一种二甲基黄青霉素在抗植物致病真菌中的应用
阅读：468发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种二甲基黄青霉素在抗植物致病真菌中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及化合物制备领域，具体涉及一种二甲基黄青霉素在抗 植物 致病 真菌 中的应用。其中，二甲基黄青霉素应用于抗植物致病真菌中。二甲基黄青霉素具有抗植物致病真菌的活性，可以将其应用于抗植物致病真菌，从而抑制 农作物 或生态环境中的植物致病真菌生长，进而解决植物病害对农作物和生态环境的危害。，下面是一种二甲基黄青霉素在抗植物致病真菌中的应用专利的具体信息内容。
1.一种二甲基黄青霉素在抗植物致病真菌中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物致病真菌为玉米小斑致病菌或番茄早疫病菌。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述二甲基黄青霉素的用药浓度为大于等于12.5μg/ml。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述二甲基黄青霉素从曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1 CCTCC No.M2019453中分离得到。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，分离二甲基黄青霉素包括以下步骤：
将曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1接种到发酵培养基中，在100-300rpm，20-40℃下发酵培养4-14天，得到菌体；
利用有机溶剂对所述菌体进行萃取，分离，得到二甲基黄青霉素。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯或丙酮中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述有机溶剂为丙酮，所述萃取步骤包括：
将菌体用丙酮浸泡超声5-60min后静置，过滤得到丙酮萃取液；
将所述丙酮萃取液在30-50℃下减压浓缩获得菌体粗提物；
对所述菌体粗提物进行层析分离，并对层析分离后的馏分进行反向HPLC分离纯化，得到二甲基黄青霉素。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述层析分离步骤包括：
将菌体粗提物用甲醇溶解后上样，干燥，得到洗脱样品；
依次利用水、50％甲醇溶液、甲醇对所述洗脱样品进行洗脱，分别收集洗脱液，并在30-
50℃下对所述洗脱液进行减压浓缩至干获得相对应的馏分；
甲醇作为洗脱剂时得到的馏分为用作反向HPLC分离纯化的目标馏分。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述反向HPLC分离纯化步骤包括：
用甲醇将所述目标馏分进行复溶，然后用100％乙腈洗脱分离，设定检测波长为210nm，于5.0min时收集液相峰，将收集的馏分进行干燥，得到二甲基黄青霉素。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包括以下组分：
葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、大豆蛋白胨10g/L以及海盐30g/L。
11.根据权利要求5-10中任一项所述的应用，其特征在于，在将曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1接种到发酵培养基中的步骤前还包括将低温保藏的曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1接种到平板培养基中，在20-40℃下培养进行复苏的步骤。
一种二甲基黄青霉素在抗植物致病真菌中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及化合物制备领域，具体涉及一种二甲基黄青霉素在抗植物致病真菌中的应用。
背景技术
[0002] 植物致病真菌是指可以寄生在植物上并引起植物病害的真菌，是植物病害的重要侵染源。几乎百分之八十左右的植物侵染性病害都是由真菌引起的，而每种植物都可以受到几种甚至几十种真菌的危害。诸如小麦锈病、稻瘟病、蔬菜软腐病、苹果树腐烂病等都属于真菌性病害。
[0003] 真菌病害会造成农作物减产、降低农产品品质，从而对农产品的生产造成严重的经济损失，有的真菌病害甚至会使农产品产生毒素，危及人、畜健康，例如感染赤霉病的小麦籽粒产生致呕毒素和类雌性毒素，人畜食后引起呕吐、腹泻等中毒症状；甘薯黑斑病病薯含有甘薯黑斑霉酮和甘薯黑斑霉二酮，人食后引起头晕，牛食后发生气喘病。因此，防治植物真菌病害是长期以来科学家们一直在努力攻克的难题。
[0004] 传统的防治植物真菌病害是通过使用化学农药，但是长期使用化学农药会导致环境污染、病原菌耐药性增加以及植物体内微生物菌群失衡等问题，由于化学农药的副作用日益凸显和人们对环保、绿色食品需求的提高，研发符合环保、健康和可持续发展理念的生物农药已成为当务之急。
[0005] 农用抗生素由于其高效、易分解、无残留、与环境相容等优势而倍受重视，但是由于农药抗生素的发现较为困难，故目前在农药市场中，农用抗生素所占份额仅占9％。目前，通过新微生物资源发现新抗生素成为主要解决方案之一。
[0006] 二甲基黄青霉素是由Takatsuki等人于1968年首次从土壤真菌Aspergillus sp.的发酵液中分离得到的，并发现其具有抗病毒活性[1]，日本科学家Tsutomu等人发现了二甲基黄青霉素具有较好的抗肿瘤活性并且具有较低的毒性[2]，Sakai等人从海洋真菌Basipetospora sp.中分离得到二甲基黄青霉素，并发现其具有血小板生成受体激活剂的活性[3]。此外，二甲基黄青霉素被发现具有抗人类致病真菌白色念珠菌的活性[4]。而黄青霉素家族化合物中含有磺酸基的同系物BU-4707(甲基磺酸基黄青霉素)被报导具有多种抗菌活性，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aures FDA 209P JC-1)、耐药型金黄色葡萄球菌(S.aureus Smith)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)、大肠杆菌(Escherichia coli Juhl)、肺炎克雷伯杆菌(Pseudomonas aeruginosa A9843A)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans D49，人类致病真菌)、须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes no.4329，人类致病真菌)等[5]。但是目前暂无关于黄青霉素类化合物在抗植物致病真菌活性方面的报导。
发明内容
[0007] 因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的植物致病真菌对农作物引起病害的问题，从而提供一种二甲基黄青霉素在抗植物致病真菌中的应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0009] 一种二甲基黄青霉素在抗植物致病真菌中的应用。
[0010] 进一步的，所述植物致病真菌为玉米小斑致病菌或番茄早疫病菌。
[0011] 进一步的，所述二甲基黄青霉素的用药浓度为大于等于12.5μg/ml。
[0012] 进一步的，所述二甲基黄青霉素从曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1 CCTCC No.M2019453中分离得到。
[0013] 进一步的，分离二甲基黄青霉素包括以下步骤：
[0014] 将曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1接种到发酵培养基中，在100-300rpm，20-40℃下发酵培养4-14天，得到菌体；
[0016] 进一步的，所述有机溶剂为乙酸乙酯或丙酮中的至少一种。
[0017] 进一步的，所述有机溶剂为丙酮，所述萃取步骤包括：
[0018] 将菌体用丙酮浸泡超声5-60min后静置，过滤得到丙酮萃取液；
[0019] 将所述丙酮萃取液在30-50℃下减压浓缩获得菌体粗提物；
[0020] 对所述菌体粗提物进行层析分离，并对层析分离后的馏分进行反向HPLC分离纯化，得到二甲基黄青霉素。
[0021] 进一步的，所述层析分离步骤包括：
[0022] 将菌体粗提物用甲醇溶解后上样，干燥，得到洗脱样品；
[0023] 依次利用水、50％甲醇溶液、甲醇对所述洗脱样品进行洗脱，分别收集洗脱液，并在30-50℃下对所述洗脱液进行减压浓缩至干获得相对应的馏分；
[0024] 甲醇作为洗脱剂时得到的馏分为用作反向HPLC分离纯化的目标馏分。
[0025] 进一步的，所述反向HPLC分离纯化步骤包括：
[0027] 进一步的，所述发酵培养基包括以下组分：
[0029] 进一步的，在将曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1接种到发酵培养基中的步骤前还包括将低温保藏的曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1接种到平板培养基中，在20-40℃下培养进行复苏的步骤。
[0030] 本发明技术方案，具有如下优点：
[0031] 1.本发明首次发现二甲基黄青霉素具有抗植物病菌的活性，可以将应用于抗植物病菌，尤其是玉米小斑病菌(Helminthosporium maydis)和番茄早疫病菌(Altemaria solani)，从而抑制农作物为或生态环境中的植物病菌，进而解决植物真菌病害对农作物和生态环境的危害。
[0032] 2.本发明在曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1 CCTCC No.M2019453中分离得到二甲基黄青霉素，并对其进行抗植物致病真菌活性的测定，用药浓度为100ug/m时可以明显抑制番茄早疫病菌和玉米小斑病菌两种植物致病真菌的生长。
具体实施方式
[0033] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
[0034] 实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0035] 本发明提供一种二甲基黄青霉素在抗植物致病真菌中的应用，将二甲基黄青霉素应用于抗植物致病真菌中。其中，植物致病真菌为玉米小斑致病菌或番茄早疫病菌。二甲基黄青霉素的用量优选为100ug/ml。
[0036] 二甲基黄青霉素可以从曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1 CCTCC No.M2019453中分离得到。该真菌已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC No.M2019453，保藏日期：2019年6月13日，该真菌以下简称为曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1。
[0037] 具体的，分离二甲基黄青霉素包括以下步骤：
[0038] 将曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1接种到发酵培养基中，在100-300rpm，20-40℃下发酵培养4-14天，得到菌体；然后利用有机溶剂对得到的菌体进行萃取分离，得到二甲基黄青霉素。
[0039] 其中，作为优选的实施例，将曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1接种到发酵培养基中，在180rpm，28℃下发酵培养7天，得到菌体。作为可选的实施例，有机溶剂可以选用乙酸乙酯或丙酮中的至少一种，发酵培养基包括如下组分的原料：葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、大豆蛋白胨10g/L以及海盐30g/L。作为可选的实施例，发酵培养基按照以下步骤进行配制：将葡萄糖20g、酵母粉5g、大豆蛋白胨10g、海盐30g溶于1l去离子水中，用1M HCl或1M NaOH调节pH至7.5，121℃高压灭菌30min。采用1000ml的锥形瓶进行发酵，每瓶发酵400ml，总共发酵25瓶，发酵量为10L。
[0040] 萃取步骤包括将菌体用丙酮浸泡超声30min后静置，然后过滤得到丙酮萃取液；将丙酮萃取液在30-50℃下减压浓缩获得菌体粗提物；对菌体粗提物进行层析分离，并对层析分离后的馏分进行反向HPLC分离纯化，得到二甲基黄青霉素。
[0041] 作为可选的实施例，静置至菌体沉降后即可用纱布进行过滤，从而得到丙酮萃取液，减压浓缩方式为旋转蒸干，减压浓缩的优选温度为45℃。
[0042] 层析分离步骤包括：将菌体粗提物用甲醇溶解后上样，干燥，得到洗脱样品；利用水、50％甲醇溶液、甲醇对所述洗脱样品进行连续洗脱，分别收集洗脱液，并在30-50℃下对所述洗脱液进行减压浓缩；甲醇作为洗脱剂时得到的馏分为用作反向HPLC分离纯化的目标馏分。
[0043] 作为可选的实施例，层析分离采用大孔吸附树脂柱(HP-20)进行层析，大孔吸附树脂柱直径为10cm，长度为100cm，底部具有控制流速的活塞。上样步骤包括：将菌体粗提物溶解于甲醇中，然后按照菌体粗提物质量：大孔吸附树脂质量＝10:1的比例进行搅拌，然后将搅拌好的样品放置于通风橱自然挥干，得到洗脱样品。洗脱步骤包括：得到洗脱样品后，用铁架台将层析柱竖直固定，将洗脱样品也就是已经上样的大孔吸附树脂缓慢装入玻璃层析柱中，在此过程中可用洗耳球轻轻敲打层析柱外壁，从而使得大孔吸附树脂沉降均匀、密实；然后选择水、50％甲醇溶液、甲醇作为洗脱剂，进行连续洗脱，分别收集洗脱液，每个体积洗脱1000ml；将回收回来的每一个组分用旋转蒸发仪进行减压浓缩(温度为35-45℃)。所得样品按照水、50％甲醇溶液、甲醇3个洗脱剂，分别命名为H-1、H-2、H-3。
[0044] 反向HPLC分离纯化步骤包括：用甲醇将所述目标馏分进行复溶，然后洗脱分离，设定检测波长为210nm，于5.0min时收集液相峰，将收集的馏分进行干燥，得到二甲基黄青霉素。
[0045] 作为可选的实施例，反向HPLC分离纯化采用YMC-Pack ODS-A柱，在将H-3组分减压浓缩蒸干、用甲醇复溶后，利用100％乙腈进行洗脱，流速为4ml/min，洗脱时间为20min。
[0046] 作为可选的实施例，由于曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1是低温保藏的，故在将曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1接种到发酵培养基中的步骤前还包括将低温保藏的曲霉属真菌Aspergillus sp.LW1接种到平板培养基中，在28℃下培养进行复苏的步骤。
[0047] 其中，平板培养基为PDA培养基，具体包括如下组分：马铃薯粉6.0g/L、葡萄糖20.0g/L、琼脂20.0g/L。平板培养基按照如下步骤进行配制：称取马铃薯粉6.0g、葡萄糖
20.0g、琼脂20.0g溶于1L去离子水中，121℃高压灭菌30min。
20.0g、琼脂20.0g溶于1L去离子水中，121℃高压灭菌30min。
[0048] 实施例
[0049] 一、菌种发酵：
[0051] 其中，平板培养基按照如下步骤进行配制：马铃薯粉6.0g、葡萄糖20.0g、琼脂20.0g溶于1L去离子水中，121℃高压灭菌30min。发酵培养基按照以下步骤进行配制：将葡萄糖20g、酵母浸出粉5g、大豆蛋白胨10g、海盐30g溶于1l去离子水中，用1M HCl或1M NaOH调节pH至7.5，121℃高压灭菌30min。
[0052] 采用1000ml的锥形瓶进行发酵，每瓶发酵400ml，总共发酵25瓶，发酵量为10L。
[0053] 二、二甲基黄青霉素的分离：
[0054] S1、菌体提取：通过抽滤的方式，将发酵所得产物进行分离，得到菌体和发酵液；
[0055] S2、丙酮萃取：用1500ml丙酮将S1得到的菌体浸泡超声30min后静置，待菌体沉降后用纱布过滤得到丙酮萃取液，将丙酮萃取液在45℃下旋转蒸干获得丙酮萃取粗膏，然后用甲醇复溶转移；重复上述浸泡过滤蒸干步骤3次，合并三次所得的萃取物，蒸干，得到菌体粗提物10g；
[0056] S3、层析分离：将菌体粗提物溶解于甲醇中，按照菌体粗提物质量：大孔吸附树脂质量＝10:1的比例进行搅拌上样，然后将搅拌好的样品放置于通风橱自然挥干，得到洗脱样品。然后用铁架台将层析柱竖直固定，将洗脱样品也就是已经上样的大孔吸附树脂缓慢装入玻璃层析柱(直径＝10cm，长度＝100cm)中，用洗耳球轻轻敲打层析柱外壁，从而使得大孔吸附树脂沉降均匀、密实；然后选择水、50％甲醇溶液、甲醇、丙酮作为洗脱剂，进行连续洗脱，分别收集洗脱液，每个体积洗脱1000ml；将回收回来的每一个组分用旋转蒸发仪进行减压浓缩(温度为40℃)。所得样品按照水、50％甲醇溶液、甲醇3个洗脱剂，分别命名为H-1、H-2、H-3。
[0057] S4、反向HPLC分离纯化：将组分H-3减压浓缩蒸干，用甲醇复溶之后，进行HPLC分离(柱子：YMC-Pack ODS-A)，100％乙腈洗脱，流速为4ml/min，洗脱时间为20min，紫外检测器检测波长为210nm，于5.0min时收集液相峰得到H-3馏分，最终获得产物41.2mg。
[0058] 三、H-3结构鉴定：
[0059] 化合物的1H NMR和13C NMR数据见表1。化合物H-3为黄色针状晶体，ESI-MS给出分子准离子峰m/z 317.1[M+H+]。13C NMR谱上呈现8个C信号，其中包含一个低场区信号δC173.4，三个芳香碳信号δC129.9、δC131.9、δC114.6，一个连氧芳碳信号δC161.2，以及一个连氧脂肪碳信号δC55.5。1H NMR谱中显示4个质子信号δH6.98(2H,s)、δH6.98(4H,d,8.4Hz)、7.76(4H,d,8.4Hz)、3.85(6H,s)经过文献查询与比对相关数据与二甲基黄青霉素一致[1]，鉴定该结构为二甲基黄青霉素(xanthocillin X dimethylether)。
[0060] 表1化合物H3的(DMSO-d6)1H NMR(400Hz)和13C NMR(300Hz)数据表
[0061]
[0062]
[0063] 化合物的结构如下：
[0064]
[0065] 四、抗植物致病真菌活性测定
[0066] 本实施例所使用的植物致病真菌为玉米小斑致病菌以及番茄早疫病菌，所使用的病菌菌株均为实验室已有菌株。活性测定实验步骤如下：
[0067] S1、植物致病真菌的培养：在超净工作台中，将冷藏保种的植物致病真菌菌株活化至平板培养基上。28℃静置培养，注意观察真菌的生长情况。待新长出来的真菌菌圈扩大至整个平板，方可进行下一步活性筛选实验；
[0068] S2、配置检测培养基：称取即用型培养基24g溶于1L去离子水中，在121℃下高压灭菌30min制备成PDB培养基，灭菌完成后放在通风阴凉位置冷却备用；将待测活性的样品用二甲基亚砜(DMSO)配制成100mg/ml的溶液。在超净台中，取无菌的24孔板，往板里的每个孔中加入1mlPDB培养基，然后在孔内分别加入待测活性的样品与DMSO配制形成的溶液1ul，即样品终浓度100μg/ml，并设立阳性对照组(加酮康唑)和空白对照组(不加样品)。同时倍量稀释样品后测定不同浓度(50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml)的样品活性；
[0069] S3、判断待测活性的样品是否具有抑制植物致病真菌生长的活性：使用直径为5mm的核磁管戳穿生长情况良好的植物致病真菌，获得菌柄，取真菌圈最外层活力较高的真菌，用接种环将真菌菌柄转移至24孔板内，培养48h，观察菌丝的生长情况(真菌圈的大小变化，菌丝长度变化)。菌丝生长情况见表2。
[0070] 活性强度判断原则：以菌柄培养后形成的真菌圈直径大小与空白组直径大小之差(△d)作为依据，△d>3mm视为具有强抑制植物致病真菌生长的活性(+++)，1mm<△d<3mm视为具有中等抑制植物致病真菌生长的活性(++)，△d<1mm视为具有弱或者无抑制植物致病真菌生长的活性(-)。
[0071] 表2.各组菌丝生长情况
[0072]
[0073]
[0074] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
[0075] 参考文献：
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[0078] [3]Sakai R,et al.Xanthocillin as thrombopoietin mimetic small molecules.Bioorg Med Chem 2005(13):6388-6395.
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