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一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群及其制备的免疫牛乳

阅读：1086发布：2020-06-05

专利汇可以提供一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群及其制备的免疫牛乳专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群，利用该代表株群制备的奶牛疫苗，奶牛疫苗免疫奶牛制备的免疫牛乳和利用免疫牛乳中多克隆IgG 抗体制备的生物制品，以用于满足临床特异性治疗幽门螺杆菌感染的需要，同时解决了细菌耐药性等问题。具有成本低、患者依从性好、可长期饮用等优点。，下面是一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群及其制备的免疫牛乳专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群，其特征在于，其包括保藏编号为CGMCCNo.15126的cagA+/cagE2/s1a/m1b/i1/iceA1代表株、保藏编号为CGMCCNo.15127的cagA+/cagE2/s1a/m2/i1/iceA1代表株、保藏编号为CGMCCNo.15128的cagA+/cagE2/s1a/m2/babA2/i1/iceA1代表株。
2.一种利用权利要求1所述的幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群制备用于免疫奶牛的奶牛疫苗。
3.根据权利要求2所述的奶牛疫苗，其特征在于，其通过如下方法制备：
（A）将幽门螺杆菌感染者按ABO血型系统分为A、B、O三组，从不同血型幽门螺杆菌感染者胃中分离出幽门螺杆菌；
（B）对每种血型分离出的幽门螺杆菌做cagA、cagE、vacA、iceA、babA2的PCR并测序；
（C）对幽门螺杆菌的基因测序完成后，根据血型和基因组合：从A组幽门螺杆菌中筛选+ +
出基因型cagA/ cagE2/s1a/m2/i1/iceA1、 B组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA/ cagE2/s1a/m1b/i1/iceA1、O组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA+/ cagE2/s1a/m2/babA2/i1/iceA1三株流行代表株；
（D）三株毒力亚型流行代表株通过扩增培养收集后，用PBS清洗三次，等比例混合配伍成1*109/毫升，制备出混合全菌奶牛疫苗，-20℃冻存备用。
4.一种根据权利要求1所述的幽门螺杆菌株毒力亚型混合株群的外膜蛋白制备的奶牛疫苗。
5.根据权利要求4所述的奶牛疫苗，其特征在于，其通过如下方法制备：
1）以30块90 mm 细菌培养皿培养的细菌数量为1个单位，收集细菌，用10 ml预冷的PBS，6000g，4℃离心5min，清洗细菌3次；
2）每单位加入10 ml预冷的Sulfo-NHS-SS-biotin反应液，4℃水平振荡30 min；
3）加入0.5 mL反应终止缓冲液，4℃孵育5 min；
4）500 g，4℃离心3 min，弃上清；
5）加入5 ml TBS清洗细菌，500 g，4℃离心5 min，清洗2次；
6）每单位加入10mL细菌裂解液，重悬细菌，转移至15 ml 离心管中；
7）4℃条件下，反复颠倒离心管，裂解细菌1 h；
8）超声破碎，1son/6off，5min；
9）12,000 g，4℃离心30 min，收集上清；
10）用清洗缓冲液平衡Streptavidin HP层析柱，将第9步的上清液进样到层析柱中，上样2-3次；
11）用清洗缓冲液清洗上完样的层析柱5-10个柱体积；
12）用洗脱缓冲液洗脱层析柱2-5个柱体积，在层析柱上孵育1h，洗脱收集；
13）用在位清洗缓冲液清洗层析柱2-5个柱体积，收集；
14）SDS-PAGE初步检测蛋白层析情况；
15）在膜蛋白收集液中加入4倍体积的预冷丙酮，沉淀过夜；
16）15000g，4℃离心30min，弃上清；
17）500ul冷丙酮洗一次，500ul70%冷乙醇洗一次，500ul冷丙酮洗一次；离心都在4℃进行；
18）将沉淀冻干，约3分钟，用50ulUA buffer 重悬；
19）质谱鉴定；
20）对蛋白进行定量后，三株代表菌的膜蛋白按1∶1∶1的比例等比例配伍混合后，调整总浓度为2mg/ml，-20℃冻存备用。
6.一种根据权利要求2和4所述的奶牛疫苗免疫奶牛制备的免疫牛乳。
7.根据权利要求6所述的免疫牛乳，其特征在于，其通过如下步骤制备：
（a）混合疫苗分别分8次免疫奶牛，前2次用10毫升全菌疫苗+5毫升外膜蛋白疫苗+完全氟氏佐剂，后6次用8毫升全菌疫苗+4毫升外膜蛋白疫苗+氢氧化铝佐剂在奶牛的颈部、背部皮下注射，每次间隔15天；
（b）ELISA检测免疫牛乳中的抗体，当抗体效价达高峰后收集牛乳；
（c）免疫牛乳的消毒；高压脉冲电场温度35℃，压力7000v，流速44mL/min,或者在65℃水浴2小时；
（d）消毒后的牛乳在-20℃保存备用。
8.一种免疫牛乳中的多克隆IgG抗体，其特征在于，其利用高纯化琼脂糖包被的蛋白G从权利要求6所述的免疫牛乳中提纯和分离。
9.根据权利要求8所述的多克隆IgG抗体，其特征在于，其通过如下步骤制备：
（1）用乳脂分离机，弃去杂物与脂肪；
（2）室温下用1N的HCl调整牛乳的pH至4.2-4.6，1100低速离心15分钟，取上清；同时用1N的NaOH调回pH到7.0；
（2）用PBS平衡protein G柱子；
（3）把处理好的乳清进入protein G柱里；
（4）用PBS清洗柱子；
（5）用甘氨酸HCl pH2.7洗脱样品，在OD280出峰时，每1ml收集管加入100微升Tris pH9中和样品；
（6）收集的多克隆IgG抗体，经脱盐处理、超滤浓缩后，调整浓度至250mg/ml，-20℃冻存备用。
10.一种包含权利要求8所述的多克隆IgG抗体的生物制剂，其特征在于，其包括多克隆IgG抗体、免疫牛乳和碱制剂，所述多克隆IgG抗体和免疫牛乳的体积比为50:1，所述碱制剂的添加量为每250ml免疫牛乳+5ml多克隆IgG抗体中添加1-3毫升1mol/L 碳酸氢钠。

说明书全文

一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群及其制备的免疫

牛乳

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群，利用上述幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群制备的奶牛疫苗、用奶牛疫苗免疫奶牛后得到的免疫牛乳和利用免疫牛乳中多克隆IgG抗体制备生物制品的技术方法及其应用方法。

背景技术

[0002] 幽门螺旋杆菌，又称幽门螺杆菌，是与人类共同进化的一种病原菌，通常感染发生于幼年时期。据估计，世界上有一半以上的人口感染幽门螺杆菌，但是80%的感染者表现为没有明显临床症状的慢性胃炎；15-20%左右的感染者发展为溃疡；1-5%的感染者因为长期幽门螺旋杆菌引起的炎症反应进展为胃癌；还有不到1%发展为胃粘膜淋巴组织相关性淋巴瘤（MALT）。因此，1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构（WHO/IARC）又将幽门螺旋杆菌定为Ⅰ类致癌原。胃癌是一种高度致死性的很难治疗的癌症。在全世界，每年胃癌发病大约100万例，每年有超过70万人死于胃癌。因此，积极根除胃中的幽门螺杆菌是降低上述疾病发病率的根本方法。目前幽门螺旋杆菌的治疗是基于几种抗生素并联合PPI的治疗方法，该方法的不足是副作用大，病人耐受性差，治疗费用高，不能解决细菌耐药性，容易复发，不能获得免疫保护，影响胃肠道中的正常菌群等问题；同时，抗生素治疗根除率在逐年下降，从最早的90%多下降到现在60%多的根除率，因此寻求新的替代疗法迫在眉睫。

[0003] 在18世纪，人们用免疫动物的血清来治疗一些感染性疾病，但是随后发现，这些动物血清也是一种异源性蛋白，进入人体后可以引起较强的人体免疫反应，同时由于抗生素在感染性疾病治疗中的广泛运用，因此限制了这类抗体药物的开发和运用。随着抗生素的广泛运用，细菌耐药性的问题也越来越突出，人们也没有找到更好的办法来解决细菌耐药性问题，于是又重新思考和定位抗体药物的作用，希望能用老办法来解决新问题。研究员LizCarpenter发现给奶牛接种人类容易感染的病原菌如轮状病毒、艰难梭状芽胞杆菌、空肠弯曲杆菌等, 这样生产出来的牛乳中含有抗体,人们饮用此种免疫牛乳不但可以获得营养而且可以帮助人们预防和治疗一些胃肠道感染性疾病。

[0004] 人工被动免疫治疗方法是治疗幽门螺杆菌感染的一种新方法，该方法就是用幽门螺杆菌免疫奶牛，刺激奶牛机体发生免疫应答，以分泌特异性抗幽门螺杆菌IgG抗体进入乳汁，然后收集这种免疫乳汁，经消毒处理后让幽门螺杆菌感染者服用，可以有效清除感染者胃中的幽门螺杆菌。但是，用该方法也面临诸多困难，比如需要用什么样的靶抗体、抗体能否穿过胃的粘液层、抗体能否不被胃酸破坏、需要抗体的剂量、抗体是否有足够的时间到达幽门定植部位、需要治疗多长时间、口服的最佳时间等等。

[0005] 幽门螺杆菌的基因分型主要是基于两个毒素基因：细胞空泡毒素（vacA）和细胞毒素相关蛋白（cagA）。根据 cagA 把临床菌株分为 cagA 阳性和 cagA阴性两种菌株。幽门螺杆菌 vacA 基因由m 区和s 区两部分组成，vacA 基因的 5’有 s1 和 s2 两种类型，其中 s2 型中含有 12 个氨基酸氨基末端疏水性片段，而 sl 型没有该片段，据此 sl 又可分为 sla 型和 slb 型。根据其中间2区基因差异又可分为 ml、mla、mlb、mlc、mlb-m2、m2a、m2b 等类型。因而，这些等位基因理论上应该有多种不同的s与m组合，不同菌株可能有不同基因组合。随着对幽门螺旋杆菌株 vacA 基因分型工作的不断深入，vacA 基因的多态性及不同地区优势基因型的分布逐渐开始清晰，例如研究发现北美以 sla 和 slb 型为主，二者比例接近；东欧和北欧是以 sla 型为主，而在南美主要以 slb/ml 型为主；日本和韩国以 sla-ml 型为主，占 90％以上；而在国内不同地区 vacA 基因型的分布也存在差异，例如南京地区主要分布 sla/ml 和 sla/m2 型，西安地区以 sla/ml 居多，湖北地区则以 sla-m2 型为主。由于不同基因组合的幽门螺杆菌毒力不同，致病能力不同，感染后的临床结果也不同，因此需要建立幽门螺杆菌区域毒力流行株。然后用区域流行株制备出全菌疫苗，优势之一是全菌表面含有糖抗原，二是可以有效减少免疫菌和患者胃里幽门螺旋杆菌的差异。

[0006] 一般情况下80%的幽门螺杆菌定植在胃粘膜表面的25-100µm粘液层，少部分定植于胃粘膜上皮表面，胃小凹内及腺腔内。幽门螺杆菌寄居的部位比较特殊，是一个酸性环境，同时还要抵抗胃蠕动、胃排空以及胃粘液层的不断脱落和再生，因此幽门螺杆菌必须要借助粘附分子牢牢地粘附在细胞表面，而发挥粘附作用的分子主要位于细菌的表面。因此如果能获得抗粘附分子的抗体，抗体和细菌的粘附分子结合，就会使细菌失去粘附的能力，从而使细菌失去定植的能力，因此理想的候选疫苗抗原应该是位于病原菌的表面。位于幽门螺杆菌的表面的分子主要是外膜蛋白和脂多糖（LPS）。幽门螺旋杆菌基因组大约用4％基因编码大部分外膜蛋白（约64种外膜蛋白），这些独特的外膜蛋白满足了幽门螺杆菌适应独特的胃部环境的需要。这些外膜蛋白根据基因相似性分成五个基因家族。家族1包括hop家族（21个成员）和hor家族（12个成员）；家族2包括hof家族（8个成员)；家族3包括hom家族（4个成员）；家族4包括铁离子调节外膜蛋白（6个成员）；家族5包括泵外排蛋白（3个成员），还有10个成员没有纳入到上述分类中。在这些外膜蛋白中，目前已经确认和它们结合的受体，还有很多外膜蛋白的粘附受体还不是很清楚，因此目前用重组的办法制备出的疫苗还不能覆盖大部分感染者胃中的幽门螺杆菌.前期的研究表明，不同血型感染者由于表达的受体不同而感染状态不同，比如O型血更容易表达Leb抗原，O型血就更容易感染幽门螺杆菌，因此需要把感染者胃中的幽门螺旋杆菌按血型进行分组。与其他革兰氏阴性菌的外膜蛋白谱相比，幽门螺杆菌的外膜蛋白（OMP）谱没有占主导含量的蛋白，而是含有多种低丰度的外膜蛋白，因此如果只用幽门螺杆菌全菌作为免疫疫苗，获得抗外膜蛋白抗体的可能性非常小，因此需要富集外膜蛋白的办法作为疫苗去免疫奶牛。

发明内容

[0007] 基于以上理论分析，因此最佳免疫疫苗是区域流行株毒力亚型混合全菌疫苗+外膜蛋白混合疫苗。考虑到分泌到牛乳中的抗体效价还达不到清除胃中幽门螺杆菌的作用，因此需要用高纯化琼脂糖包被的蛋白G提纯、分离和富集免疫牛乳中的多克隆IgG抗体再加入到免疫牛乳中，此种方法一是提高免疫牛乳抗体的效价，二是利用牛乳具有很强的缓冲能力，能提高胃液中的pH，使IgG得到很好的保护。为了保证抗体在胃中不被胃酸破坏，因此制备出来的免疫牛乳和多克隆IgG抗体需要搭配一定量中和胃酸的碱制剂。虽然80%的幽门螺杆菌定植在胃粘膜表面的25-100µm粘液层，但是有少部分定植于胃粘膜上皮表面，胃小凹内及腺腔内，甚至定植在细胞间隙或细胞内，因此抗体从粘液层表面到达细胞间隙还是比较困难的。要解决这个问题，可以通过长期每天饮用多克隆抗体，让抗体每天能够有小部分逐渐渗透到胃小凹内、腺腔内和细胞间隙。

[0008] 本发明所要解决的技术问题在于，提供一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群，利用该代表株群制备的奶牛疫苗，奶牛疫苗免疫奶牛制备的免疫牛乳、以及利用免疫牛乳中多克隆IgG抗体生物制品，以用于满足临床特异性治疗幽门螺杆菌感染的需要，同时解决了细菌耐药性等问题。具有成本低、患者依从性好、可长期饮用等优点。

[0009] 本发明采用如下技术方案：一种幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群，其包括保+藏编号为CGMCCNo.15126的cagA /cagE2/s1a/m1b/i1/iceA1代表株、保藏编号为CGMCCNo.15127的cagA+/cagE2/s1a/m2/i1/iceA1代表株、保藏编号为CGMCCNo.15128的cagA+/cagE2/s1a/m2/babA2/i1/iceA1代表株。上述菌种均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为幽门螺杆菌 Helicobacter pylori，保藏时间为2017年12月26日。

[0010] 一种利用上述的幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群制备用于免疫奶牛的奶牛疫苗。

[0011] 进一步的，所述幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群制备的奶牛疫苗，通过如下方法制备：（A）将幽门螺杆菌感染者按ABO血型系统分为A、B、O三组，从不同血型幽门螺杆菌感染者胃中分离出幽门螺杆菌；
（B）对每种血型分离出的幽门螺杆菌做cagA、cagE、vacA、iceA、babA2的PCR并测序；
（C）对幽门螺杆菌的基因测序完成后，根据血型和基因组合：从A组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA+/ cagE2/s1a/m2/i1/iceA1、 B组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA+/ cagE2/s1a/m1b/i1/iceA1、O组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA+/ cagE2/s1a/m2/babA2/i1/iceA1三株流行代表株；
（D）三株毒力亚型流行代表株通过扩增培养收集后，用PBS清洗三次，等比例混合配伍成1*109/毫升，制备出混合全菌奶牛疫苗，-20℃冻存备用。

[0012] 一种上述的幽门螺杆菌株毒力亚型混合株群的外膜蛋白制备的奶牛疫苗。

[0013] 进一步的，所述幽门螺杆菌株毒力亚型混合株群的外膜蛋白制备的奶牛疫苗，通过如下方法制备：1）以30块90 mm 细菌培养皿培养的细菌数量为1个单位，收集细菌，用10 ml预冷的PBS，6000g，4℃离心5min，清洗细菌3次；
2）每单位加入10 ml预冷的Sulfo-NHS-SS-biotin反应液，4℃水平振荡30 min；
3）加入0.5 mL反应终止缓冲液，4℃孵育5 min；
4）500 g，4℃离心3 min，弃上清；
5）加入5 ml TBS清洗细菌，500 g，4℃离心5 min，清洗2次；
6）每单位加入10mL细菌裂解液，重悬细菌，转移至15 ml 离心管中；
7）4℃条件下，反复颠倒离心管，裂解细菌1 h；
8）超声破碎，1son/6off，5min；
9）12,000 g，4℃离心30 min，收集上清；
10）用清洗缓冲液平衡Streptavidin HP层析柱，将第9步的上清液进样到层析柱中，上样2-3次；
11）用清洗缓冲液清洗上完样的层析柱5-10个柱体积；
12）用洗脱缓冲液洗脱层析柱2-5个柱体积，在层析柱上孵育1h，洗脱收集；
13）用在位清洗缓冲液清洗层析柱2-5个柱体积，收集；
14）SDS-PAGE初步检测蛋白层析情况；
15）在膜蛋白收集液中加入4倍体积的预冷丙酮，沉淀过夜；
16）15000g，4℃离心30min，弃上清；
17）500ul冷丙酮洗一次，500ul70%冷乙醇洗一次，500ul冷丙酮洗一次。离心都在4℃进行；
18）将沉淀冻干，约3分钟，用50ulUA buffer 重悬；
19）质谱鉴定；
20）对蛋白进行定量后，三株代表菌的膜蛋白按1∶1∶1的比例等比例配伍混合后，调整总浓度为2mg/ml，-20℃冻存备用。

[0014] 一种上述的奶牛疫苗免疫奶牛制备的免疫牛乳。

[0015] 所述免疫牛乳通过如下步骤制备：（a）混合疫苗分别分8次免疫奶牛，前2次用10毫升全菌疫苗+5毫升外膜蛋白疫苗+完全氟氏佐剂，后6次用8毫升全菌疫苗+4毫升外膜蛋白疫苗+氢氧化铝佐剂在奶牛的颈部、背部皮下注射，每次间隔15天；
（b）ELISA检测免疫牛乳中的抗体，当抗体效价达高峰后收集牛乳；
（c）免疫牛乳的消毒：高压脉冲电场温度35℃，压力7000v，流速44mL/min,或者在65℃水浴2小时；
（d）消毒后的牛乳在-20℃保存备用。

[0016] 一种免疫牛乳中的多克隆IgG抗体，其利用高纯化琼脂糖包被的蛋白G从上述的免疫牛乳中提纯和分离。

[0017] 进一步的，所述多克隆IgG抗体，通过如下步骤制备：（1）用乳脂分离机，弃去杂物与脂肪；
（2）室温下用1N的HCl调整牛乳的pH至4.2-4.6，1100低速离心15分钟，
取上清；同时用1N的NaOH调回pH到7.0；
（2）用PBS平衡protein G柱子；
（3）把处理好的乳清进入protein G柱里；
（4）用PBS清洗柱子；
（5）用甘氨酸HCl pH2.7洗脱样品，在OD280出峰时，每1ml收集管加入100微升Tris pH9中和样品；
（6）收集的多克隆IgG抗体，经脱盐处理、超滤浓缩后，调整浓度至250mg/ml，-20℃冻存备用。

[0018] 一种包含上述的多克隆IgG抗体的生物制剂，其包括多克隆IgG抗体、免疫牛乳和碱制剂，所述多克隆IgG抗体和免疫牛乳的体积比为50:1，所述碱制剂的添加量为每250ml免疫牛乳+5ml多克隆IgG抗体中添加1-3毫升1mol/L 碳酸氢钠。

[0019] 使用方法：250毫升免疫牛乳+5毫升多克隆IgG抗体+1-3毫升1mol/L碳酸氢钠，每日一次，饭后1-2小时服用，一个疗程2个月，至少服用3个疗程以上，清除率可以达50%以上。

[0020] 本发明将幽门螺旋杆菌感染者按ABO血型系统分为A、B、O三组，从不同血型幽门螺旋杆菌感染者胃中分离出幽门螺旋杆菌；对每种血型分离出的幽门螺旋杆菌做cagA、cagE、vacA、iceA、babA2的PCR并测序；测序完成后，根据血型和基因组合，从A组幽门螺杆菌中筛选出基因型是cagA+/ cagE2/s1a/m2/i1/iceA1毒力亚型流行代表株，保存编号是CGMCCNo.15126；从B组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA+/ cagE2/s1a/m1b/i1/iceA1毒力亚型流行代表株，保存编号是CGMCCNo.15127；从O组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA+/ cagE2/s1a/m2/babA2/i1/iceA1毒力亚型流行代表株，保存编号是CGMCCNo.15128。

[0021] 用三株毒力亚型流行代表株制备出混合全菌疫苗；再分别提取各组中分离出的代表株的外膜蛋白制备出免疫奶牛的混合蛋白疫苗；然后用混合蛋白疫苗+全菌疫苗+佐剂免疫奶牛，用ELISA检测牛乳中抗体总效价，用双向电泳结合Western-Blot、co-IP或者pull-down检测抗体结合位点。

[0022] 当奶牛产生的抗体效价达到高峰的时收集牛乳，消毒灭菌处理后用高纯化琼脂糖包被的蛋白G提纯和分离免疫牛乳中的多克隆IgG抗体，让幽门螺杆菌感染者通过搭配碱制剂口服本发明方法制备出的免疫牛乳和抗幽门螺杆菌多克隆IgG抗体制品，可以有效清除胃里的幽门螺杆菌，清除率可达50%以上；同时具有成本低、患者依从性好、不会产生耐药性、可以长期饮用等优点。附图说明

[0023] 图1 PCR扩增后的电泳图谱。

[0024] 图2 富集的外膜总蛋白电泳图。

[0025] 图3 Omp20膜蛋白对应的高质量肽图谱。

具体实施方式

[0026] 下面对发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方法和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的各实施例。

[0027] 实施例1 胃幽门螺杆菌的分离培养与鉴定方法分离人群来源于石家庄地区幽门螺旋杆菌感染者共498例。通过胃镜咬检幽门螺杆菌感染者的胃粘膜组织，然后将胃粘膜组织置于含有0.5ml布氏肉汤的玻璃研磨器中研磨成浆，吸取100微升涂布于歌伦比亚选择培养基平板上（含8%的脱纤维羊血，5mg/L TMP，5mg/L多粘菌素B，5mg/L 两性霉素B，10mg/L 万古霉素），然后把平板放置于三气培养箱中培养（10% CO2，85% N2，5% O2），37℃培养3-7天，对培养出的可疑菌落进行革兰染色镜检，脲素酶，触酶，氧化酶实验。结果是革兰阴性，S 型或弧型，三酶实验阳性可初步鉴定为Hp，然后进一步做16sRNA 的PCR验证。

[0028] 实施例2 幽门螺杆菌的基因PCR方法（一）细菌DNA的提取方法
1.从幽门螺杆菌培养基上刮取新鲜的菌苔（黄豆大小），置于1.5mlEP管壁上。加入0.9%生理盐水，震荡混匀，离心10000rpm 2 min，弃上清，如此重复3次；
2.加入180ul ATL（将细菌裂解，溶开沉淀）；
3.加入20ul蛋白酶K，震荡混匀，56度金属浴300rpm 1-3小时，瞬时离心；
4.加入200ul AL 震荡混匀，70度金属浴10mins，瞬时离心；
5.加入200ul 无水乙醇，轻柔上下颠倒混匀至澄清15秒，瞬时离心；
6.加入500ul AW1 ，离心8000rpm 1min 弃管留柱，换上新收集管；
7.加入500ul AW2，离心14000rpm 3min 弃管留柱，换上新收集管，离心14000rpm
1min；
8.将吸附柱置于一经高压灭菌处理的1.5mlEP管中，放置5min 让酒精挥发；
9.加入200ul ddH2O，室温放置5mins 离心8000rpm 1min；
10.测定OD260/280，OD260/230。

[0029] （二）PCR的引物及其反应条件PCR引物如表1所示，反应体系如表2所示，PCR反应条件如表3所示，图1所示PCR扩增后的电泳图谱
表1 PCR引物
。

[0030] 表2 反应体系。

[0031] 表3 PCR反应条件。

[0032] 实施例3 幽门螺旋杆菌毒力亚型混合代表株群制备奶牛疫苗（A）将幽门螺杆菌感染者按ABO血型系统分为A、B、O三组，从不同血型幽门螺杆菌感染者胃中分离出幽门螺杆菌；
（B）对每种血型分离出的幽门螺杆菌做cagA、cagE、vacA、iceA、babA2的PCR并测序（C）对cagA、cagE、vacA、iceA、babA2测序完成后，根据血型和基因组合：从A组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA+/cagE2/s1a/m2/i1/iceA1、 B组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA+/+
cagE2/s1a/m1b/i1/iceA1、O组幽门螺杆菌中筛选出基因型cagA/cagE2/s1a/m2/babA2/i1/iceA1三株代表株；
（D）三株毒力亚型流行代表株通过扩增培养收集后，用PBS清洗三次，等比例混合配伍成1*109/毫升，制备出混合全菌免疫疫苗，-20℃冻存备用。

[0033] 实施例4 幽门螺杆菌株毒力亚型混合株群的外膜蛋白制备奶牛疫苗1）以30块90 mm 细菌培养皿培养的细菌数量为1个单位，收集细菌，用10 ml预冷的PBS，6000g，4℃离心5min，清洗细菌3次；
2）每单位加入10 ml预冷的Sulfo-NHS-SS-biotin反应液，4℃水平振荡30 min；
3）加入0.5 mL反应终止缓冲液，4℃孵育5 min；
4）500 g，4℃离心3 min，弃上清；
5）加入5 ml TBS清洗细菌，500 g，4℃离心5 min，清洗2次；
6）每单位加入10mL细菌裂解液，重悬细菌，转移至15 ml 离心管中；
7）4℃条件下，反复颠倒离心管，裂解细菌1 h；
8）超声破碎，1son/6off，5min；
9）12,000 g，4℃离心30 min，收集上清；
10）用清洗缓冲液平衡Streptavidin HP层析柱，将第9步的上清液进样到层析柱中，上样2-3次；
11）用清洗缓冲液清洗上完样的层析柱5-10个柱体积；
12）用洗脱缓冲液洗脱层析柱2-5个柱体积，在层析柱上孵育1h，洗脱收集；
13）用在位清洗缓冲液清洗层析柱2-5个柱体积，收集；
14）SDS-PAGE初步检测蛋白层析情况；如图2所示富集的外膜总蛋白电泳图；
15）在膜蛋白收集液中加入4倍体积的预冷丙酮，沉淀过夜；
16）15000g，4℃离心30min，弃上清；
17）500ul冷丙酮洗一次，500ul70%冷乙醇洗一次，500ul冷丙酮洗一次。离心都在4℃进行；
18）将沉淀冻干，约3分钟，用50ulUA buffer 重悬；
19）质谱鉴定；如图3所示鉴别出Omp20膜蛋白其中一条肽段的二级质谱图
20）对蛋白进行定量后，三株代表菌的膜蛋白按1∶1∶1的比例等比例配伍混合后，调整总浓度为2mg/ml，-20℃冻存备用。

[0034] 实施例5 奶牛疫苗免疫奶牛制备的免疫牛乳（a）混合疫苗分别分8次免疫奶牛，前2次用10毫升全菌疫苗+5毫升外膜蛋白疫苗+完全氟氏佐剂，后6次用8毫升全菌疫苗+4毫升外膜蛋白疫苗+氢氧化铝佐剂在奶牛的颈部、背部皮下注射，每次间隔15天；
（b）ELISA检测免疫牛乳中的抗体，当抗体效价达高峰后收集牛乳；
（c）免疫牛乳的消毒：高压脉冲电场温度35℃，压力7000v，流速44mL/min,或者在65℃水浴2小时；
（d）消毒后的牛乳在-20℃保存备用。

[0035] 实施例6 ELISA检测免疫牛乳中的抗体先用2.5%戊二醛溶液150µl/孔预处理96孔板1小时，37℃，超纯水洗涤4次，每次甩净拍干；用100µl细菌总蛋白（1mg/mL）包被酶标板，37℃至干燥，用PBST （含0.5ml/L Tweem 20的PBS缓冲液）洗涤液洗板3次，每次3min，每次甩净拍干；用3%BSA的PBST封闭1小时，洗涤同上；加不同稀释度的奶样和血样，100µl/孔，每样3个复孔，37℃温育1小时；洗涤3次后加入兔抗牛IgG-HRP（1:8000），100µl/孔，37℃温育1小时；洗涤3次后加四甲基联苯胺底物工作液100µl，37℃反应15分钟后每孔加50µl H2SO4（2mol/L）终止反应，立即在酶标仪上测450nm 波长的吸光度值，以OD450 0.05的最大稀释倍数为抗体效价，抗体总效价达到1∶800以上，收集牛乳。

[0036] 实施例7 利用高纯化琼脂糖包被的蛋白G从免疫牛乳中提纯和分离多克隆IgG抗体（1）用乳脂分离机，弃去杂物与脂肪；
（2）室温下用1N的HCl调整牛乳的pH至4.2-4.6，1100低速离心15分钟，
取上清；同时用1N的NaOH调回pH到7.0；
（2）用PBS平衡protein G柱子；
（3）把处理好的乳清进入protein G柱里；
（4）用PBS清洗柱子；
（5）用甘氨酸HCl pH2.7洗脱样品，在OD280出峰时，每1ml收集管加入100微升Tris pH9中和样品；
（6）收集的多克隆IgG抗体，经脱盐处理、超滤浓缩后，调整浓度至250mg/ml，-20℃冻存备用。

[0037] 实施例8 多克隆IgG抗体的生物制剂包括多克隆IgG抗体和碱制剂，所述碱制剂的添加量为每250毫升免疫牛乳+5毫升多克隆IgG抗体中添加1-3毫升1mol/L碳酸氢钠。

[0038] 使用方法：250毫升免疫牛乳+5毫升多克隆IgG抗体+1-3毫升1mol/L碳酸氢钠，每日一次，饭后1-2小时服用，一个疗程2个月，至少服用3个疗程以上，清除率可以达50%以上。

[0039] 实施例9 临床效果将符合入选标准的79例幽门螺杆菌感染者按随机方法分入试验组和对照组,试验组39人，对照组40人，采用执行者和患者双盲原则分发、饮用牛奶。

[0040] 试验组饮用免疫牛乳 250 ml/d+1 ml NaHCO3（1 mol/L）+5毫升多克隆抗体；对照组饮用普通牛乳 255 ml/d+1 ml NaHCO（3 1 mol/L），饮用 6 个月，C-13 呼气试验检测清除效果，实验组清除20人，对照组未有清除，清除率51.28%。

[0041] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，但并不限于此，本领域的技术人员很容易根据上述实施例领会本发明的精神，并作出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围之内。

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