一种高产抗真菌活性物质菌株的构建及其应用
阅读：189发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种高产抗真菌活性物质菌株的构建及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种高产抗 真菌 活性物质菌株的构建及其应用，本发明所构建的菌株可以极大提高了ATB的产量，而且能够降低后续大规模产业化生产的成本。本发明还进一步提供了利用该菌株 发酵 生产ATB的方法，并优化了SGC培养基，通过添加 氨 基酸，极大地提高ATB的产量，最高达到893.32mg/L，比原始菌株提高了50倍。而且本发明还公布了该化合物ATB对各种 植物 病原真菌、卵菌具有高效的拮抗活性。因此ATB具有开发成 生物 农药 防治作物病害的潜 力 。，下面是一种高产抗真菌活性物质菌株的构建及其应用专利的具体信息内容。
1.一种高产抗真菌活性物质ATB菌株的构建方法，其特征在于，将原始菌株L.enzymogenes OH11敲除基因Le5115或Le5117中的一个或两个，所述的Le5115基因序列如SEQ ID NO:4所示；所述的Le5117基因序列如SEQ ID NO:6所示；优选的敲除基因Le5115和Le5117。
2.权利要求1所述的方法构建的菌株。
3.一种菌株OH57，其保藏编号为CGMCC No.16309。
4.权利要求3所述的菌株OH57在生产抗真菌物质ATB中的应用。
5.一种菌株OH57发酵生产ATB的方法：将菌株OH57接种于LB培养液中，振荡培养，获得种子液；按照1.0～2.0％的接种量转接至发酵培养基中，发酵培养获得含有ATB的发酵液；
所述发酵培养基为10％TSB、15％NB、25％YG、8％SOC、25％YM或SGC中的一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为黄豆粉7～9.00g/L，葡萄糖7～8g/L，CaCl20.70～0.75g/L，氨基酸1～6g/L；所述的氨基酸选自鸟氨酸、谷氨酸、精氨酸或瓜氨酸中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当添加鸟氨酸时，鸟氨酸与发酵液的质量体积浓度为1～6g/L，优选为4～5g/L，更优选为5g/L；当添加谷氨酸时，谷氨酸与发酵液的质量体积浓度为1～5g/L，优选为2～4g/L，更优选为3g/L；当添加精氨酸时，精氨酸与发酵液的质量体积浓度为1～6g/L，优选为3～6g/L，更优选为5g/L；当添加瓜氨酸时，瓜氨酸与发酵液的质量体积浓度为1～6g/L，优选为3～5g/L，更优选为4g/L。
8.抗真菌物质ATB在抑制植物病原菌上的应用。
9.权利要求8中的应用，所述的植物病原菌包括病原真菌和病原卵菌。
10.根据权利要求9所述的应用，所述的病原真菌包括梨腐烂病菌、水稻纹枯病菌、梨黑斑病菌、轮纹病菌、炭疽病菌和稻瘟病菌，优先选用腐烂病菌、梨黑斑病菌、轮纹病菌、炭疽病菌和稻瘟病菌；所述的病原卵菌包括辣椒疫霉和小麦赤霉，特别是用于辣椒疫霉。
一种高产抗真菌活性物质菌株的构建及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 农作物病害已成为严重危害农业生产的自然灾害之一，在发展中国家甚至造成50％以上的产量损失。化学农药的使用虽取得了不错的治理效果，但随着人们对健康、安全认识的转变，其弊端亦越发突显。生物农药具有高效、安全、不易产生抗药性等优点，结合其他防治手段可作为绿色农业发展的重要选择。多年来，对其产品创制一直是国内外研究的重点和热点。微生物次生代谢产物是应用范围比较广泛的一类生物农药，如井冈霉素、阿维菌素、赤霉素。传统上，革兰氏阳性细菌链霉菌，是公认为生物活性天然产物的主要来源。然而，由于已经开发了几十年，导致从这种微生物中发现的产物重复率太多。因此，迫切需要从未被过度开发的微生物中筛选新的活性物质作为生防制剂。
[0003] 溶杆菌(Lysobacter)属于变形杆菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gmmaproteobaeteria)、黄单胞菌目(Xanthomonadaceae)、黄单胞科(Xanthomonadaeeae)，由Christensen和Cook在1978年首次提出的。研究表明大多数溶杆菌对植物病原真菌、卵菌、细菌、线虫和绿藻具有突出的拮抗作用，而且这种作用主要归结于其产生的具有生物活性的代谢产物，如来源于L.capsiciSB-K88的黄原菌素能够抑制甜菜腐霉病的发生；L.antibioticus HS124分泌的4-对羟基苯乙酸具有防治疫霉病的活性；来自于L.capsiciAZ78的2,5-环缩二氨酸对辣椒疫霉病和白粉病展示出了防治效果。因此，溶杆菌蕴藏丰富的生物活性物质，是产生生防制剂潜在的新资源。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种高产抗真菌活性物质菌株的构建及其应用，本发明所构建的菌株可以极大提高了ATB的产量，而且能够降低后续大规模产业化生产的成本。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提供一种高产抗真菌活性物质菌株的的构建方法，将原始菌株L.enzymogenes OH11，敲除目的基因Le5112、Le5113、Le5114、Le5115、Le5116或Le5117中的一个或几个。具体的，本发明可以选择待敲除的目的基因，并参照全基因组信息设计引物，PCR扩增获得目的基因的上下游片段；将目的基因上下游片段与自杀质粒pEX18GM融合，接着通过电转化转入原始菌株，经过两次交换子筛选及PCR测序验证确定目的基因发生突变的菌株。
[0007] 进一步的，敲除目的基因为Le5115或Le5117中的一个或两个。
[0008] 更进一步，敲除目的基因为Le5115和Le5117。
[0009] 其中，所述的Le5112基因序列如SEQ ID NO:1所示；
[0010] 其中，所述的Le5113基因序列如SEQ ID NO:2所示；
[0011] 其中，所述的Le5114基因序列如SEQ ID NO:3所示；
[0012] 其中，所述的Le5115基因序列如SEQ ID NO:4所示；
[0013] 其中，所述的Le5116基因序列如SEQ ID NO:5所示；
[0014] 其中，所述的Le5117基因序列如SEQ ID NO:6所示。
[0015] 本发明所述的基因敲除方法可以采用现有技术的方法，如具体操作参照《分子克隆实验指南》(第三版)。
[0016] 本发明还提供上述方法所获得的菌株。
[0017] 本发明还提供上述方法所获得的菌株在生产抗真菌活性物质ATB中的应用。
[0018] 本发明还提供一种高产抗真菌活性物质ATB的突变菌株OH57，已于2018年8月16日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC No.16309，经鉴定为溶杆菌(Lysobacter sp.)。主要生物学特征为：菌株呈杆状，两端钝圆，单生，大小一般在(0.2-0.5)μm×(2-70)μm之间，没有鞭毛，能够进行滑行运动。呼吸方式为好氧型，革兰氏阴性细菌，无芽孢，最适生长温度为28℃。菌落特征为：该菌菌落颜色为黄色至黄褐色，菌落粘性、圆形，呈光滑或者啮齿状，可以看到稀薄扩散的透明微菌落，轮廓清晰。
[0019] 本发明还提供所述菌株OH57在生产抗真菌活性物质ATB中的应用。本发明还提供一种更为具体的产酶溶杆菌突变菌株OH57发酵生产ATB的方法：将菌株OH57接种于LB培养液中，振荡培养，获得种子液；按照1.0～2.0％的接种量转接至发酵培养基中，发酵培养获得含有ATB的发酵液。
[0020] 本发明所获得的含有ATB的发酵液可进一步通过将pH调节至3.0～4.5，添加CaCl2和乙酸乙酯，置于漩涡混合振荡器上反应萃取，离心后吸取有机相吹干，加入甲醇溶解后通过HPLC对其含量进行检测。
[0021] 进一步的，本发明所述的生产ATB的方法中，振荡培养条件为：26～30℃、160～200rpm、10～14h。
[0022] 进一步的，本发明所述的生产ATB的方法中发酵培养条件为24～28℃、160～200rpm、56～60h。
[0023] 进一步的，本发明所述的生产ATB的方法中发酵培养基为10％TSB(胰蛋白胨大豆肉汤培养基)、15％NB(营养肉汤)、25％YG、8％SOC、25％YM或SGC中的一种，优选10％TSB、25％YG或SGC，更优选SGC。其中TSB(胰蛋白胨大豆肉汤培养基)、NB(营养肉汤)、YG、SOC、YM或SGC均可按照现有技术的配方进行配备。
[0024] 为了进一步提高ATB的产量，本发明优选的SGC培养基配方为黄豆粉7～9.00g/L，葡萄糖7～8g/L，CaCl20.70～0.75g/L，氨基酸1～6g/L；更优选的，所述的氨基酸选自鸟氨酸、谷氨酸、精氨酸或瓜氨酸中的一种或几种。
[0025] 进一步的优选的，当添加鸟氨酸时，鸟氨酸与发酵液的质量体积浓度为1～6g/L，更优选为4～5g/L，最优选为5g/L；当添加谷氨酸时，谷氨酸与发酵液的质量体积浓度为1～5g/L，更优选为2～4g/L，最优选为3g/L；当添加精氨酸时，精氨酸与发酵液的质量体积浓度为1～6g/L，更优选为3～6g/L，最优选为5g/L；当添加瓜氨酸时，瓜氨酸与发酵液的质量体积浓度为1～6g/L，更优选为3～5g/L，最优选为4g/L。
[0026] 进一步的，本发明发酵液萃取条件为1500～2000rpm下涡旋混合振荡1～1.5min。
[0027] 进一步的，本发明发酵液萃取时CaCl2的添加量为(0.15～0.20)g/mL发酵液；
[0028] 进一步的，本发明发酵液萃取时乙酸乙酯的添加量为(0.8～1.2)mL/mL发酵液。
[0029] 本发明还提供ATB的一种新的应用，即在抑制植物病原菌上的应用。
[0030] 进一步的，本发明所述的植物病原菌包括病原真菌和病原卵菌。
[0032] 进一步的，所述的病原卵菌包括辣椒疫霉和小麦赤霉，特别是用于辣椒疫霉。
[0033] 有益效果：
[0034] 本发明基于溶杆菌能产生活性抗菌物质的特性，通过基因工程对原始菌株一系列敲除改造，从而获得了能够高产抗菌物质ATB的突变菌株，该方法操作简单，而且菌株发酵性质稳定。另外，本发明进一步选用低值、广泛来源的发酵原料，不仅极大提高了ATB的产量，而且能够降低后续大规模产业化生产的成本。这些对于ATB开发成生物农药具有重大的意义。附图说明
[0035] 图1 ATB的分子结构；
[0036] 图2不同突变体发酵ATB的结果对比；
[0037] 图3不同培养基对ATB产量的影响对比；
[0038] 图4不同浓度鸟氨酸对ATB产量的影响对比；
[0039] 图5不同浓度谷氨酸对ATB产量的影响对比；
[0040] 图6不同浓度精氨酸对ATB产量的影响对比；
[0041] 图7不同浓度瓜氨酸对ATB产量的影响对比；
[0042] 图8突变菌株和原始菌株在不同培养基中的发酵ATB对比；
[0043] 图9不同浓度的ATB对各种病原菌的拮抗效果。
具体实施方式
[0044] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
[0045] 实施例1：原始菌株L.enzymogenes OH11中ATB的分离鉴定及生产水平分析[0046] (1)发酵培养：将原始菌株L.enzymogenes OH11接种于100mL LB培养液中，28℃下180rpm振荡培养12h，获得种子液；按照1.5％的接种量转接至100mL10％TSB发酵培养基中，于26℃、180rpm下培养58h。
[0047] (2)分离鉴定：向100mL发酵液中添加浓HCl调节pH至3.0，并加入100mL乙酸乙酯，与40℃、200rpm下萃取2h；离心得到有机相，旋转真空干燥后，通过HPLC制备柱收集保留时间为20.8-21.3min段的馏分，冷冻干燥获得纯品化合物；送至分析中心进行质谱和核磁共振分析。
[0048] (3)产量测定：吸取发酵液3mL至15mL离心管中，滴加浓HCl至pH为3.0，向混合液中添加0.45g CaCl2和3mL乙酸乙酯，置于漩涡混合振荡器上2000rpm反应1min，使有机溶剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使发酵液与有机溶剂分成两相，上清即为HSAF有机溶剂层，吸取1mL吹干加入500μL甲醇溶解后通过HPLC对其含量进行检测。
[0049] 结果显示该分离得到的化合物分子量为510.5Da，分子式为C29H38N2O6，结构如图1所示，与已报道的化合物Alteramide B(ATB)结构完全一致；通过检测分析，确定原始菌株L.enzymogenes OH11发酵液中ATB产量仅为17.75mg/L。
[0050] 实施例2：单敲除基因菌株的获得及发酵ATB水平分析
[0051] 选取Le5112、Le5113、Le5114、Le5115、Le5116、Le5117共计6个基因作为待敲除基因，根据L.enzymogenes OH11全基因信息，设计目的基因的上下游臂引物，如表1所示。
[0052] 表1目的基因的上下游引物
[0053]
[0054]
[0055] 利用同源重组的方法进行单个基因的敲除，具体如下：通过PCR反应分别扩增目的基因上游和下游片段，双酶切消化后，与自杀质粒pEX18GM连接，获得重组质粒pEX18GM-X；利用电转化将重组质粒转入原始菌株，基因敲除组件进入细胞后会经同源重组可以将目的基因部分序列替换，从而破坏该基因的功能。经过两次交换子筛选确定单基因缺失的突变体，具体分子操作方案参照《分子克隆实验指南》(第三版)。
[0056] 对各突变菌株的发酵培养及ATB含量的测定，同实施例1中所述。
[0057] 结果如图2所示：①与原始菌株相比，敲除基因Le5113后，没有ATB产生；②敲除Le5114、Le5116、Le5112基因后，发酵液中ATB的产量都急剧下降；③而在分别各自敲除Le5115和Le5117后，ATB的产量比原始菌株中提高了123.27％、71.94％，为39.63mg/L和30.52mg/L。
[0058] 实施例3：双敲除基因菌株的获得及发酵ATB水平分析
[0059] 本实施例进行了Le5115和Le5117双敲除基因菌株的构建，具体如下：以实施例2中获得的单敲除基因ΔLe5115突变体为供体，将构建好的质粒pEX18GM-Le5117通过电转化转入ΔLe5115中，并参照实施例2方法确定发生双突变的菌株。
[0060] 双突变菌株ΔLe5115+ΔLe5117的发酵培养及ATB含量的测定，同实施例1中所述。
[0061] 结果如图2所示：在双突变菌株中ATB的含量为36.67mg/L，相比于单突变菌株ΔLe5115稍微有所下降，但是从液相图谱上可以看出，相近ATB的副产物的吸收峰明显较ΔLe5115要小很多(数据未列出)，这对于今后ATB的发酵生产以及后续提取过程是非常有利的，因此双突变菌株ΔLe5115+ΔLe5117比较适合作为ATB的生产菌株，2018年8月16日被保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.16309，拉丁学名为溶杆菌(Lysobacter sp.，中文名称是产酶溶杆菌OH57，生物学特征为呈杆状，两端钝圆，单生，大小一般在(0.2-0.5)μm×(2-70)μm之间，没有鞭毛，革兰氏阴性细菌，无芽孢，最适生长温度为28℃。菌落特征为黄色至黄褐色，粘性、圆形，呈光滑或者啮齿状，可以看到稀薄扩散的透明微菌落，轮廓清晰。
[0062] 实施例4：不同培养基对L.enzymogenes OH57发酵生产ATB的影响
[0063] 分别配制10％TSB、15％NB、25％YG、8％SOC、25％YM和SGC培养基，分装至500mL三角瓶中，每瓶100mL，121℃灭菌15min，冷却备用；SGC养基配方如下：黄豆粉8.00g/L，葡萄糖7.89g/L，CaCl2 0.72g/L，其他培养基均为常规的发酵培养基。发酵培养：所用菌株为L.enzymogenes OH57，具体关于发酵培养过程及ATB含量的测定，同实施例1中所述。
[0064] 结果如图3所示：当使用25％YG和SGC培养基时，发酵液中ATB的产量都得到提高，分别为58.20mg/L和471.77mg/L。特别是在SGC培养基下，ATB的产量是对照(10％TSB)的12.87倍，表明SGC培养基非常适合ATB的生物合成过程。
[0065] 实施例5：添加不同浓度鸟氨酸对L.enzymogenes OH57发酵生产ATB的影响[0066] SGC基本培养基的配制：称取葡萄糖17.52g，CaCl21.60g，充分溶解后定容至2L，以每瓶90mL分装于500mL三角瓶中，并每瓶单独加入0.88g黄豆粉，121℃灭菌15min，冷却备用。
[0067] 鸟氨酸发酵培养基SGCO的配制：分别称取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g鸟氨酸溶于100mL纯水中，搅拌至充分溶解，制得不同梯度的鸟氨酸母液；分别吸取10mL谷氨酸母液添加到90mL SGC基本培养基中，获得含鸟氨酸1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L的SGCO培养基，121℃灭菌15min，冷却备用。
[0068] 发酵培养及ATB含量测定，同实施例4中所述。
[0069] 结果如图4所示：在本发明所述的1-6g/L浓度范围内的鸟氨酸都能促进细胞的生长，而且更能刺激ATB的合成，特别是添加5g/L鸟氨酸的情况下，ATB的产量达到最大，为703.34mg/L，比对照(471.77mg/L)提高了49.09％。当鸟氨酸添加浓度大于5g/L时，发酵液中ATB产量稍微出现下降。
[0070] 实施例6：添加不同浓度谷氨酸对L.enzymogenes OH57发酵生产ATB的影响[0071] SGC基本培养基的配制同实施例5中所述。
[0072] 谷氨酸发酵培养基SGCG的配制：分别称取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g谷氨酸溶于90mL纯水中，利用6M NAOH调节pH至7.0，使谷氨酸充分溶解，并定容至100mL，制得不同梯度的谷氨酸母液；分别吸取10mL谷氨酸母液添加到90mL SGC基本培养基中，获得含谷氨酸1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L的SGCG培养基，121℃灭菌15min，冷却备用。
[0073] 发酵培养及ATB含量测定，同实施例5中所述。
[0074] 结果如图5所示：在本发明所述的添加范围内(1-5g/L)，都能够提高HSAF产量，最佳的添加浓度为3g/L，此时ATB的产量为776.19mg/L，比对照(471.77mg/L)提高了64.53％。随着谷氨酸浓度的继续增加，ATB的产量出现下降，当添加浓度为6g/L时，发酵液中ATB产量仅为245.02，相比对照，下降了48.06％。
[0075] 实施例7：添加不同浓度精氨酸对L.enzymogenes OH57发酵生产ATB的影响[0076] SGC基本培养基的配制同实施例5中所述。
[0077] 精氨酸发酵培养基SGCA的配制：分别称取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g精氨酸溶于90mL纯水中，添加浓HCl调节pH至7.0，使精氨酸充分溶解，并定容至100mL，制得不同梯度的精氨酸母液；分别吸取10mL谷氨酸母液添加到90mL SGC基本培养基中，获得含精氨酸1g/L、
2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L的SGCA培养基，121℃灭菌15min，冷却备用。
2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L的SGCA培养基，121℃灭菌15min，冷却备用。
[0078] 发酵培养及ATB含量测定，同实施例5中所述。
[0079] 结果如图6所示：在本发明所述的添加范围内(1-6g/L)，细胞生长和ATB产量都得到提高。当添加浓度为2g/L时，ATB的产量急速上升，随后逐渐平稳增加，在5g/L精氨酸时，ATB产量达到最大893.32mg/L，比对照(471.77mg/L)提高了89.35％。
[0080] 实施例8：添加不同浓度瓜氨酸对L.enzymogenes OH57发酵生产ATB的影响[0081] SGC基本培养基的配制、发酵培养及ATB含量测定，同实施例5中所述。
[0082] 瓜氨酸发酵培养基SGCC的配制：分别称取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g瓜氨酸溶于100mL纯水中，搅拌使其充分溶解，制得不同梯度的瓜氨酸母液；分别吸取10mL瓜氨酸母液添加到90mL SGC基本培养基中，获得含瓜氨酸1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L的SGCC培养基，121℃灭菌15min，冷却备用。
[0083] 结果如图7所示：当添加瓜氨酸后，ATB的产量都得到极大地提升，而且在本发明所述的添加范围内(1-6g/L)，ATB的产量变化不很明显，最大产量在4g/L瓜氨酸时取得，为852.77mg/L。最低产量为768.88mg/L，此时添加浓度为1g/L。
[0084] 实施例9：原始菌株和突变菌株在不同培养基条件下发酵ATB的对比[0085] 参照实施例1可知：原始菌株L.enzymogenes OH11在10％TSB培养基下发酵，ATB产量为17.75mg/L；
[0086] 参照实施例3可知：双突变菌株L.enzymogenes OH57在10％TSB培养基下发酵，ATB产量为36.67mg/L；
[0087] 参照实施例3可知：双突变菌株L.enzymogenes OH57在添加5g/L精氨酸的SGCA培养基下发酵，ATB产量高达893.32mg/L。
[0088] 以上对比可知(图8)，通过基因突变和培养基优化，能够极大地提高了抗真菌活性物质ATB的产量，为大规模产业化生产奠定基础。
[0089] 实施例10：L.enzymogenes OH57发酵生产ATB的抑菌试验
[0090] 利用实施例7得到的高产量的ATB发酵液，进行ATB的分离提取，得到ATB产品，方法同实施例1中所述。
[0091] ATB母液的配制：精确称取20mg纯化得到的ATB产品，充分溶解于10mL甲醇溶液中，制成2000μg/mL的高浓度ATB溶液，再分别作梯度稀释，得到1500、1000、500、100μg/mL不同浓度的ATB溶液。
[0092] ATB平板的配制：配制6瓶PDA培养基，每瓶100mL，灭菌后冷却到60℃左右，分别加入配制好的ATB母液500μL，以添加纯甲醇作为对照，倾倒入培养皿中待其冷却，即得含0、0.5、2.5、5.0、7.5、10.0μg/mL ATB的PDA平板。
[0093] 拮抗真菌试验：指示菌为辣椒疫霉、梨腐烂病菌、梨黑斑病菌、轮纹病菌、炭疽病菌和稻瘟病菌。利用打孔器接入指示菌至不同浓度的ATB平板的中心位置，28℃下培养，辣椒疫霉、梨腐烂病菌、梨黑斑病菌及轮纹病菌培养3天，炭疽病菌培养4天，稻瘟病菌培养6天。观察抑菌效果并测量菌丝直径。
[0094] 结果如图9所示：ATB对各种病原真菌、卵菌都有明显的抑制活性，而且随着ATB含量的增大，抑制效果越明显；当ATB含量达到2.5μg/mL时，所测的病原菌抑制率都达到50％以上，特别是对炭疽病菌，其抑制率为71.15％。由此可见，ATB展现出高效广谱的拮抗活性，可开发成新型的生防制剂，对于减少农作物病害的生物防治具有十分重要的意义。
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