F基因型腮腺炎病毒减毒株及构建方法和应用
阅读：736发布：2020-05-08
专利汇可以提供F基因型腮腺炎病毒减毒株及构建方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种F基因型腮腺炎病毒减毒株及构建方法和应用。具体地，本发明提供了一种F基因型腮腺炎病毒减毒株，所述减毒株是保藏号为CCTCC NO:V201950的腮腺炎病毒QS-F-SH2。本发明还提供了包含所述F基因型腮腺炎病毒减毒株作为活性成分的 疫苗 组合物及其制备方法。本发明的腮腺炎病毒减毒疫苗株能够更加匹配中国地区优势流行的F型腮腺炎病毒，且与当前的疫苗株在生长特性、免疫原性和神经毒 力 等方面的 水 平相当。此外，本发明筛选出的腮腺炎病毒基因工程弱毒株能够在鸡胚细胞中稳定生产，安全性高。，下面是F基因型腮腺炎病毒减毒株及构建方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种F基因型腮腺炎病毒减毒株，其特征在于，所述减毒株是保藏号为CCTCC NO:
V201950的腮腺炎病毒QS-F-SH2。
2.如权利要求1所述的F基因型腮腺炎病毒减毒株，其特征在于，所述F基因型腮腺炎病毒减毒株的基因组中含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
3.一种衍生自如权利要求1所述的F基因型腮腺炎减毒疫苗株的衍生病毒株，其特征在于，具有以下一个或多个特性：
(a)适于在鸡胚原代培养细胞中传代，其稳定传代数≥10，较佳地，其稳定传代数≥15，更佳地，其稳定传代数≥30；
(b)低毒力：毒力指数与保藏号为CCTCC NO:V201950的腮腺炎病毒QS-F-SH2的毒力指数相当；其中，所述毒力指数相当是指其毒力指数为保藏号为CCTCC NO:V201950的腮腺炎病毒QS-F-SH2的≤150％，较佳地≤120％，更佳地≤100％；其中，毒力指数是引起脑积水的程度；
(c)相比于野生型F基因型腮腺炎病毒，基因组不包含SH基因。
4.如权利要求3所述的衍生病毒株，其特征在于，所述衍生病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：
(i)对应于F基因型腮腺炎病毒的野生型基因组中的如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的SH基因被替换为如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和
(ii)与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％，较佳地≥90％，更佳地≥
95％。
5.一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包括：
(i)如权利要求1所述的F基因型腮腺炎病毒减毒株或如权利要求3所述的衍生病毒株；
和
(ii)疫苗上可接受的载体。
6.如权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物每剂量中病毒至少
3.7lgCCID50。
7.如权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物为注射剂型。
8.一种制备F基因型腮腺炎病毒减毒株的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)构建缺失且仅缺失SH基因的F基因型腮腺炎病毒的全长重组质粒；
(ii)获得分别包含腮腺炎病毒中的N基因、P基因和L基因的三种辅助质粒；和(iii)分别将(i)中所获得的全长重组质粒与所述三种辅助质粒共转染宿主细胞，培养
3d后，将细胞进行裂解，接种至新的细胞进行培养，待能观察到细胞病变，即获得所述F基因型腮腺炎病毒减毒株。
9.一种如权利要求1所述的F基因型腮腺炎病毒减毒株或如权利要求3所述的衍生病毒株的用途，其特征在于，用于制备一疫苗组合物，所述疫苗组合物用于预防腮腺炎。
10.一种制备疫苗组合物的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)对保藏号为CCTCC NO:V201950的腮腺炎病毒QS-F-SH2进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；
(ii)将步骤(i)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。
F基因型腮腺炎病毒减毒株及构建方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 流腮是由腮腺炎病毒引起的一种急性传染病，在20世纪中叶以前，是严重危害儿童和青少年健康的传染病之一。腮腺炎的临床症状以腮腺肿痛为主，常继发脑炎和生殖系统炎症等，重症患者可能死亡；且当前该病已成为我国不育症的六大诱因之一。
[0003] 20世纪60年代以来，随着腮腺炎减毒活疫苗的开发成功和大范围使用，包括我国在内的全球大多数国家的腮腺炎的发病率急剧下降且长时间维持在较低水平(十万分之一以下)。但是，20世纪90年代以来，许多国家(尤其是欧洲和东亚国家)的腮腺炎发病率开始逐步上升，且即使大范围强化免疫腮腺炎疫苗，腮腺炎的发病率也没有得到有效的控制。以我国为例，尽管2008年国家将麻疹-腮腺炎-风疹三联疫苗列入扩大免疫规划，每年仍然会出现流腮疫情局部暴发的情况，且发病率逐年提升。
[0004] 针对于当前腮腺炎严峻的防控形势，世界各国的病毒学家和WHO在探究其原因方面做了诸多工作，也得到了公认的研究成果：不同基因型腮腺炎病毒之间不能完全实现交叉保护。腮腺炎病毒虽然只有一个血清型，却有11个不同的基因型。20世纪全球范围内流行的腮腺炎基因型以A基因型为主。但是近 20年，多数国家的优势流行毒株都是非A基因型病毒：例如，欧美主要以G 基因型病毒为主，伴有H、D基因型；在我国F基因型毒株占绝大多数，G基因型病毒只占很小的比例。
[0005] 综上，研发新基因型的更有效的腮腺炎疫苗意义重大且刻不容缓。
[0007] 传统腮腺炎减毒活疫苗致弱手段都是连续在非最适条件下传代而实现的。具体过程是，首先在原代或者传代细胞中扩增，再在原代鸡胚成纤维细胞中持续传代致弱。其缺点有二：第一，成功率低，病毒可能致弱失败，也可能造成免疫原性随着毒力减弱而降低；第二，弱化的终点不好判断。所以，为了疫苗不至于毒力返强，国家对传统腮腺炎减毒活疫苗的病毒代次限定在一个很窄的范围内。并且，对于传统腮腺炎减毒活疫苗致弱手段，不能解释其致弱的原理，故需要长时间且大量的评价试验来确定新疫苗株的安全性和遗传稳定性，疫苗的研发周期很长。
[0008] 相比于传统腮腺炎病毒活疫苗致弱技术，新型的腮腺炎病毒致弱策略主要是通过反向遗传操作技术，基于系统和明晰的病毒蛋白功能研究，直接将病毒的毒力相关基因删除，从而获得致弱机理清晰的减毒腮腺炎疫苗株。在病毒学研究中，通过突变或者缺失毒力相关基因获得毒力减弱且免疫原性保持稳定的候选疫苗株，是一种有效的新型减毒活疫苗制备策略。
[0009] 迄今为止，对于F基因型(我国的优势流行毒株)腮腺炎减毒活疫苗的研究较少，并且也只验证了其在Vero细胞上的生长特性，不具备按我国药典要求开展生产的能力。需要特别注意的是，全球的腮腺炎减毒活疫苗都是在原代鸡胚成纤维细胞中生产而得的，如果换用其它的细胞基质，需要完成很多工艺和质量控制方面的研究，研发周期会很漫长。
[0010] 因此，本领域迫切需要开发一种有效的、安全性高的可在原代鸡胚成纤维细胞中大规模制备生产而得的F基因型腮腺炎减毒活疫苗的高效制备技术。
发明内容
[0011] 本发明的目的就是提供一种有效的、安全性高的可在原代鸡胚成纤维细胞中大规模制备生产而得的F基因型腮腺炎减毒活疫苗的高效制备技术。
[0012] 在本发明的第一方面，提供了一种F基因型腮腺炎病毒减毒株，所述减毒株是保藏号为CCTCC NO:V201950的腮腺炎病毒QS-F-SH2。
[0013] 在本发明的第二方面，提供了一种衍生自如本发明第一方面所述的F基因型腮腺炎病毒减毒疫苗株的衍生病毒株，具有以下一个或多个特性：
[0014] (a)适于在鸡胚原代培养细胞中传代，其稳定传代数≥10，较佳地，其稳定传代数≥15，更佳地，其稳定传代数≥30；
[0015] (b)低毒力：毒力指数与保藏号为CCTCC NO:V201950的腮腺炎病毒 QS-F-SH2的毒力指数相当；其中，所述毒力指数相当是指其毒力指数为保藏号为CCTCC NO:V201950的腮腺炎病毒QS-F-SH2毒力的≤150％，较佳地≤ 120％，更佳地≤100％；其中，毒力指数是引起脑积水的程度；
[0016] (c)相比于野生型F基因型腮腺炎病毒，基因组中缺失且仅缺失SH基因。
[0017] 在另一优选例中，所述衍生病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：
[0018] (i)对应于F基因型腮腺炎病毒的野生型基因组中的如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的SH基因被替换为如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和
[0019] (ii)与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％，较佳地≥ 90％，更佳地≥95％。
[0020] 在另一优选例中，所述衍生病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：
[0021] (i)对应于F基因型腮腺炎病毒的野生型基因组中的如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的SH基因被替换为如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和
[0022] (ii)与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％、≥86％、≥ 87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥ 96％、≥97％、≥98％或≥99％。
[0023] 在另一优选例中，所述衍生病毒株的基因组中含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
[0024] 在本发明的第三方面，提供了一种疫苗组合物，所述组合物包括：
[0025] (i)如本发明第一方面所述的F基因型腮腺炎减毒株或如本发明第二方面所述的衍生病毒株；和
[0026] (ii)疫苗上可接受的载体。
[0027] 在另一优选例中，所述的载体是药学上可接受的载体。
[0028] 在另一优选例中，所述药学上可接受的载体含有液体，较佳地为水、盐水或缓冲液。
[0029] 在另一优选例中，所述载体还含有辅助性的物质，较佳地为填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
[0031] 在另一优选例中，所述疫苗组合物为二联疫苗或多联疫苗。
[0032] 在另一优选例中，所述疫苗组合物还含有源自一种或多种选自下组的病原体的疫苗组分：麻疹；风疹；乙型脑炎；甲型肝炎；水痘；脊髓灰质炎；或其组合。
[0033] 在另一优选例中，所述的疫苗组分包括灭活株、减毒株、或蛋白、核酸等。
[0034] 在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。
[0035] 在另一优选例中，所述佐剂包括：颗粒型和非颗粒型佐剂。
[0037] 另一优选例中，所述非颗粒型佐剂选自下组：胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、蜂胶、或其组合。
[0038] 在另一优选例中，所述疫苗组合物每剂量中病毒至少3.7lgCCID50。
[0039] 在另一优选例中，所述的疫苗组合物为注射剂型。
[0040] 在本发明的第四方面，提供了一种制备F基因腮腺炎病毒减毒株的方法，包括步骤：
[0041] (i)构建缺失且仅缺失SH基因的F基因型腮腺炎病毒的全长重组质粒；
[0042] (ii)获得分别包含腮腺炎病毒中的N基因、P基因和L基因的三种辅助质粒；和[0043] (iii)分别将(i)中所获得的全长重组质粒与所述三种辅助质粒共转染宿主细胞，培养3d后，将细胞进行裂解，接种至新的细胞进行培养，待能观察到细胞病变，待能观察到细胞病变，即获得所述F基因型腮腺炎病毒减毒株。
[0044] 在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：BSR-T7细胞、293T细胞、Vero 细胞、Slam/Vero细胞，或其组合。
[0045] 在本发明的第五方面，提供了一种如本发明第一方面所述的F基因型腮腺炎病毒减毒株或如本发明第二方面所述的衍生病毒株的用途，用于制备一种疫苗组合物，所述疫苗组合物用于预防腮腺炎。
[0046] 在另一优选例中，所述腮腺炎为F基因型腮腺炎。
[0047] 在本发明的第六方面，提供了一种制备疫苗组合物的方法，包括步骤：
[0048] (i)对保藏号为CCTCC NO:V201950的腮腺炎病毒QS-F-SH2进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；
[0049] (ii)将步骤(i)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。
[0050] 在本发明的第七方面，提供了一种预防腮腺炎的接种方法，包括步骤：给需要的对象接种如本发明第一方面所述的F基因型腮腺炎病毒减毒株或如本发明第二方面所述的衍生病毒株，或如本发明第三方面所述的疫苗组合物。
[0051] 在另一优选例中，所述的对象为8月龄以上的腮腺炎易感者。
[0052] 在另一优选例中，所述的接种方式包括为皮下注射接种。
[0053] 在另一优选例中，所述接种的剂量不低于3.7lgCCID50。
[0055] 图1显示了rMuV-ΔSH全长克隆示意图。
[0056] 图2显示了rMuV-ΔSH全长克隆酶切示意图。
[0057] 图3显示了辅助质粒构建示意图。
[0058] 图4显示了各重组病毒的测序结果。
[0059] 其中，A显示了rMuV-ΔSHΔV相关位点测序结果；B显示了rMuV-ΔSH相关位点测序结果；C显示了rMuV-ΔV相关位点测序结果。
[0060] 图5显示了三株重组病毒在Vero细胞上的生长曲线。
[0061] 图6显示了三株病毒在鸡胚成纤维细胞上的生长情况。
[0062] 其中，A为rMuV-ΔV；B为rMuV-ΔSH；C为rMuV-ΔSHΔV。
[0063] 图7显示了QS-F-SH2-P15和P30的PCR测定结果。
[0064] 图8显示了QS-F-SH2重组疫苗与各对照的免疫原性检测结果。
[0065] 图9显示了乳鼠神经毒力试验结果。
[0066] 其中，A显示了神经毒力统计结果；B显示了神经毒力结果。
具体实施方式
[0067] 本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种可在原代鸡胚成纤维细胞中大规模制备生产而得的F基因型腮腺炎减毒活疫苗。具体地，本发明人在F基因型的腮腺炎病毒株中，利用反向遗传操作系统，将其基因组中的SH基因缺失而保留其他基因，可获得F基因型的SH基因缺失的腮腺炎减毒疫苗株。
[0068] 实验证明，获得的F基因型的SH基因缺失的腮腺炎减毒疫苗株能够更加匹配中国地区优势流行的F型腮腺炎病毒，且与当前的疫苗株在生长特性、免疫原性和神经毒力等方面的水平相当。并且，在对其的制备过程中，使用本发明的制备方法，相比于传统腮腺炎病毒致弱手段，致弱机理清晰、周期更短，更加高效。此外，本发明筛选出的腮腺炎病毒基因工程弱毒株能够在鸡胚细胞中稳定生产，安全性高。
[0069] 在此基础上，完成了本发明。
[0070] 腮腺炎病毒及F基因型腮腺炎病毒现状
[0071] 腮腺炎病毒是副粘病毒科腮腺炎病毒属的成员，基因组为不分节段的单股负链RNA，长为15384bp，整个基因组按照3’-N-P-M-F-SH-HN-L-5’的顺序编码7种病毒蛋白。其中N蛋白、P蛋白和L蛋白组成RNA复制酶复合体，参与病毒的转录和复制。F和HN是重要的跨膜糖蛋白和重要的免疫原，SH蛋白含有57个氨基酸，是病毒复制非必需蛋白，与TNF-α介导的细胞凋亡有关。
[0073] 特别值得注意的是，本发明人从血清学方向对腮腺炎疫情反复的原因做了系统研究，结果如下：
[0074] (1)F基因型病毒是我国流行的腮腺炎病毒的绝对优势群体。
[0075] 2015年，本发明人联合6家省级CDC从国内采集了大量患者的样本，并成功分离到29株病毒，生物信息学分析表明，这些病毒株全部为F基因型，且进化关系较近。
[0076] (2)A基因型腮腺炎疫苗的交叉保护能力有限。
[0077] 基于人、豚鼠和小鼠三种免疫模型，本发明人进行了大量血清学交叉中和实验。实验结果表明，A基因型腮腺炎减毒活疫苗(Jeryl Lynn株)产生的中和抗体对F基因型的流行毒株的中和能力要显著低于针对A基因型毒株的中和能力。同时，在豚鼠和小鼠模型中，F基因型腮腺炎病毒免疫产生的抗体对F基因型的中和能力略高于对A基因型病毒的中和能力。
[0078] 本发明F基因型腮腺炎病毒减毒株
[0079] 为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0080] 本发明以从我国分离的F基因型腮腺炎病毒株QS-F为亲本毒株，构建了反向遗传操作系统并在此基础上利用改进的方法构建了SH基因缺失的腮腺炎减毒疫苗候选株。本发明所用的QS-F毒株源自2016年以来本公司联合我国六家省级CDC(江苏、浙江、北京、广东、湖北和陕西)分离的F基因型腮腺炎病毒库。
[0081] 通过定型基因测序，生物信息学分析，血清学比较，免疫原性分析以及体外表型鉴定等研究，最终筛选获得；QS-F毒株具有复制能力较强，遗传稳定性高且免疫原性好等特点，在我国当前流行的F基因型腮腺炎病毒株中具有良好的代表性。
[0082] 本发明构建的F基因型的SH基因缺失的腮腺炎减毒疫苗株的基因组中SH的 CDS区域缺失由174个碱基变成18个碱基，致使SH蛋白不能有效表达。SH基因编码的蛋白与腮腺炎病毒引起的神经毒力直接相关；SH蛋白可以通过抑制NF-κB 和TNF-α通路的激活来帮助腮腺炎病毒逃避宿主的先天性免疫。一旦SH基因缺失，腮腺炎病毒更容易被宿主识别而触发免疫反应；因此，有效提高了缺失病毒的生物安全性。
[0083] 构建QS-F的全长重组质粒和辅助质粒，通过反向遗传学操作系统对QS-F-SH2 进行病毒拯救。对拯救病毒进行传代，收获上清液进行PCR鉴定，结果表明本发明所构建的重组病毒株QS-F-SH2拯救成功；多步生长曲线表明，QS-F-SH2与亲本病毒具有相似的生长动力学；分别将该病毒在原代鸡胚成纤维细胞中长期传代并对其全基因序列测定，结果表明，该病毒SH基因区域稳定，具有良好的遗传稳定性。
[0084] 具体地，在本发明中，提供了一种F基因型腮腺炎病毒减毒株，所述减毒株是保藏号为CCTCC NO:V201950的腮腺炎病毒QS-F-SH2。优选地，本发明所述的F基因型腮腺炎病毒减毒株的基因组中含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
[0086] (a)适于在鸡胚原代培养细胞中传代，其稳定传代数≥10，较佳地，其稳定传代数≥15，更佳地，其稳定传代数≥30；
[0087] (b)低毒力：毒力指数与保藏号为CCTCC NO:V201950的腮腺炎病毒 QS-F-SH2的毒力指数相当；其中，所述毒力指数相当是指其毒力指数为保藏号为 CCTCC NO:V201950的F型腮腺炎减毒疫苗株毒力的≤150％，较佳地≤120％，更佳地≤100％；其中，毒力指数是引起脑室水肿的程度；
[0088] (c)相比于野生型F基因型腮腺炎病毒，基因组中不包含SH基因。
[0089] 在本发明中，所述衍生病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：
[0090] (i)对应于F基因型腮腺炎病毒的野生型基因组中的如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的SH基因被替换为如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和
[0091] (ii)与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％，较佳地≥ 90％，更佳地≥95％。
[0092] 在另一个实施方式中，所述衍生病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：
[0093] (i)对应于F基因型腮腺炎病毒的野生型基因组中的如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的SH基因被替换为如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和
[0094] (ii)与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％、≥86％、≥ 87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥ 96％、≥97％、≥98％或≥99％。
[0095] SH完整基因序列：
[0096] ATGCCGGCAATCCACCCTCCCTTATACCTAACATTTCTATTGCTAATTCT TCTTCATCTGATCTTAAATTTATATGTCTGAATTATGCTAACCATTACTCACA AGACTGCGGTGCAACATGCAGCACTGTACCAGAGATCCCTCTTTCGTTGGAG TTTCGATCACTCACTCTAG(SEQ ID NO:1)
[0097] SH缺失后基因序列：
[0098] ATGCCGGCAGCTAGCTAG(SEQ ID NO:2)
[0099] 在一个优选的实施方式中，本发明采用肌肉注射6周龄BALB/c雌性小鼠，小鼠没有出现任何异常。后肢肌肉注射免疫分两次进行，间隔21d，免疫剂量为 4×105CCID50/100μL。二次免疫后14d，测定产生的中和抗体，结果表明，QS-F-SH2 相比于JL疫苗株可以有效的抵抗我国广泛流行的F基因型腮腺炎病毒的攻击，具备良好的免疫原性。
[0100] 在本发明一个优选的实施方式中，分别用本发明构建的F基因型的SH基因缺失的腮腺炎减毒疫苗株QS-F-SH2、亲本病毒QS-F、疫苗JL(100CCID50/10μL) 和阴性对照DMEM 10μL通过颅内注射的方式感染1日龄的大鼠乳鼠。各实验组的乳鼠在观测时间段内均没有出现任何异常反应。颅内注射25d后，对实验鼠的左侧脑半球进行振动切片(距矢状缝2mm)，根据第三脑室空洞大小定量计算神经毒力值。
[0101] 结果表明，亲本病毒QS-F、QS-F-SH2、JL株的神经毒力值分别为5.66、0.53、 0.31。亲本病毒神经毒力明显，而QS-F-SH2神经毒力，与疫苗株JL株没有显著区别。结合免疫原性和神经毒力，QS-F-SH2具备作为腮腺炎候选疫苗株的潜质。
[0102] 本发明的腮腺炎病毒致弱策略
[0103] 传统腮腺炎病毒减毒的策略是通过长时间非最适条件体外培养进而筛选出毒力减弱的候选毒株。然而，由于至今仍不能解释其致弱的原理，故需要长时间且大量的评价试验来确定新疫苗株的安全性和遗传稳定性。因此，疫苗的研发周期很长。
[0104] 在本发明中，采用病毒学研究的前沿技术，反向遗传操作技术，直接构建毒力基因缺失的重组腮腺炎病毒，能够获得减毒原理清楚的活疫苗。
[0105] 此外，本发明所采用的的毒力评价模型是国际生物标准化协会(IABS)、世界卫生组织(WHO)、欧洲药品质量管理局(EDQM)、美国食品药品监督管理局生物制品评价和研究中心(FDA CBER)与欧洲联盟(EU)推荐的新一代腮腺炎病毒神经毒力评价体系，并进行了相关的优化。相比于恒河猴神经毒力试验，评价方法更能真实反应减毒株和野毒株之间的神经毒力情况，同时成本低廉，周期短。
[0106] 本发明方法
[0107] 在本发明中，提供了一种制备F基因型腮腺炎病毒减毒株的方法，包括步骤：
[0108] (i)构建缺失且仅缺失SH基因的F基因型腮腺炎病毒的全长重组质粒；
[0109] (ii)获得分别包含腮腺炎病毒中的N基因、P基因和L基因的三种辅助质粒；和[0110] (iii)分别将(i)中所获得的全长重组质粒与所述三种辅助质粒共转染宿主细胞，培养3d后，将细胞进行裂解，接种至新的细胞进行培养，待能观察到细胞病变，即获得所述F基因型腮腺炎病毒减毒株。
[0111] 在一优选的实施方式中，所述宿主细胞选自下组：BSR-T7细胞、293T细胞、Vero细胞、Slam/Vero细胞，或其组合。
[0112] 疫苗组合物
[0113] 在本发明中，提供了一种制备疫苗组合物的方法，包括步骤：
[0114] (i)对保藏号为CCTCC NO:V201950的腮腺炎病毒QS-F-SH2进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；
[0115] (ii)将步骤(i)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。
[0116] 在本发明所提供的疫苗组合物中，包括：
[0117] (i)如本发明第一方面所述的F基因型腮腺炎病毒减毒株或如本发明第二方面所述的衍生病毒株；和
[0118] (ii)疫苗上可接受的载体。
[0119] 优选地，所述的载体是药学上可接受的载体。在一个优选的实施方式中，所述药学上可接受的载体含有液体，较佳地为水、盐水或缓冲液。
[0120] 所述载体还可含有辅助性的物质，较佳地为填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
[0121] 在另一个优选的实施方式中，所述载体中还含有细胞转染试剂。
[0122] 在本发明中，所述疫苗组合物为二联疫苗或多联疫苗。优选地，所述疫苗组合物还含有源自一种或多种选自下组的病原体的疫苗组分：麻疹；风疹；乙型脑炎；甲型肝炎；水痘；脊髓灰质炎；或其组合。
[0123] 在一个实施方式中，所述的疫苗组分包括灭活株、减毒株、或蛋白、核酸等。
[0124] 在本发明中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。优选地，所述佐剂包括：颗粒型和非颗粒型佐剂。在一个优选的实施方式中，所述颗粒型佐剂选自下组：铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、纳米颗粒、微小颗粒、脂质体、免疫刺激复合物，或其组合。在另一个优选的实施方式中，所述非颗粒型佐剂选自下组：胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、蜂胶、或其组合。
[0125] 在本发明中，优选地，所述疫苗组合物每剂量中病毒至少3.7lgCCID50。在更加优选的实施方式中，本发明所述的疫苗组合物为注射剂型。
[0126] 病毒株保藏
[0127] 如本文所用，本发明的“F基因型腮腺炎病毒减毒株”和“腮腺炎病毒 QS-F-SH2”可互换使用，已于2019年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC No:V201950。
[0128] 并且，本发明中分离所得的腮腺炎病毒QS-F也已于2019年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC No: V201948。
[0129] 本发明的主要优点包括：
[0130] 1)选用F基因型腮腺炎病毒株与国内优势流行毒株的基因型匹配。
[0131] 2)本发明利用新型的腮腺炎病毒致弱策略，采用反向遗传操作进行病毒的定向改造，相比于传统腮腺炎病毒致弱手段，致弱机理清晰、致弱周期短；因此更加高效。
[0132] 3)目前国外团队类似的基因工程减毒株，只研究了其在Vero细胞上的生长特性。而本发明筛选出了能够适应鸡胚细胞生产的腮腺炎病毒基因工程弱毒株，具备基于当前药典要求开展生产的条件，因而具有极好的应用前景。
[0133] 4)与当前的疫苗株在生长特性、免疫原性和神经毒力等各方面水平一致。
[0134] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0135] 实验材料
[0136] QS-F病毒由江苏省疾病控制与预防中心提供咽拭子样本，上海青赛生物科技有限公司分离鉴定和保存；Vero细胞本公司研发中心提供。pAC载体和pcDNA3.1 用于全长质粒和辅助质粒的构建。
[0137] 实施例1：rMuV-ΔSH缺失病毒的构建
[0138] 1.1QS-F病毒全长质粒的构建
[0139] 根据NCBI上提供的腮腺炎F基因型的序列信息进行比对，设计通用引物对 QS-F病毒进行全基因组测序。测序引物信息如下所示：
[0140] 表1测序引物序列信息
[0141]
[0142]
[0143] 根据测序结果设计引物，将F基因型QS-F分成5段进行克隆，具体策略如图 1所示。
[0144] 以pAC为载体分别将F1和F5通过双酶切Not I、BstE II和Not I和Rsr II得到质粒pAC-F1，pAC-F5，之后通过BstE II、Rsr II双酶切F2和Not I、Hind III双酶切F4得到pAC-F1-F2、和pAC-F4-F5。再次通过Pac I、Rsr II双酶切pAC-F4-F5 和pAC-F1-F2，得到质粒pAC-F1-F2-F4-F5。片段F3通过过渡到T载体上进行克隆，得到pMD18T-F3-1和pMD18T-F3-2，通过双酶切得到pMD18T-F3。将质粒 pAC-F1-F2-F4-F5和pMD18T-F3通过单酶切Pac I最终得到pAC-F1-F2-F3-F4-F5，即pAC-MuV，经过HindIII酶切pAC-MuV，将质粒酶切成三段，分别为8969bp、 5207bp、3803bp，根据图2可知，表明QS-F病毒全长质粒构建成功。
[0145] 表2引物序列及扩增片段
[0146]
[0147]
[0148] 1.2rMuV-ΔSH缺失病毒的感染性克隆的构建及鉴定
[0149] 根据得到的pAC-MuV设计引物序列，对SH基因由原来的174bp缺失成18bp: TTTCTAGCTAGCTGCCGGCATAGTGCAACGGCAGGGT，将载体使用Pml I和Apa I 进行双酶切，使用如下引物，PCR扩增同源臂L和R，在进行融合PCR，将目的片段与酶切后的载体进行同源重组，得到缺失SH基因的全长重组质粒。引物信息如下表所示：
[0150] 表3引物序列及扩增片段
[0151]
[0152] 1.3辅助质粒的构建
[0153] 根据测序结果得到的QS-F病毒的全长基因信息，设计引物扩增N、P、L连接到pcDNA3.1上，得到质粒pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-L。
[0154] 1.4病毒拯救与鉴定
[0155] Sigma去内毒素试剂盒大量提取SH基因缺失QS-F病毒全长质粒和辅助质粒；将其共转染到细胞中。将细胞接种于六孔板中过夜培养，选择细胞汇合度80-90％的细胞孔用于病毒拯救，具体过程如下：将全长质粒pAC-MuV(7μg)、辅助质粒 pcDNA3.1-N(1.5μg)、pcDNA3.1-P(0.2μg)、pcDNA3.1-L(1.0μg)与LipofectamineTM 2000转染试剂(12μL)混合于500μL DMEM培养基中，37℃孵育20min；用PBS 洗涤细胞3次，而后将质粒转染试剂混合物加入细胞孔中，37℃孵育6h。用PBS 洗涤3次，更换为含2％血清，1％抗生素的DMEM培养基，37℃继续培养3-4d；将转染细胞进行裂解，接种至Vero细胞进行培养；待细胞出现明显的融合病灶后，收集细胞上清并进行鉴定。
[0156] 主要拯救以下病毒：缺失SH基因的重组腮腺炎病毒(rMuV-ΔSH)(缺失SH基因由174bp变成18bp)、缺失V基因的重组腮腺炎病毒(rMuV-ΔV)(2439-2430位以及2432-2433位插入A和3199位插入TAGC)、缺失SH基因和V基因的重组腮腺炎病毒(rMuV-ΔSHΔV)(结合上述两种突变方法)。
[0157] 其中，rMuV-ΔV缺失病毒和rMuV-ΔSHΔV缺失病毒的感染性克隆的构建方法类似于本实施例1.2中的构建方法。
[0158] 1.5PCR检测
[0159] 分别收集以上各病毒拯救实验后的细胞上清液。将收集的细胞上清感染Vero 细胞，待细胞出现50％以上病变时，收集细胞并用TRIZOL裂解处理，提取总RNA，进行逆转录，使用特异性引物SH-F/SH-R进行PCR检测，同时将扩增片段进行基因序列测定，得到的结果如图4所示。
[0160] 1.6实验结论
[0161] 根据病毒在Vero细胞中引起的典型病变特征和拯救出的病毒基因组的测序结果，判定缺失SH基因、缺失V基因，以及缺失SH基因和V基因的重组腮腺炎病毒构建成功。
[0162] 实施例2：重组病毒的生长特性和遗传稳定性
[0163] 2.1重组病毒的生长特性
[0164] 三株重组病毒分别以MOI＝0.01(体积为300μL)接种培养于24孔板中长成单层的Vero细胞。分别感染1h后，PBS洗涤细胞3次，并以含2％胎牛血清的 DMEM培养基继续培养。分别于接种病毒后1d、2d、3d、4d和5d，收集细胞上清并进行病毒滴度测定。并且绘制多步生长曲线，分析三株腮腺炎病毒的体外复制特性。
[0165] 结果如图5所示，三株重组病毒在Vero细胞中的生长动力学曲线具有一定的重合性，生长动力学上无显著差异。
[0166] 2.2重组病毒在鸡胚细胞上的传代适应性
[0167] 三株重组病毒以MOI＝0.01与由9-11日龄鸡胚制成的鸡胚成纤维细胞进行混种。接种培养24h后PBS洗涤细胞3次，并以含2％胎牛血清的DMEM培养基继续培养。
[0168] 三株病毒在鸡胚成纤维细胞中进行连续传代，比较P0代和P10代的体外复制特性。
[0169] 按照MOI＝0.01进行混种，分别于接种病毒后2d、3d、4d和5d，收集细胞上清并进行毒价滴度测定，绘制多步生长曲线，分析三株腮腺炎病毒的体外复制特性。
[0170] 结果如图6所示。比较三株重组病毒在鸡胚细胞上的生长特性，结果显示 rMuV-ΔSHΔV、rMuV-ΔV在鸡胚细胞上传代前后，在鸡胚细胞上病毒滴度没有明显提高，而rMuV-ΔSH P10可以较好的适应鸡胚细胞，病毒滴度显著提高，满足疫苗生产需求，并将其命名为QS-F-SH2。
[0171] 2.3QS-F-SH2的遗传稳定性
[0172] 将得到的QS-F-SH2在鸡胚细胞进行连续传代，在第15代，第30代对SH 基因进行测序，琼脂糖凝胶电泳结果如图7所示。
[0173] 结果表明，QS-F-SH2在传代过程中SH基因未发生突变，SH基因缺失稳定遗传。
[0174] 2.4实验结论
[0175] 由上述结果可知，三株重组病毒在生长动力学上没有明显差异，均能够达到较高的滴度。
[0176] 然而其中，只有QS-F-SH2重组病毒在鸡胚细胞上具有良好的传代适应性。并且，QS-F-SH2重组病毒具备良好的遗传稳定性，在病毒传代增殖过程中，未发生突变，具备作为新型腮腺炎疫苗候选株的潜力。
[0177] 实施例3：在小鼠体内的免疫原性检测试验
[0178] 选取SPF级6-8周小鼠60只，随机分成4组即A、B、C、D。A组接种商品化腮腺炎弱毒疫苗JL接种剂量4×105CCID50/只，B组接种F基因型野生病毒接种剂量4×105CCID50/只，C组接种重组疫苗QS-F-SH2接种剂量4×105 CCID50/只，D组接种空白稀释液。每组接种部位均为后肢肌肉注射，每侧50μL。免疫21d后，以相同剂量加强免疫一次。在二免14d后，对小鼠进行采血，采集血液，分离血清。测定病毒的中和效价(攻击毒种：F基因型WT)，注意在免疫前后每天对小鼠进行临床观察。
[0179] 表4免疫方案
[0180]分组 疫苗 剂量(CCID50) 数量(只) 收样
5
A JL 4×10 15 二免后14d
B WT 4×105 15 二免后14d
C QS-F-SH2 4×105 15 二免后14d
D 稀释液 100μL
5
A JL 4×10 15 二免后14d
B WT 4×105 15 二免后14d
C QS-F-SH2 4×105 15 二免后14d
D 稀释液 100μL
[0181] 3.1病毒中和试验
[0182] 先将待检血清于56℃灭活30min，然后进行2倍倍比稀释，每个血清稀释度取50μL加入50μL的F基因型病毒(含100CCID50)，37℃条件下作用1h。加入100μL含有10％胎牛血清DMEM细胞培养液，37℃，5％CO2培养7d，于显微镜下观察细胞的病变情况。按照公式计算血清抗体的中和效价。将结果进行统计分析。
[0183] 免疫原性检测的结果如图8所示。其中，JL即A基因型的疫苗对F基因型野毒(流行毒株)的中和效价显著低于F基因型野生病毒产生的对F基因型病毒的中和效价滴度。同时与F基因型野生病毒QS-F的免疫效果相当，即 QS-F-SH2保持良好的免疫原性。
[0184] 实施例4：病毒神经毒性测试
[0185] 选取SPF级WISTAR孕鼠4只，随机分成4组即A、B、C、D。待生产后，对乳鼠进行颅内注射试验。A组乳鼠接种商品化腮腺炎减毒疫苗，接种剂量100 CCID50/只；B组乳鼠接种F基因型野生病毒，接种剂量100CCID50/只；C组接种缺失重组疫苗，接种剂量100CCID50/只；D组接种空白稀释液。每组接种部位为大脑矢状缝左侧2mm，前囟点和人字点中间，接种量10μL/只。接种 25d后，将乳鼠进行处死，取大脑进行振动切片，分析脑积水程度＝侧脑室横截面积/大脑横截面积×100。
[0186] 实验结果如图9所示。乳鼠的脑组织病理切片结果显示缺失病毒株 QS-F-SH2引起的脑积水程度与JL没有明显差异。结合中和抗体的结果说明 QS-F-SH2表现出高度致弱的特点，且对大鼠乳鼠安全，能够抵抗流行性腮腺炎的感染。
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