基于CRISPR/Cas9的小菜蛾APN3a基因的敲除和应用
阅读：1062发布：2020-05-26
专利汇可以提供基于CRISPR/Cas9的小菜蛾APN3a基因的敲除和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用CRISPR/Cas9实现非模式 生物 小菜蛾 APN3a基因的敲除及其在Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性分子机制研究中的应用。所述CRISPR/Cas9基因编辑系统主要包括：小菜蛾APN3a基因特异性sgRNA靶标序列、小菜蛾卵的显微注射方法和突变个体及其基因型的 无损检测 方法。将构建的可稳定遗传的小菜蛾APN3a基因纯合突变种群用于Bt Cry1Ac杀虫蛋白毒 力 生物测定，结果证实小菜蛾APN3a基因突变可以导致其对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生高抗性。本发明对于小菜蛾Bt Cry1Ac抗性的功能基因筛选、田间抗性 水 平检测以及田间防治均具有重要的理论和实践意义，应用前景广泛。，下面是基于CRISPR/Cas9的小菜蛾APN3a基因的敲除和应用专利的具体信息内容。
1.一种基于CRISPR/Cas9技术的小菜蛾APN3a基因的敲除方法。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，设计并合成小菜蛾APN3a基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以小菜蛾四龄幼虫新鲜蛹蜕的痕量gDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增和直接测序鉴定G0代突变个体，G0代突变个体相互交配获得G1代，直接和TA测序鉴定后选取数量足够且具有相同突变型的杂合子个体进行自交获得G2代，TA测序鉴定得到能稳定遗传的G2代纯合子个体，随后自交获得G3代的APN3a纯合基因突变型种群。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，sgRNA靶标序列设计在小菜蛾APN3a基因编码区的第13个外显子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，sgRNA靶标位点的合成引物为：
CRISPR正向引物如SEQ ID NO. 2所示，以及CRISPR反向引物如SEQ ID NO. 3所示。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA终浓度为150 ng/μl，Cas9蛋白的终浓度为300 ng/μl。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，利用正向引物SEQ ID NO. 4和反向引物SEQ ID NO. 5可以特异性扩增APN3a基因sgRNA靶标位点附近的gDNA序列。
8.一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的小菜蛾APN3a基因敲除试剂盒，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示sgRNA靶标序列和Cas9蛋白。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括配套的检测试剂，用于检测所述基因的剪切效果和评估基因敲除效率。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO.
3所示序列的引物；以及SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示序列的引物。
基于CRISPR/Cas9的小菜蛾APN3a基因的敲除和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及小菜蛾APN3a基因的敲除以及在小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性分子机制研究中的应用。
背景技术
[0002] 小菜蛾Plutella xylostella (L.)属鳞翅目Lepidoptera, 菜蛾科Plutellidae。它是一种主要危害十字花科蔬菜和作物的世界性重大农业害虫，其寄主多达40多种，一年发生多代，繁殖率高，世代重叠现象严重。幼虫在十字花科蔬菜的整个生育期危害叶片，大大降低了蔬菜的产量和质量，严重发生时可减产90%以上，甚至绝收，在世界上每年都引起巨大的经济损失。小菜蛾的危害之所以如此严重是因为其极易对各类杀虫剂产生抗药性，目前小菜蛾已经对50多种杀虫剂产生不同程度的抗药性，抗性谱极广，田间化学防治十分困难。苏云金芽孢杆菌Bt因其对害虫高效、对人畜安全、对环境友好而在世界范围内得到广泛的应用。随着Bt制剂的推广使用和Bt作物的大面积种植，昆虫对Bt的抗性问题受到了普遍的关注。多种因素影响昆虫对Bt的抗性，其中小菜蛾中肠Bt杀虫蛋白受体的突变是目前公认的昆虫Bt抗性的主要原因，现在已经发现的Bt杀虫蛋白潜在受体主要有钙黏蛋白(Cadherin, CAD)、氨基肽酶N (aminopeptidase N, APN)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)以及ABC转运蛋白(ABC transporter subfamily C member 2, ABCC2)等，那么研究这些受体功能对于揭示小菜蛾Bt抗性就显得十分有意义。
[0003] 目前主要鉴定的APN同工酶共被分为8个种类(APN1-8)。APN在昆虫体内的蛋白质水解方面起着至关重要的作用，Ortego等在1996年就有报道称，APN的特异性抑制剂能够显著降低其对酪蛋白的水解作用；Knight等于1994年首次发现烟草天蛾(Manduca sexta)中120 kDa处的APN为Cry1Ac的结合蛋白，随后120 kDa处的APN作为Cry1Ac的受体蛋白在棉铃虫(Helicoverpa armigera)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、烟草天蛾(M. sexta)、家蚕(Bombyx mori)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)和小菜蛾(Plutella xylostella)等等害虫中被发现并得到鉴定。Rakagopal等于2002年利用RNAi技术对斜纹夜蛾的APN基因进行干扰后，发现其幼虫对Cry1C的敏感性发生降低了。Banks等研究发现，在烟芽夜蛾中存在
110 kDa的APN，该蛋白与澳洲棉铃虫(Helicoverpa punctigera)的APN2一样，含有不同的APN保守序列，能与Cry1Ac和Cry1Fa结合。
110 kDa的APN，该蛋白与澳洲棉铃虫(Helicoverpa punctigera)的APN2一样，含有不同的APN保守序列，能与Cry1Ac和Cry1Fa结合。
[0004] CRISPR簇是广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，充当了防御外源遗传物种的“基因武器”。CRISPR全称Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-成簇的规律间隔的短回文重复序列，分布在40%已测序的细菌和90%已测序的古细菌中。CRISPR序列由众多短而保守的重复序列区(repeat)和间隔区(spacer)组成，重复序列区含有回文序列，可以形成发夹结构，而间隔区比较特殊，高度可变，用以俘获外源DNA序列。重复序列区和间隔区分别转录形成tracrRNA (trans-activating crRNA)与crRNA (CRISPR-derived RNA)，两者互补形成具有引导作用的sgRNA (single guide RNA)，指导Cas9核酸酶对靶向DNA双链进行切割切，形成DNA双链断裂(Double-strand break, DSB)，沉默外源基因的表达。CRISPR/Cas9技术是继锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，简称ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)技术之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”，近几年来，该技术也被应用到编辑昆虫的基因组，但是很多与昆虫抗药性相关的基因都是隐性的，如何寻找简便省时的方法筛选及鉴定突变事件的发生是我们所面临的一个巨大的挑战。
发明内容
[0005] 本发明针对现有的小菜蛾Bt抗性分子机制验证方法的不足，提供了一种利用反向遗传学手段CRISPR/Cas9敲除小菜蛾APN3a基因，获得了APN3a基因的纯合突变系，通过Bt毒素Cry1Ac的生物学测定，检测APN3a基因突变的小菜蛾个体对Bt Cry1Ac杀虫蛋白的抗性水平，准确高效的实现了体内验证小菜蛾APN3a基因与Bt Cry1Ac杀虫蛋白的抗性关系。本发明通过应用突变个体及其基因型的无损检测方法，检测出小菜蛾各代的突变情况，将筛选得到的突变个体直接杂交产生下一代， 该方法极大地节省了工作时间与工作量。
[0006] 本发明提供的技术方案是：一种基于CRISPR/Cas9技术的小菜蛾APN3a基因的敲除方法，该方法利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，设计并合成小菜蛾APN3a基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位，以小菜蛾四龄幼虫新鲜蛹蜕的痕量gDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增和直接测序鉴定G0代突变个体，G0代突变个体相互交配获得G1代，直接和TA测序鉴定后选取数量足够且具有相同突变型的杂合子个体进行自交获得G2代，TA测序鉴定得到能稳定遗传的G2代纯合子个体，随后自交获得G3代的APN3a纯合基因突变型种群。
[0007] 进一步地，所述的方法，sgRNA靶标序列设计在小菜蛾APN3a基因编码区的第13个外显子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；sgRNA靶标位点的合成引物为：CRISPR正向引物如SEQ ID NO. 2所示，以及CRISPR反向引物如SEQ ID NO. 3所示。
[0008] 所述的方法，所述sgRNA终浓度为150 ng/μl，Cas9蛋白的终浓度为300 ng/μl。
[0009] 所述的方法，进一步地，利用正向引物SEQ ID NO. 4和反向引物SEQ ID NO. 5可以特异性扩增APN3a基因sgRNA靶标位点附近的gDNA序列。
[0011] 所述的试剂盒，进一步包括配套的检测试剂，用于检测所述基因的剪切效果和评估基因敲除效率。
[0012] 所述的试剂盒，进一步包括SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示序列的引物；以及SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示序列的引物。
[0013] 本发明人设计并合成小菜蛾APN3a基因特异性sgRNA靶标序列，将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到小菜蛾前胚盘期卵后极部位，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统筛选出可稳定遗传的小菜蛾APN3a基因纯合突变种群并用于Bt Cry1Ac杀虫蛋白毒力生物测定，证实小菜蛾APN3a基因突变可以导致其对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生高抗性。本发明方法简单高效，省时省力，不仅为非模式生物体内功能基因的深入研究提供技术支撑，也为探索新的害虫防治策略奠定了基础。
[0014] 本发明应用CRISPR/Cas9基因编辑体系对小菜蛾APN3a基因进行敲除，对于其他非模式生物（尤其农业昆虫）基因编辑体系的建立具有很好的借鉴价值。
[0015] 本发明提供了一种筛选小菜蛾隐性基因突变体的方法，该方法是一种无需破坏任何小菜蛾形体结构的无损基因突变型鉴定方法，简单有效，对于其他类似的昆虫具有很好的借鉴价值。
[0016] 本发明使用CRISPR/Cas9基因编辑系统结合突变个体筛选方法，建立的小菜蛾突变种群为APN3a基因的体内功能研究以及揭示小菜蛾APN3a基因与Bt毒素Cry1Ac之间的关系奠定了基础，为田间昆虫Bt抗性治理和使用反向遗传学手段防治田间害虫提供理论和实践基础，与现有的技术相比，该方法简单快速，节省工作时间与工作量。
[0018] 图1是位于靶标位点附近的一段294-bp的脱氧核苷酸序列，其中斜体加下划线的序列为扩增时使用的引物，分别是正向引物(APN3a-F)和反向引物(APN3a-R)，箭头标明了上下游引物的方向。
[0019] 图2为sgRNA设计图，图中按比例标注了小菜蛾APN3a基因的基因组结构，sgRNA设计在APN3a基因的第13个外显子区域，虚线内的序列代表sgRNA靶标序列的核心片段，下划线标注的是PAM位点，黑色倒三角形代表Cas9切割位点。
[0020] 图3是以蛹蜕的gDNA为模板扩增的294-bp的DNA片段。
[0021] 图4为G1代小菜蛾个体的突变类型，星号为最终获得的纯合突变个体基因型，下划线标注的序列为靶标序列核心区域，黑色倒三角是Cas9切割位点。
[0022] 图5从上到下依次是野生型个体（DBM1Ac-S敏感种群）、杂合子个体以及最终获得的7-bp缺失的（APN3aKO种群）纯合子突变个体的测序峰图，黑色下划线代表纯合突变种群所缺失的7-bp碱基序列，箭头所指的位置为基因编辑开始的位点。
[0023]
具体实施方式
[0024] 、小菜蛾APN3a基因sgRNA靶标序列的设计与合成1.利用Cas-Designer软件(http://www.rgenome.net/cas-designer/)在小菜蛾APN3a基因的特异性区域（第13个外显子）设计sgRNA靶标序列（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示），如图2所示，并搜索小菜蛾DBM-DB基因组数据库(http://59.79.254.1/DBM/index.php)以及CRISPR脱靶效应检测Cas-OFFinder软件(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)，检测潜在的脱靶位点。
[0025] 2.在sgRNA核心位点CGAGACGGCATCGCTACGCC前加上T7启动子序列，在sgRNA核心位点后加上与crRNA/tracrRNA互补的序列，组成sgRNA的完整5′端DNA片段。
[0026] 3.将一段80-bp的crRNA/tracrRNA序列与步骤2中的sgRNA 5′端DNA片段经过PCR变性、退火、延伸合成完整的sgRNA脱氧核苷酸链，采用的引物如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
[0027] CRISPR正向引物(N3-CRI-F)：5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGCGAGACGGCATCGCTACGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′（SEQ ID NO. 2）；
CRISPR反向引物(CRI-R)：5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3′（SEQ ID NO. 3）。
CRISPR反向引物(CRI-R)：5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3′（SEQ ID NO. 3）。
[0028] (1)sgRNA合成：使用TaKaRa公司的 PrimeSTAR Max Premix聚合酶，进行50 μl体系的无模板PCR反应，具体为(10 μM CRISPR-F 2 μl；10 μM CRISPR-R 2 μl；PrimeSTAR Max Premix (2×) 25 μl；ddH2O 21 μl)。
[0029] (2)PCR反应条件为：98 °C 2 min；38个循环 (98 °C 10 s, 70 °C 5 s, 72 °C 30 s)；72 °C 10 min；4 °C ∞。
[0030] (3)应用北京康为世纪生物科技有限公司的DNA clean-up试剂盒对上述PCR产物进行纯化，具体步骤如下： 将步骤3中得到的sgRNA脱氧核苷酸链体外反转录合成sgRNA核苷酸序列。
[0031] (1)sgRNA体外转录：利用Ambion公司的MEGAshortscript T7 High Yield Transcription试剂盒进行体外反转录，按照表1加入相应试剂：表1
试剂 体系
10×T7 Reaction Buffer 2 μl
DNA template 1 μg
10mM ATP 2 μl
10mM CTP 2 μl
10mM GTP 2 μl
10mM UTP 2 μl
T7 Enzyme Mix 2 μl
Nuclease-free Water 至20 μl
轻轻混合反应试剂，37 °C孵育4 h。
试剂 体系
10×T7 Reaction Buffer 2 μl
DNA template 1 μg
10mM ATP 2 μl
10mM CTP 2 μl
10mM GTP 2 μl
10mM UTP 2 μl
T7 Enzyme Mix 2 μl
Nuclease-free Water 至20 μl
轻轻混合反应试剂，37 °C孵育4 h。
[0032] 加入1 μl TURBO DNase，混匀，37 °C孵育15 min，去除DNA模板。
[0033] (2)使用MEGAclear试剂盒纯化sgRNA核苷酸链，具体步骤如下： 加115 μl的DEPC水和15 μl醋酸铵终止液，混匀。
[0034] 加150 μl抽提液（苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1）剧烈震荡，室温静置5 min，4 °C离心15 min，取上清于新管中。
[0035] 加150 μl氯仿，剧烈震荡，室温静置1 min，4 °C离心10 min，取上清于新管中，加300 μl乙醇，轻轻混匀，-20 °C放置30 min。
[0036] 4 °C离心10 min，弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两次，晾干。
[0037] 加30 μl水溶解，-70 °C保存。
[0038] 、小菜蛾卵的显微注射1.显微注射前期实验准备：
(1)使用美国Sutter Instrument公司的P-97拉针仪与日本Narishige公司的EG-401磨针仪制作注射针。
(1)使用美国Sutter Instrument公司的P-97拉针仪与日本Narishige公司的EG-401磨针仪制作注射针。
[0039] (2)交配的小菜蛾应提前2天放出，以便达到产卵高峰期，产卵时要制造黑暗环境，养虫室内温度维持在26-28 °C。
[0041] (4)显微注射前，榨取新鲜甘蓝汁，将玻片浸泡在甘蓝汁中20 min，取出晾干，两个玻片重叠，边缘用封口膜封口，放在产卵的小菜蛾笼中，每隔一个小时收集新鲜的小菜蛾卵。
[0042] (5)显微注射前，配制sgRNA/Cas9混合物，sgRNA与Cas9蛋白浓度分别为715 ng/μl和1000 ng/μl，以至sgRNA与Cas9的终浓度分别为150 ng/μl和300 ng/μl，用灭菌蒸馏水补足至5 μl。
[0043] 2.显微注射：(1)取在黑暗环境下产下的小菜蛾卵，将封上封口膜的玻片展开，使用德国Eppendorf公司的FemtoJet 4i 和 InjectMan 4注射系统进行显微注射，注射时伤口尽量小，将伤害降到最低。
[0044] (2)将注射后的小菜蛾卵放于温度为26 °C，相对湿度为65%的环境中，等待卵孵化，计算孵化率。
[0045] 、突变个体的检测与筛选：(1)共注射DBM1Ac-S品系小菜蛾卵218颗，在G0代注射的小菜蛾卵中有131颗卵孵化，孵化率为60%，在这131个卵中有69个化蛹，提取新鲜蛹蜕的gDNA样品，蛹蜕gDNA提取使用的是KAPA Quick Extract试剂盒(KAPA Biosystems)。
[0047] 表2试剂 体系
10×KAPA Quick Extract Buffer 3 μl
1 U/μl KAPA Quick Extract Enzyme 0.5 μl
PCR-grade water 26.5 μl
应用程序（75 °C 10 min；95 °C 5 min；4°C ∞）进行PCR。
10×KAPA Quick Extract Buffer 3 μl
1 U/μl KAPA Quick Extract Enzyme 0.5 μl
PCR-grade water 26.5 μl
应用程序（75 °C 10 min；95 °C 5 min；4°C ∞）进行PCR。
[0048] 所得PCR产物即为小菜蛾蛹蜕gDNA，于-20°C保存备用。
[0049] (2)利用特异性引物（正向引物APN3a-F，如SEQ ID NO. 4所示；反向引物APN3a-R，如SEQ ID NO. 5所示，具体序列如图1所示）进行PCR反应扩增（表3）sgRNA靶标位点附近序列（图3），将PCR产物直接测序，筛选得到31个杂合突变个体，即G0代的突变率约为45%。
[0050] 表3试剂 体系
10 μM APN3a-F 2 μl
10 μM APN3a-R 2 μl
PrimeSTAR Max Premix (2×) 12.5 μl
gDNA模板 150 ng
ddH2O 至25 μl
(3)将G0代筛选得到的31个突变个体相互杂交，产生G1代，在G1代，得到92个蛹，继续提取新鲜蛹蜕的gDNA样品后，PCR产物直接测序，同时连接北京全式金生物科技有限公司的pEASY-T1克隆载体，转化大肠杆菌，进行TA测序，确定具体突变基因型，如图4所示，G1代杂合突变个体为40个，突变率为43%。
10 μM APN3a-F 2 μl
10 μM APN3a-R 2 μl
PrimeSTAR Max Premix (2×) 12.5 μl
gDNA模板 150 ng
ddH2O 至25 μl
(3)将G0代筛选得到的31个突变个体相互杂交，产生G1代，在G1代，得到92个蛹，继续提取新鲜蛹蜕的gDNA样品后，PCR产物直接测序，同时连接北京全式金生物科技有限公司的pEASY-T1克隆载体，转化大肠杆菌，进行TA测序，确定具体突变基因型，如图4所示，G1代杂合突变个体为40个，突变率为43%。
[0051] (4)选取G1代测序筛选得到的，数量最多的(n=22)且同时含有7-bp (GAGACGG)缺失的杂合子小菜蛾个体进行杂交，产生G2代。
[0052] (5)G2代小菜蛾化蛹后，提取132个新鲜蛹蜕的gDNA样品后，PCR扩增靶标位点附近序列，将PCR产物直接测序，筛选得到28个纯合突变个体，纯合率约为21%。将这些纯合突变个体进行杂交后产生的G3代即为纯合突变种群，如图5所示。
[0053] 四、小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白毒力生物测定(1)使用叶片浸渍法，以原始Bt敏感种群DBM1Ac-S作为阴性对照，将Bt Cry1Ac杀虫蛋白按等比稀释法顺次配制成7个系列浓度（DBM1Ac-S：10 mg/L、5 mg/L、2.5 mg/L、1.25 mg/L、0.625 mg/L、0.3125 mg/L和0.15625 mg/L；APN3aKO：1200 mg/L、600 mg/L、300 mg/L、
150 mg/L、75 mg/L、37.5 mg/L和18.75 mg/L）进行毒力生物测定。
150 mg/L、75 mg/L、37.5 mg/L和18.75 mg/L）进行毒力生物测定。
[0054] (2)毒力生测结果显示，与DBM1Ac-S种群相比，APN3a基因纯合突变种群对Bt Cry1Ac杀虫蛋白的抗性倍数达到了413倍，形成了显著的Cry1Ac抗性表型（表4）。
[0055] 表4. 小菜蛾种群Bt Cry1Ac杀虫蛋白的毒力生物测定种群 数量 LC50 (95%置信区间)a 斜率 卡方（自由度） 相对抗性倍数bDBM1Ac-S 210 0.75 (0.60-0.94) 2.38 ± 0.28 1.38(5) 1.00
APN3aKO 210 259.34 (194.89-333.10) 2.43 ± 0.36 1.82(5) 345.79
aLC50值即为杀死50%小菜蛾幼虫的Cry1Ac杀虫蛋白浓度(mg/L)，若两个种群LC50值的
95%置信区间不重叠视为显著性差异；
b相对抗性倍数=APN3aKO种群的LC50值/DBM1Ac-S种群的LC50值。
APN3aKO 210 259.34 (194.89-333.10) 2.43 ± 0.36 1.82(5) 345.79
aLC50值即为杀死50%小菜蛾幼虫的Cry1Ac杀虫蛋白浓度(mg/L)，若两个种群LC50值的
95%置信区间不重叠视为显著性差异；
b相对抗性倍数=APN3aKO种群的LC50值/DBM1Ac-S种群的LC50值。
[0056] (3)因此，本发明通过CRISPR/Cas9技术，在小菜蛾体内验证了APN3a可以作为Bt Cry1Ac杀虫蛋白的功能性受体，其基因突变可以导致小菜蛾对Bt Cry1Ac杀虫蛋白产生了346倍的高抗性。
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