乙酰激酶ackA基因缺失的应用
阅读：823发布：2020-05-08
专利汇可以提供乙酰激酶ackA基因缺失的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种乙酰激酶ackA基因缺失的应用，属于基因工程技术领域。本发明利用λ-Red重组技术构建鸡白痢沙 门 菌ackA基因缺失株，并对其 生物 学特性和毒 力 进行研究，明确了ackA基因缺失引起鸡白痢沙门菌 毒力 下降；用同样的方法证明ackA基因缺失也能引起肠炎沙门菌毒力下降；为设计鸡白痢沙门菌 疫苗 靶点以及肠炎沙门菌疫苗靶点提供参考，进而防治沙门菌感染。，下面是乙酰激酶ackA基因缺失的应用专利的具体信息内容。
1.乙酰激酶ackA基因缺失用于降低鸡白痢沙门菌的毒力。
2.乙酰激酶ackA基因缺失在鸡白痢沙门菌疫苗中的应用。
3.鸡白痢沙门菌ackA基因缺失株的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)以质粒pKD3为模板，利用引物P1和P2，经PCR扩增，获得cat基因片段；所述引物序列为：
P1：5’-ATGTCGAGTAAGTTAGTACTGGTTCTGAACTGCGGTAGTTCTTCACTGAAATTTGCAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’，SEQ ID NO.1；
P2：5’-CGACTGCATCCAGACGACCGTCCATCAGAGCGGTGTAAGAACCGATGTACTTCGCCAGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’，SEQ ID NO.2；
(2)将cat基因片段电转化进入含有pKD46质粒的ATCC19945感受态细胞中，获得阳性重组子ATCC19945::cat；
(3)利用ATCC19945::cat菌株制备感受态细胞，电转化导入pCP20质粒，得到目的菌株ATCC19945ΔackA；
(4)对目的菌株ATCC19945ΔackA进行PCR验证。
4.乙酰激酶ackA基因缺失用于降低肠炎沙门菌的毒力。
5.乙酰激酶ackA基因缺失在沙门菌疫苗中的应用。
乙酰激酶ackA基因缺失的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及乙酰激酶ackA基因缺失的应用。
背景技术
[0002] 大肠杆菌等肠道菌能够分泌和利用乙酸，这种能力对于细菌在肠道酸性环境下生存，保持竞争优势具有重要意义。细菌乙酸分泌过程主要受Pta-AckA和PoxB通路调控，其中Pta-AckA通路能够快速调控细菌乙酸的合成和消耗，以应对外环境乙酸浓度变化，是乙酸合成的主要途径。此外，在S.aμreμs的研究发现，将Pta-AckA通路灭活，会引起细菌的生长和活力的大幅度下降。揭示了该通路对于细菌的存活能力具有重要意义。
[0003] Pta-AckA通路包含两个关键酶--磷酸乙酰转移酶(Pta)和乙酰激酶(AckA)，两者协同作用，缺一不可。在营养丰富的条件下，Pta可以催化糖代谢产物乙酰辅酶A合成中间分子乙酰磷酸，而AckA进一步催化乙酰磷酸生产乙酸；而在营养贫瘠时，这一过程可逆，细菌可以通过Pta-AckA通路利用环境中的乙酸生成乙酰辅酶A以供给能量。正是由于该通路的存在，细菌才能够在复杂营养环境下得以存活。此外，有研究发现，Pta-AckA通路的中间产物乙酰磷酸盐，参与调控大肠杆菌众多功能性蛋白的乙酰化和磷酸化，揭示Pta-AckA可能与细菌的多种生物学过程相关。
[0004] 基于此，本发明利用Red同源重组方法构建乙酰激酶ackA基因缺失株，并对其生物学特性和毒力进行研究，明确ackA基因缺失与鸡白痢沙门菌毒力之间的关系，为鸡白痢沙门菌疫苗开发提供工具和基础是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种乙酰激酶ackA基因缺失的应用，用于明确ackA基因缺失与沙门菌毒力之间的关系。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 乙酰激酶ackA基因缺失用于降低鸡白痢沙门菌的毒力。
[0008] 进一步，乙酰激酶ackA基因缺失在鸡白痢沙门菌疫苗中的应用。
[0009] 进一步，鸡白痢沙门菌ackA基因缺失株的构建方法，具体步骤如下：
[0010] (1)以质粒pKD3为模板，利用引物P1和P2，经PCR扩增，获得cat基因片段；所述引物序列为：
[0011] P1：5’-ATGTCGAGTAAGTTAGTACTGGTTCTGAACTGCGGTAGTTCTTCACTGAAATTTGCAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’，SEQ ID NO.1；
[0012] P2：5’-CGACTGCATCCAGACGACCGTCCATCAGAGCGGTGTAAGAACCGATGTACTTCGCCAGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’，SEQ ID NO.2；
[0013] (2)将cat基因片段电转化进入含有pKD46质粒的ATCC19945感受态细胞中，获得阳性重组子ATCC19945::cat；
[0014] (3)利用ATCC19945::cat菌株制备感受态细胞，电转化导入pCP20质粒，得到目的菌株ATCC19945ΔackA；
[0015] (4)对目的菌株ATCC19945ΔackA进行PCR验证。
[0016] 进一步，乙酰激酶ackA基因缺失用于降低肠炎沙门菌的毒力。
[0017] 进一步，乙酰激酶ackA基因缺失在沙门菌疫苗中的应用。
[0018] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明利用λ-Red重组技术构建鸡白痢沙门菌ackA基因缺失株，并对其生物学特性和毒力进行研究，明确了ackA基因缺失引起鸡白痢沙门菌毒力下降；用同样的方法证明ackA基因缺失也能引起肠炎沙门菌毒力下降；为设计鸡白痢沙门菌疫苗靶点以及肠炎沙门菌疫苗靶点提供参考，进而防治鸡白痢沙门菌和肠炎沙门菌感染。
附图说明
附图说明
[0019] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0020] 图1附图为本发明鸡白痢沙门菌基因缺失株ATCC19945ΔackA的鉴定；
[0021] 其中，M：DL2000 DNA Marker；1：ATCC19945；2：ATCC19945::cat；3：ATCC19945ΔackA；
[0022] 图2附图为本发明待检菌株在LB中的生长曲线测定；
[0023] 其中，WT：ATCC19945；KO：ATCC19945ΔackA；RS：ATCC19945ΔackA/pBR322-ackA；
[0024] 图3附图为本发明待检菌株在M9培养基中的生长曲线测定；
[0025] 其中，WT：ATCC19945；KO：ATCC19945ΔackA；RS：ATCC19945ΔackA/pBR322-ackA。
具体实施方式
[0026] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027] 鸡白痢沙门菌参考菌株ATCC19945由吉林省出入境检验检疫局王伟利研究员惠赠；肠炎沙门菌C50336，全称CMCC(B)50336，由扬州大学朱国强教授惠赠；pKD3、pKD46、pCP20质粒由吉林农业大学康元环教授惠赠；pBR322质粒由扬州大学朱国强教授惠赠；2×Es Taq MasterMix(Dye)、D2000 plμs DNA ladder购自康为世纪公司；L-阿拉伯糖购自Sigma公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司；健康成年母鸡分离血清由本实验室保存；1日龄健康雏鸡购自河北科技师范学院牧场。
[0028] 实施例1鸡白痢沙门菌ATCC19945ΔackA基因缺失株的构建与鉴定
[0029] (1)根据NCBI登录的鸡白痢沙门菌基因组序列(CP012347.1)设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0030] (2)以pKD3质粒为模板，P1/P2为引物，扩增并纯化cat基因片段。PCR反应体系为(50μl)：引物P1、P2各1μl，dNTPs 5μl，LA-Taq酶1μl，10×buffer 5μl，100倍稀释的pKD3质粒1μl，其余用水补足；PCR反应程序为：94℃预变性5min，30个循环(94℃45s，54℃30s，72℃1.5min)，72℃终延伸10min。反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，获得1149bp大小的条带。
[0031] 其中，P1、P2的引物序列如下：
[0032] P1：5’-ATGTCGAGTAAGTTAGTACTGGTTCTGAACTGCGGTAGTTCTTCACTGAAATTTGCAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’，SEQ ID NO.1；
[0033] P2：5’-CGACTGCATCCAGACGACCGTCCATCAGAGCGGTGTAAGAACCGATGTACTTCGCCAGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’，SEQ ID NO.2。
[0034] 引物P1、P2由两部分组成，5’端下划线部分与ackA基因序列同源，3’端与质粒pKD3氯霉素抗性基因同源。
[0035] (3)将cat基因片段电转化(1.8KV，脉冲25μF，电阻200欧姆)导入含有pKD46质粒的ATCC19945(WT)感受态细胞中；复壮4h后，涂布在含有氯霉素(终浓度为34μg/mL)的平板上。30℃倒置培养，次日挑取单菌落，进行PCR鉴定。
[0036] (4)阳性菌落接种新鲜LB，42℃培养至对数期，菌液划线，对长出的单菌落进行抗生素敏感性测试，选取对氨苄青霉素敏感的菌落，即为一次重组菌株ATCC19945::cat。
[0037] (5)将pCP20质粒电转化入ATCC19945::cat感受态细胞中，产物涂布于含有氨苄青霉素(终浓度为50μg/mL)平板上。对长出的菌落进行PCR鉴定(P3/P4)，阳性克隆于42℃培养，筛选氨苄青霉素敏感菌落，得到二次重组菌株ATCC19945ΔackA。
[0038] 利用引物P3/P4(P3、P4引物位于ackA基因敲除序列外侧，用于ackA基因缺失株的鉴定)对鸡白痢沙门菌野生型菌株ATCC19945、一次重组菌株ATCC19945::cat和二次重组菌株ATCC19945ΔackA进行PCR检测。PCR反应体系为(25μl)：引物P1、P2各1μl，dNTPs 2.5μl，rTaq酶0.5μl，10×buffer 5μl，菌液模板1μl，其余用水补足；PCR反应程序为：94℃预变性5min，30个循环(94℃45s，54℃30s，72℃1.5min)，72℃终延伸10min。结果如图1所示，分别获得1166、1330和400bp大小的条带，与预期大小一致，表明成功从ATCC19945菌株中移除ackA基因，基因缺失株ATCC19945ΔackA(KO)构建成功。
[0039] 其中，P3、P4的引物序列如下：
[0040] P3：5’-ATGTCGAGTAAGTTAGTACTGGTTC-3’；SEQ ID NO.3；
[0041] P4：5’-AGTTCTTCGTTGGTTGGGATC-3’；SEQ ID NO.4。
[0042] 实施例2鸡白痢沙门菌ackA基因回补菌株的构建
[0043] 提取ATCC19945菌株基因组，以其为模板，P5/P6为引物，扩增ackA基因片段。PCR反应体系为(50μl)：引物P1、P2各1μl，dNTPs 5μl，LA-Taq酶1μl，10×buffer 5μl，基因组模板1μl，其余用水补足；PCR反应程序为：94℃预变性5min，30个循环(94℃45s，54℃30s，72℃
1.5min)，72℃终延伸10min。
1.5min)，72℃终延伸10min。
[0044] 其中，P5、P6的引物序列如下：
[0045] P5：5’-CCCAAGCTTATGTCGAGTAAGTTAGTACTGGTTC-3’；Hind III；SEQ ID NO.5；
[0046] P6：5’-CGGGATCCTCAGGCAGTCAGACGGCTC-3’；BamH I；SEQ ID NO.6。
[0047] 将扩增的ackA基因片段克隆至pBR322载体上，构建重组pBR322-ackA回补质粒。将回补质粒转化入缺失株ATCC19945ΔackA中，经PCR鉴定，得到回补菌株ATCC19945ΔackA/pBR322-ackA(RS)。
[0048] 实施例3重组菌生长曲线的测定
[0049] 分别将野生型菌株WT、KO和RS菌株接种液体LB中，37℃培养过夜，次日按1：100比例转接新鲜LB或M9培养基，37℃同步振摇培养；每隔1h吸取菌液样品，测定其吸光度OD600，绘制生长曲线。将三个菌株分别接种于LB培养基，结果如图2所示，待检菌株各时间段的生长趋势基本一致。将三个菌株分别接种于限制培养基M9中，结果如图3所示，ackA基因缺失菌株的生长速度明显低于野生型菌株和回补菌株，表明ackA影响白痢沙门菌在贫瘠营养条件下的生长。
[0050] 实施例4重组菌的耐药性试验
[0051] 根据CLSI药棉试验标准，采用K-B纸片扩散法测定重组菌耐药性，将待检菌株培养至0.5个麦氏浊度，使用灭菌的棉签均匀涂布在MHA平板上，将药敏纸片贴在平板上，37℃倒置培养，次日测定抑菌圈直径并判定结果，结果如表1所示。
[0052] 表1重组菌药敏试验结果
[0053]
[0054] 注：S：高度敏感(抑菌圈直径>15mm)；I：中度敏感(抑菌圈直径10mm～15mm)；R：不敏感(抑菌圈直径<10mm)。
[0055] 表1药物敏感性测试结果显示，ackA基因缺失后，鸡白痢沙门菌ATCC19945对氯霉素、庆大霉素、复方新诺明等抗生素敏感性增加，表明AckA影响白痢沙门菌的抗生素敏感性。
[0056] 实施例5AckA影响白痢沙门菌毒力测定
[0057] 利用1日龄雏鸡模型评估白痢沙门菌各菌株致病力。将160只1日龄白来航雏鸡随机分为11组，每组10只。将37℃摇床培养过夜的WT、KO菌株，进行梯度稀释后，腿肌外侧进行注射攻毒，对照组注射等体积PBS。记录7d试验组雏鸡的死亡数量。利用寇氏法计算半数致死量(LD50)，结果如表2所示。
[0058] 表2待检菌株的LD50检测结果
[0059]
[0060] 表2结果显示，在攻毒后，野生型和回补菌株感染组雏鸡不同程度死亡，而缺失株组和对照组未出现死亡(表2未显示对照组)。根据寇式法计算，野生型LD50为1.65×108CFU，ackA缺失株在7d内未出现死亡。表明ackA基因缺失会引起沙门菌毒力下降。
[0061] 实施例6AckA影响肠炎沙门菌毒力测定
[0062] 用同样的方法构建肠炎沙门菌C50336 ackA基因缺失菌株，利用昆明鼠模型测定ackA基因缺失对肠炎沙门菌C50336菌株毒力的影响。结果显示，肠炎沙门菌C50336对小鼠的LD50为3.16×106CFU，而ackA基因缺失菌株对小鼠的LD50为6.3×109CFU，毒力下降约2000倍。
[0063] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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