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一株解淀粉芽孢杆菌BR25及其培养方法和应用

阅读:1062发布:2020-07-05

专利汇可以提供一株解淀粉芽孢杆菌BR25及其培养方法和应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株解 淀粉 芽孢杆菌及其培养方法和应用,属于 生物 防治 植物 病害领域。该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BR25,保藏编号为CGMCC No.10962。本发明还公开了上述菌株的分子生物学特性和生理生化特性、培养方法,以及在防治 橡胶 树 炭疽病 中的应用。,下面是一株解淀粉芽孢杆菌BR25及其培养方法和应用专利的具体信息内容。

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BR25,该菌株的保藏号为:
CGMCC No.10962。
2.权利要求1所述的菌株BR25在防治植物真菌病害中的用途;所述植物真菌病害由橡胶炭疽病菌、柱花草炭疽病菌、胡椒枯萎病镰刀菌中的一种或几种引起。
3.一种生物防治制剂,含有权利要求1所述的菌株或其发酵液。
4.权利要求3所述的生物防治制剂在防治植物真菌病害中的用途;所述植物真菌病害由橡胶炭疽病菌、柱花草炭疽病菌、胡椒枯萎病镰刀菌中的一种或几种引起。
5.一种植物真菌病害的生物防治方法,其特征在于,向具有真菌病害的植物施用权利要求1的菌株或权利要求3的生物防治制剂;所述真菌病害由橡胶炭疽病菌、柱花草炭疽病菌、胡椒枯萎病镰刀菌中的一种或几种引起。

说明书全文

一株解淀粉芽孢杆菌BR25及其培养方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物防治植物病害领域,涉及一株解淀粉芽孢杆菌BR25(Bacillus amyloliquefaciens)及其在防治橡胶炭疽病中的应用。

背景技术

[0002] 橡胶树炭疽病是炭疽菌引起的一种常见病害,它会使橡胶树叶脱落,严重时甚至可能造成整株死亡,是橡胶树的三大叶部病害之一。目前对于该病害的防治主要是应用化学农药进行防治,对环境造成很大影响。于是,探索生物防治的方法变得迫切。炭疽菌能够侵染多种植物引起炭疽病,该类病害分布广泛,危害严重,是植物病理学家重点研究的对象之一,橡胶树炭疽病是其中危害最为严重的一种。橡胶树炭疽病是由胶孢炭疽菌侵染引起的,在海南、南地区引起了无数橡胶树叶片脱落,甚至整株死亡,给当地的橡胶产业发展造成了严重损失。
[0003] 炭疽菌主要以菌丝体形式在病枝中越冬,在适合的条件下产生分生孢子作为初侵染源。橡胶树幼苗、幼龄树直至成龄开割胶树均可被炭疽菌侵染而发病。病菌能够侵染嫩叶、叶柄、嫩梢和果实等部位,引起嫩叶脱落、嫩梢回枯和果实腐烂,甚至形成僵果悬挂在树上,严重时会引起胶树的重复落叶和嫩梢回枯,推迟开割时间。该病害被认为是造成天然橡胶树减产的主要原因之一。目前对于橡胶炭疽病的防治仍以化学杀菌剂为主,然而,化学农药造成的病菌抗药性、毒性和环境污染问题日益突出,成为制约农业可持续发展的主要障碍,生防微生物具有环境兼容性好、无毒无害的优点,是化学农药的理想替代品。因此,用生防微生物防治橡胶树炭疽病对实现农业的可持续发展具有重要意义。
[0004] 生物防治作为植物病害防治的重要组成部分,被认为是最具有发展潜的重要防治方法之一。随着人们环保意识的加强,生物防治以其符合对环境、生态、人类健康的安全,不污染环境,成本低廉等特征成为近年来国内外病害综合防治与研究热点。近年来,橡胶树炭疽病的发生危害呈现越来越严重的趋势。由此可见,开展对橡胶树炭疽病生防菌筛选研究是如今橡胶树生产过程中一项迫切的任务。
[0005] 从橡胶植株内分离筛选获得对橡胶树炭疽病菌具有拮抗作用的生防菌株,对 橡胶树炭疽病的防治具有重要的意义,但目前相关技术仍然很薄弱甚至空白,至今有效防治橡胶树炭疽病的拮抗细菌未见报道,也没有防治橡胶树炭疽病的生物农药的报道。本发明的目的针对现有技术的空白提供一株解淀粉芽孢杆菌BR25(Bacillus amyloliquefaciens)及其在防治橡胶树炭疽病中的应用。

发明内容

[0006] 本发明的目的针对现有技术的空白提供一株解淀粉芽孢杆菌BR25(Bacillus amyloliquefaciens)及其在防治橡胶树炭疽病中的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
[0008] 本发明采用的细菌是解淀粉芽孢杆菌BR25菌株,分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens,已于2015年06月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址:中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编100101;保藏编号为CGMCC NO.10962。
[0009] 本发明的生产菌株BR25分离自海南省儋州市宝岛新村的橡胶植株叶片,经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特性试验以及16s rDNA序列分析,该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的一个新菌株,具有以下特征:①菌株呈直杆状,常以成对或链状排列,具圆端或方端;芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形,无荚膜;革兰氏染色阳性;②通过甲基红实验、酪酸分解实验、V-P实验、柠檬酸盐生长实验等生理生化指标,并结合《伯杰细菌鉴定手册》,鉴定结果BR25属于枯草芽孢杆菌属,结果与分子鉴定一致。
[0010] 该解淀粉芽孢杆菌BR25的基本培养基为LB培养基或者YEP培养基。
[0011] 该解淀粉芽孢杆菌BR25的可利用源有:山梨醇、鼠李糖、维生素C、苏氨酸、半乳糖、脯氨酸、甘露醇、麦芽糖、胱氨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、酪氨酸、果糖。
[0012] 本发明还研究了菌株BR25对不同抗生素的敏感性,为化学防治打下基础
[0013] 本发明的菌株BR25对柱花草炭疽菌、橡树炭疽菌、胡椒枯萎镰刀菌具有抑制作用。
[0014] 本发明的菌株BR25或其发酵液可以作为生物防治制剂使用,用于防治植物真菌病害。
[0015] 本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BR25的应用,该菌株可以用于防治橡胶树炭疽病、柱花炭疽病和胡椒枯萎镰刀菌。
[0016] 本发明还提供一种植物真菌病害的生物防治方法,向具有真菌病害的植物施 用菌株BR25或其发酵液,也可以施用含有上述菌株或其发酵液的生物防治制剂,也可以与其他生物防治制剂联合施用。
[0017] 本发明的菌株BR25具有广谱抗菌性,培养简单,适应性强,抗菌能力稳定,可以广泛应用于多种植物真菌病害的防治。附图说明
[0018] 图1为BR25和其他生防菌的16S rDNA PCR产物电泳图,泳道M为DNA marker,4为BR25,5为BR23,6为BR24,7为BR26。
[0019] 图2为菌株BR25的革兰氏染色结果。
[0020] 图3为菌株BR25第1-10代的拮抗效果图。
[0021] 图4为菌株BR25对橡胶树炭疽菌的抑制作用。
[0022] 图5为菌株BR25对胡椒枯萎病镰刀菌的抑制作用。

具体实施方式

[0023] 实施例1
[0024] 菌株BR25的分离培养和筛选纯化。
[0025] 1.1采样
[0026] 样品为海南省儋州市宝岛新村的橡胶植株叶片,将采集好的叶片放入塑料袋中并记录。
[0027] 1.2材料表面消毒与拮抗细菌分离
[0028] 1.2.1清冲洗与剪取病叶
[0029] 用清水洗去叶片上的灰尘砂砾,晾干。用剪刀在病健交界处剪取大小为5×5mm的小叶片备用。
[0030] 1.2.2样品消毒
[0031] 将剪取的小病叶放入烧杯,用升汞浸泡30秒,在浸泡的过程中应注意不断轻轻搅动小病叶,然后用无菌水冲洗三次,晾干,备用。
[0032] 1.3细菌分离培养
[0033] 用灭过菌的镊子将剪取的小叶片贴放到PDA固体培养基上,每皿均匀摆放4,再将培养皿用保鲜膜密封。倒置放入恒温培养箱中,28℃培养。每隔12h进行观察48h后将长出的菌体转接至相同的培养基上,28℃培养48h后进行纯化;同时,将纯化后所得的细菌采用梯度稀释涂布LB平板培养基中,28℃培养48h后 挑取单菌落接至相应培养基斜面上。
[0034] 1.4拮抗细菌的筛选
[0035] 1.4.1细菌的纯化
[0036] 无限稀释法:将放置于8~10℃培养箱中的斜面试管取出,在无菌操作台中,将液体LB培养基分装到锥形瓶中,然后用接种针挑去少量的细菌于锥形瓶中,封口。放置于28℃摇床上震荡培养约12小时,取出。然后用移液器吸取200μL于LB固体培养基上,涂抹棒涂抹均匀,于28℃培养箱培养。然后再通过无限稀释法处理获得单一菌株。
[0037] 或者采用划线纯化法:
[0038] 如果要挑的菌落很小,而且又长得慢,菌落全部粘到接种环上,划线时可适当增加第二梯度线的宽度和划线数,因为当菌少时,拉不开4个梯度,而第二梯度可较好的分离出单菌落。如果要挑的菌落很大,而且又长得快,可挑菌少些,第一梯度线要多划几下,且占地要小。第二梯度线划得少且密一些,第三和第四梯度线则划得多且疏,因为这些菌主要靠第三和第四梯度线分离单菌落。第二梯度2~3条线与第一梯度线连接,第三与第二梯度线也是2~3条线连接。在第二与第三梯度划线前将接种环灼烧冷却,这样可烧死粘在接种环上的细菌。
[0039] 实施例2
[0040] 菌株BR25的鉴定
[0041] 1、微生物学特性:
[0042] 对在37℃培养箱中划线培育的生防菌株进行形态特征观察,发现生防菌株BR25呈直杆状,较少成链,具圆端或方端;芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形,无荚膜,为芽孢杆菌属。经革兰氏染色后菌体均呈现出蓝紫色,为革兰氏阳性菌
[0043] 2、分子生物学鉴定:
[0044] (1)DNA提取:采用本领域通用的试剂盒进行基因组DNA的提取;
[0045] (2)PCR反应:细菌通用引物8F和1492R,由英潍捷基(上海)贸易公司合成,结构如下:8F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
[0046] 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3',
[0047] 生防菌株BR25的16S rDNA基因扩增结果如图1所示,扩增条带长度约 1500bp,与预期大小一致;
[0048] (3)将PCR鉴定正确的重组菌送英潍捷基(上海)贸易公司基因测序。
[0049] 通过在NCBI网上进行比对分析,结果显示与枯草芽孢杆菌属的同源性为99%,因此推断BR25菌株属于枯草芽孢杆菌属。
[0050] 3、生防菌的生理生化鉴定
[0051] (1)吲哚试验
[0052] ①培养基配制:取1%胰蛋白胨水溶液,调pH 7.2-7.6,分装于试管中,高度为试管的1/3-1/4,121℃灭菌20min;
[0053] ②待培养基冷却后,取10μL供试菌株新鲜种子液接种于胰蛋白胨液体培养基;
[0054] ③28℃培养,分别于2d、4d后观察结果;
[0055] ④每次观察时,沿管壁慢慢加入3-5mm高的试剂于培养液表面,在液层界面出现红色,即为阳性反应。若颜色不明显,可在培养液中加入乙醚约1mL,充分震荡,静置片刻,待乙醚浮至液面后再加吲哚试剂,在乙醚和试剂液层界面出现红色,即为阳性反应。
[0056] 结果均无红色产生,结果如表1所示,故分析生防菌在吲哚为生理生化指标情况下为阴性。
[0057] 表1 吲哚试验结果
[0058]
[0059] 注:“+”为阳性,“-”为阴性。
[0060] (2)柠檬酸盐生长试验
[0061] ①培养基配制:分别取NaCl 1.0g,MgSO4·7H2O 0.2g,NH4H2PO40.5g,柠檬酸钠2.0g,琼脂18.0g,0.04%酚红水溶液10mL;蒸馏水补充至1000.0mL,调pH为7.0,然后加入指示剂,分装试管;
[0062] ②121℃灭菌20min,摆斜面;
[0063] ③挑取新鲜培养的供试菌株单菌落在斜面上划线接种,28℃培养3-7d;
[0064] ④观察实验结果:培养基变蓝色或桃红色为阳性,否则为阴性。
[0065] 除接生防菌BR23不变色以外,接其他生防菌均变为桃红色,其余生防菌株为阳性如表2所示;
[0066] 表2 柠檬酸盐生长试验结果
[0067]
[0068] 注:“+”为阳性,“-”为阴性。
[0069] (3)最适碳源利用测定
[0070] ①选取可溶性淀粉、胱氨酸、抗坏血酸、脯氨酸、精氨酸、麦芽糖、酪氨酸、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、甘氨酸、鼠李糖、果糖、草酸、苏氨酸、半乳糖、等碳源利用测定;
[0071] ②基本培养基:(NH4)2SO42.0g,NaH2PO4·H2O 0.5g,K2HPO40.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,CaCl2·2H2O 0.1g,蒸馏水补充至1000.0mL,pH 6.5,分装于试管中(每支试管4mL),
121℃灭菌20min;
[0072] ③将所得碳源配制成5%的水溶液,灭菌后加入试管中,使其终浓度为1%;
[0073] ④取供试菌株种子液10μL分别加到不同碳源中,并设置空白对照,然后在28℃,200r/min条件下,摇培40h;
[0074] ⑤若出现明显浑浊,说明该碳源可以被利用;若无,则需从中取出10μL,转接到相应的新的碳源试管中,同样条件下,连续培养3次;如果仍无浑浊,则证明此碳源不适合被供试菌株利用。
[0075] 实验结果如下:
[0076] 可利用碳源有:山梨醇、鼠李糖、维生素C、苏氨酸、半乳糖、脯氨酸、甘露醇、麦芽糖、胱氨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、酪氨酸、果糖;
[0077] 不可利用碳源有:精氨酸、草酸、甘氨酸。
[0078] (4)接触酶试验
[0079] ①用液体培养基摇培菌株16h;
[0080] ②接种环蘸取培养16h的新鲜菌液,涂在已滴有3%过化氢水溶液的玻片上;
[0081] ③观察结果:有气泡产生为阳性,无气泡为阴性。
[0082] 结果发现均有气泡产生;显示接触酶实验结果均为阳性。
[0083] 表3 接触酶试验结果
[0084]
[0085] 注:“+”为阳性,“-”为阴性。
[0086] (5)氧化酶试验
[0087] ①用液体LB培养基摇培菌株16h;
[0088] ②在干净培养皿里放一张滤纸,滴加1%二甲基对苯撑二胺盐酸盐水溶液,仅使滤纸湿润即可,不可过湿;
[0089] ③用接种环取培养16h的新鲜菌液,涂抹在湿润的滤纸上;
[0090] ④观察结果:在10s内涂抹的菌苔现红色者为阳性,10-60s现红色者为延迟反应,60s以上现红色者不计,按阴性处理。
[0091] 结果显示:在涂抹菌苔后的60S内均未产生颜色的变化;全部显示阴性。
[0092] 表4 氧化酶试验结果
[0093]
[0094] 注:“+”为阳性,“-”为阴性。
[0095] (6)对抗生素的敏感性研究
[0096] 用滤纸片法测定枯草芽孢杆菌BR25对不用抗生素的敏感性,用打孔器制备直径7毫米的滤纸片,高温灭菌。在溶化后冷却至50摄氏度~55摄氏度的LB固体培养基中加入1毫升供试菌株种子液,摇匀后倒平板,将灭菌后的滤纸片置于平板中,然后在滤纸上添加抗生素溶液,添加量相当于氨苄青霉素Amp 50微克每毫升、卡那霉素Kana 50微克每毫升、氯霉素Chl 50微克每毫升、链霉素Str 50微克每毫升、四环素Tet 50微克每毫升、红霉素Ery 50微克每毫升、利福平Rif 50微克每毫升、头孢霉素Cef 50微克每毫升。放置于28摄氏度恒温培养箱内培养,分别于24小时、48小时观察结果。结果如下:
[0097] 表5 抗生素抗性实验结果
[0098]
[0099] 注:“+”为出现抑菌圈,“-”为不出现抑菌圈。
[0100] 实施例3
[0101] 对植物病原真菌的抑制效果
[0102] 在事先备好的PDA平板中央,接种直径为6mm的供试病原菌菌块,同时在距PDA平板中心25mm的对称两点处接种待测细菌,每株菌重复3次,28℃恒温倒置培养,6d后观察抑菌状况。
[0103] 表5 对病原真菌的抑制效果
[0104]
[0105] 实施例4
[0106] 解淀粉芽孢杆菌BR25对病原菌的抑菌效果
[0107] 培养基:胰蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g,氯化钠5.0g,琼脂粉20g,蒸馏水补充至1000.0mL,121℃灭菌20min。
[0108] 通过对生防菌BR25进行对峙培养试验,结果显示BR25的第1-10代稳定拮 抗柱花草炭疽菌。还验证了BR25对橡树炭疽菌和胡椒枯萎镰刀菌的抑制作用。
[0109] 以上所披露的仅为本发明的较佳实施例,不能以此来限定本发明的权利范围,因此依本发明权利要求所作的等同变化,仍属于本发明所涵盖的范围。
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