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一种微 生物 土壤改良剂及其制备方法和应用

阅读：444发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种微生物土壤改良剂及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种微生物土壤改良剂及其制备方法和应用。所述的微生物土壤改良剂为功能菌株发酵液按照10％～15％添加到基质改良剂中，再将混合了发酵液的基质改良剂与土壤混合所得；所述的功能菌株选自菌种编号为BNCC 336568的哈茨木霉，菌种编号为BNCC 231887的荧光假单胞菌，菌种编号为BNCC 335914的灰色链霉中的任意一种或多种，所述的基质改良剂为醋糟和水稻秸秆炭的混合物，二者体积比为1:0.8～1.2；基质改良剂与土壤的体积比为1:23～28。本发明利用土壤本地微生物与外源有益微生物共同协调作用于基质调理剂，达到平衡土壤微生物环境，降低真菌病害影响，且同时改良土壤理化环境的效果。，下面是一种微生物土壤改良剂及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种微生物土壤改良剂，其特征在于所述的微生物土壤改良剂为功能菌株发酵液按照10％～15％(V/W)添加到基质中，再将混合了发酵液的基质与土壤混合所得；所述的功能菌株选自菌种编号为BNCC 336568的哈茨木霉，菌种编号为BNCC 231887的荧光假单胞菌，菌种编号为BNCC 335914的灰色链霉中的任意一种或多种，所述的基质为醋糟和水稻秸秆炭的混合物，二者体积比为1:0.8～1.2；基质与土壤的体积比为1:23～28。
2.根据权利要求1所述的微生物土壤改良剂，其特征在于所述的功能菌株发酵液的菌浓为大于等于1×107CFU/ml。
3.根据权利要求1所述的微生物土壤改良剂，其特征在于所述的功能菌株发酵液按照
10％(V/W)添加到基质中。
4.根据权利要求1所述的微生物土壤改良剂，其特征在于所述的功能菌株选自菌种编号为BNCC 335914的灰色链霉。
5.根据权利要求1所述的微生物土壤改良剂，其特征在于基质与土壤的混合体积比为醋糟：水稻秸秆炭：土壤＝1：1：50。
6.权利要求1～5中任一项所述的微生物土壤改良剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)液体培养所述的功能菌得成熟菌悬液；
(2)以血球计数板计数的方法调整菌悬液浓度后接种到基质中，混合均匀后将基质混拌于障碍土壤中即可。
7.权利要求1～5中任一项所述的微生物土壤改良剂在降低盐渍化土壤的盐分含量，改良土壤酸化中的应用。
8.权利要求1～5中任一项所述的微生物土壤改良剂在蓄积土壤有效养分中的应用。
9.权利要求1～5中任一项所述的微生物土壤改良剂在有效调控土壤微生物环境中的应用。
10.权利要求1～5中任一项所述的微生物土壤改良剂在降低盐渍化土壤的盐分含量、改良土壤酸化、蓄积土壤有效养分和/或有效调控土壤微生物环境中的应用。

说明书全文

一种微 生物 土壤改良剂及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于土壤调节材料领域，涉及一种微生物土壤改良剂及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 近30年来，我国设施农业得以迅速发展，并成为世界上设施栽培面积最大的国家。在农业生产中作物病害、盐胁迫及酸化等环境条件是制约园艺作物产量和质量的最重要因素。但是，目前国内外对于园艺作物的生产仍然以大量施用化学肥料促进作物生长为主，其次以大量的化学农药来防治病虫害为辅，以此来获得产量上的大收益。长此以往，这种模式带来了巨大的经济投入，而且大量的使用化学肥料和农药，尽管带来园艺作物的大幅度增产，但同样也引起了严重的环境问题。与此同时，设施蔬菜生产的规模化、专业化和工厂化的发展也导致了一些地区连作障碍(指在同一块土壤上连续种植同种或同科作物时，即使在正常的栽培管理条件下，也会出现不同程度的生长缓慢、发育不良、长势变弱、产量和品质降低以及病虫害等现象)的日益严重，从而限制了一些地区蔬菜生产可持续发展和经济效益的日益增长。因此，环境友好的、可持续发展的农业生产措施日益受到欢迎与重视。大量研究已明确指出，导致连作障碍产生的因素主要为：(1)设施栽培作物，缺乏雨水淋溶，大量盐基离子附着于土壤表面，养分流失；(2)大量施用化肥和农药，导致土壤理化环境失调，潜伏病原活化，破坏植物生理代谢；(3)植物自毒作用，根系分泌酚酸类等有机小分子破坏了土壤生态环境的平衡，影响了植株的养分吸收。

[0003] 目前国内外对于土壤连作障碍的防治方法主要为减少农药和化肥的施用、合理轮作、园艺作物抗病材料的选育以及施用物理土壤改良剂以此改善土壤生境，促进园艺作物的生长。其中应用于改良连作障碍土壤最多的主要是利用改变耕种制度，降低复种指数等物理调控方面较多，最近慢慢地生产研究上已经将研究重心迁移到化学及生物改良方面了：在化学方面，主要是通过施加某种有机或无机基质(如生物炭、醋糟、菇渣、木薯渣等)使障碍土壤的理化环境发生一定改变，首先提高其酸碱度、降低盐分含量，其次是调控障碍土壤的养分环境，有效的提高土壤的速效养分含量(如有效氮、磷、钾)；在生物方面，主要是将土壤微生物与相关酶活性相联系，两者协同调控土壤的生物环境，为理化环境奠定了基础。两者都在一定程度上解决了以上土壤连作障碍所带来的一系列问题，但并不完整、全面。

[0004] 目前主流的土壤调理剂的研究方法通常为：将基质一定施用比例与障碍土壤混合均匀；主要以盆栽种植作物(黄瓜、番茄、花生等)开展技术研究，正常水肥供应；通过观察勘测土壤盐分、酸碱度及有效养分，及作物的生长来综合测评该种土壤改良剂是否适用。这样的研究方法存在以下缺陷：(1)仅局限于理化性状研究，土壤环境研究不完整；(2)筛选新型土壤改良剂周期过长；(3)局限于物理基质，未能与有益微生物联结作用；(4)新型基质调理剂的作用机理不明确，功能不完善；(5)试验研究方法创新点不够，依旧沿用前人相似方法较多；(6)部分基质成本较高，施用麻烦，且仅能改良障碍土壤的理化环境，本地微生物的作用基本被忽略；(7)现有土壤改良剂配方对于土壤改良的作用效应周期不长，仅仅满足于短期效应；(8)现有技术作用对象太单一，且功能比较局限，仅仅只能作为土壤改良，无其他附加有益功能(9)虽然大部分现有技术已确定配方，但几乎很少运用于实际栽培中，效应不好且效益不高。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种能够改良盐渍化连作土壤理化环境、一定程度上蓄积土壤有效养分、有效调控土壤微生物环境的微生物土壤改良剂。

[0006] 本发明的另一目的是提供该微生物土壤改良剂的制备方法。

[0007] 本发明的又一目的是提供该土壤改良剂的应用。

[0008] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：

[0009] 一种微生物土壤改良剂，所述的微生物土壤改良剂为功能菌株发酵液按照10％～15％(V/W)添加到基质改良剂中，再将混合了发酵液的基质与土壤混合所得；所述的功能菌株选自菌种编号为BNCC 336568的哈茨木霉，菌种编号为BNCC 231887的荧光假单胞菌，菌种编号为BNCC 335914的灰色链霉中的任意一种或多种，所述的基质为醋糟和水稻秸秆炭的混合物，二者体积比为1:0.8～1.2；基质与土壤的体积比为1:23～28。

[0010] 所述的微生物土壤改良剂优选，所述功能菌株发酵液的菌浓为1×107CFU/ml。

[0011] 所述的功能菌株发酵液优选按照10％(V/W)添加到基质中

[0012] 所述的功能菌株优选自菌种编号为BNCC 335914的灰色链霉。

[0013] 所述的微生物土壤改良剂优选基质与土壤的混合体积比为醋糟：水稻秸秆炭：土壤＝1：1：50。

[0014] 本发明所述的微生物土壤改良剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

[0015] (1)液体培养所述的功能菌得成熟菌悬液；

[0016] (2)以血球计数板计数的方法调整菌悬液浓度后接种到基质中，混合均匀后将基质混拌于土壤中即可。

[0017] 本发明所述的微生物土壤改良剂在降低盐渍化土壤的盐分含量，改良土壤酸化中的应用。

[0018] 本发明所述的微生物土壤改良剂在蓄积土壤有效养分中的应用。

[0019] 本发明所述的微生物土壤改良剂在有效调控土壤微生物环境中的应用。

[0020] 本发明所述的微生物土壤改良剂在降低盐渍化土壤的盐分含量、改良土壤酸化、蓄积土壤有效养分和/或有效调控土壤微生物环境中的应用。

[0021] 有益效果：

[0022] 本发明是一个具有系统的、完整的功能的微生物土壤改良剂，包含了土壤物理、化学、生物三个方面的性质；加强了微生物与基质(如醋糟、生物炭等)之间的联系和相互作用，强强联手，从而摆脱了仅以基质作为改良剂的单一性问题，有益微生物可与基质协同作用，共同为作物的栽培和生产提供充足的养分环境和微生态环境，改良效率更高、更全面，这使得本发明中的新型微生物土壤改良剂不仅优于现有技术中的土壤改良剂的基础理化改良效果，还在基础上新开发了一项功能，可提供育苗生产；本发明优选的技术方案中最主要的作用成分是现生产应用较少的放线菌门-灰色链霉，发明开展中发现它还具有很多潜在的价值，可作为育苗基质中添加用，不仅具有蓄积养分的效果，还具有富集有益微生物的趋势。

[0023] 本发明以工业生产中有机废弃物和微生物这些比较常见的且好分离的材料作为技术支撑重心，一方面解决了废弃物的再利用问题，提高了这些废弃物的利用效率，另一方面也可作为有机肥料或者有机育苗基质来进行育苗施用，更加地丰富了土壤改良剂的功能性。

[0024] 本发明中使用了低成本有机废弃物醋糟，材料容易获得且具有潜在的营养价值及生物研究价值，使成本一定程度上的得到了降低。

[0025] 本发明是一种新型的具有显著改良盐渍化土壤盐分、调节酸碱平衡并能够有效蓄积或转化土壤有效养分、平衡土壤有益微生物群落的微生物耦合基质的土壤改良剂；既可作为改良连作障碍土壤的土壤改良剂，又可作为蔬菜育苗的育苗基质，意味着它不仅有改良土壤环境的杀真菌、重组本地微生物的功能，另外也是作物生长所需要的肥料或者养分的提供者。

[0026] 本发明低碳、环保，所用成本也不高，且用途广泛，微生物的活动周期较长(因为放线菌)，效益性好，可提供作物较长期的养分供应。附图说明

[0027] 图1技术方案工作流程图

[0028] 注：表示无菌剂添加的等量无菌水。

[0029] 图2不同微生物基质改良剂对土壤可溶性总盐含量的调控作用

[0030] 注：其中T1-T9分别依次代表以上TR-哈茨木霉；Tv-绿色木霉；Pl-淡紫拟青霉；Jc-枯草芽孢杆菌；Ba-解淀粉芽孢杆菌；Bl-地衣芽孢杆菌；Pf-荧光假单胞菌；Sm-细黄链霉；Sg-灰色链霉。

[0031] 图3不同微生物基质改良剂对土壤有效养分的蓄积作用

[0032] A不同微生物基质改良剂对土壤有效氮养分的蓄积作用

[0033] B不同微生物基质改良剂对土壤有效磷养分的蓄积作用

[0034] 注：其中T1-T9分别依次代表以上TR-哈茨木霉；Tv-绿色木霉；Pl-淡紫拟青霉；Jc-枯草芽孢杆菌；Ba-解淀粉芽孢杆菌；Bl-地衣芽孢杆菌；Pf-荧光假单胞菌；Sm-细黄链霉；Sg-灰色链霉。

具体实施方式

[0035] 实施例1

[0036] (1)培养基配方：供试细菌培养基——牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0，121℃，15min高温灭菌；哈茨木霉(真菌)，综合PDA——20％马铃薯煮汁1.0L，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，C6H12O6 20g，VB1 10mg，琼脂20g，pH自然，121℃，
15min高温灭菌；绿色木霉(真菌)与灰色链霉(放线菌)——20％马铃薯煮汁1.0L，C6H12O6
20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，VB1 10mg，琼脂15g，pH自然，121℃，15min高温灭菌；细黄链霉(放线菌)——KNO3 1g，可溶性淀粉20g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4 0.01g，琼脂20g，蒸馏水1.0L，pH7.2-7.4，121℃，15min高温灭菌；淡紫拟青霉(真菌)，Czapek’s——蔗糖30.0g，NaNO3 3.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH6.0-6.5，121℃，15min高温灭菌。

[0037] (2)培养条件：28℃下于生化培养箱中，细菌1-2天、真菌2-3天、放线菌5-7天。待生化培养箱培养出完整菌落时(细菌1-2天、真菌3天、放线菌5天)，在超净工作台上以新的培养基进行继代培养以得成熟菌株后，进一步地，将各菌种接种于装有各自相应液体培养基的150ml锥形瓶中，摇瓶培养参数设置为200r/min，震荡培养24-48h可得成熟菌悬液。

[0038] (3)进一步地，将其以血球计数板计数的方法统一菌悬液浓度为C＝1×107CFU/ml后以10％的体积质量比接种到基质(水稻秸秆炭：醋糟＝1：1)中，混合均匀后以基质：土壤＝1：25(v/v)混拌于障碍土壤中即可。

[0039] (4)供试菌株：哈茨木霉TR-BNCC 336568；绿色木霉Tv-BNCC 187879；淡紫拟青霉Pl-BNCC 342068；解淀粉芽孢杆菌Ba-BNCC 195265；地衣芽孢杆菌Bl-BNCC 189067；荧光假单胞菌Pf-BNCC 231887；细黄链霉Sm-BNCC 337579；灰色链霉Sg-BNCC 335914,其余菌株为实验室保藏.

[0040] 实施例2改良盐分环境，一定程度上降低了土壤盐分含量，同时提高了土壤pH[0041] (1)土壤培养试验：将基质材料水稻秸秆炭与醋糟以1：1的体积比混匀，然后分别将实施例1中培养所得的成熟菌液(TR-Sg)，以无菌水调节菌悬液的浓度为C＝1×107CFU/ml后，以10％的体积质量比接种到以上混合基质中后，再将此微生物基质调理剂与障碍土壤以1:25的体积比混拌均匀，常规温室大棚中培养30天，同时分别以0-10-20day为研究时间进行土壤化学环境的探测。

[0042] (2)土壤pH测定：取新鲜土壤样品10g，以5：1的水土比加入50ml蒸馏水，反复振荡30mi后静置10min以无磷滤纸过滤，取上清液以Spectrum PH 400Meter Item 2107进行土壤浸提液pH值的测定。

[0043] (3)土壤EC测定：取新鲜土壤样品10g，以5：1的水土比加入50ml蒸馏水，反复振荡30mi后静置10min以无磷滤纸过滤，取上清液以Spectrum Direct Soil EC Meter Item
2265FS进行土壤浸提液EC值的测定。

[0044] 表2不同微生物基质改良剂对土壤理化环境的调控

[0045]

[0046]

[0047] 从表2和图2中数据结果可知，经过微生物菌株与基质的添加，常年(连作9年)连作的设施大棚土壤在其影响下均能够显著提高土壤酸碱度，使其一定程度上脱离了以前的酸化环境，且随着培养时间的延长效果越显著，改良作用越好；同时障碍土壤的电导率也随着达到一定的显著降低作用，这两者直接决定了作物是否能够良好生长、甚至能否存活的一个基础理化环境。显然，添加微生物基质改良剂后，盐渍化土壤的理化环境是有所显著改善的，且其中TR、Pl、Pf、Sg相较于其余处理有更显著的调控作用。

[0048] 实施例3蓄积土壤有效养分，为作物生长提供一个良好的养分储备

[0049] (1)土壤培养试验：将基质材料水稻秸秆炭与醋糟以1：1的体积比混匀，然后将实施例1中培养所得的成熟菌液(TR-Sg)，以无菌水调节菌悬液的浓度为C＝1×107CFU/ml后，以10％的体积质量比接种到以上混合基质中后，再将此微生物基质调理剂与障碍土壤以1:25的体积比混拌均匀，常规温室大棚中培养30天，同时分别以0-10-20day为研究时间进行土壤有效氮、磷养分的探测。

[0050] (2)土壤有效氮养分的测定：取风干土壤样品2g均匀铺于扩散皿外室中，取2ml 2％硼酸溶液，加1-2滴甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，混匀后在外室边缘上涂上碱性甘油，盖上毛玻璃旋转密合；慢慢旋动毛玻璃盖使得外室一边缺口处露出，从缺口处加入10ml
1.0mol/L的NaOH溶液，立即盖严，小心转动扩散皿使碱液与土壤样品充分混匀，以皮筋扎好放于40℃恒温箱中2h，后取出以0.005mol/L的硫酸标注溶液滴定，至溶液颜色由蓝绿色变为微红色为终点。

[0051] 水解性氮(mg/kg)＝(V-V0)××14×1000/m

[0052] 式中：c为标注滴定酸H+的浓度，mol/L；

[0053] V0为滴定空白所用毫升数；

[0054] V为滴定样品所用毫升数；

[0055] 14为氮院子的毫摩尔质量，g；

[0056] 1000为换算成每kg样品中氮的毫克数的系数。

[0057] (3)土壤有效磷养分的测定：称取1mm风干土壤样品2.5g，置于干燥150ml锥形瓶中，加入浸提液0.5mol/L，pH＝8.5的NaHCO3溶液50ml，于室温下往复振荡30min后立即用无磷滤纸过滤于干燥150ml锥形瓶中，吸取10ml于干燥150ml锥形瓶中(含量较高时可吸取2.5-5.0ml，同时补加提取液至10ml)，再加入蒸馏水35ml；然后用移液枪加入钼锑抗显色剂
5ml，摇匀；放置30min后用700nm 波长比色，以空白为对照。

[0058]

[0059] 式中:ρ—从工作曲线上查得P的质量浓度(μg/mL)；

[0060] V—显色时定容体积(mL)；

[0061] m—风干质量(g)；

[0062] ts—为分取倍数(即浸提液总体积与吸取浸提液体积之比)；

[0063] k—将风干换算成烘干基质质量的系数；

[0064] 103—将μg换算成mg；

[0065] 1000—换算成每kg含P量

[0066] 从图3中可以得出：不同微生物基质改良剂施加入障碍土壤以后对于土壤有效养分有不同的影响。其中Pf、Sg相较于其他微生物菌株处理有显著的蓄积有效氮和有效磷的作用，为作物生长提供的了一个良好的养分环境，一定程度上保证了营养的供应，且随着周期的增加养分呈现一个“不减少”、“持平”的状态，意味着养分供应周期可能会延长。

[0067] 实施例4塑造微生物环境，降低有害真菌丰度

[0068] (1)土壤培养试验：将基质材料水稻秸秆炭与醋糟以1：1的体积比混匀，然后将实施例1中培养所得的成熟菌液(TR-Sg)，以无菌水调节菌悬液的浓度为C＝1×107CFU/ml后，以10％的体积质量比接种到以上混合基质中后，再将此微生物基质调理剂与障碍土壤以1:25的体积比混拌均匀，常规温室大棚中培养30天，同时分别以10-20day为研究时间进行土壤微生物群落丰度的探测。

[0069] (2)培养基配方：牛肉膏斜面培养基的配比为每500ml灭菌水中加入牛肉膏1.5g，蛋白胨5.0g，NaCl2.5g，琼脂9.0g，调pH 7.4-7.6；PDA斜面培养基的配比为每500ml灭菌水中加入马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂粉9g，自然pH；高氏一号斜面培养基的配比为每500ml灭菌水中加入KNO3 0.50g，可溶性淀粉10.0g，K2HPO4 0.25g，MgSO4.7H2O 0.25g，NaCl 0.25g，FeSO4 0.005g，琼脂9g，调pH 7.4-7.6。

[0070] (3)培养条件：28℃下于生化培养箱中，细菌1-2天、真菌2-3天、放线菌5-7天。待生化培养箱培养出完整菌落时(细菌1-2天、真菌3天、放线菌5天)

[0071] (4)计数：待其生长稳定成成熟菌株后进行平板计数计算方法如下

[0072]

[0073] 式中：a——各平板所读菌落数，个

[0074] 稀释倍数——103、104、105等，视操作而定

[0075] 表3不同微生物基质改良剂对土壤微生物区系的影响

[0076]

[0077] 从表3中可知，添加不同微生物基质改良剂后，原生土壤的微生物环境发生一系列变化：首先是土壤的细菌和放线菌的丰度均发生了一些变化，随着培养周期的增加，障碍土壤的细菌和放线菌群落丰度均显著降低，而微生物基质改良剂处理土壤的细菌和放线菌丰度均呈现保持水平或升高水平，均显著高于障碍土壤的丰富度；其次是原生土壤中真菌丰度的变化情况，原生障碍土壤的真菌风度均显著高于其余微生物基质改良处理，且部分菌株出现增加了土壤真菌丰富度的作用，这对于我们的改良目的来说是相悖而驰的，基于此，我们发现其中Pf、TR等有显著降低真菌丰度的作用，符合我们的改良目标。

[0078] 实施例5可直接混土进行育苗，提高种子萌发与发芽率

[0079] (1)将津优4号黄瓜种子放于150ml锥形瓶中，以常温水浸泡4h，然后除去废液，重新取干净的清水于瓶中，附上封口膜于28℃、190-210r/min下振荡催芽20-22h后进行播种。

[0080] (2)以实施例1中同样方法得到成熟菌液后，以相同比例混拌基质于障碍土壤中，分别将其分装于各15孔穴盘中，每处理5盘，共60盘。

[0081] (3)进一步地，土壤打孔，每穴1粒黄瓜种子进行育苗播种，覆土后浇足定根水，于正常温室大棚中进行育苗管理，待幼苗大部分生长至1叶1心或2叶1心时计算其发芽率即可。

[0082] 种子发芽率(％)＝(发芽种子粒数/供试种子粒数)×100％

[0083] 表4不同微生物基质改良剂对黄瓜发芽率的影响

[0084]

[0085] 从上表4对比各微生物基质改良剂可知，其中TR、Pf、Sg三者均能够显著提高黄瓜种子的发芽率，且相对于CK(障碍土壤)均有极显著的促进作用，三者当中又属Sg(灰色链霉)效果最好。

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一种微生物土壤改良剂及其制备方法和应用

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