 방법을 약간 변형하여 시행하였으며, HPLC를 사용하여 표 5의 조건에서 측정하였다.

분리된 토양선충 포획균의 염색체 DNA의 G+C 함량과 이소프레노이드 퀴논계의 분석결과를 하기 표 6에 제시하였다.

포획균의 염색체 DNA의 G+C 함량은 42∼45%로써, 일반적으로 알려진 아쓰로보트리스 속 균주의 G+C 함량과 동일한 결과를 보였으며, 이소프레노이드 퀴논계의 분석결과 주된 퀴논은 표준물질로 사용한 Q-10보다는 늦게 검출되고, Q-11보다는 일찍 검출되었으므로 Q-10(Hn)으로 동정되었으며, 극소량의 Q-10과 Q-7을 함유하고 있었다.

실시예 7

분리균주의 최적 배양온도

분리된 균주(ME-9702)를 포테이토-덱스트로스액체배지가 들어있는 플라스크에 접종하고 10∼40℃까지 배양온도를 달리하여 7일동안 진탕배양하면서 성장특성을 조사하였다. 24시간 마다 시료를 채취하여 원심분리기를 이용하여 멸균 증류수로 3회 세척한 후, 회수균체를 진공동결건조하고 건조균체 중량을 측정하므로써 성장도를 측정하였다.

그 측정 결과는 하기 표 7에 제시한 바와 같이, 배양온도에 따라 전체적인 성장도는 큰 차이가 있었으며, 25℃에서 배양한 경우 분리균체의 성장도가 가장 큰 것으로 나타났다. 또한, 배양 5일째에서 배양균체는 최대성장을 보였다.

10℃에서의 경우, 균체의 성장은 매우 미약하였으나, 배양 말기에 온도를 25℃로 올려 재배양하면 급속한 성장을 보이는 것으로 보아 생존성은 그대로 유지된 것을 확인할 수 있음에 반해, 40℃에서 배양한 경우에는 균체의 성장이 보이지 않음은 물론 7일 후 온도를 25℃로 내려서 배양해도 균체의 증식이 일어나지 않았다.

20℃에서 배양한 경우, 균체의 성장은 25℃에서배양한 결과 보다 약간 미약하지만 매우 왕성하게 성장하였으며 이는 30℃에서 배양한 경우에도 유사한 결과를 볼 수 있었다.

상기 표 7에 제시된 바와 같이, 토양선충 포획능을 갖는 분리균주 Arthrobotrys sp.(KCTC 8992P)는 10℃에서도 생존능력을 가지며, 서서히 증식하고, 20∼30℃에서 최적 생육온도 범위를 가지므로 국내의 일반적인 경작온도에 적합한 것을 확인할 수 있다.

실시예 8

pH변화에 따른 분리균주의 성장특성

분리된 균주를 초기 pH를 3∼9로 조정한 각각의 포테이토-덱스트로스 액체배지가 들어있는 플라스크에 접종하고, 25℃에서 5일동안 진탕배양하면서 배양특성을 조사하였다. 24시간 마다 시료를 채취하여 원심분리기를 이용하여 멸균 증류수로 3회 세척한 후, 회수균체를 진공동결건조하고 건조균체 중량을 측정하므로써 성장도를 측정하였다.

그 측정 결과, 하기 표 8에 제시한 바와 같이, 배지의 초기 pH에 따라 전체적인 성장도는 큰 차이가 있었으며, 초기 pH를 6.0으로 조정한 조건에서 가장 왕성한 균체의 성장을 보였으며, 초기 pH 5∼7 사이에서 기대할 만한 성장을 보였다.그러나, 초기 pH가 3과 9로 조정된 경우에는 성장이 일어나지 않았으며, 초기 pH가 4과 8로 조정된 경우에도 균체의 성장은 미약하였다.

상기 표 8에 제시된 바와 같이, 토양선충 포획능을 갖는 분리균주 Arthrobotrys sp.(KCTC 8992P)는 pH 5∼7 사이에서 비교적 왕성한 성장을 보이며, 특히 pH 6에서 최적 생육pH를 가지므로, 국내의 일반적인 경작지 토양의 pH에 부합하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 9

분리균주의 배양특성

실시예 7 및 8의 결과를 토대로 분리된 균주를 초기 pH 6.0으로 조정한 GY(포도당 4%, 효모엑기스 2%)액체배지가 포함된 5ℓ 발효기에 접종하고, 25℃의 배양온도를 유지하면서 1 vvm으로 통기하며, 150rpm의 조건으로 배양하면서 배양특성을 조사하였다. 24시간 마다 시료를 채취하여 원심분리기를 이용하여 멸균 증류수로 3회 세척한 후, 회수균체를 진공동결건조하고, 건조균체 중량을 측정하므로써 성장도를 측정하였다.

그 결과 분리균주는 배양 24시간만에 2.7 g/l, 48시간에 8.5 g/l, 72시간에12.6 g/l, 96시간에 17.5 g/l, 120시간에 21.4 g/l로 매우 활발한 성장을 보였다.

실시예 10

미생물의 고농도 배양 및 제제화

분리된 토양선충 포식성 미생물 아쓰로보리스속 ( Arthrobotrys sp.) (KCTC 8992P)을 대량으로 배양하기 위해, 펩톤 200g, 우육추출물 200g, 효모추출물 100g, 포도당 500g, KH ₂ PO ₄ 30g, MgSO ₄ 5g, KCl 5g을 물 10ℓ에 넣고 용해한 후 멸균하여 배지로 사용하였다. 이때 pH는 NH ₄ OH를 사용하여 6.0으로 조정하며, 공기주입량은 5ℓ/분으로, 멸균필터를 통과시켜 주입한다. 이렇게 제조된 배지에 미리 30℃에서 48시간 배양한 분리균주 배양액 1ℓ를 접종한 후, 25℃에서 150rpm으로 120시간 배양하고. 배양이 종료된 배양액에서 원심분리를 통해 균체를 수득하였다.

이렇게 수득한 균체는 탈지강, 누에가루 및 제오라이트를 5:1:10의 비율로 혼합한 부형제 1Kg에 건조균체중량으로 100g의 비율로 혼합하고, 건조하여 제제화하였다. 이때 사용한 부형제 성분으로 탈지강은 균체의 생존을 위한 탄소원과 조회분의 공급원으로, 누에가루는 질소원과 조회분의 공급원으로 고려하였다.

실시예 11

제제화한 배양균주의 토양선충 포식성 확인

실시예 10에서 만들어진 제제를 이용하여 실험실 조건에서 토양선충 포식의 재현성을 확인하였고, 또한 인위적으로 토양선충을 투입한 토양에 직접 살포하여 토양선충 포식능을 확인하였다. 실험실에서 배양한 토양선충과 실시예 10에서 만들어진 제제를 페트리 접시에 투입한 후, 25℃ 정치배양기에서 정치배양하면서 분리균주의 토양선충 포획기관을 형성하는 것과 토양선충을 포획하는 과정을 현미경을 이용하여 관찰하였다.

토양선충과 제제를 혼합하고 정치배양을 시작한지 3시간 정도 경과 후 제제에 포함된 균주는 균사를 신장하며 활발하게 성장하였고, 9시간 정도 경과하면서 3차원적 그물구조의 선충포획기관을 형성하기 시작하였다. 12시간 경과 후, 일부에서는 이 포획기관에 토양선충이 포획된 모습이 관찰되기 시작하였으며, 24시간 경과 후 포획기관의 밀도가 가장 높은 것으로 나타났다.

또한, 경작지 토양을 5 Kg 채취하여 멸균한 후, 실험실에서 배양된 토양선충을 1000마리/Kg의 밀도로 투입하고 잘 혼합하였다. 이것을 반분하여 대조구와 시험구로 나누고, 시험구에 실시예 10에서 만들어진 제제를 25 g 첨가한 후 25℃ 정치배양기에서 7일동안 정치배양하면서 매일 200 g의 시료를 채취하고 현미경을 이용하여 대조구와 시험구에 존재하는 토양선충의 개체수를 측정하므로써 토양내에서 제제에 포함된 균주의 토양선충 포획 및 포식능을 확인하였다.

그 결과 대조구에서는 7일동안 1000마리/Kg의 선충밀도에 큰 변화가 없었으며, 시험구에서도 3일까지는 개체수에 큰변화가 없었으나 시간이 경과함에 따라 잔존하는 토양선충의 개체수가 감소하여 4일 경과 후 8%, 5일 경과 후 20%, 6일 경과 후 45 %, 7일 경과 후 80%까지 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 토양으로부터 분리하여 배양한 본 발명의 아쓰로보트리스 속 미생물은 식물기생성 토양선충에 대한 포식능이 있으므로, 토양, 특히 연작을 수행하는 시설재배지 등의 작물에 지대한 손상을 입히는 토양선충의 천적미생물로 매우 유용하며, 또한, 그 성장조건이 경작 토양 조건과 유사하고, 그 성장속도가 빨라 대량생산이 가능하므로, 살충 제제로 상품화가 가능하다.