鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽及其应用
阅读：641发布：2020-05-08
专利汇可以提供鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于鲍曼不动杆菌Omp22的应用；具体涉及鲍曼不动杆菌Omp22重组多 抗原 表位多肽及其应用；以A.b高度保守、较强免疫原性的Omp22蛋白为目的抗原，通过 生物 信息学及免疫学方法筛选Omp22蛋白的优势B细胞表位和T细胞表位，通过6- 氨 基己酸将各优势抗原表位多肽进行 串联 ，化学合成重组多抗原表位多肽rOmp22，既保留A.b Omp22蛋白的免疫原性，又避免原结构蛋白的毒 力 作用，研制一种安全有效的抗A.b菌感染的新型 疫苗 ，为减少A.b在医院的感染与流行提供一个新的工具。动物实验表明，该重组疫苗能诱导 机体 产生显著的细胞免疫和体液免疫反应，对鲍曼不动杆菌感染有免疫保护效应，且安全性高，使用方便。，下面是鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽及其应用专利的具体信息内容。
1.鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽，其特征在于包括3个B细胞表位和2个优势T细胞表位，各表位肽段的氨基酸序列分别为：
A.bOmp22 158-172：NIPLSQARAQSVKNY；
A.bOmp22 125-135：YATLDKVAQTL；
A.bOmp22 102-108：SVQLIMP；
A.bOmp22 178-188：VPSSRIDAQGY；
A.bOmp22 112-122：TFDTNKSNIKP。
2.根据权利要求1所述的鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽，其特征在于：所述表位肽段的氨基酸通过linker进行任意组合连接；其中linker的氨基酸包括： -（AHX）n-，-（Beta-Ala）n-，-（Gly）n-，-（GABA）n-，-（Ava）n-，其中n大于等于1。
3.根据权利要求1或2所述的鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽，其特征在于：其氨基酸序列为：
NIPLSQARAQSVKNY{AHX}YATLDKVAQTL{AHX}SVQLIMP{AHX}VPSSRIDAQGY{AHX}TFDTNKSNIKP。
4.根据权利要求1或2所述的鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建重组质粒pET28a-omp22，将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21，经诱导表达、纯化步骤获得Omp22蛋白，通过SDS-PAGE检测Omp22蛋白在原核细胞中的表达;
（2）设定Omp22蛋白免疫组、PBS对照组，皮下注射免疫雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，收集小鼠血清，ELISA法检测蛋白抗原特异性抗体水平；候选B细胞表位包被酶标板，ELISA方法检测小鼠血清中针对该抗原表位的IgG水平，根据OD值筛选出3条优势的B细胞表位，所筛选的B细胞表位亲水性强，表面可及性强，抗原指数高；
三条B细胞表位多肽的氨基酸序列分别为：
A.bOmp22 158-172：NIPLSQARAQSVKNY；
A.bOmp22 125-135：YATLDKVAQTL；
A.bOmp22 102-108：SVQLIMP；
（4）收集小鼠脾脏，分离脾细胞置于24孔板中培养，20ug/ml的候选T细胞表位刺激脾细胞，培养至72h收集细胞上清，ELISA法检测IFN-γ水平；根据T细胞表位刺激脾细胞产生IFN-γ的水平筛选出2条优势T细胞表位；
两条T细胞表位的氨基酸序列分别为：
A.bOmp22 178-188：VPSSRIDAQGY；
A.bOmp22 112-122：TFDTNKSNIKP。
5.根据权利要求1或2所述的多肽在制备A.b亚单位疫苗中的应用。
6.根据权利要求1或2所述的多肽在制备治疗性A.b抗体中的应用。
鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于鲍曼不动杆菌外膜蛋白Omp22的应用，具体涉及一种对鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，A.b)感染具有免疫保护效应的A.bOmp22重组多抗原表位多肽及应用。
背景技术
[0002] 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，A.b)为非发酵革兰阴性杆菌，属于条件致病菌，在医院环境中分布广泛并可长期存活，可导致呼吸系统、消化系统、泌尿系统及中枢系统感染甚至血流感染，发病率、致死率及耐药率在革兰阴性杆菌感染中居于前列。A.b的耐药机制复杂，包括多种灭活酶的生成、细胞外膜蛋白的丢失、主动外排系统的表达、药物靶位的变异、生物被膜的耐药屏蔽等，甚至其耐药基因盒可容纳多种耐药基因移动元件致多种耐药机制共存，使得A.b耐药成为临床难题，有时甚至面临“无药可治”。虽然近二十余年来有关A.b耐药性的分子流行病学及防治研究在全球范围内广泛开展，但迄今尚未取得突破性进展。因此，从免疫保护角度对A.b感染进行防治研究，已成为近年来更多研究者关注的方向。
[0003] 近年来，不少学者对A.b被动免疫进行了有益的探索，他们研制的小蛋白A抗血清、磷脂酶D抗血清、22-kDa外膜蛋白抗血清及外膜核酸酶抗血清，虽然对A.b感染小鼠有一定的保护作用，但其中的非抗体物质极易引起过敏、腹泻等并发症，且被动免疫方法不具备主动预防作用，不能有效减少发病率。因此，研制一种高效安全的A.b疫苗就显得很有意义，而免疫原性及安全性是疫苗研制的两个关键问题。McConne II等制备的A.b全菌疫苗虽具有较强的免疫原性，但目前以甲醛灭活为主的制备A.b全菌疫苗的方法不能保证将A.b菌完全灭活，而这些复活的A.b菌接种后既可引起新的耐药，亦可导致血流感染，存在极大的安全隐患。A.b菌的外膜是其与宿主作用的重要部位，尽管含有丰富的抗原表位，但其中仅有少数抗原能对保护性免疫应答发挥作用，而且用全菌提取粗制外膜蛋白制备疫苗工艺复杂、产品纯度极低，不适宜于大量生产，因而单纯利用细菌外膜制备A.b疫苗的方法不可取。Fattahian等则选择A.b的细菌生物被膜形成过程发挥重要作用的抗原蛋白——生物被膜相关蛋白，制备重组蛋白疫苗，虽然显示出一定的保护作用，但因其抗原比较单一，免疫保护效应极低，常需加佐剂增强免疫，且覆盖菌株面较窄，故不宜应用于临床。因而，确定既具备高效免疫原性又避免结构蛋白毒力作用的抗原是制备A.b疫苗的关键。
[0004] Omp22为A.b外膜囊泡中分泌的一种高度保守的蛋白，在A.b致病过程中发挥重要作用，同时Omp22具有高效的免疫原性。Weiwei Huang等研究显示，纯化的重组Omp22蛋白能够诱导小鼠产生特异性抗体，对致死量鲍曼不动杆菌攻击小鼠具有一定的保护效应，提示Omp22可作为A.b菌相对理想的抗原蛋白。不少研究者认为，理想的A.b疫苗抗原应该能普遍表达于各种菌株的细胞外膜并参与细菌的黏附定植，其编码序列保守、蛋白结构稳定，重组诱导后不破坏抗原性且可溶性高。A.b的Omp22蛋白广泛表达于目前临床所有A.b分离菌株，具有高度同源性和保守性，是制备A.b疫苗理想的候选抗原蛋白。Omp22既是参与A.b代谢过程的关键蛋白，又具有一定的毒性，若单独以全长蛋白作为疫苗抗原免疫宿主将会存在一定的危害性。因此，针对Omp22蛋白的抗原表位研制亚单位疫苗（即保留抗原的表位，删除致病片段），既能保留其相应免疫原性，又能避免其对宿主的有害性，应该成为抗A.b感染的优先策略。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽的合成方法，解决目前在研A.b疫苗的不足，构建一种安全有效的A.b亚单位疫苗。
[0006] 本发明构建的鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽包括3条B细胞表位及2条T细胞表位，具体序列如下：A.b Omp22 158-172：NIPLSQARAQSVKNY；
A.b Omp22 125-135：YATLDKVAQTL；
A.b Omp22 102-108：SVQLIMP；
A.b Omp22 178-188：VPSSRIDAQGY；
A.b Omp22 112-122：TFDTNKSNIKP；
上述表位氨基酸的核苷酸序列分别为：
A.b Omp22 158-172：aacattccgc tgagtcaagc acgcgcacaa agcgttaaaa actat；
A.b Omp22 125-135：tacgcgaccc tggataaagt tgcgcaaacc ctg；
A.b Omp22 102-108：tctgttcagc tgattatgcc g；
A.b Omp22 178-188：gttccgagta gtcgtattga cgcacaaggt tac；
A.b Omp22 112-122：accttcgaca ccaacaaaag caacatcaaa ccg。
A.b Omp22 125-135：YATLDKVAQTL；
A.b Omp22 102-108：SVQLIMP；
A.b Omp22 178-188：VPSSRIDAQGY；
A.b Omp22 112-122：TFDTNKSNIKP；
上述表位氨基酸的核苷酸序列分别为：
A.b Omp22 158-172：aacattccgc tgagtcaagc acgcgcacaa agcgttaaaa actat；
A.b Omp22 125-135：tacgcgaccc tggataaagt tgcgcaaacc ctg；
A.b Omp22 102-108：tctgttcagc tgattatgcc g；
A.b Omp22 178-188：gttccgagta gtcgtattga cgcacaaggt tac；
A.b Omp22 112-122：accttcgaca ccaacaaaag caacatcaaa ccg。
[0007] 上述表位氨基酸序列可以通过linker进行任意组合连接，其组合顺序不影响免疫反应。常用作Linker的氨基酸包括：{AHX}芴甲氧羰酰基-6-氨基己酸，{Beta-Ala} β-丙氨酸,{Gly} 甘氨酸, {GABA} γ-氨基丁酸, {Ava} 5-氨基戊酸。所述的linker可以为单个氨基酸连接，也可以为重复氨基酸序列连接。如-（AHX）n-，-（Beta-Ala）n-，-（Gly）n-，-（GABA）n-，-（Ava）n-，其中n大于等于1。事实上只要是具有连接功能，序列无抗原反应的序列，不影响A.b Omp22重组多抗原表位，都可以作为linker。其中， {AHX} 6-氨基己酸用的最多，且效果也是最好的，被优先推荐使用。
[0008] 优选为：上述各抗原表位多肽通过6-氨基己酸进行串联，其氨基酸序列为：NIPLSQARAQSVKNYXYATLDKVAQTLXSVQLIMPXVPSSRIDAQGYXTFDTNKSNIKP，其中X为{AHX}。
[0009] 所述的鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽在制备A.b亚单位疫苗中的应用。
[0010] 鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽在制备治疗性A.b抗体中的应用。
[0011] 鲍曼不动杆菌Omp22重组多抗原表位多肽及各表位多肽的合成使用化学法固相合成，多肽的纯度高、易获取，且不含细菌毒力蛋白或毒力结构的氨基酸序列，避免潜在细菌感染危险。
[0012] 将筛选出的A.b Omp22的优势抗原表位多肽之间通过6-氨基己酸进行连接，可保持重组多抗原表位多肽rOmp22的线性结构，避免表位多肽折叠、无法暴露抗原位点。
[0013] 多抗原表位多肽rOmp22联合弗氏佐剂及佐剂对照组分别免疫雌性BALB/c小鼠，共免疫三次，末次免疫后气管灌注A.b标准菌株ATCC19606，rOmp22组小鼠存活率高于佐剂组，且肺组织炎症程度及细菌载量低于佐剂对照组，重组多抗原表位多肽rOmp22显示出针对A.b感染的免疫保护效应。
[0014] 本发明的构思：以A.b高度保守、较强免疫原性的Omp22蛋白为目的抗原，筛选Omp22蛋白的优势B细胞表位和T细胞表位，通过6-氨基己酸将各优势抗原表位多肽进行串联，化学合成重组多抗原表位多肽rOmp22，既保留A.b Omp22蛋白的免疫原性，又避免结构蛋白的毒力作用，研制一种安全有效的抗A.b菌感染的新型疫苗，为减少A.b在医院的感染与流行提供一个新的方法与工具。
[0015] 有益效果与已有的技术相比，本发明的优势在于：构建了一种A.b新型多抗原表位多肽，既保留A.b Omp22蛋白的抗原性，又避免了其对宿主的毒性作用，构建一种安全有效的A.b亚单位疫苗，为减少A.b在医院的感染与流行提供一个新的方法与工具。
附图说明
附图说明
[0017] 图1显示了重组表达载体pET28a-omp22用BamHI+ EcoRI酶切后的电泳结果，其中泳道M为DNA Marker, 泳道1为未酶切对照，泳道2为质粒酶切图；图2为A.bOmp22蛋白纯化条带；M泳道为蛋白Marker, 泳道1为1ug纯化后的Omp22蛋白，泳道2为2ug纯化后的Omp22蛋白。
[0018] 图3为A.bOmp22 蛋白优势B细胞表位及T细胞表位筛选结果。图3A示，Omp22蛋白B细胞表位肽段与Omp22免疫小鼠血清间接ELISA结果，Omp22蛋白的优势B细胞表位Omp22 B2:NIPLSQARAQSVKNY, Omp22 B3: YATLDKVAQTL, Omp22 B4: SVQLIMP。图3B示，Omp22蛋白T细胞表位刺激小鼠脾脏细胞，培养上清中IFN-γ含量。筛选出的优势T细胞表位Omp22 T1: TFDTNKSNIKP, Omp22 T3: VPSSRIDAQGY。
[0019] 图4为重组多抗原表位多肽rOmp22质谱分析图。
[0020] 图5为重组多抗原表位多肽rOmp22液相色谱图。
[0021] 图6为rOmp22特异性IgG表达水平。
[0022] 图7为rOmp22免疫组及对照组小鼠脾细胞上清IFN-r表达水平。
[0023] 图8为气管灌注A.b标准株ATCC19606一周内，免疫组与对照组小鼠存活率、体重变化、临床评分、肺组织细菌载量。图A示，各组小鼠的存活率，rOmp22 40ug免疫组小鼠存活率为100%，生理盐水对照组组及弗氏佐剂对照组小鼠存活率均为50%。图B示，小鼠体重变化，各组小鼠气管灌注攻毒后48小时体重降至最低，生理盐水对照组小鼠体重下降最明显，rOmp22 40ug免疫组小鼠体重下降最少，4-6天后恢复至攻毒前体重。图C示，临床症状评分，气管灌注后24小时内各组小鼠临床症状最重，生理盐水对照组评分最差，出现死亡及濒临死亡现象；rOmp22 40ug免疫组小鼠症状较轻，仅部分小鼠出现动作缓慢、毛发褶皱表现，6-7天后各组存活的小鼠活动恢复正常。图D示，肺组织匀浆细菌载量，气管灌注后24h, rOmp22免疫组小鼠肺组织匀浆细菌载量最低，明显低于生理盐水组及佐剂对照组。
[0024] 图9为气管灌注A.b标准株ATCC19606 24h后免疫组与对照组小鼠肺组织HE染色病理炎症程度分析。A图为生理盐水对照组小鼠肺组织，可以看到肺组织有大面积实变、气管塌陷、大量炎症细胞浸润；B图为弗氏佐剂对照组小鼠肺组织，可见大量炎症细胞浸润，肺组织部分实变，气管结构改变；C图为rOmp22 10ug免疫组小鼠肺组织，可见气管结构塌陷、纤毛倒伏，炎症细胞浸润；D图为rOmp22 40ug免疫组小鼠肺组织，炎症程度较轻，大部分为正常肺组织结构；E图为正常小鼠肺组织；F图为各组小鼠肺组织炎症面积半定量分析结果。
[0025] 图10为气管灌注A.b标准株ATCC19606一周内，重组抗原表位多肽rOmp22免疫组与Omp22全长蛋白免疫组小鼠存活率、体重变化、临床评分、肺组织细菌载量。图A示，各组小鼠的存活率无统计学差异。Omp22蛋白滴鼻免疫组、皮下注射免疫组及重组多抗原表位多肽rOmp22滴鼻免疫组各死亡一只小鼠，rOmp22皮下注射免疫组无小鼠死亡。图B示，小鼠体重变化，各组小鼠气管灌注攻毒后48小时体重降至最低，各组小鼠体重下降无统计学差异。图C示，临床症状评分无统计学差异，气管灌注后24小时内各组小鼠临床症状最重，个别小鼠出现死亡和濒死状态，仅部分小鼠出现动作缓慢、毛发褶皱表现，6-7天后各组存活的小鼠活动恢复正常。图D示，肺组织匀浆细菌载量，气管灌注后24h, 各组小鼠肺组织匀浆细菌载量无统计学差异。
[0026] 图11为气管灌注A.b标准株ATCC19606 24h后重组抗原表位多肽rOmp22免疫组与Omp22全长蛋白免疫组小鼠肺组织HE染色病理炎症程度分析。A、B图分别为重组多抗原表位多肽rOmp22滴鼻免疫组、皮下注射免疫组小鼠肺组织HE染色病理；C、D图分别为Omp22全长蛋白滴鼻免疫组和皮下注射免疫组小鼠肺组织HE染色病理；E图为各组小鼠肺组织炎症面积半定量分析结果，各组小鼠病理炎症程度无统计学差异。
[0027] 图12为CCK-8法检测重组多抗原表位多肽rOmp22对人肺腺癌细胞A549的细胞毒性。由图所示，不同浓度的rOmp22与A549细胞共培养6h、24h及48h，对细胞增殖均无显著影响，说明重组多抗原表位多肽在体外无毒性作用。
[0028] 图13为pET28a-omp22测序结果，A为测序报告第一页，B为测序报告第二页。
具体实施方式
[0030] 实施例1A.bOmp22蛋白B细胞抗原表位和T细胞抗原表位的多肽序列的构建和筛选，化学合成重组多抗原表位多肽rOmp22。具体步骤如下：
鲍曼不动杆菌Omp22蛋白的4条B细胞表位和4条T细胞表位，其氨基酸序列分别为：
A.bOmp22 175-182：GKGVPSSR；
A.bOmp22 158-172：NIPLSQARAQSVKNY；
A.bOmp22 125-135：YATLDKVAQTL；
A.bOmp22 102-108：SVQLIMP；
A.bOmp22 112-122：TFDTNKSNIKP；
A.bOmp22 153-164：GNDSINIPLSQ；
A.bOmp22 178-188：VPSSRIDAQGY；
A.bOmp22 204-215：EQNRRVEISIY。
鲍曼不动杆菌Omp22蛋白的4条B细胞表位和4条T细胞表位，其氨基酸序列分别为：
A.bOmp22 175-182：GKGVPSSR；
A.bOmp22 158-172：NIPLSQARAQSVKNY；
A.bOmp22 125-135：YATLDKVAQTL；
A.bOmp22 102-108：SVQLIMP；
A.bOmp22 112-122：TFDTNKSNIKP；
A.bOmp22 153-164：GNDSINIPLSQ；
A.bOmp22 178-188：VPSSRIDAQGY；
A.bOmp22 204-215：EQNRRVEISIY。
[0031] 委托南京金斯瑞生物科技有限公司化学合成，纯度85%以上，并在每条表位短肽的C端耦合BSA分子；A、构建重组质粒pET28a-omp22，将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21，经诱导表达、纯化等步骤获得Omp22蛋白，通过SDS-PAGE检测Omp22蛋白在原核细胞中的表达，结果见图1，图
2；其中所述的重组质粒pET28a-omp22的序列见图13。
2；其中所述的重组质粒pET28a-omp22的序列见图13。
[0032] B、Omp22蛋白免疫小鼠，具体步骤如下：将6-8周SPF级雌性BALB/c小鼠分为Omp22蛋白免疫组、PBS对照组，每组6只。100ug/只Omp22蛋白溶液与等体积的弗氏佐剂充分乳化，总体积200ul，消毒小鼠背部及大腿股四头肌，进行多点皮下注射免疫，初次免疫使用弗氏完全佐剂，后两次免疫使用弗氏不完全佐剂，两周一次，共免疫3次。末次免疫后一周，收集小鼠血清，分离脾脏。
[0033] C、间接ELISA法筛选Omp22蛋白B细胞表位，具体步骤如下：Omp22的4条候选B细胞表位肽段包被ELISA酶标板，用量为20ug+100ul包被缓冲液，阴性对照组每孔使用等体积PBS溶液，BSA对照组每孔使用等体积1%BSA溶液，每组均设3个复孔，4℃包被过夜。倒扣出孔内液体，洗板5次。分别加入Omp22蛋白免疫小鼠血清100ul（1:500稀释，用PBS稀释），37℃孵育2h，洗板5次。加入新鲜稀释的酶标二抗（HRP标记的山羊抗小鼠IgG 1:10000稀释）100ul/孔，室温孵育1h，洗板5次。加入TMB底物，100ul/孔，室温避光显色20mins。加入50ul/孔10% H2SO4终止液，于OD450处读取数值。根据OD值筛选出3条优势的B细胞表位，所筛选的B细胞表位亲水性强，表面可及性强，抗原指数高，见图3A；三条B细胞表位多肽的氨基酸序列分别为：
A.bOmp22 158-172：NIPLSQARAQSVKNY；
A.bOmp22 125-135：YATLDKVAQTL；
A.bOmp22 102-108：SVQLIMP；
D、双夹心ELISA法筛选Omp22蛋白T细胞表位，具体步骤如下：收集小鼠脾脏，分离脾细胞置于24孔板中培养，每孔1×106个细胞，总体积1ml。20ug/ml的候选T细胞表位刺激脾细胞，培养至72h收集细胞上清，ELISA法检测IFN-γ水平，步骤如下：按照设定的标准品和收集的细胞上清，依次加入100ul/孔，每组设三个复孔，室温孵育2h，洗板5次，拍干。加入预先稀释的生物素标记抗体工作液100ul/孔，室温孵育1h，洗板5次，拍干。加入HRP酶标结合物工作液100ul/孔，避光室温孵育20min, 洗板5次，拍干。加入TMB显色剂100ul/孔，避光室温孵育20min。加入终止液50ul/孔，于OD450nm处读取数据。根据T细胞表位刺激脾细胞产生IFN-γ的水平筛选出2条优势T细胞表位，见图3B；
两条T细胞表位的氨基酸序列分别为：
A.bOmp22 178-188：VPSSRIDAQGY；
A.bOmp22 112-122：TFDTNKSNIKP。
A.bOmp22 158-172：NIPLSQARAQSVKNY；
A.bOmp22 125-135：YATLDKVAQTL；
A.bOmp22 102-108：SVQLIMP；
D、双夹心ELISA法筛选Omp22蛋白T细胞表位，具体步骤如下：收集小鼠脾脏，分离脾细胞置于24孔板中培养，每孔1×106个细胞，总体积1ml。20ug/ml的候选T细胞表位刺激脾细胞，培养至72h收集细胞上清，ELISA法检测IFN-γ水平，步骤如下：按照设定的标准品和收集的细胞上清，依次加入100ul/孔，每组设三个复孔，室温孵育2h，洗板5次，拍干。加入预先稀释的生物素标记抗体工作液100ul/孔，室温孵育1h，洗板5次，拍干。加入HRP酶标结合物工作液100ul/孔，避光室温孵育20min, 洗板5次，拍干。加入TMB显色剂100ul/孔，避光室温孵育20min。加入终止液50ul/孔，于OD450nm处读取数据。根据T细胞表位刺激脾细胞产生IFN-γ的水平筛选出2条优势T细胞表位，见图3B；
两条T细胞表位的氨基酸序列分别为：
A.bOmp22 178-188：VPSSRIDAQGY；
A.bOmp22 112-122：TFDTNKSNIKP。
[0034] E、将筛选出的优势B细胞表位和T细胞表位通过6-氨基己酸进行串联，制备Omp22重组多抗原表位多肽rOmp22，见图4和图5，其氨基酸序列为：NIPLSQARAQSVKNY{AHX}YATLDKVAQTL{AHX}SVQLIMP{AHX}VPSSRIDAQGY{AHX}
TFDTNKSNIKP
实施例2
重组多抗原表位多肽rOmp22免疫效应检测，具体实施步骤如下：
6-8周雌性BALB/c小鼠随机分成4组，每组6只，分别为重组多抗原表位多肽rOmp22高剂量组 （40ug/只），rOmp22低剂量组 （10ug/只）, 与弗氏佐剂1:1混合充分乳化，另设生理盐水+佐剂组及生理盐水对照组，总体积200ul，皮下注射进行免疫，初次免疫使用弗氏完全佐剂，后两次免疫使用弗氏不完全佐剂，两周一次，共免疫三次。末次免疫后一周，收集小鼠血清，分离脾脏。
TFDTNKSNIKP
实施例2
重组多抗原表位多肽rOmp22免疫效应检测，具体实施步骤如下：
6-8周雌性BALB/c小鼠随机分成4组，每组6只，分别为重组多抗原表位多肽rOmp22高剂量组 （40ug/只），rOmp22低剂量组 （10ug/只）, 与弗氏佐剂1:1混合充分乳化，另设生理盐水+佐剂组及生理盐水对照组，总体积200ul，皮下注射进行免疫，初次免疫使用弗氏完全佐剂，后两次免疫使用弗氏不完全佐剂，两周一次，共免疫三次。末次免疫后一周，收集小鼠血清，分离脾脏。
[0035] ELISA法检测小鼠血清中rOmp22特异性IgG表达水平，步骤如下：重组多抗原表位多肽rOmp22 20ug+100ul包被缓冲液包被ELISA酶标板，4℃包被过夜。倒扣出孔内液体，洗板5次。分别加入rOmp22高剂量组、rOmp22低剂量组免疫小鼠新鲜稀释的血清100ul（1:500稀释，用PBS稀释），对照组加入生理盐水免疫组及生理盐水+佐剂免疫组小鼠新鲜稀释的血清100ul，每只小鼠血清设5个复孔，37℃孵育2h，洗板5次。加入新鲜稀释的酶标二抗（HRP标记的山羊抗小鼠IgG 1:10000稀释）100ul/孔，室温孵育1h，洗板5次。加入TMB底物，100ul/孔，室温避光显色20mins。加入50ul/孔10% H2SO4终止液，于OD450处读取数值，结果见图6, 重组多抗原表位多肽rOmp22与血清中抗体结合，进而通过二抗（HRP标记的山羊抗小鼠IgG）显色，说明重组多抗原表位多肽rOmp22与免疫后小鼠血清存在抗原抗体反应，rOmp22免疫小鼠后可以诱导机体产生体液免疫反应，产生rOmp22特异性抗体IgG。
[0036] ELISA法检测rOmp22免疫组及对照组小鼠脾细胞上清中IFN-γ表达水平：收集小鼠脾脏，分离脾细胞置于24孔板中培养，每孔1×106个细胞，总体积1ml。20ug/ml的重组多抗原表位多肽rOmp22刺激脾细胞，培养至72h收集细胞上清，ELISA法检测IFN-γ水平，步骤如下：按照设定的标准品和收集的细胞上清，依次加入100ul/孔，每组设五个复孔，室温孵育2h，洗板5次，拍干。加入预先稀释的生物素标记抗体工作液100ul/孔，室温孵育1h，洗板5次，拍干。加入HRP酶标结合物工作液100ul/孔，避光室温孵育20min, 洗板5次，拍干。加入TMB显色剂100ul/孔，避光室温孵育20min。加入终止液50ul/孔，于OD450nm处读取数据。根据标准品及OD450值绘制标准曲线，计算各组小鼠脾细胞上清IFN-r表达水平，结果见图7，重组多抗原表位多肽rOmp22免疫组小鼠脾细胞上清中分泌的IFN-r水平明显高于对照组，且rOmp22高剂量免疫组小鼠脾细胞上清中IFN-r水平更高，结果表明rOmp22免疫小鼠，可以诱导机体产生细胞免疫反应，促进Th1型细胞因子IFN-r的分泌。
[0037] 实施例3重组多抗原表位多肽rOmp22对A.b所致小鼠肺炎有免疫保护效应，具体实施步骤如下：
6-8周雌性BALB/c小鼠随机分成4组（每组10只），分别为重组多抗原表位多肽rOmp22高剂量组 （40ug/只），rOmp22低剂量组 （10ug/只）, 与弗氏佐剂1:1混合充分乳化，另设生理盐水+佐剂组及生理盐水对照组，总体积200ul，皮下注射进行免疫，初次免疫使用弗氏完全佐剂，后两次免疫使用弗氏不完全佐剂，两周一次，共免疫三次。
6-8周雌性BALB/c小鼠随机分成4组（每组10只），分别为重组多抗原表位多肽rOmp22高剂量组 （40ug/只），rOmp22低剂量组 （10ug/只）, 与弗氏佐剂1:1混合充分乳化，另设生理盐水+佐剂组及生理盐水对照组，总体积200ul，皮下注射进行免疫，初次免疫使用弗氏完全佐剂，后两次免疫使用弗氏不完全佐剂，两周一次，共免疫三次。
[0038] 末次免疫2周后，经气管灌注50ul半数致死量的A.b标准菌株ATCC 19606（1×108CFU，含5%猪黏蛋白），建立小鼠急性肺炎模型。
[0039] 气管灌注后24h, 每组处死4只小鼠，取小鼠右肺组织称重后制备成匀浆，按1:10梯度稀释，取100ul至血平板，涂布均匀，置入37℃细菌培养箱，48小时后进行菌落计数。结果见图8，发现rOmp22高剂量免疫组菌落数较佐剂组及生理盐水对照组明显降低。
[0041] 观察气管灌注后1周内，每天观察各组小鼠临床症状、体重变化及存活率；结果见图10，rOmp22高剂量组小鼠仅有轻微临床症状，未出现死亡，体重下降最少，表明高剂量的重组多抗原表位多肽rOmp22对A.b标准株ATCC19606所致小鼠肺炎有免疫保护效应。
[0042] 实施例4重组多抗原多肽rOmp22与Omp22全长蛋白对A.b所致小鼠肺炎免疫保护效应比较。具体实施步骤如下：
6-8周雌性BALB/c小鼠随机分成4组（每组10只），分别为重组多抗原表位多肽rOmp22鼻粘膜免疫组, rOmp22皮下注射免疫组，重组Omp22全长蛋白鼻粘膜免疫组及Omp22全长蛋白皮下注射免疫组。免疫剂量为每只小鼠经鼻粘膜滴入或皮下注射rOmp22多肽或Omp22全长蛋白20ug, 用生理盐水溶解，与弗氏佐剂1:1混合充分乳化，鼻粘膜给药组总体积为20ul/只，皮下注射免疫组总体积为200ul/只。初次免疫使用弗氏完全佐剂，后两次免疫使用弗氏不完全佐剂，两周一次，共免疫三次。
6-8周雌性BALB/c小鼠随机分成4组（每组10只），分别为重组多抗原表位多肽rOmp22鼻粘膜免疫组, rOmp22皮下注射免疫组，重组Omp22全长蛋白鼻粘膜免疫组及Omp22全长蛋白皮下注射免疫组。免疫剂量为每只小鼠经鼻粘膜滴入或皮下注射rOmp22多肽或Omp22全长蛋白20ug, 用生理盐水溶解，与弗氏佐剂1:1混合充分乳化，鼻粘膜给药组总体积为20ul/只，皮下注射免疫组总体积为200ul/只。初次免疫使用弗氏完全佐剂，后两次免疫使用弗氏不完全佐剂，两周一次，共免疫三次。
[0043] 末次免疫2周后，经气管灌注50ul半数致死量的A.b标准菌株ATCC 19606（1×108CFU，含5%猪黏蛋白），建立小鼠急性肺炎模型。
[0044] 气管灌注后24h, 每组处死4只小鼠，取小鼠右肺组织称重后制备成匀浆，按1:10梯度稀释，取100ul至血平板，涂布均匀，置入37℃细菌培养箱，48小时后进行菌落计数。结果发现各组小鼠菌落计数无统计学差异。
[0045] 左肺组织切片后4%多聚甲醛进行固定，HE染色，观察组织病理学改变，结果发现各组小鼠肺组织均有轻微实变、炎症细胞浸润现象，半定量分析发现各组小鼠肺组织炎症程度无统计学差异。
[0046] 气管灌注后1周内，每天观察各组小鼠临床症状、体重变化及存活率。结果见图11发现Omp22蛋白滴鼻免疫组、皮下注射免疫组及重组多抗原表位多肽rOmp22滴鼻免疫组在攻毒后一周内各死亡一只小鼠，rOmp22皮下注射免疫组无小鼠死亡，各组小鼠存活率无统计学差异。小鼠气管灌注攻毒后48小时体重降至最低，各组小鼠体重下降无统计学差异。临床症状评分无统计学差异，气管灌注后24小时内各组小鼠临床症状最重，个别小鼠出现死亡和濒死状态，仅部分小鼠出现动作缓慢、毛发褶皱表现，6-7天后各组存活的小鼠活动恢复正常。
[0047] 上述结果表明重组多抗原表位多肽rOmp22与全长蛋白Omp22对鲍曼不动杆菌气管灌注小鼠均有免疫保护效应，且免疫保护效应无统计学差异。发现重组多抗原表位多肽rOmp22滴鼻免疫和皮下注射免疫，与全长蛋白Omp22滴鼻免疫和皮下注射免疫后，小鼠存活率、体重变化、临床症状评分及病理炎症程度均无统计学差异。重组多抗原表位多肽rOmp22对鲍曼不动杆菌ATCC19606所致小鼠急性肺炎的免疫保护效应不劣于Omp22全长蛋白组。
[0048] 实施例5CCK-8方法检测重组多抗原多肽rOmp22对人肺腺癌细胞A549无毒性作用。具体实施步骤如下：
A549细胞培养至对数生长期时，加入不含EDTA的胰酶消化细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加入1640完全培养基1ml重悬细胞，细胞计数。1640完全培养基将细胞稀释至1.0×
106cells/ml，将细胞铺至96孔板，每孔100ul(含1.0×104cells), 设不含细胞的1640完全培养基对照孔，37℃含二氧化碳培养箱中培养过夜。
A549细胞培养至对数生长期时，加入不含EDTA的胰酶消化细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加入1640完全培养基1ml重悬细胞，细胞计数。1640完全培养基将细胞稀释至1.0×
106cells/ml，将细胞铺至96孔板，每孔100ul(含1.0×104cells), 设不含细胞的1640完全培养基对照孔，37℃含二氧化碳培养箱中培养过夜。
[0049] 称取1mg重组多抗原表位多肽rOmp22, 1640完全培养基稀释为800ug/ml，加入1640完全培养基倍比稀释为400ug/ml、200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml，分别取10ul相应浓度的rOmp22溶液刺激A549细胞中，每个浓度设5个复孔。37℃含二氧化碳培养箱中孵育。
[0050] 重组多抗原表位多肽rOmp22与A549细胞共培养6小时、24小时或48小时后，每孔分别加入CCK-8试剂10ul，避光孵育1小时，于OD450nm处读取数据。根据OD450nm计算每孔细胞与对照孔的比例。结果见图12，表明重组多抗原表位多肽rOmp22对A549细胞无毒性。
[0051] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造保护的范围之内。
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