一株荧光假单胞菌XY2F4及其在防治作物黄萎病中的应用
阅读：1078发布：2020-05-18
专利汇可以提供一株荧光假单胞菌XY2F4及其在防治作物黄萎病中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株 荧光 假单胞菌(Pseudomonas protegens)XY2F4及其在防治作物黄萎病中的应用。所述荧光假单胞菌XY2F4已于2019年06月24日保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18017。该荧光假单胞菌菌株XY2F4本身对 植物 无致病 力 ，对由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的 棉 花黄萎病具有显著的抑制作用，能显著减轻棉花黄萎病的发生，具有很好的 生物防治 效果。基因组研究表明，荧光假单胞菌菌株Pseudomonas protegens XY2F4具有一系列生物防治相关化合物合成基因簇，可用于开发针对作物黄萎病病害的生物 农药 ，为利用生物防治作物黄萎病提供新思路、新方法。，下面是一株荧光假单胞菌XY2F4及其在防治作物黄萎病中的应用专利的具体信息内容。
1.一株荧光假单胞菌XY2F4，其分类命名为Pseudomonas protegens，于2019年06月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18017。
2.一种权利要求1所述荧光假单胞菌XY2F4在防治作物的黄萎病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的作物包括棉花、大豆、烟草、拟南芥、马铃薯、番茄、柑橘、樱桃、草莓、苹果、大麦、燕麦、蓝莓等。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的黄萎病包括由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)或黑白轮枝菌(Verticillium alboatrum)引起的真菌性病害。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将荧光假单胞菌XY2F4接种于作物进行黄萎病防治。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的接种方法为混土法或蘸根法。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，荧光假单胞菌XY2F4的接种浓度为OD600＝1.0～2.0。
一株荧光假单胞菌XY2F4及其在防治作物黄萎病中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 棉花是我国重要的经济作物，为纺织工业提供可再生性原材料。由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的棉花黄萎病是一种具有毁灭性的病害，病害的蔓延不仅显著降低棉花纤维品质，而且也会严重影响棉花的经济产量。每年全世界范围内由大丽轮枝菌引起的黄萎病造成的直接经济损失超过数十亿美元。1982年，棉花黄萎病已经蔓延我国农业土壤面积近13万公顷。到1993年，棉花黄萎病已经成为我国棉花高产稳产的主要障碍，发病面积达到266.6万公顷。目前，我国棉花种植区一半左右面积都受黄萎病害影响，经济损失每年达15-20亿元。
[0003] 黄萎病属于土传种传维管束病害，主要通过带菌的棉籽、棉籽饼、棉籽壳、病株残体、土壤、肥料、流水和农田管理工具等途径传播蔓延。病菌从根部入侵，进而系统侵染危害棉株，因此从苗期到成株期的各个生育阶段，均可表现病症。由于致病菌大丽轮枝菌治病关键机制尚未清晰及棉花高抗种质资源的缺乏，棉花黄萎病的防治至今尚未取得突破性进展。目前的防治方向主要是减少人工合成的杀菌剂的使用，尽可能利用黄萎病抗/耐病品种为基础，改善土壤生态条件及诱导棉株抗病性相结合的综合控制措施。在实践生产中的综合防治主要分为三个方面。(1)通过轮作倒茬、土壤深翻、及时中耕等农业防治方法来增加土壤通透性，加强对病菌侵染的控制，提高棉株抵抗力；(2)用缩节胺、化学类等农药进行农药防治；(3)利用生防菌对黄萎病的抑制作用的微生物菌剂防治。在三种防治方式中，由于农药防治的便利高效，所以目前应用最为广泛，但也对环境造成了严重的污染。近年来，研究如何提高作物的对植物病害的耐受力、提高产量、降低灌溉成本、减少化肥和农药使用量成为了生态农业发展的核心。生物防治是利用有益微生物去对抗病原菌微生物，抑制病原菌的生长，提高植物自身的免疫能力，从而起到防治植物病害的方式。但目前对棉花黄萎病的生物防治的菌株和产品十分有限，仅有少数几种含有活性芽孢杆菌、木霉菌或荧光假胞菌等有效微生物成分的产品可以用于防治黄萎病。另外，黄萎病病菌的寄主非常广泛，棉花、大豆、烟草、拟南芥、马铃薯、番茄、柑橘、樱桃、草莓、苹果、大麦、燕麦、蓝莓、果树作物和温室蔬菜等作物，严重危害农业生产。
[0004] 总之，寻找有效的生物防治菌株和防治方法，是防治作物黄萎病病害的发展方向和有效途径。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有黄萎病病害防治技术的缺陷和不足，提供一种对多种作物黄萎病病害具有较好的抑制作用的生防菌，为使用微生物代替化学合成杀菌剂提供新的开发资源，可作为生物农药进行开发利用。
[0006] 本发明的目的是提供一株荧光假单胞菌XY2F4。
[0007] 本发明另一目的是提供所述荧光假单胞菌XY2F4在防治作物黄萎病病害方面的应用。
[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0009] 本发明筛选鉴定得到一株荧光假单胞菌(Pseudomonas protegens)XY2F4，并于2019年06月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18017。
[0010] 所述菌株荧光假单胞菌XY2F4在含大丽轮枝菌株V15QY1、V07DF2、V08DF2、V08T2、V16DF4(菌株由江苏省农科院和植物保护研究所提供)的平板上形成明显抑菌圈，在温室盆栽试验中没有影响棉花的生长，并且能有效抑制大丽轮枝菌V15QY1对棉花植株的侵染。说明本发明的菌株XY2F4可被用于开发针对作物黄萎病的生物农药。此外，菌株XY2F4基因组信息显示，该菌株与非常有名的生防菌株荧光假单胞菌菌株CHA0和Pf-5有着极高的同源相似性，共同地具有荧光假单胞菌菌株CHA0和Pf-5一系列生防相关化合物合成的基因簇，并特有地进化出了一些新的化合物代谢途径和类菌毛(Flp菌毛)的束状纤维蛋白编码基因簇(与细菌在植物根部中的黏附和定植相关的)，预示着该菌株具有更好的与宿主植物进行物质/信号交流和在植物根部定植的能力。
[0011] 该菌株的发现，有利于减轻化学药剂滥用的问题，也为利用生物防治方法防治植物黄萎病病害提供了资源。
[0012] 由于大丽轮枝菌寄主范围广泛，因此，所述荧光假单胞菌XY2F4在防治作物黄萎病病害方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。
[0013] 优选地，所述作物黄萎病包括但不限于由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)或黑白轮枝菌(Verticillium alboatrum)引起的棉花黄萎病病害。
[0014] 优选地，所述黄萎病病害包括棉花、大豆、烟草、拟南芥、马铃薯、番茄、柑橘、樱桃、草莓、苹果、大麦、燕麦、蓝莓、果树作物和温室蔬菜等作物。
[0015] 另外，包含所述荧光假单胞菌XY2F4的作物黄萎病病害的生防制剂，也应在本发明的保护范围之内。
[0016] 优选地，所述生防制剂中荧光假单胞菌XY2F4的浓度为OD600＝1.0～2。
[0017] 作为一种可选择的实施方式，本发明还提供了一种防治作物黄萎病病害的方法，将上述生防制剂接种于植物材料即可。
[0018] 优选地，所述接种可采用混土法。
[0019] 优选地，所述接种可采用蘸根法。
[0020] 发明具有以下有益效果：
[0021] 本发明提供了一株荧光假单胞菌XY2F4，对多种大丽轮枝菌株具有广谱的、显著的抑制作用，能够减轻棉花的黄萎病发生。
[0022] 本发明研究表明，荧光假单胞菌菌株XY2F4在含V15QY1、V07DF2、V08DF2、V08T2、V16DF4菌液的平板上能形成抑菌圈；接种试验发现XY2F4能很好的抑制病原菌对棉花植物的侵染，降低棉花黄萎病的发病率。而且，菌株XY2F4本身无致病力，可用于开发针对作物细菌性病害的生物农药，为利用生物防治作物黄萎病提供了新思路、新想法。附图说明
[0023] 图1为荧光假单胞菌菌株XY2F4在进化上与其他已经报道的同种属的菌株的关系。图1a为基于10个看家基因的聚类图；图1b为XY2F4与最为相似的两个荧光假单胞菌菌株CHA0和Pf5共有基因和特有基因分析；图1c为XY2F4特有的960个基因的注释信息；
[0024] 图2为荧光假单胞菌菌株XY2F4含有的可能与黄萎病病菌生长的抑制活性相关的次生代谢物合成基因簇及结构。
[0025] 图3为荧光假单胞菌株XY2F4对黄萎病病菌生长的抑制活性。
[0026] 图4为荧光假单胞菌菌株XY2F4显著减轻棉花黄萎病病情。
具体实施方式
[0028] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。其中，V15QY1、V07DF2、V08DF2、V08T2、V16DF4和V991菌株由江苏省农业科学院植物保护研究所提供，但不限于此。
[0029] 实施例1假单胞菌XY2F4的分离和筛选
[0030] 1.样本采集及菌株培养：在长江流域、新疆棉花产区、海南棉花南繁基地、东北农业产区等多地的土壤、水体以及植物的根系附近，采集带土的植物根系样本，装袋保存，带回实验室进行菌株分离。带土根系样本采用稀释涂布平板法进行菌株的分离。分别选取土壤、根系等样品放置于50ml收集管中，加入50ml水混合震荡，一般进行4～5次震荡，吸取800μl混合液，用ddH2O在96孔板上进行101-105的梯度稀释。选取适宜浓度的10μl溶液在LB培养基上进行涂布，一般选取103或104的稀释浓度进行平板涂布，平板在28℃恒温培养箱中黑暗倒置培养24～48h，继续在4℃冰箱中培养数日。挑取形态、大小、颜色不同的单菌落纯化培养。在96孔板中加入720μl的培养液，用牙签挑菌培养，于28℃，220rpm摇床过夜震荡培养，待用。
[0031] 2.黄萎病拮抗菌株筛选：黄萎病拮抗菌株筛选采用平板抑菌圈试验进行。在LB培养基上活化棉花黄萎病V15QY1，挑取棉花黄萎病的单克隆于含3ml培养液的10ml离心管中，28℃，220rpm摇床震荡培养24h。4000rpm离心5min收集分生孢子。吸去上清，用3ml水重悬。
调节测算OD值，保证OD600＝0.2。准备0.8％(质量分数)的琼脂，每一个培养基预备6ml的琼脂，保持水浴恒温55℃。将病菌与琼脂混匀铺于平板上，静置1h晾干。将96孔板中吸取5μl点在平板上，每个培养皿点16个样，晾干，而后在28℃恒温箱倒置培养，封膜。培养皿放在28℃培养箱里，24h后从培养箱中取出培养皿，观察预选菌株周围是否有清晰可见的抑菌圈。筛选到一株对黄萎病病菌生长具有很好抑制活性的菌株，在本实验室菌种库的编号为XY2F4(图3a)。
调节测算OD值，保证OD600＝0.2。准备0.8％(质量分数)的琼脂，每一个培养基预备6ml的琼脂，保持水浴恒温55℃。将病菌与琼脂混匀铺于平板上，静置1h晾干。将96孔板中吸取5μl点在平板上，每个培养皿点16个样，晾干，而后在28℃恒温箱倒置培养，封膜。培养皿放在28℃培养箱里，24h后从培养箱中取出培养皿，观察预选菌株周围是否有清晰可见的抑菌圈。筛选到一株对黄萎病病菌生长具有很好抑制活性的菌株，在本实验室菌种库的编号为XY2F4(图3a)。
[0032] 实施例2荧光假单胞菌XY2F4的鉴定及基因组测序
[0033] 1.形态鉴定
[0034] 菌株XY2F4为革兰氏染色阴性菌，非芽孢形成，单个或多个鞭毛提供运动。在LB培养基上培养24h后可形成较大菌落，菌落可产生色素，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起。
[0035] 2.分子鉴定
[0036] 为了明确实施例1获得的菌株XY2F4的菌种分类，我们对菌株XY2F4的16S核糖DNA(rDNA)序列进行分析，用于细菌的分子生物学鉴定。结果表明，XY2F4的16SrDNA序列与荧光假单胞菌Pseudomonas protegens CHA0和Pseudomonas protegens CHA0和Pseudomonas saponiphila DSM9751菌株的同源性最高达到99％，说明该菌株属于假单胞菌这一大类。假单胞菌是一类含有多个种属的革兰氏阴性菌，由于它们在形态结构水平、基因组水平和代谢水平上的多样性，它们广泛存在于多种土壤、水体、宿主中。目前，研究最多的假单胞菌包括了在动物中机会致病菌绿脓假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，植物机会致病菌丁香假单胞菌Pseudomonas syringae，以及具有植物生长促进作用的荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens.。为了揭示XY2F4菌株在进化上与这些假单胞菌不同属的菌株的关系，运用MEGA 5.0软件采用Neighbor-joining方法，构建基于10个看家基因(acsA，aroE，dnaE，guaA，gyrB，mutL，ppsA，pyrC，recA，rpoB)的进化树，对XY2F4与假单胞菌不同种属的模式菌株在进化上的关系进行了分析，结果表明XY2F4在进化上与P.protegens的模式菌株CHA0和Pf-5密切聚类在一起(图1a)，属于荧光假单胞菌大类种的Pseudomonas protegens种。综上，将XY2F4菌株鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas protegens)XY2F4。并将上述菌株于2019年06月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18017，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
[0037] 3.基因组特征
[0038] XY2F4基因大小为6,811,381个碱基；GC含量63.6％；具有6153个蛋白编码区域(CDS)，且蛋白编码序列平均长度为969bp(表1)。该基因组信息于2017年12月06日上传于NCBI数据库，编号为PIZE00000000。总的来说，XY2F4基因组特征与已经报道的生防菌株Pseudomonas protegens CHA0、Pf-5十分相似(图1a)。共有基因和特有基因分析表明，XY2F4同菌株CHA0、Pf-5有5033个共有基因，有960个特有基因(图1b)。这些特有基因主要包括了一些与膜运输氨基酸及其衍生物质代谢，及碳水化合物质代谢等过程相关的基因(图1c)。特别是，与生防菌株Pseudomonas protegens CHA0、Pf-5相比，XY2F4具有独特的Type II及Type VI分泌系统，色氨酸代谢，丁二胺及多胺代谢，麦芽糖与麦芽糖糊精代谢基因簇，并具有编码一种类菌毛(Flp菌毛)的束状纤维蛋白(参与细菌在植物根部中的黏附和定植)(表2)，说明该菌株与标准菌株相比，进化出了一些新的物质代谢途径及与宿主互作的蛋白质分泌系统，并且具有更好的在植物根部定植的能力。
[0039] 表1荧光假单胞菌菌株XY2F4基因组特征
[0040] XY2F4 CHA0 Pf-5
基因组大小(bp) 6,811,381 6,867,980 7,074,893
contigs个数 50 1 1
GC含量(％) 63.6 63.4 63.3
编码基因个数 6153 6219 6342
平均编码基因长度(bp) 969 971 977
核糖体RNA编码基因簇个数 8 11 16
转运RNA编码基因簇个数 60 64 70
基因组大小(bp) 6,811,381 6,867,980 7,074,893
contigs个数 50 1 1
GC含量(％) 63.6 63.4 63.3
编码基因个数 6153 6219 6342
平均编码基因长度(bp) 969 971 977
核糖体RNA编码基因簇个数 8 11 16
转运RNA编码基因簇个数 60 64 70
[0041] 表2荧光假单胞菌菌株XY2F4特有的基因簇
[0042]
[0043] 我们关注XY2F4基因组中与生物防治相关的基因和基因簇，结果表明，与标准菌株CHA0、Pf-5类似，XY2F4也具有合成生防相关的次生代谢化合物的基因簇，包括合成铁载体pyochelin和pyoverdine，细菌素bacteriocin，2，4二乙酰基间苯三酚(2，4-DAPG)，rhizoxin及其衍生物等化合物的基因簇(图2)。
[0044] 实施例3假单胞菌XY2F4抑菌活性的测定
[0045] 为了能够更好地研究本发明菌株XY2F4的生防潜力，我们对该菌的抑菌谱进行了研究。具体操作如下：
[0046] XY2F4具有抑制其他致病真菌生长的能力。使用与实施例1菌株筛选相同的方法，把致病菌V15QY1换成培养条件和方法相同的等量的V07DF2、V08DF2、V08T2、V16DF4，其余步骤不变。实验结果发现，菌株XY2F4对黄萎病V07DF2、V08DF2、V08T2、V16DF4均具有很强的抑菌作用(图3a)。
[0047] 另外，XY2F4还能抑制大丽轮枝菌生长。供测试的大丽轮枝菌为常见的黄萎病强致病性菌株V991。分别挑取病菌V991和生防菌XY2F4单克隆于含3ml培养液的10ml离心管中，28℃震荡培养，220rpm，24h。用无菌水调节测算OD值，保证OD600＝0.2。用无菌水对XY2F4进行梯度稀释(稀释106、105、104、103、102、10倍及不稀释)，各吸取200μl这7个不同浓度的XY2F4培养物，分别加入200μl OD600＝0.2的黄萎病菌V991的分生孢子液，进行共培养1h。而后吸取共培养混合液200μl进行平板涂布，封膜，28℃，倒置培养24h。单克隆计数，观测不同组别的大丽轮枝菌单孢数目。实验中，随着XY2F4浓度上升，V991单孢生长数目明显减少，XY2F4稀释倍数为10倍时候，V991单克隆生长已经能被彻底抑制(图3b)。以上结果表明，XY2F4在平板实验中对黄萎病病菌具有显著的抑制作用。
[0048] 实施例4假单胞菌XY2F4对棉花植株黄萎病的防效测定
[0049] 在PDA固体平板上活化棉花黄萎病大丽轮枝菌菌株V15QY1,在LB固体平板上活化菌株XY2F4，分别挑取单菌落于含50ml培养液的200ml培养瓶中，28℃，220rpm摇床震荡培养24h，用清水调节至OD600为1-2均可。在本实施例中调节至OD600＝2。50ml XY2F4菌液与50ml的V15QY1菌液混合为处理组；50ml的V15QY1菌液加入50mL LB，混合作为对照组。用ddH2O对两组混合溶液进行1:10稀释，用稀释10倍的混合溶液对棉花单株进行接种，每组30个重复，每天观察棉花苗的生长发病情况。图4为通过混土法对棉花植株黄萎病进行的防效测定，其结果可以看出，图中箭头所示的植株，其叶片全部发黄枯萎，没有存活的绿色叶片。病情指数是全面考虑发病率与严重度的综合指标，实验结果表明，与只有黄萎病病菌V15QY1处理的对照组相比，同时含有XY2F4的处理组棉花植株黄萎病的病情指数降低(图4a)。在样本量为30的重复实验中得到一致的结果，即处理组的棉花叶片黄化萎蔫掉落的情况减轻(对照组病情指数80％vs.处理组病情指数55.8％)，再次验证了XY2F4对棉花黄萎病具有较强的抗性(图4b)。
[0050] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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