诱导针对EGFRvIII的免疫应答的方法和组合物
阅读：1069发布：2020-07-13
专利汇可以提供诱导针对EGFRvIII的免疫应答的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及在受试者中诱导对抗EGFRvIII的T细胞应答的方法。这些方法包括向受试者施用表达至少一种免疫原性多肽的组合物，所述免疫原性多肽的 氨 基酸序列包含多个EGFRvIII多肽序列，所述多个EGFRvIII多肽序列的序列各自包含EEKKGNYV(SEQ ID NO:3)；和/或施用多肽本身。，下面是诱导针对EGFRvIII的免疫应答的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种免疫原性多肽，其氨基酸序列包含至少两个拷贝的EGFRvIII多肽序列，所述EGFRvIII多肽序列的序列各自选自：LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO:2)、EEKKGNYV(SEQ ID NO:
3)、LEEKKGNYV(SEQ ID NO:4)或PASRALEEKKGNYVVTDHGSC(SEQ ID NO:5)，其中每个EGFRvIII多肽序列均与被构造成被蛋白酶体裂解的序列侧接。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述免疫原性多肽的氨基酸序列包含至少3个拷贝的PASRALEEKKGNYVVTDHGSC(SEQ ID NO:5)或至少5个拷贝的PASRALEEKKGNYVVTDHGSC(SEQ ID NO:5)。
3.根据权利要求1-2中的任一项所述的多肽，进一步包含被构造成使所述多肽靶向抗原呈递细胞的细胞表面受体的半族。
4.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-3中的任一项所述的多肽。
5.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子经密码子优化以便被单核细胞增生李斯特菌表达。
6.根据权利要求4或5所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码作为融合蛋白的所述免疫原性多肽，所述融合蛋白包含分泌信号序列。
7.根据权利要求6所述的分离的核酸分子，其中所述分泌信号序列选自由SEQ ID NO:
28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31组成的群组的框内ActA-N100序列。
8.一种组合物，包含细菌或病毒，其包含根据权利要求4-7中的任一项所述的核酸。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述细菌可选地为减毒或灭活但具有代谢活性(KBMA)的单核细胞增生李斯特菌，所述单核细胞增生李斯特菌包含整合到所述细菌的基因组中的所述核酸。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述核酸已被整合到所述细菌的毒力基因中，并且所述核酸序列的整合破坏所述毒力基因的表达或破坏所述毒力基因的编码序列。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述毒力基因为actA或inlB。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述细菌为LmΔactA/ΔinlB。
13.根据权利要求8-12中的任一项所述的组合物，其中所述细菌进一步包含减弱所述细菌修复核酸的能力的基因突变。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述基因突变为选自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD和recA的一种或多种基因中的突变。
15.一种药物组合物，其包含根据权利要求8-14中的任一项所述的组合物或根据权利要求4-7中的任一项所述的核酸。
16.权利要求15所述的药物组合物在制备用于治疗受试者中表达EGFRvIII的肿瘤的药物中的用途，其中所述表达EGFRvIII的肿瘤选自胶质瘤或乳腺癌。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述肿瘤选自胶质瘤。
诱导针对EGFRvIII的免疫应答的方法和组合物
[0001] 相关申请案的交叉参考
[0003] 发明背景
[0004] 提供关于本发明背景的以下讨论只是为了帮助读者理解本发明，并非承认描述或构成本发明的现有技术。
[0005] EGFR3基因(c-erbB-1)在恶性人组织中扩增和过表达。这种扩增经常与基因结构重排相关联，从而导致野生型c-erb-1的细胞内和跨膜结构域中缺乏框内缺失突变体。一类在一些恶性胶质瘤和非小细胞肺癌中鉴定的缺失突变体被称为EGFRvIII。EGFRvIII是这样的突变，其中氨基酸6–273（在细胞外结构域中，残基1是紧接在信号序列之后的残基）缺失，并且甘氨酸插入在残基5与残基274之间。EGFRvIII突变的N-末端10个残基的序列为LEEKKGNYVV(SEQ ID NO:1)。
[0006] 患有表达EGFRvIII的乳腺癌的患者具有可检测的对抗这种肽的体液和细胞免疫应答，揭示它充当免疫原性新抗原。来自这种接合体(LEEKKGNYVVTDH;SEQ ID NO:2)的称为PEPvIII的13氨基酸肽已用于给患有表达EGFRvIII的肿瘤的人免疫接种。在最近公布的研究中，缀合至KLH的PEPvIII被施用给没有显示出进展的放射影像学证据，经完全切除(>95%)、辐射和替莫唑胺(temozolomide)治疗的新诊断的多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者。在
14位经免疫患者中的6位中观察到针对EGFRvIII的体液免疫应答，而17位中的3位表现出阳性DTH应答。用疫苗和替莫唑胺治疗的患者的中位总生存期为从病理诊断时间起的26.0个月，相比之下，仅接受替莫唑胺的匹配队列的中位总生存期仅为15.0个月。这些令人鼓舞的结果支持表达EGFRvIII的疫苗的实用性，并且揭示更强效的疫苗，即诱发稳健、持久、强有力的抗原特异性T细胞应答的疫苗，可改善抗-EGFRvIII应答的强度和持续时间。
14位经免疫患者中的6位中观察到针对EGFRvIII的体液免疫应答，而17位中的3位表现出阳性DTH应答。用疫苗和替莫唑胺治疗的患者的中位总生存期为从病理诊断时间起的26.0个月，相比之下，仅接受替莫唑胺的匹配队列的中位总生存期仅为15.0个月。这些令人鼓舞的结果支持表达EGFRvIII的疫苗的实用性，并且揭示更强效的疫苗，即诱发稳健、持久、强有力的抗原特异性T细胞应答的疫苗，可改善抗-EGFRvIII应答的强度和持续时间。
[0007] 单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogene)是革兰氏阳性细胞内细菌，其因其作为疫苗载体的应用而受到探究。用单核细胞增生李斯特菌感染能诱发杀死单核细胞增生李斯特菌感染的细胞和控制感染所必需的强有力的CD8+T细胞应答。单核细胞增生李斯特菌的减毒提高了该载体的安全性100-1,000倍，同时维持或增强它的免疫原性。该载体可被遗传操纵的简易性，以及简单的生产方法使得单核细胞增生李斯特菌成为癌症疫苗的有引力的平台。
[0008] 本领域中仍然需要刺激针对表达EGFRvIII的恶性肿瘤的有效免疫应答的组合物和方法。发明概要
[0009] 本发明提供了使用重组编码和表达多聚EGFRvIII抗原的细菌递送多聚EGFRvIII抗原疫苗的组合物和方法。
[0010] 在本发明的第一方面，本发明涉及在受试者中诱导对抗EGFRvIII的T细胞应答的方法。这些方法包括向受试者施用包含表达一种或多种免疫性多肽的细菌的组合物，所述免疫性多肽的氨基酸序列包含多个（2、3、4、5，或更多个拷贝）EGFRvIII多肽序列，所述多个（2、3、4、5，或更多个拷贝）EGFRvIII多肽序列的序列各自包含EEKKGNYV(SEQ ID NO:3)。在某些实施方案中，这些EGFRvIII来源的序列可包含LEEKKGNYV(SEQ ID NO:4)、LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO:2)，或PASRALEEKKGNYVVTDHGSC(SEQ ID NO:5)或者由其组成。
如下文所描述，最优选表达一种（多种）本文所描述的免疫性多肽的单核细胞增生李斯特菌细菌。
如下文所描述，最优选表达一种（多种）本文所描述的免疫性多肽的单核细胞增生李斯特菌细菌。
[0011] 如本文还描述的，此类方法可刺激在所述受试者中的针对重组表达的EGFRvIII多肽的免疫应答，包括体液应答和抗原特异性T细胞（CD4+和/或CD8+）应答中的一种或多种。此类多肽产生CD4+和/或CD8+T细胞应答的能力可以通过本文详细描述的以及本领域中熟知的多种方法证实。优选地，当递送给受试者时，本发明组合物诱导选自由IL-12p70、IFN-γ、IL-6、TNFα和MCP-1组成的组的蛋白质中的一种或多种，优选每一种的血清浓度在所述递送后24小时增加；并且诱导对抗EGFRvIII的CD4+和/或CD8+抗原特异性T细胞应答。
[0012] 在本发明的相关方面，本发明涉及可用于在受试者中诱导对抗EGFRvIII的T-细胞应答的组合物。此类组合物包含细菌，所述细菌包含核酸分子，所述核酸分子的序列编码一种或多种免疫原性多肽，所述免疫原性多肽的氨基酸序列包含多个（2、3、4、5或更多个拷贝）EGFRvIII多肽序列，所述多个（2、3、4、5或更多个拷贝）EGFRvIII多肽序列的序列各自包含EEKKGNYV(SEQ ID NO:3)。在某些实施方案中，这些EGFRvIII来源的序列可包含LEEKKGNYV(SEQ ID NO:4)、LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO:2)或PASRALEEKKGNYVVTDHGSC(SEQ ID NO:5)，或者由其组成。如下文所描述的，最优选表达一种（多种）本文所描述的免疫原性多肽的单核细胞增生李斯特菌细菌。在某些实施方案中，编码EGFRvIII来源的序列的核酸序列经密码子优化以在期望细菌中表达。
[0013] 在另一个相关方面，本发明涉及分离的核酸分子，所述分离的核酸分子的序列编码一种或多种免疫原性多肽，所述免疫原性多肽的氨基酸序列包含多个（2、3、4、5或更多个拷贝）EGFRvIII多肽序列，所述多个（2、3、4、5或更多个拷贝）EGFRvIII多肽序列的序列各自包含EEKKGNYV(SEQ ID NO:3)，或其相应的多肽它们自身。在某些实施方案中，这些EGFRvIII来源的序列可包含LEEKKGNYV(SEQ ID NO:4)、LEEKKGNYVVTDH(SEQ ID NO:2)或PASRALEEKKGNYVVTDHGSC(SEQ ID NO:5)或者由其组成。
[0014] 获取合适的免疫原性多肽序列的方法在下文有详细描述。在某些实施方案中，EGFRvIII多肽序列中的至少两个由被构造成被存在于受试者中的蛋白酶加工的多肽接头隔开。举例来说，一个EGFRvIII多肽序列与相邻的EGFR多肽序列可由被构造成被蛋白酶体裂解的序列隔开。在某些实施方案中，每个EGFRvIII多肽序列侧接（并且因此与一个（多个）相邻EGFR多肽序列隔开）被构造成被蛋白酶体裂解的序列。合适的多肽序列及编码它们的核酸序列在下文有详细描述。
[0015] 在某些实施方案中，一种（多种）免疫原性多肽包含一种或多种选自由以下组成的组的“可裂解”氨基酸序列：ASKVL↓ADGSVK、ASKVA↓GDGSIK、LSKVL↓ADGSVK、LAKSL↓ADLAVK、ASVVA↓GIGSIA、GVEKI↓NAANKG，和DGSKKA↓GDGNKK(SEQ ID NOS:6-12)。在这些序列中，抗原序列位于箭头指示的位置处，使得“可裂解”氨基酸序列侧接抗原序列。这些序列可进行组合，使得位于箭头左侧的任何序列可与位于箭头右侧的任何序列组合从而创建新侧接对。
[0016] 也可以创建这些序列的串，例如ASKVL↓ADGSVKASKVA↓GDGSIKLSKVL↓ADGSVKASKVA↓GDGSIKLSKVL↓ADGSVK(SEQ ID NO:13)，同样地，在其中抗原序列位于箭头指示的位置处。为了提高清晰度，这个列表示出加下划线的第一侧接序列、不加下划线的第二侧接序列、加下划线的第三侧接序列、不加下划线的第四侧接序列，及加下划线的第五侧接序列。另一个实例为ASKVL↓ADGSVKDGSKKA↓GDGNKKLSKVL↓ADGSVKDGSKKA↓GDGNKKLSKVL↓ADGSVKDGSKKA↓GDGNKK(SEQ ID NO:14)。这些序列实质上仅为示例性的。合适的蛋白酶体裂解基序详细描述于Toes等人，J.Exp.Med.194:1-12,2001中，其以引用的方式完整地并入本文。还参见Lauer等人，Infect.Immun.76:3742-53,2008；及Sinnathamby等人，(J.Immunother.32:856–69,2009。
[0017] 许多细菌物种已被开发用作疫苗，并且可用作本发明中的疫苗平台，所述细菌物种包括但不限于，弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)或分支杆菌属(mycobacterium)物种。这个列表并非意欲限制。本发明考虑了减毒、共栖，和/或被杀死但具有代谢活性的细菌菌株作为疫苗平台的用途。在优选的实施方案中，该细菌为单核细胞增生李斯特菌，其包含为细菌对本发明EGFRvIII多肽序列的表达编码的核酸序列。这种核酸最优选被整合到细菌的基因组中。特别优选减毒且被杀死但具有代谢活性的形式的单核细胞增生李斯特菌，下文在优选实施方案中描述了在actA和/或inlB中含有减毒突变的单核细胞增生李斯特菌。虽然本发明在本文中针对细菌载体进行描述，但是用于递送靶抗原的合适的物质包括另外的重组载体，例如，病毒，和裸DNA。
[0018] 本文所描述的疫苗组合物可单独地或与药学上可接受的赋形剂组合，以足以诱导合适的免疫应答从而预防或治疗与EGFRvIII表达相关的恶性肿瘤的量施用给宿主。选择用于在受试者中诱导T细胞应答的优选条件包括将疫苗平台静脉内施用给受试者；然而，施用可以为经口施用、静脉内施用、皮下施用、皮肤施用、皮内施用、肌内施用、粘膜施用、肠胃外施用、器官内施用、病灶内施用、鼻内施用、吸入施用、眼内施用、血管内施用、结内施用、通过划痕施用、直肠施用、腹膜内施用，或多种熟知的施用途径中的任何一种或组合。
[0019] 在某些优选的实施方案中，在给受试者施用有效剂量的含有免疫原性多肽的疫苗以激发免疫应答之后，施用第二疫苗。这在本领域中称为“初免-加强”方案。在此种方案中，本发明组合物和方法可用作“初免”递送、用作“加强”递送，或者既用作“初免”递送又用作“加强”递送。此类方案的实例在下文有描述。
[0020] 用于本发明的优选单核细胞增生李斯特菌包含在prfA基因中的突变，其将所表达的prfA转录因子锁定为组成性活性状态。例如，PrfA*突变体(G155S)已被证明在初免-加强静脉内或肌内免疫方案之后增强功能细胞免疫力。
[0021] 在某些实施方案中，本发明EGFRvIII多肽序列被表达为包含框内分泌信号序列的融合蛋白，从而导致它们被细菌分泌为一种（多种）可溶性多肽。许多示例性信号序列在本领域中已知用于细菌表达系统中。在细菌为单核细胞增生李斯特菌的情况下，优选分泌信号序列为单核细胞增生李斯特菌信号序列，最优选ActA信号序列。另外的ActA或其他接头氨基酸也可被表达融合至一种（多种）免疫原性多肽。在优选实施方案中，一种或多种免疫原性多肽被表达为一种（多种）融合蛋白，其包含框内ActA-N100序列（例如选自由SEQ ID NO:37、38和39组成的组）或与所述ActA-N100序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
[0022] 在优选实施方案中，疫苗组合物包含表达包含以下的融合蛋白的单核细胞增生李斯特菌：
[0023] (a)选自由SEQ ID NO:37、38和39组成的组的ActA-N100序列，或与此种ActA-N100序列有至少90%的序列同一性的氨基酸序列；
[0024] (b)包含多个（2、3、4、5或更多个拷贝）EGFRvIII多肽序列的氨基酸序列，所述多个（2、3、4、5或更多个拷贝）EGFRvIII多肽序列的序列各自包含EEKKGNYV(SEQ ID NO:3)；以及[0025] (c)位于至少两个EGFRvIII多肽序列之间的接头氨基酸序列，其中所述接头氨基酸序列被构造用于蛋白酶体裂解，
[0027] 在另一方面，本发明涉及评价小鼠模型系统中的EGFRvIII免疫应答的方法。这些方法包括用EGFRvIII多肽免疫小鼠，以及通过确定对序列——由EEKKGNYV组成的多肽的反应性来评估由此产生的EGFRvIII特异性免疫应答。
[0028] 如上所指出的，在某些实施方案中，编码一种（多种）抗原多肽的核酸序列经密码子优化以便被细菌（例如，单核细胞增生李斯特菌）表达。如下文所描述的，不同的生物体通常显示出“密码子偏倚”，就是说，编码特定氨基酸的给定密码子在遗传密码中出现的程度在生物体之间显著改变。一般而言，基因含有的密码子越稀有，则在所述特定宿主系统内以合理水平表达异源蛋白的可能性就越小。如果稀有密码子出现在簇中或出现在蛋白质的N-末端部分中，则这些水平变得甚至更低。在不修饰氨基酸序列的情况下将稀有密码子置换为更密切地反映宿主系统的密码子偏倚的其他密码子可增加功能蛋白表达的水平。密码子优化的方法在下文有描述。
[0029] 应理解，本发明的应用不局限于以下描述中阐述或图中示出的构建细节和组分布置。本发明能够以除所描述的那些方式以外的方式来实施，并且能够以多种方式实践与执行。此外，应理解，本文中使用的措辞和术语，以及摘要用于描述的目的，而不应当视为限制。
[0030] 因此，本领域技术人员将意识到，本公开基于的概念可容易地被用作设计用于执行本发明数个目的的其他结构、方法和系统的基础。因此重要的是，权利要求书被认为包括此类等价构建，只要它们不偏离本发明的精神和范围。
[0032] 图1示意性示出用于本发明的示例性表达盒。
[0033] 图2示出证明重组李斯特菌属表达EGFRvIII抗原的蛋白质印迹结果。
[0034] 图3示出通过用重组李斯特菌属免疫诱导的EGFRvIII抗原-特异性CD8+T细胞。
[0035] 图4示出在用重组李斯特菌属免疫后从B3Z T细胞激活测定获得的结果。
[0036] 图5示出在用重组李斯特菌属免疫后针对对抗特异性EGFRvIII肽的反应性筛选CD8+T细胞获得的结果。
[0037] 图6示出从测量在EGFRvIII肽结合后I类表达的诱导的T2细胞测定中获得的结果。
[0038] 图7示出相对于单拷贝变异体而言，在用表达多个拷贝的EGFRvIII20-40的重组李斯特菌属免疫之后增强的CD8+T细胞初免。
[0039] 发明详述
[0040] 本发明涉及使用编码并表达多个拷贝的来源于EGFRvIII的抗原的细菌递送免疫治疗的组合物和方法。
[0041] 应理解，本发明的应用不局限于以下描述中阐述或图中示出的构建细节和组分布置。本发明能够以除所描述的那些方式以外的方式来实施，并且能够以多种方式实践与执行。此外，应理解，本文中使用的措辞和术语，以及摘要用于描述的目的，而不应当视为限制。
[0042] 因此，本领域技术人员将意识到，本公开基于的概念可容易地被用作设计用于执行本发明数个目的的其他结构、方法和系统的基础。因此重要的是，权利要求书应被视为包括此类等价构建，只要它们不偏离本发明的精神和范围。
[0043] 1.定义
[0044] 用于表示基因中的突变或包含基因的细菌中的突变的缩写如下所示。举例来说，缩写“单核细胞增生李斯特菌ΔactA”是指actA基因的部分或全部缺失。Delta符号(Δ)是指缺失。包括上标负号的缩写（李斯特菌属ActA-)是指actA基因突变，例如通过缺失、点突变，或移码突变的方式进行的突变，但不限于这些类型的突变。
[0045] 在应用于人、哺乳动物、哺乳动物受试者、动物、兽类受试者、安慰剂受试者、研究受试者、试验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，“施用”非限制性指使外源配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物接触受试者、细胞、组织、器官或生物流体等。“施用”可指，例如，治疗、药物动力学、诊断、研究、安慰剂和试验方法。细胞的处理包括使试剂接触细胞，以及使试剂接触流体，其中流体接触细胞。“施用”还包括利用试剂、诊断、结合组合物或利用另一细胞对例如细胞进行的体外和离体处理。
[0046] 在涉及配体和受体时，“激动剂”包含剌激受体的分子、分子组合、络合物或试剂组合。例如，粒-巨噬细胞集落剌激因子(GM-CSF)的激动剂可包括GM-CSF、GM-CSF的突变蛋白或衍生物、GM-CSF的肽模拟物、模拟GM-CSF的生物功能的小分子，或剌激GM-CSF受体的抗体。
[0047] 在涉及配体和受体时，“拮抗剂”包含抑制、抵消、下调和/或脱敏受体的分子、分子组合，或络合物。“拮抗剂”包括抑制受体的组成性活性的任何试剂。组成性活性是在不存在配体/受体相互作用的情况下显现的活性。“拮抗剂”还包括抑制或防止受体的受剌激（或受调节）活性的任何试剂。举例来说，GM-CSF受体的拮抗剂包括但不限于：结合配体(GM-CSF)并防止其结合受体的抗体，或结合受体并防止配体结合受体的抗体，或其中抗体以失活构象锁住受体。
[0048] 如本文中使用的，关于肽、多肽或蛋白质的“类似物”或“衍生物”是指具有与初始肽、多肽或蛋白质的功能类似或相同的功能的另一种肽、多肽或蛋白质，但其不必包含与初始肽、多肽或蛋白质的氨基酸序列或结构类似或相同的氨基酸序列或结构。类似物优选满足下列中的至少一种：(a)具有与初始氨基酸序列有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的同一性的氨基酸序列的蛋白质剂；(b)由核苷酸序列编码的蛋白质剂，所述核苷酸序列在严格条件下与编码初始氨基酸序列的核苷酸序列杂交；和(c)由核苷酸序列编码的蛋白质剂，所述核苷酸序列与编码初始氨基酸序列的核苷酸序列具有至少30%、至少
35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的同一性。
35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的同一性。
[0049] “抗原呈递细胞”(APC)是用于呈递抗原至T细胞的免疫系统的细胞。APC包括树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、边缘区Kupffer细胞、小胶质细胞、朗氏细胞(Langerhans cell)、T细胞，和B细胞。树突细胞产生在至少两个谱系中。第一谱系包括DC1前体、骨髓DC1和成熟DC1。第二谱系包括CD34+CD45RA-早期祖多能细胞、CD34+CD45RA+细胞、CD34+CD45RA+CD4+IL-3Rα+促-DC2细胞、CD4+CD11c-类浆细胞性DC2前体细胞、淋巴人DC2类浆细胞源性DC2、和成熟DC2。
[0050] “减毒”和“减毒的”包括经修饰以减少对宿主的毒性的细菌、病毒、寄生虫、感染生物体、朊病毒、肿瘤细胞、感染生物体中的基因等。宿主可为人或动物宿主、或器官、组织或细胞。为了给出非限制性实例，可使细菌减毒以减少与宿主细胞的结合，以减少从一种宿主细胞扩散至另一宿主细胞，以减少细胞外生长，或以减少在宿主细胞中的细胞内生长。减毒可通过测量例如一种或多种毒性指标、LD50、从器官的清除率，或竞争指数来评估（例如参见Auerbuch，等人(2001)Infect.Immunity69:5953-5957）。一般地，减毒导致LD50增加和/或清除率增加至少25%；更一般地，增加至少50%；最一般地，增加至少100%（2-倍）；正常增加至少5-倍；更正常增加至少10-倍；最正常增加至少50-倍；经常增加至少100-倍；更经常增加至少500-倍；及最经常增加至少1000-倍；通常增加至少5000-倍；更通常增加至少10,000-倍；
及最通常增加至少50,000-倍；以及最经常增加至少100,000-倍。
及最通常增加至少50,000-倍；以及最经常增加至少100,000-倍。
[0051] “减毒基因”包括介导对宿主的毒性、病理或毒力，在宿主内生长，或在宿主内存活的基因，其中所述基因以减轻、减少或消除毒性、病理或毒力的方式突变。减少或消除可通过比较由突变基因介导的毒力或毒性与由非突变（或母体）基因介导的毒力或毒性来评价。“突变基因”包括基因的调节区、基因的编码区、基因的非编码区、或其任意组合中的缺失、点突变和移码突变。
[0052] “保守性修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守性修饰的变体是指编码相同氨基酸序列，或具有一个或多个保守性置换的氨基酸序列的核酸。保守性置换的实例是将下列组的一个组中的氨基酸替换为同一组中的另一氨基酸（授予Lee,等人的美国专利第5,767,063号，Kyte和Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157:105-132）。
[0053] (1)疏水性：正亮氨酸、Ile、Val、Leu、Phe、Cys、Met；
[0054] (2)中等亲水性：Cys、Ser、Thr；
[0055] (3)酸性：Asp、Glu；
[0056] (4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
[0057] (5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
[0058] (6)芳族：Trp、Tyr、Phe；以及
[0059] (7)小氨基酸：Gly、Ala、Ser。
[0060] “有效量”包括但不限于可改善、逆转、缓和、预防或诊断医学病状或病症的症状或迹象的量。除非另外明确地或根据上下文说明，否则“有效量”不限于足以改善病状的最小量。
[0062] 在多肽上下文中的术语“片段”包括肽或多肽，其包含下列的氨基酸序列：较大多肽的氨基酸序列的至少5个邻接的氨基酸残基、至少10个邻接的氨基酸残基、至少15个邻接的氨基酸残基、至少20个邻接的氨基酸残基、至少25个邻接的氨基酸残基、至少40个邻接的氨基酸残基、至少50个邻接的氨基酸残基、至少60个邻接的氨基酸残基、至少70个邻接的氨基酸残基、至少80个邻接的氨基酸残基、至少90个邻接的氨基酸残基、至少100个邻接的氨基酸残基、至少125个邻接的氨基酸残基、至少150个邻接的氨基酸残基、至少175个邻接的氨基酸残基、至少200个邻接的氨基酸残基，或至少250个邻接的氨基酸残基。
[0063] “基因”是指编码寡肽或多肽的核酸序列。寡肽或多肽可以为有生物活性的、有抗原活性的、无生物活性的，或无抗原活性的寡肽或多肽等。术语基因包括例如编码特异性寡肽或多肽的开放阅读框(ORF)的总和；ORF加编码内含子的核酸的总和；ORF和一种（多种）可操作地连接的启动子的总和；ORF和一种（多种）可操作地连接的启动子与任何内含子的总和；ORF和一种（多种）可操作地连接的启动子、一种（多种）内含子和一种（多种）启动子与其他调节元件例如增强子的总和。在某些实施方案中，“基因”包括用于顺式调节基因表达所需的任何序列。术语基因还可指编码这样的肽的核酸，所述肽包括肽、寡肽、多肽或蛋白质的抗原或有抗原活性的片段。术语基因不一定暗指编码的肽或蛋白质具有任何生物活性，或甚至肽或蛋白有抗原活性。编码非可表达的序列的核酸序列一般被认为是假基因。术语基因还包括编码核糖核酸例如rRNA、tRNA或核酶的核酸序列。
[0064] 细菌例如李斯特菌属的“生长”包括但不限于涉及定殖、复制、蛋白质含量增加和/或脂质含量增加的细菌生理学和基因的功能。除非另外明确地或根据上下文说明，否则李斯特菌属的生长包括细菌在宿主细胞外部的生长，还包括细菌在宿主细胞内部的生长。生长相关基因包括但不限于，介导能量产生（例如糖酵解、三羧酸循环、细胞色素），氨基酸、糖、脂质、矿物质、嘌呤和嘧啶的合成代谢和/或分解代谢，营养物运输，转录，翻译和/或复制的基因。在一些实施方案中，李斯特菌属细菌的“生长”是指李斯特菌属细菌的细胞内生长，即，在宿主细胞例如哺乳动物细胞内部的生长。尽管李斯特菌属细菌的细胞内生长可通过光学显微术或集落形成单元(CFU)测定法来测量，但是生长不受任何测量技术限制。生物化学参数例如李斯特菌属抗原、李斯特菌属核酸序列，或李斯特菌属细菌特异性脂质的量可用于评估生长。在一些实施方案中，介导生长的基因是特异性地介导细胞内生长的基因。在一些实施方案中，特异性地介导细胞内生长的基因包括但不限于，其中基因失活降低细胞内生长速率但没有可检测地、实质上地或可察觉地降低细胞外生长（例如在肉汤中的生长）速率的基因，或其中基因失活降低细胞内生长速率的程度大于其降低细胞外生长速率的程度的基因。为了提供非限制性实例，在一些实施方案中，其中失活降低细胞内生长速率的程度大于其降低细胞外生长的程度的基因包括这样的情况，其中失活降低细胞内生长至小于正常或最大值的50%，但是仅降低细胞外生长至最大值的1-5%、5-10%或10-15%。在某些方面，本发明包括在细胞内生长减弱但在细胞外生长不减弱的李斯特菌属、在细胞内生长不减弱且在细胞外生长不减弱的李斯特菌属、以及在细胞内生长不减弱但在细胞外生长减弱的李斯特菌属。
[0065] “嗜水性分析”是指通过Kyte和Doolittle:"A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein".J.Mol.Biol.157(1982)105-132的方法分析多肽序列。在这种方法中，给予每种氨基酸介于4.6和-4.6之间的疏水性分数。4.6的分数是最具疏水性，而-4.6的分数是最具亲水性。然后设定窗口大小。窗口大小是这样的氨基酸的数量，该氨基酸的疏水性分数将被平均化并被分配给所述窗口中的第一氨基酸。计算开始于氨基酸的第一窗口，并且计算该窗口中所有疏水性分数的平均值。然后窗口向一种氨基酸的下方移动并计算第二窗口中所有疏水性分数的平均值。这种模式继续至蛋白质末端，从而计算每个窗口的平均分数并将其分配至窗口中的第一氨基酸。然后将平均值绘制成图表。y轴表示疏水性分数，x轴表示窗口号。下列疏水性分数用于20种常见氨基酸。
[0066]
[0067] “标记的”组合物可通过光谱法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、同位素法或化学方法直接或间接检测。例如，有用的标记包括32P、33P、35S、14C、3H、125I、稳定同位素、表位标签、荧光染料、电子-致密试剂、底物，或酶（例如如在酶联免疫测定中使用的酶），或fluorette（例如参见Rozinov和Nolan(1998)Chem.Biol.5:713-728）。
[0068] “配体”是指作为受体的激动剂或拮抗剂的小分子、肽、多肽、或者膜缔合或膜结合分子。“配体”还包括不是激动剂或拮抗剂并且不具有激动剂或拮抗剂性质的结合剂。按照惯例，如果配体膜结合于第一细胞上，则受体通常产生在第二细胞上。第二细胞可具有与第一细胞相同的特性（相同的名称），或它可具有与第一细胞不同的特性（不同的名称）。配体或受体可完全在细胞内，即，它可存在于胞液、细胞核中或存在于一些其他细胞内隔室中。配体或受体可改变其位置，例如从细胞内隔室改变至血浆膜的外面。配体和受体的络合物称为“配体受体络合物”。如果配体和受体涉及信号传导途径，则配体产生在信号传导途径的上游位置，而受体产生在信号传导途径的下游位置。
[0069] “核酸”是指单链、双链形式、或多链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。核酸的非限制性实例为例如cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸。特定核酸序列还可隐含地包括“等位基因变体”和“剪接变体”。
[0070] 在编码mRNA的启动子和核酸的上下文中的“可操作地连接”意指启动子可用于启动该核酸的转录。
[0071] 术语“序列同一性百分比”和“%序列同一性”是指通过比较或比对两种或更多种氨基酸或核酸序列而发现的序列类似性的百分比。同一性百分比可通过如下方式确定：通过比对序列而直接比较两种分子之间的序列信息，对两种比对的序列之间的精确匹配数进行计数，除以较短序列的长度，并且将结果乘以100。用于计算序列同一性的算法是Smith-Waterman同源性搜索算法（参见例如Kann和Goldstein(2002)Proteins48:367-376；Arslan，等人(2001)Bioinfomatics17:327-337)。
[0072] 当涉及多肽时，“纯化的”和“分离的”意指该多肽在基本上不存在在自然界中与其相关联的其他生物大分子的情况下存在。如本文中所使用的术语“纯化的”意指鉴定的多肽经常占本发明多肽的至少50重量%，更经常占至少60重量%，典型地占至少70重量%，更典型地占至少75重量%，最典型地占至少80重量%，通常占至少85重量%，更通常占至少90重量%，最通常占至少95重量%，并且常规地占至少98重量%或更大。在多肽纯度的测定中一般不使用水、缓冲液、盐、洗洁剂、还原剂、蛋白酶抑制剂、稳定剂（包括加入的蛋白例如白蛋白），和赋形剂，及分子量小于1000的分子的重量。参见例如授于Covacci等人的美国专利第6,090,611号中关于纯度的讨论。
[0073] “肽”是指氨基酸的短序列，其中氨基酸通过肽键彼此连接。肽可以游离或者与另一半族，例如大分子、脂质、寡糖或多糖，和/或多肽结合的形式出现。在肽被掺入到多肽链中时，术语“肽”仍可用于具体地指氨基酸的短序列。“肽”可经由肽键或一些其他类型的连键与另一半族连接。肽的长度为至少两个氨基酸，并且一般长度小于约25个氨基酸，其中最大长度随惯例或上下文而变。术语“肽”和“寡肽”可互换地使用。
[0074] “蛋白质”一般是指包含多肽链的氨基酸的序列。蛋白质还可指多肽的三维结构。“变性蛋白质”是指具有一些残余三维结构的部分变性的多肽，或替代地，基本上任意的三维结构，即全部变性。本发明包括多肽变体的试剂和使用多肽变体的方法，例如涉及糖基化、磷酸化、硫酸化、二硫键形成、脱酰胺、异构化、信号或前导序列加工中的分裂点、共价和非共价键合的辅助因子、氧化的变体等。二硫基连接的蛋白质的形成已被描述（例如参见Woycechowsky和Raines(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4:533-539；Creighton，等人(1995)Trends Biotechnol.13:18-23）。
[0075] 当针对例如核酸、细胞、动物、病毒、质粒、载体等使用时，“重组”表示通过引入外源非天然核酸、改变天然核酸，或者通过全部或部分地来源于重组核酸、细胞、病毒、质粒或载体来修饰。重组蛋白质是指来源于例如重组核酸、病毒、质粒、载体等的蛋白质。“重组细菌”包括其中基因组用重组方法工程化，例如通过突变、缺失、插入和/或重排工程化的细菌。“重组细菌”还包括经修饰以包括重组基因组外核酸，例如质粒或第二染色体的细菌，或者其中现有基因组外核酸发生改变的细菌。
[0076] “样品”是指来自人、动物、安慰剂或研究样品的样品，例如细胞、组织、器官、流体、气体、气溶胶、浆料、胶体或凝聚材料。“样品”可在体内测试，例如无需从人或动物中除去，或者它可在体外测试。样品可在加工后，例如通过组织学方法测试。“样品”还指例如包含流体或组织样品的细胞，或从流体或组织样品分离的细胞。“样品”还可指从人或动物新鲜提取的细胞、组织、器官或流体，或者是指经加工或储存的细胞、组织、器官或流体。
[0077] “可选择标记”包括允许对或针对含有可选择标记的细胞进行选择的核酸。可选择标记的实例包括但不限于例如：(1)编码对其他毒性化合物提供抗性的产物（例如抗菌素）的核酸，或编码对其他有害化合物敏感的产物（例如蔗糖）的核酸；(2)编码受体细胞中缺乏的产物（例如tRNA基因、营养缺陷型标记）的核酸；(3)编码抑制基因产物的活性的产物的核酸；(4)编码可容易地鉴定的产物（例如表型标记，例如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)、细胞表面蛋白、表位标签、FLAG标签）的核酸；(5)可通过杂交技术例如PCR或分子信标鉴定的核酸。
[0078] 当涉及配体/受体、核酸/互补核酸、抗体/抗原，或其他结合对（例如细胞因子与细胞因子受体）时，“特异性地”或“选择性地”结合是指决定蛋白质在蛋白质异质群体和其他生物制剂中的存在形式的结合反应。因此，在指定条件下，具体指定的配体结合特定受体，并且不以显著的量结合样品中存在的其他蛋白质。特异性结合也可意指，例如在所涵盖的方法中的来源于抗体的抗原-结合位点的结合化合物、核酸配体、抗体或结合组合物与其靶结合的亲和力比与任何其他结合化合物的亲和力经常大至少25%，更经常大至少50%，最经常大至少100%（2-倍），正常大至少10倍，更正常大至少20-倍，最正常大至少100-倍。
[0079] 在典型实施方案中，例如如通过Scatchard分析（Munsen，等人(1980)9
Analyt.Biochem.107:220-239）测定的，抗体的亲和力大于约10升/mol。熟练技术人员应认识到，一些结合化合物可特异性地结合多于一种靶，例如抗体特异性地结合其抗原、经由抗体的寡糖结合外源凝集素，和/或经由抗体的Fc区结合Fc受体。
Analyt.Biochem.107:220-239）测定的，抗体的亲和力大于约10升/mol。熟练技术人员应认识到，一些结合化合物可特异性地结合多于一种靶，例如抗体特异性地结合其抗原、经由抗体的寡糖结合外源凝集素，和/或经由抗体的Fc区结合Fc受体。
[0080] 细菌的“扩散”包括如例如由囊泡介导的“细胞至细胞扩散”，即，细菌从第一宿主细胞传递至第二宿主细胞。涉及扩散的功能包括但不限于，例如肌动蛋白尾的形成、假足状延长(pseudopod-like extension)的形成和双膜液泡的形成。
[0081] 如本文中使用的术语“受试者”是指人或非-人生物体。因此，本文所描述的方法和组合物可适用于人和兽类疾病。在某些实施方案中，受试者是“患者”，即因为疾病或病状接受医学护理的活人。这包括未患有确定的疾病，因病理迹象而被调查的人。优选患有表达EGFRvIII的恶性肿瘤的受试者。在某些实施方案中，受试者罹患胶质瘤（例如，GBM）、头部和颈部鳞状细胞癌、大肠癌，或乳腺癌。
[0082] 重组酶的“靶位”是重组酶识别、结合和/或作用的核酸序列或区域（例如参见授予Graham等人的美国专利第6,379,943号；Smith和Thorpe(2002)Mol.Microbiol.44:299-307；Groth和Calos(2004)J.Mol.Biol.335:667-678；Nunes-Duby，等人(1998)Nucleic Acids Res.26:391-406）。
[0083] “治疗有效量”被定义为足以表现出患者益处，即减轻、抑制或改善受治疗病状的症状的试剂或药物组合物的量。当试剂或药物组合物包含诊断剂时，“诊断有效量”被定义为足以产生信号、图像或其他诊断参数的量。药物制剂的有效量将根据多种因素而改变，例如个体的敏感程度、个体的年龄、性别和体重，以及个体的特异体质应答（参见例如授于Netti等人的美国专利第5,888,530号）。
[0084] “治疗”（“Treatment”或“treating”）（就病状或疾病而言）是用于获得有益或期望结果（包括并优选临床结果）的途径。对于本发明的目的，关于疾病的有益或期望结果包括但不限于下列的一种或多种：改善与疾病相关的病状、治愈疾病、减缓疾病的严重性、延迟疾病的进展、缓和与疾病相关的一种或多种症状、提高患有疾病的患者的生活质量，和/或延长存活期。同样，对于本发明的目的，关于病状的有益或期望结果包括但不限于下列的一种或多种：改善病状、治愈病状、减缓病状的严重性、延迟病状的进展、缓和与病状相关的一种或多种症状、提高患有病状的患者的生活质量，和/或延长存活期。
[0085] “疫苗”包括预防疫苗。疫苗还包括治疗疫苗，例如施用给哺乳动物的疫苗，所述哺乳动物具有与由疫苗提供的抗原或表位相关的病状或病症。
[0086] 2.示例性EGFRvIII抗原
[0087] EGFRvIII抗原可包含编码至少一种MHC I类表位和/或至少一种MHC II类表位的序列。预测算法“BIMAS”根据肽/HLA络合物的预测半衰期解离将潜在HLA结合表位分等级。“SYFPEITHI”算法根据说明初级和次级HLA-结合锚定残基的分数将肽分等级。这两种计算机化算法给基于给定蛋白质内的氨基酸序列的候选表位评分，所述候选表位具有与此前公布的HLA结合表位类似的结合基序。其他算法也可用于鉴定用于进一步生物测试的候选物。
[0088] 如上所指出的，本发明的EGFRvIII抗原肽包含多个（2、3、4、5，或多个拷贝）EGFRvIII多肽序列，其序列各自包含EEKKGNYV(SEQ ID NO:3)。这个序列代表H2-Kk-限制性表位。优选的EGFRvIII序列包含多个拷贝的在本文称为EGFRvIII20-40的序列PASRALEEKKGNYVVTDHGSC(SEQ ID NO:4)。这个21-AA序列跨越由相对于天然EGFR的267-AA缺失创建的新接合体。这也增加了找到I-类结合表位的机会，所述I-类结合表位包括在EGFRvIII剪接位点处的新型甘氨酸（45种独特的在EGFRvIII20-40内的7至11-AA新肽与22种在PEPvIII内的潜在I-类结合肽），而不包括过多量的天然EGFR序列。另外，这种扩充的EGFRvIII肽增加了潜在II-类结合表位（30种在EGFRvIII20-40中的>9-AA新肽与11种在PEPvIII中的肽）的数目，但是疫苗效价不一定取决于EGFRvIII-特异性II类限制性表位的存在。
[0089] 如下文所描述的，抗原剂量是疫苗效价的关键性决定因素。为了使免疫接种后EGFRvIII肽-MHC络合物的数量最大，优选至少5个拷贝的EGFRvIII多肽序列包括在单一蛋白质构建体中，其中每个拷贝由预测将促进蛋白酶体裂解的序列隔开。作为一个实例，此种氨基酸序列可为ASKVLPASRALEEKKGNYVVTDHGSCADGSVKTSASKVAPASRALEEKKGNYVVTDHGSCGDGSIKLSKVLPASRALEEKKGNYVVTDHGSCADGSVKASKVAPASRALEEKKGNYVVTDHGSCGDGSIKLSKVLPASRALEEKKGNYVVTDHGSCADGSVKTS(SEQ ID NO:15)。为了清楚起见，在这个序列中，示例性EGFRvIII-来源的多肽序列加有下划线，而示例性“可裂解”序列未加下划线。
[0090] 如本文中所使用的术语“免疫原性”意指抗原能够诱发抗原特异性体液或T-细胞应答（CD4+和/或CD8+）。用于本发明疫苗组合物的一种或多种抗原或其衍生物的选择可以多种方式执行，包括评估选择的细菌成功表达和分泌一种（多种）重组抗原的能力；和/或所述一种（多种）重组抗原引发抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞应答的能力。如下文所讨论的，为了完成用于与特定细菌递送媒介一起使用的一种（多种）抗原的最终选择，优选将所述一种（多种）重组抗原的这些属性与完整疫苗平台（意指针对所选的一种（多种）抗原的所选细菌表达系统）引发先天免疫应答及针对一种（多种）重组表达的抗原的抗原特异性T细胞应答的能力组合。合适抗原的初始测定可通过选择由所选择的细菌宿主（例如，李斯特菌属）成功地重组表达并且具有免疫原性的一种（多种）抗原或一种（多种）抗原片段来进行。
[0091] 经由蛋白质印迹对重组抗原表达的直接检测可使用检测重组产生的抗原序列的抗体，或者使用检测与EGFRvIII-来源的抗原一起作为融合蛋白被表达的引入序列(included sequence（)“标签”）的抗体执行。例如，一种（多种）抗原可与李斯特菌属ActA蛋白质的N-末端部分一起作为融合体被表达，并且针对对应于ActA的成熟N末端18个氨基酸的合成肽(ATDSEDSSLNTDEWEEEK(SEQ ID NO:27))产生的抗-ActA抗体可用来检测表达的蛋白质产物。
[0092] 用于测试抗原的免疫原性的测定在本文有描述并且是本领域中熟知的。举例来说，由选择的细菌重组产生的抗原可任选地被构建成含有编码八个氨基SIINFEKL(SEQ ID NO:28)肽（也称为SL8和卵白蛋白257-264）、位于抗原的羧基末端的框内的核苷酸序列。诸如C-末端SL8表位的组成起到代用品的作用以：(i)证明重组抗原从N-末端至C-末端全部表达；及(ii)使用体外抗原呈递测定经由MHC I类途径来证明抗原呈递细胞呈递重组抗原的能力。此种呈递测定可使用克隆的C57BL/6-来源的树突细胞系DC2.4以及B3Z T细胞杂交瘤细胞系来进行，如下文所描述。
[0093] 替代地或另外地，可使用如下文所描述的ELISPOT测定测试免疫原性。ELISPOT测定最初开发用于对分泌抗原-特异性抗体的B细胞进行计数，但随后已被修改用于多种任务，尤其是在单细胞水平上对产生细胞因子的细胞进行鉴定和计数。可从用合适的细菌疫苗接种的动物中收获脾，并且将分离的脾在存在或不存在来源于细菌疫苗表达的一种或多种EGFRvIII抗原的肽的情况下温育过夜。固定化抗体捕获任何分泌的IFN-γ，因此允许随后测量分泌的IFN-γ和评估对疫苗的免疫应答。
[0094] 3.重组表达系统-“疫苗平台”
[0095] 用于递送抗原的疫苗平台的选择是有效疫苗的关键组分。重组载体使用本领域中已知的标准技术制备，并且含有可操作地连接至编码靶抗原的核酸序列的合适的控制元件。参见，例如，Plotkin，等人（编）(2003)Vaccines，第4版，W.B.Saunders,Co.,Phila.,PA.；Sikora，等人（编）(1996)Tumor Immunology Cambridge University Press,Cambridge,UK；Hackett和Harn（编）Vaccine Adjuvants,Humana Press,Totowa,NJ；
Isaacson（编）(1992)Recombinant DNA Vaccines,Marcel Dekker,NY,NY；Morse，等人（编）(2004)Handbook of Cancer Vaccines,Humana Press,Totowa,NJ),Liao，等人(2005)
Cancer Res.65:9089-9098；Dean(2005)Expert Opin.Drug Deliv.2:227-236；Arlen，等人(2003)Expert Rev.Vaccines2:483-493；Dela Cruz，等人(2003)Vaccine21:1317-1326；
Johansen，等人(2000)Eur.J.Pharm.Biopharm.50:413-417；Excler(1998)Vaccine16:
1439-1443；Disis，等人(1996)J.Immunol.156:3151-3158)。肽疫苗已被描述（参见例如McCabe，等人(1995)Cancer Res.55:1741-1747；Minev，等人(1994)Cancer Res.54:4155-
4161；Snyder，等人(2004)J.Virology78:7052-7060）。
Isaacson（编）(1992)Recombinant DNA Vaccines,Marcel Dekker,NY,NY；Morse，等人（编）(2004)Handbook of Cancer Vaccines,Humana Press,Totowa,NJ),Liao，等人(2005)
Cancer Res.65:9089-9098；Dean(2005)Expert Opin.Drug Deliv.2:227-236；Arlen，等人(2003)Expert Rev.Vaccines2:483-493；Dela Cruz，等人(2003)Vaccine21:1317-1326；
Johansen，等人(2000)Eur.J.Pharm.Biopharm.50:413-417；Excler(1998)Vaccine16:
1439-1443；Disis，等人(1996)J.Immunol.156:3151-3158)。肽疫苗已被描述（参见例如McCabe，等人(1995)Cancer Res.55:1741-1747；Minev，等人(1994)Cancer Res.54:4155-
4161；Snyder，等人(2004)J.Virology78:7052-7060）。
[0096] 合适的病毒来源的抗原递送载体包括病毒、经修饰病毒，和病毒粒子。可将病毒来源的载体直接施用给哺乳动物受试者，或者可将其离体引入到抗原呈递细胞(APC)中，然后将APC施用给受试者。病毒载体可基于，例如，包括α病毒和黄病毒的披膜病毒；α病毒，例如辛德贝斯病毒(Sindbis virus)、辛德贝斯株SAAR86、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus,SFV)、委内瑞拉马脑炎(VEE)、东方马脑炎(EEE)、西方马脑炎、罗斯河病毒、鹭山病毒(Sagiyami virus)、阿尼昂尼昂病毒(O’Nyong-nyong virus)、高原J病毒、黄病毒，例如黄热病毒、黄热株17D、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎(St.Louis encephalitis)、蜱传脑炎(Tick-borne encephalitis)、登革病毒(Dengue virus)、西尼罗河病毒(West Nile virus)、库京病毒（西尼罗河病毒的亚型）；动脉炎病毒，例如马动脉炎病毒；和风疹病毒属(rubivirus)，例如风疹病毒(rubella virus)、疱疹病毒、经修饰的安卡拉痘苗(MVA)；禽痘病毒载体；鸟痘载体；痘苗病毒载体；流感病毒载体；腺病毒载体、人乳头瘤病毒载体；牛乳头瘤病毒载体等等。病毒载体可基于正痘病毒属，例如天花病毒（天花）、痘苗病毒（天花疫苗）、安卡拉病毒(Ankara,MVA)或哥本哈根株(Copenhagen strain)、骆驼痘、猴痘或牛痘。
病毒载体可基于禽痘病毒类病毒，例如鸟痘病毒或金丝雀痘病毒。
病毒载体可基于禽痘病毒类病毒，例如鸟痘病毒或金丝雀痘病毒。
[0097] 可用腺病毒载体和腺相关病毒载体(AAV)，其中腺病毒载体包括腺病毒血清型5（腺5；Ad5）、腺6、腺11，和腺35。有至少51种人腺病毒血清型可用，其分为6个亚群（亚群A、B、C、D、E和F）。可用于例如评估针对“空”腺病毒载体的免疫应答的腺病毒蛋白包括六邻体蛋白，例如六邻体3蛋白、纤维蛋白和五邻体类蛋白，而且针对腺病毒蛋白的人免疫应答已被描述（参见，例如，Wu，等人(2002)J.Virol.76:12775-12782；Mascola(2006)Nature441:161-162；Roberts，等人(2006)Nature441:239-243）。下表描述了用于本发明的示例性病毒来源的疫苗载体：
[0098]
[0099]
[0100]
[0101] 抗原呈递细胞(APC)载体，例如树突细胞(DC)载体，包括加载有抗原的细胞、加载有肿瘤裂解物的细胞，或用包含核酸的组合物转染的细胞，其中所述核酸可以为例如质粒、mRNA，或病毒。也可以使用DC/肿瘤融合疫苗。参见，例如，Di Nicola，等人(2004)Clin.Cancer Res.10:5381-5390；Cerundolo，等人(2004)Nature Immunol.5:7-10；
Parmiani，等人(2002)J.Natl.Cancer Inst.94:805-818；Kao，等人(2005)
Immunol.Lett.101:154-159；Geiger，等人(2005)J.Transl.Med.3:29；Osada，等人(2005)Cancer Immunol.Immunother.Nov.5,1-10[印刷前电子出版]；Malowany，等人(2005)
Mol.Ther.13:766-775；Morse和Lyerly(2002)World J.Surg.26:819-825；Gabrilovich(2002)Curr.Opin.Mol.Ther.4:454-458；Morse，等人(2003)Clin.Breast
Cancer3Suppl.4:S164-S172；Morse，等人(2002)Cancer Chemother.Biol.Response
Modif.20:385-390；Arlen，等人(2003)Expert Rev.Vaccines2:483-493；Morse和Lyerly(1998)Expert Opin.Investig.Drugs7:1617-1627；Hirschowitz，等人(2004)
J.Clin.Oncol.22:2808-2815；Vasir，等人(2005)Br.J.Haematol.129:687-700；Koido，等人(2005)Gynecol.Oncol.99:462-471。
Parmiani，等人(2002)J.Natl.Cancer Inst.94:805-818；Kao，等人(2005)
Immunol.Lett.101:154-159；Geiger，等人(2005)J.Transl.Med.3:29；Osada，等人(2005)Cancer Immunol.Immunother.Nov.5,1-10[印刷前电子出版]；Malowany，等人(2005)
Mol.Ther.13:766-775；Morse和Lyerly(2002)World J.Surg.26:819-825；Gabrilovich(2002)Curr.Opin.Mol.Ther.4:454-458；Morse，等人(2003)Clin.Breast
Cancer3Suppl.4:S164-S172；Morse，等人(2002)Cancer Chemother.Biol.Response
Modif.20:385-390；Arlen，等人(2003)Expert Rev.Vaccines2:483-493；Morse和Lyerly(1998)Expert Opin.Investig.Drugs7:1617-1627；Hirschowitz，等人(2004)
J.Clin.Oncol.22:2808-2815；Vasir，等人(2005)Br.J.Haematol.129:687-700；Koido，等人(2005)Gynecol.Oncol.99:462-471。
[0102] 肿瘤细胞，例如，自体和异体肿瘤细胞可用作疫苗（Arlen，等人(2005)Semin.Oncol.32:549-555）。疫苗还可以包含经修饰的肿瘤细胞，例如，肿瘤细胞裂解物，或经辐射的肿瘤细胞。也可通过掺入编码诸如以下的分子的核酸来修饰肿瘤细胞：细胞因子（GM-CSF、IL-12、IL-15等）、NKG2D配体、CD40L、CD80、CD86等（参见，例如，Dranoff(2002)Immunol.Rev.188:147-154；Jain，等人(2003)Ann.Surg.Oncol.10:810-820；Borrello和Pardoll(2002)Cytokine Growth Factor Rev.13:185-193；Chen，等人(2005)Cancer Immunol.Immunother.27:1-11；Kjaergaard，等人(2005)J.Neurosurg.103:156-164；Tai，等人(2004)J.Biomed.Sci.11:228-238；Schwaab，等人(2004)J.Urol.171:1036-1042；
Friese，等人(2003)Cancer Res.63:8996-9006；Briones，等人(2002)Cancer Res.62:
3195-3199；Vieweg和Dannull(2003)Urol.Clin.North Am.30:633-643；Mincheff，等人(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39:125-132）。
Friese，等人(2003)Cancer Res.63:8996-9006；Briones，等人(2002)Cancer Res.62:
3195-3199；Vieweg和Dannull(2003)Urol.Clin.North Am.30:633-643；Mincheff，等人(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39:125-132）。
[0103] 也可使用裸DNA载体和裸RNA载体提供抗原表达平台。这些含有核酸的疫苗可通过基因枪、电穿孔、细菌膜影(bacterial ghost)、微球、微粒、脂质体、聚阳离子纳米颗粒等施用（参见，例如，Donnelly，等人(1997)Ann.Rev.Immunol.15:617-648;Mincheff，等人(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39:125-132;Song，等人(2005)J.Virol.79:9854-9861;Estcourt，等人(2004)Immunol.Rev.199:144-155）。用于通过例如基因枪、皮内、肌内和电穿孔法施用裸核酸的试剂和方法是可获得的。核酸疫苗可包含锁核酸(LNA)，其中LNA使功能性半族能够与质粒DNA附连，并且其中功能性半族可以是佐剂（参见，例如，Fensterle，等人(1999)J.Immunol.163:4510-4518；Strugnell，等人(1997)Immunol.Cell Biol.75:364-
369；Hertoughs，等人(2003)Nucleic Acids Res.31:5817-5830；Trimble，等人(2003)Vaccine21:4036-4042；Nishitani，等人(2000)Mol.Urol.4:47-50；Tuting(1999)
Curr.Opin.Mol.Ther.1:216-225）。可以将核酸疫苗与试剂组合使用，所述试剂为促进未成熟树突细胞向疫苗迁移的试剂，和促进成熟DC向可发生初免的引流淋巴结迁移的试剂，其中这些试剂包括MIP-1α和Flt3L（参见，例如，Kutzler和Weiner(2004)J.Clin.Invest.114:
1241-1244；Sumida，等人(2004)J.Clin.Invest.114:1334-1342）。
369；Hertoughs，等人(2003)Nucleic Acids Res.31:5817-5830；Trimble，等人(2003)Vaccine21:4036-4042；Nishitani，等人(2000)Mol.Urol.4:47-50；Tuting(1999)
Curr.Opin.Mol.Ther.1:216-225）。可以将核酸疫苗与试剂组合使用，所述试剂为促进未成熟树突细胞向疫苗迁移的试剂，和促进成熟DC向可发生初免的引流淋巴结迁移的试剂，其中这些试剂包括MIP-1α和Flt3L（参见，例如，Kutzler和Weiner(2004)J.Clin.Invest.114:
1241-1244；Sumida，等人(2004)J.Clin.Invest.114:1334-1342）。
[0104] 许多细菌物种已被开发用作疫苗并且可用于本发明中，所述细菌物种包括但不限于，弗氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌或分支杆菌属物种。这个列表并非意欲限制。参见，例如，WO04/006837、WO07/103225，和WO07/117371，它们的包括所有表格、图和权利要求的全部内容据此以引用的方式并入。在疫苗组合物中使用的细菌载体可为兼性细胞内细菌载体。细菌可用来递送本文所描述的多肽至宿主生物体中的抗原呈递细胞。如本文中所描述，单核细胞增生李斯特菌提供了用于本发明抗原表达的优选疫苗平台。
[0105] 减毒和共栖微生物都已成功地用作疫苗抗原的载体，但所述抗原的细菌载体任选地被减毒或被杀死但具有代谢性活性(KBMA)。制剂中使用的载体菌株的基因背景、选择用于实现减毒的突变类型，和免疫原的固有性质从而优化诱发的免疫应答的程度和质量。优化由细菌载体剌激的免疫应答需要考虑的一般因素包括：载体的选择；菌株的特异性背景；减毒突变和减毒水平；减毒表型的稳定性和最优剂量的确定。要考虑的其他抗原-相关因素包括：抗原的固有性质；表达系统；抗原-展示形式和重组表型的稳定性；调节分子的共表达和免疫接种方案。
[0106] 疫苗平台的优选特征是有引发先天免疫应答以及针对一种（多种）重组表达的抗原的抗原-特异性T细胞应答的能力。例如，表达一种（多种）本文所描述的抗原的单核细胞增生李斯特菌可诱导肝内1型干扰素(IFN-α/β)及趋化因子和细胞因子的下游级联。响应于这种肝内免疫剌激，NK细胞和抗原呈递细胞(APC)被募集至肝脏。在某些实施方案中，本发明疫苗平台诱导细胞因子和趋化因子中的一种或多种(优选全部)的血清浓度在疫苗平台递送至受试者后的24小时增加，所述细胞因子和趋化因子选自由IL-12p70、IFN-γ、IL-6、TNFα，和MCP-1组成的组；并且诱导对抗疫苗平台表达的一种或多种EGFRvIII来源的抗原的CD4+和/或CD8+抗原-特异性T细胞应答。在其他实施方案中，本发明疫苗平台还诱导定居不成熟肝脏NK细胞的成熟，如通过小鼠模型系统中激活标记，例如DX5、CD11b和CD43的上调来证实，或通过使用用作靶细胞的51Cr-标记的YAC-1细胞测量的NK细胞-介导的细胞溶解活性来证实。
[0107] 在各种实施方案中，本发明的疫苗和免疫原性组合物可包含单核细胞增生性李斯特菌，其被构造成表达一种（多种）期望的EGFRvIII来源的抗原。单核细胞增生李斯特菌用作疫苗载体的能力综述在Wesikirch等人，Immunol.Rev.158:159-169(1997)中。单核细胞增生李斯特菌的天然生物群落的许多期望特征使它成为应用于治疗疫苗的有吸引力的平台。主要理由是单核细胞增生李斯特菌的细胞内生命周期能够有效地剌激CD4+和CD8+T细胞免疫。包括TLR(TLR2、TLR5、TLR9)和核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)在内的多种病原体相关分析模式(PAMP)受体在感染后响应于与单核细胞增生李斯特菌大分子相互作用而被触发，从而导致先天免疫效应物的泛激活及Th-1极化细胞因子的释放，并且对针对所表达的抗原的CD4+和CD8+T细胞应答的形成产生深刻的影响。
[0108] 单核细胞增生李斯特菌的菌株最近已被开发作为异源蛋白的有效细胞内递送媒介，其递送抗原至免疫系统从而诱导对不允许注射致病原的临床病状例如癌症和HIV的免疫应答。例如参见美国专利第6,051,237号；Gunn等人，J.Immunol.,167:6471-6479(2001)；Liau，等人，Cancer Research,62:2287-2293(2002)；美国专利第6,099,848号；WO99/
25376；WO96/14087；及美国专利第5,830,702号），其包括所有表格、图和权利要求的全部内容据此以引用的方式并入。表达淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)抗原的重组单核细胞增生李斯特菌疫苗也已被证明能诱导针对抗原的保护性细胞-介导的免疫（Shen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:3987-3991(1995)。
25376；WO96/14087；及美国专利第5,830,702号），其包括所有表格、图和权利要求的全部内容据此以引用的方式并入。表达淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)抗原的重组单核细胞增生李斯特菌疫苗也已被证明能诱导针对抗原的保护性细胞-介导的免疫（Shen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:3987-3991(1995)。
[0109] 已经生产可用于免疫原性组合物中的减毒且被杀死但具有代谢性活性形式的单核细胞增生李斯特菌。WO07/103225和WO07/117371，其包括所有表格、图和权利要求书的全部内容据此以引用的方式并入。单核细胞增生李斯特菌的ActA蛋白足以促进负责细胞内运动的肌动蛋白募集和聚合事件。人安全性研究已报道，在成年人中，口服施用actA/plcB-缺失减毒形式的单核细胞增生李斯特菌没有引起严重的后遗症（Angelakopoulos等人，Infection and Immunity,70:3592-3601(2002)）。其他类型的减毒形式的单核细胞增生李斯特菌也已被描述（参见例如WO99/25376和美国专利第6,099,848号，其描述表达异源抗原的李斯特菌属的营养缺陷型减毒菌株）。
[0110] 在某些实施方案中，本发明疫苗组合物中使用的单核细胞增生李斯特菌是活减毒菌株，其包含actA和/或inlB中的减毒突变，优选actA和inlB的全部或一部分的缺失（本文中称为“LmΔactA/ΔinlB”），并且含有为一种（多种）感兴趣的EGFRvIII来源的抗原的表达编码的重组DNA。所述一种（多种）EGFRvIII来源的抗原优选在细菌表达序列的控制下，并且被稳定地整合到单核细胞增生李斯特菌基因组中。因此，此种单核细胞增生李斯特菌疫苗菌株没有使用真核转录或翻译元件。
[0111] 本发明还考虑了至少一种调节因子，例如启动子或转录因子减弱的李斯特菌属。下列涉及启动子。ActA表达由两种不同的启动子调节（Vazwuez-Boland，等人(1992)
Infect.Immun.60:219-230）。inlA与inlB表达一起由5个启动子调节（Lingnau，等人(1995)Infect.Immun.63:3896-3903）。转录因子prfA是许多单核细胞增生李斯特菌基因的转录所需要的，所述许多单核细胞增生李斯特菌基因例如hly、plcA、ActA、mpl、prfA，和iap。PrfA的调节性质由例如PrfA-依赖性启动子(PinlC)和PrfA-盒介导。在某些实施方案中，本发明提供编码ActA启动子、inlB启动子、PrfA、PinlC、PrfA盒等中的至少一种的失活、突变或缺失的核酸（例如参见Lalic Mullthaler，等人(2001)Mol.Microbiol.42:111-120；Shetron-Rama，等人(2003)Mol.Microbiol.48:1537-1551；Luo，等人(2004)Mol.Microbiol.52:39-
52）。可通过Gly145Ser突变、Gly155Ser突变或Glu77Lys突变使PrfA有组成性活性（参见例如Mueller和Freitag(2005)Infect.Immun.73:1917-1926；Wong和Freitag(2004)
J.Bacteriol.186:6265-6276；Ripio，等人(1997)J.Bacteriol.179:1533-1540）。
Infect.Immun.60:219-230）。inlA与inlB表达一起由5个启动子调节（Lingnau，等人(1995)Infect.Immun.63:3896-3903）。转录因子prfA是许多单核细胞增生李斯特菌基因的转录所需要的，所述许多单核细胞增生李斯特菌基因例如hly、plcA、ActA、mpl、prfA，和iap。PrfA的调节性质由例如PrfA-依赖性启动子(PinlC)和PrfA-盒介导。在某些实施方案中，本发明提供编码ActA启动子、inlB启动子、PrfA、PinlC、PrfA盒等中的至少一种的失活、突变或缺失的核酸（例如参见Lalic Mullthaler，等人(2001)Mol.Microbiol.42:111-120；Shetron-Rama，等人(2003)Mol.Microbiol.48:1537-1551；Luo，等人(2004)Mol.Microbiol.52:39-
52）。可通过Gly145Ser突变、Gly155Ser突变或Glu77Lys突变使PrfA有组成性活性（参见例如Mueller和Freitag(2005)Infect.Immun.73:1917-1926；Wong和Freitag(2004)
J.Bacteriol.186:6265-6276；Ripio，等人(1997)J.Bacteriol.179:1533-1540）。
[0112] 减毒可通过例如热处理或化学修饰来实现。减毒还可通过对调节例如代谢、细胞外生长或细胞内生长的核酸进行基因修饰，对编码毒力因子（例如李斯特菌属prfA、actA、李斯特菌属溶胞素(LLO)）、粘附介导因子（例如内化蛋白，如inlA或inlB）、mpl、磷脂酰胆碱磷脂酶C(PC-PLC)、磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C（PI PLC；plcA基因），上述的任何组合等的核酸进行基因修饰来实现。可通过比较减毒李斯特菌属的生物功能与合适的母体李斯特菌属表现出的相应生物功能来评估减毒。
[0113] 本发明在其他实施方案中提供了通过用核酸靶向剂，例如交联剂、补骨脂素、氮芥、顺铂、大体积加合物、紫外光、γ辐射及其组合等处理来减毒的李斯特菌属。典型地，由一种交联剂分子产生的损害涉及双螺旋体的两条链的交联。本发明的李斯特菌属还可通过使至少一种核酸修复基因，例如uvrA、uvrB、uvrAB、uvrC、uvrD、uvrAB、phrA和/或介导重组修复的基因，例如recA突变来减毒。而且，本发明提供了通过核酸靶向剂和通过使核酸修复基因突变二者来减毒的李斯特菌属。另外，本发明包括用光敏核酸靶向剂，例如补骨脂素，和/或光敏核酸交联剂，例如补骨脂素处理，然后暴露于紫外光。
[0114] 可用于本发明中的减毒李斯特菌属描述于例如美国专利公布第2004/0228877号和第2004/0197343号中，其全部内容以引用的方式并入本文中。用于评估是否李斯特菌属的特定菌株具有期望的减毒的各种测定提供在例如美国专利公布第2004/0228877号、第2004/0197343号，和第2005/0249748号中，其全部内容以引用的方式并入本文中。
[0115] 在其他实施方案中，本发明疫苗组合物中使用的单核细胞增生李斯特菌是来源于LmΔactA/ΔinlB的被杀死但具有代谢性活性(KBMA)的平台，并且还缺失uvrA和uvrB，即编码核苷酸切除修复(NER)途径的DNA修复酶的基因，并且含有为一种（多种）感兴趣的EGFRvIII来源的抗原的表达编码的重组DNA。所述一种（多种）感兴趣抗原优选在细菌表达序列控制下，并且被稳定地整合到单核细胞增生李斯特菌基因组中。KBMA平台对通过合成补骨脂素、S-59和长波长UV光的联合处理进行的光化学失活极其敏感。尽管被杀死，但是KBMALm疫苗可瞬时表达它们的基因产物，从而允许它们逃脱吞噬溶酶体，并且诱导对抗野生型WT Lm和疫苗病毒攻击的功能性细胞免疫和保护。
[0116] 在某些实施方案中，减毒或KBMA单核细胞增生李斯特菌疫苗菌株包含具有组成性活性的PrfA基因（本文中称为PrfA*突变体）。PrfA是细胞内激活的转录因子，其诱导毒力基因和编码的异源抗原(Ags)在合适的工程化疫苗菌株中的表达。如上所指出的，actA基因的表达响应于PrfA，并且actA启动子是PrfA响应性调节元件。引入prfA G1 55s等位基因可以赋予活减毒或KBMA疫苗明显增强的疫苗效价。优选的PrfA突变体描述于2008年5月19日提交的题目为COMPOSITIONS COMPRISING PRFA*MUTANT LISTERIA ANDMETHODS OF USE THEREOF的美国临时专利申请61/054,454中，其包括所有表格、图和权利要求的全部内容据此以引用的方式并入。
[0117] 包括在残基155处的甘氨酸的单核细胞增生李斯特菌PrfA的序列如下(SEQ ID NO：16)：
[0118] MNAQAEEFKK YLETNGIKPK QFHKKELIFN QWDPQEYCIF LYDGITKLTS 50ISENGTIMNL QYYKGAFVIM SGFIDTETSV GYYNLEVISE QATAYVIKIN 100ELKELLSKNL THFFYVFQTL QKQVSYSLAK FNDFSINGKL GSICGQLLIL 150TYVYGKETPD GIKITLDNLT MQELGYSSGI
AHSSAVSRII SKLKQEKVIV 200YKNSCFYVQN LDYLKRYAPK LDEWFYLACP ATWGKLN 237
AHSSAVSRII SKLKQEKVIV 200YKNSCFYVQN LDYLKRYAPK LDEWFYLACP ATWGKLN 237
[0119] 包括在残基155处的丝氨酸的单核细胞增生李斯特菌PrfA*的序列如下(SEQ ID NO：17)：
[0120] MNAQAEEFKK YLETNGIKPK QFHKKELIFN QWDPQEYCIF LYDGITKLTS 50ISENGTIMNL QYYKGAFVIM SGFIDTETSV GYYNLEVISE QATAYVIKIN 100ELKELLSKNL THFFYVFQTL QKQVSYSLAK FNDFSINGKL GSICGQLLIL 150TYVYSKETPD GIKITLDNLT MQELGYSSGI
AHSSAVSRII SKLKQEKVIV 200YKNSCFYVQN LDYLKRYAPK LDEWFYLACP ATWGKLN 237
AHSSAVSRII SKLKQEKVIV 200YKNSCFYVQN LDYLKRYAPK LDEWFYLACP ATWGKLN 237
[0121] 4.抗原构建体
[0122] 由本发明的疫苗菌株表达的抗原构建体至少包含用于支持分泌的在疫苗平台内可操作的编码分泌序列的核酸，其与待表达的一种(多种)EGFRvIII来源的抗原融合。在细菌平台的情况下，所得融合蛋白通过细菌疫苗平台可操作地连接至融合蛋白表达所需要的调节序列(例如启动子)。本发明不限于分泌的多肽和肽抗原，而且还包括从李斯特菌属或其他细菌不分泌或不能分泌的多肽和肽。但优选地，当细菌疫苗菌株被接种到接受者中时，一种（多种）EGFRvIII来源的抗原由细菌疫苗菌株表达为可溶性分泌的形式。
[0123] 表1公开了用于与融合蛋白配偶序列，例如异源抗原融合的信号肽的许多非限制性实例。信号肽往往含有三个结构域：带正电的N-末端（1-5个残基长）；中间疏水性结构域（7-15个残基长）；和中性但极性的C-末端结构域。
[0124] 表1.细菌信号途径.信号肽通过信号肽酶位点鉴定
[0125]
[0126]
[0127] 在下文中所描述的某些示例性实施方案中，一种（多种）EGFRvIII来源的序列可表达为与单核细胞增生李斯特菌ActA蛋白的氨基-末端部分融合的单个多肽，所述单核细胞增生李斯特菌ActA蛋白允许该细菌在经免疫接种的宿主内表达和分泌融合蛋白。在这些实施方案中，抗原构建体可以是多核苷酸，其包含可操作地连接至编码融合蛋白的核酸序列的启动子，其中融合蛋白包含(a)修饰的ActA和(b)在经修饰的ActA序列之后的待表达为融合蛋白的一种或多种EGFRvIII来源的表位。
[0128] “经修饰的ActA”是指单核细胞增生李斯特菌ActA蛋白的邻接部分，其包含至少ActA信号序列，但不含整个ActA序列，或其与此种ActA序列具有至少约80%的序列同一性、至少约85%的序列同一性、至少约90%的序列同一性、至少约95%的序列同一性，或至少约98%的序列同一性。ActA信号序列为MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFA(SEQ ID NO:27)。在一些实施方案中，启动子为来自WO07/103225和WO07/117371的ActA启动子，该参考文献的全部内容以引用的方式并入本文中。
[0129] 举例来说，经修饰的ActA可包含ActA的至少前59个氨基酸，或与ActA的至少前59个氨基酸有至少约80％的序列同一性、至少约85％的序列同一性、至少约90％的序列同一性、至少约95％的序列同一性，或至少约98％的序列同一性的序列。在一些实施方案中，经修饰的ActA包含ActA的至少前100个氨基酸，或与ActA的至少前100个氨基酸有至少约80％的序列同一性、至少约85％的序列同一性、至少约90％的序列同一性、至少约95％的序列同一性，或至少约98％的序列同一性的序列。换言之，在一些实施方案中，经修饰的ActA序列对应于在残基100或100之后的残基处截短的ActA的N-末端片段(包括ActA信号序列)。
[0130] ActA-N100具有下列序列(SEQ ID NO：28)：
[0131] VGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100
[0132] 在这个序列中，第一残基被描绘为缬氨酸；该多肽是由李斯特菌属利用在这个位置处的蛋氨酸合成的。因此，ActA-N100还可以具有下列序列(SEQ ID NO：29)：
[0133] MGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100
[0134] ActA-N100还可包含位于经修饰ActA的C-末端残基与EGFRvIII来源的抗原序列之间的一个或多个额外残基。在下列序列中，通过引入BamH1位点添加两个残基而使ActA-N100延长：
[0135] VGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100GS(SEQ ID NO：30)
[0136] 当用第一残基蛋氨酸合成时，所述ActA-N100具有序列：
[0137] MGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100GS(SEQ ID NO：31)。
[0138] 因而，示例性构建体如下：
[0139] vglnrfmram mvvfitanci tinpdiifaa tdsedsslnt deweeektee 50qpsevntgpr yetarevssr dieeleksnk vkntnkadli amlkakaekg 100gsASKVLPAS RALEEKKGNY VVTDHGSCAD GSVKTSASKV APASRALEEK 150KGNYVVTDHG SCGDGSIKLS KVLPASRALE
EKKGNYVVTD HGSCADGSVK 200ASKVAPASRA LEEKKGNYVV TDHGSCGDGS IKLSKVLPAS
RALEEKKGNY 250
EKKGNYVVTD HGSCADGSVK 200ASKVAPASRA LEEKKGNYVV TDHGSCGDGS IKLSKVLPAS
RALEEKKGNY 250
[0140] VVTDHGSCAD GSVKTS(SEQ ID NO：32)。在这个序列中，ActA-N100序列是小写的，EGFRvIII来源的抗原序列加有下划线，而接头“可裂解”序列未加下划线。相应的DNA序列如下：gtgggattaaatagatttatgcgtgcgatgatggtagttttcattactgccaactgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattccagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcagccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattgaggaactagaaaaatcgaataaagtgaaaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagcaaaagcagagaaaggtggatCCGCAAGCAAAGTATTGCCAGCTAGTCGTGCATTAGAGGAGAAAAAGGGGAATTACGTGGTGACGGATCATGGATCGTGTGCCGATGGCTCAGTAAAGACTAGTGCGAGCAAAGTGGCCCCTGCATCACGAGCACTTGAAGAGAAAAAAGGAAACTATGTTGTGACCGATCATGGTAGCTGCGGAGATGGTTCAATTAAATTATCAAAAGTCTTACCAGCATCTAGAGCTTTAGAGGAAAAGAAGGGTAACTATGTCGTAACAGATCATGGAAGTTGTGCTGACGGAAGTGTTAAAGCGTCGAAAGTAGCTCCAGCTTCTCGCGCATTAGAAGAAAAGAAAGGCAATTATGTTGTAACAGACCATGGTAGTTGTGGTGATGGCTCGATCAAATTGTCAAAAGTTCTACCGGCTTCTCGTGCGCTAGAAGAGAAGAAAGGAAATTACGTAGTTACAGACCACGGCTCTTGCGCGGAT
[0141] GGTTCCGTTAAAACTAGT(SEQ ID NO：33)。在这个序列中，ActA-N100序列为小写，BamHI克隆位点加有下划线，而EGFRvIII来源的抗原和接头“可裂解的”序列未加下划线。这个序列的前面可有Acta启动子序列，如
[0142]gggaagcagttggggttaactgattaacaaatgttagagaaaaattaattctccaagtgatattcttaaaataattcatgaatattttttcttatattagctaattaagaagataattaactgctaatccaatttttaacggaataaattagtgaaaatgaaggccgaattttccttgttctaaaaaggttgtattagcgtatcacgaggagggagtataa(SEQ ID NO：34)。
[0143] 示例性构建体在下文和WO07/103225中有描述，该参考文献以引用的方式并入本文。ANZ-100(原来被称为CRS-100；BB-IND 12884和clinicaltrials.gov identifier NCT00327652)由不含任何外源抗原表达序列的单核细胞增生李斯特菌ΔactA/ΔinlB平台组成。在WO07/103225中所描述的示例性构建体中，这个平台经工程化改造从而表达人间皮素与ActA-N100的融合体。使用CRS-207(BB-IND13389和clinicaltrials.gov identifier NCT00585845)，在患有伴有肝转移的晚期癌的受试者中评价了间皮素表达疫苗。本发明考虑了通过用EGFRvIII来源的抗原序列置换间皮素序列来修饰这种疫苗。
[0144] 因为由一种生物体编码的序列未必经受密码子优化以在所选疫苗平台细菌菌株中最佳表达，因此本发明还提供了通过密码子优化而改变的核酸，所述密码子优化是为了使核酸被诸如单核细胞增生李斯特菌的细菌表达。
[0145] 在多种实施方案中，任何非-最优密码子的至少1％被改变以提供最优密码子，更正常至少5％被改变，最正常至少10％被改变，经常至少20％被改变，更经常至少30％被改变，最经常至少40％被改变，通常至少50％被改变，更通常至少60％被改变，最通常至少70％被改变，理想地至少80％被改变，更理想地至少90％被改变，最理想地至少95％被改变，并且常规地，100％的任何非一最优密码子经受密码子优化以便被李斯特菌属表达(表
2)。
2)。
[0146] 表2.针对在李斯特菌属中的表达的最优密码子
[0147]
[0148] 本发明供应许多用于制备或工程化改造本发明疫苗平台的李斯特菌属物种和菌株。本发明的李斯特菌属不受表3中所公开的物种和菌株限制。
[0149] 表3.适用于本发明，例如作为疫苗或核酸来源的李斯特菌属菌株
[0150]
[0151]
[0152]
[0153]
[0154] 靶向针对专职抗原呈递细胞(APC)上的胞吞受体的抗原也是增强疫苗功效的有吸引力的策略。此种APC-靶向疫苗具有引导外源蛋白抗原进入囊泡的特殊能力，所述囊泡有效地加工用于主要组织相容性复合体I类和II类呈递的抗原。有效靶向不仅要求对在APC表面上丰富表达的受体有高特异性，而且要求能够迅速内在化并加载到含有抗原加工机构的元件的隔室内。在这些实施方案中，本发明抗原是作为融合构建体提供的，所述融合构建体包括免疫原性EGFRvIII-来源的抗原多肽和期望的胞吞受体-靶向半族。合适的APC胞吞受体包括DEC-205、甘露糖受体、CLEC9、Fc受体。这个列表并非意欲限制。受体靶向半族可通过重组子或使用化学交联与免疫原性EGFRvIII-来源的抗原多肽偶联。
[0155] 4.治疗组合物
[0156] 本文所描述的疫苗组合物可单独或联合药学上可接受的赋形剂以足以诱导合适的免疫应答的量施用给宿主。免疫应答可包括但不限于特异性免疫应答、非特异性免疫应答、特异性和非特异性应答、先天应答、初次免疫应答、适应性免疫、二次免疫应答、记忆免疫应答、免疫细胞激活、免疫细胞增殖、免疫细胞分化和细胞因子表达。本发明疫苗可作为混悬剂、作为细胞糊剂，或作为与固体基质或胶体基质的络合物储存，例如冷冻、冻干。
[0157] 在某些实施方案中，在向受试者施用有效剂量的含有免疫原性EGFRvIII来源的抗原多肽的疫苗以激发免疫应答后，施用第二疫苗。这在本领域中称为“初免-加强”方案。在此种方案中，本发明的组合物和方法可用作“初免”递送、用作“加强”递送，或者既用作“初免”递送又用作“加强”递送。
[0158] 举例来说，包含编码并表达一种（多种）抗原多肽的被杀死但具有代谢活性的李斯特菌属的第一疫苗可作为“初免疫苗”递送，而包含编码一种（多种）抗原多肽的减毒（活的或被杀死的但具有代谢活性的）李斯特菌属的第二疫苗可作为“加强疫苗”递送。然而，应该理解，初免疫苗和加强疫苗中的每一者均不必利用本发明的方法和组合物。相反，本发明考虑了将其他疫苗形式与本发明的细菌疫苗方法和组合物一起使用。下列为合适的混合初免-加强方案的实例：DNA（例如质粒）疫苗初免/细菌疫苗加强；病毒疫苗初免/细菌疫苗加强；蛋白疫苗初免/细菌疫苗加强；DNA初免/细菌疫苗加强加上蛋白疫苗加强；细菌疫苗初免/DNA疫苗加强；细菌疫苗初免/病毒疫苗加强；细菌疫苗初免/蛋白疫苗加强；细菌疫苗初免/细菌疫苗加强加上蛋白疫苗加强等。该列表并非意欲限制。
[0159] 初免疫苗和加强疫苗可通过相同途径或不同途径来施用。术语“不同途径”包括但不限于身体上的不同部位，例如经口、非经口、肠、肠胃外、直肠、节内（淋巴节）、静脉内、动脉、皮下、肌内、肿瘤内、肿瘤周围、输注、粘膜、鼻、在脑脊髓间隙或脑脊髓液内等部位，以及不同模式，例如经口、静脉内和肌内。
[0160] 初免或加强疫苗的有效量可以以单剂量给予，但不限于单剂量。因此，施用可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次的疫苗施用。如果在本发明的方法中有多于一次的一种疫苗或多种疫苗的施用，则可以1分钟、2分钟、3、4、5、6、7、8、
9、10或更多分钟的时间间隔，以约1小时、2小时、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24小时等的时间间隔来隔开施用。在小时的上下文中，术语“约”意指加或减30分钟内的任何时间间隔。还可以1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天及其组合的时间间隔来隔开施用。本发明不限于时间相等地隔开的给药间隔，而包括以不相等的间隔来给药，例如初免方案由在1天、4天、7天和25天施用组成，这仅为了提供非限制性实例。
9、10或更多分钟的时间间隔，以约1小时、2小时、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24小时等的时间间隔来隔开施用。在小时的上下文中，术语“约”意指加或减30分钟内的任何时间间隔。还可以1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天及其组合的时间间隔来隔开施用。本发明不限于时间相等地隔开的给药间隔，而包括以不相等的间隔来给药，例如初免方案由在1天、4天、7天和25天施用组成，这仅为了提供非限制性实例。
[0161] 在某些实施方案中，可在初免免疫接种启动后的约5天，在初免免疫接种启动后的约10天，在初免免疫接种的施用启动后的约15天、约20天、约25天、约30天、约35天、约40天、约45天、约50天、约55天、约60天、约65天、约70天、约75天、约80天、约6个月和约1年启动加强免疫接种的施用。优选地，初免和加强免疫接种中的一者和两者包括递送本发明的组合物。
[0162] “药学上可接受的赋形剂”或“诊断上可接受的赋形剂”包括但不限于无菌蒸馏水、盐水、磷酸盐缓冲液、氨基酸基缓冲液，或碳酸氢盐缓冲液。选择的赋形剂和使用的赋形剂的量将取决于施用模式。施用可以为经口施用、静脉内施用、皮下施用、皮肤施用、皮内施用、肌内施用、粘膜施用、肠胃外施用、器官内施用、病灶内施用、鼻内施用、吸入施用、眼内施用、肌内施用、血管内施用、节内施用、通过划痕施用、直肠施用、腹膜内施用，或者多种熟知施用途径中的任一种或组合。施用可包括注射、输注或其组合。
[0163] 通过非经口途径施用本发明疫苗可避免耐受性。本领域中已知静脉内施用、皮下施用、肌内施用、腹膜内施用、经口施用、粘膜施用、通过尿道施用、通过生殖道施用、通过胃肠道施用或通过吸入施用的方法。
[0164] 对于具体患者的有效量可随着诸如受治疗病状、患者的一般健康状况、施用途径和剂量及副作用的严重性的因素而改变。治疗和诊断方法的指南是可获得的（参见例如Maynard，等人(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,FL;Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK）。
[0165] 本发明疫苗可以以这样的剂量或用量来施用，其中每个剂量包含至少100个细菌细胞/kg体重或更高，在某些实施方案中1000个细菌细胞/kg体重或更高、正常至少10,000个细胞/kg体重、更正常至少100,000个细胞/kg体重、最正常至少100万个细胞/kg体重、经常至少1000万个细胞/kg体重、更经常至少10000万个细胞/kg体重、典型地至少10亿个细胞/kg体重、通常至少100亿个细胞/kg体重、常规地至少1000亿个细胞/kg体重，并且有时至少1万亿个细胞/kg体重。本发明提供了以上剂量，其中细菌施用单位为集落形成单位(CFU)，补骨脂素处理前的CFU的当量，或其中单位是细菌细胞数。
[0166] 本发明疫苗可以以这样的剂量或用量施用，其中每个剂量包含107至108个细菌/70kg体重（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、2x107至2x108个细菌/70kg体重（或/
1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5x107至5x108个细菌/70kg体重（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、108至109个细菌/70kg体重（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、2.0x108至2.0x109个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5.0x108至
9 9 10
5.0x10 个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、10 至10 个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、2x109至2x1010个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5x109至5x1010个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、1011至1012个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、2x1011至
12 11 12
2x10 个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5x10 至5x10 个细菌/
70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、1012至1013个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积）、2x1012至2x1013个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5x1012至
5x1013个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、1013至1014个细菌/70kg
13 14
（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、2x10 至2x10 个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5x1013至5x1014个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、1014至1015个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、2x1014至
2x1015个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）等湿重。
1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5x107至5x108个细菌/70kg体重（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、108至109个细菌/70kg体重（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、2.0x108至2.0x109个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5.0x108至
9 9 10
5.0x10 个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、10 至10 个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、2x109至2x1010个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5x109至5x1010个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、1011至1012个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、2x1011至
12 11 12
2x10 个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5x10 至5x10 个细菌/
70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、1012至1013个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积）、2x1012至2x1013个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5x1012至
5x1013个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、1013至1014个细菌/70kg
13 14
（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、2x10 至2x10 个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、5x1013至5x1014个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、1014至1015个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）、2x1014至
2x1015个细菌/70kg（或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝脏重量）等湿重。
[0167] 还提供了以上剂量中的一种或多种，其中所述剂量通过每天注射一次、每2天注射一次、每3天注射一次、每4天注射一次、每5天注射一次、每6天注射一次，或每7天注射一次来施用，其中所述注射方案维持例如仅1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、5周或更长。本发明还包括以上剂量和方案的组合，例如采用相对大的初始细菌剂量，接着采用相对小的后续剂量，或者采用相对小的初始剂量，接着采用大剂量。
[0168] 本发明可使用例如1次/周、2次/周、3次/周、4次/周、5次/周、6次/周、7次/周、每2周1次、每3周1次、每4周1次、每5周1次等的给药方案。该给药方案包括总共给药例如1周、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月，和12个月的时间。
[0169] 提供了以上给药方案的循环。该循环可约例如每7天、每14天、每21天、每28天、每35天、42天、每49天、每56天、每63天、每70天等重复。在循环之间可存在非给药的间隔，其中所述间隔可为约，例如7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天等。在这个上下文中，术语“约”意指加或减1天、加或减2天、加或减3天、加或减4天、加或减5天、加或减
6天，或加或减7天。
6天，或加或减7天。
[0170] 本发明包括经口施用李斯特菌属的方法。还提供了静脉内施用李斯特菌属的方法。而且，提供了经口、肌内、静脉内、皮内和/或皮下施用李斯特菌属的方法。本发明提供了李斯特菌属细菌，或李斯特菌属细菌的培养物或悬浮液，所述李斯特菌属细菌的培养物或悬浮液通过在基于肉的培养基或含有来源于肉或动物产品的多肽的培养基中生长来制备。本发明还提供了李斯特菌属细菌，或李斯特菌属细菌的培养物或悬浮液，所述李斯特菌属细菌的培养物或悬浮液通过在不含肉或动物产品的培养基中生长来制备、通过在含有植物多肽的培养基中生长来制备、通过在不基于酵母产品的培养基中生长来制备，或通过在含有酵母多肽的培养基中生长来制备。
[0171] 与另外的治疗剂联合施用的方法是本领域熟知的（Hardman，等人（编）(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill,New York,NY；Poole和Peterson（编）(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,PA；Chabner和Longo（编）(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams& Wilkins,Phila.,PA）。
[0172] 也可使用有益于提高溶细胞性T细胞应答的另外药剂。此类药剂在本文中称为载体。这些包括而不限于B7共剌激分子、白介素-2、干扰素-γ、GM-CSF、CTLA-4拮抗剂、OX-40/OX-40配体、CD40/CD40配体、沙莫司亭(sargramostim)、左旋咪唑(levamisol)、痘苗病毒、卡介苗(Bacille Calmette-Guerin,BCG)、脂质体、明矾、氟氏完全或不完全佐剂、解毒的内毒素、矿物油、表面活性物质如脂卵磷脂(lipolecithin)、多聚醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽，及油或烃乳剂。相对于抗体应答而言优先剌激溶细胞性T细胞应答的诱导T细胞免疫应答的载体是优选的，但也可使用刺激这两种类型的应答的那些。在药剂为多肽的情况下，可施用多肽本身或编码多肽的多核苷酸。载体可以为细胞，例如抗原呈递细胞(APC)或树突细胞。抗原呈递细胞包括这样的细胞类型，例如巨噬细胞、树突细胞和B细胞。其他专职抗原-呈递细胞包括单核细胞、边缘区Kupffer细胞、小胶质细胞、朗氏细胞、指突状树突细胞(interdigitating dendritic cell)、滤泡树突细胞和T细胞。还可以使用兼性抗原-呈递细胞。兼性抗原-呈递细胞的实例包括星形细胞、滤泡细胞、内皮和成纤维细胞。载体可以为细菌细胞，其经转化从而表达多肽或递送随后在经免疫接种的个体的细胞中表达的多核苷酸。可添加诸如氢氧化铝或磷酸铝的佐剂以增加疫苗触发、增强，或延长免疫应答的能力。诸如以下的另外的材料也是潜在的佐剂：细胞因子、趋化因子，及像CpG一样的细菌核酸序列、toll-样受体(TLR)9激动剂以及针对TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9的另外激动剂，包括脂蛋白、LPS、单磷酰基脂质A、脂膜酸、咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫德(resiquimod)，和单独或联合所述组合物使用的其他类似的免疫调节剂。佐剂的其他代表性实例包括合成佐剂QS-21，其包含从皂皮树(Quillaja saponaria)的树皮和短棒状杆菌(Corynebacterium parvum)中纯化的匀质皂角苷（McCune等人，Cancer,1979;43:1619）。应理解，佐剂经受优化。换言之，技术人员可进行常规实验以确定要使用的最佳佐剂。
[0173] 治疗剂的有效量是减轻或改善症状正常至少10%、更正常至少20%、最正常至少30%、典型地至少40%、更典型地至少50%、最典型地至少60%、经常至少70%、更经常至少80%，及最经常至少90%、常规地至少95%、更常规地至少99%，及最常规地至少99.9%的量。
[0174] 本发明的试剂和方法提供了仅包含一种免疫接种的疫苗；或包含第一免疫接种的疫苗；或包含至少一种加强剂免疫接种、至少两种加强剂免疫接种，或至少三种加强剂免疫接种的疫苗。加强剂免疫接种的参数指南是可获得的。参见，例如Marth(1997)Biologicals25:199-203；Ramsay，等人(1997)Immunol.Cell Biol.75:382-388；Gherardi，等人(2001)Histol.Histopathol.16:655-667；Leroux-Roels，等人(2001)ActA
Clin.Belg.56:209-219；Greiner，等人(2002)Cancer Res.62:6944-6951；Smith，等人(2003)J.Med.Virol.70:Suppl.1:S38-S41；Sepulveda-Amor，等人(2002)Vaccine20:2790-
2795）。
Clin.Belg.56:209-219；Greiner，等人(2002)Cancer Res.62:6944-6951；Smith，等人(2003)J.Med.Virol.70:Suppl.1:S38-S41；Sepulveda-Amor，等人(2002)Vaccine20:2790-
2795）。
[0175] 治疗剂制剂可通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合制备成例如冻干粉末、浆料、水溶液或混悬液形式用于储存（参见，例如Hardman，等人(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,
Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis，等人（编）(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman，等人（编）(1990)
Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman，等人（编）(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner and
Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY）。
实施例
Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis，等人（编）(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman，等人（编）(1990)
Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman，等人（编）(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner and
Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY）。
实施例
[0176] 下列实施例用于说明本发明。这些实施例决不意欲限制本发明的范围。
[0177] 实施例1.细菌菌株和抗原选择
[0178] 在两种菌株背景，活减毒(Lm11,aka LmΔactA/ΔinlB)和KBMA PrfA*(Lm677,aka LmΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB/prfA G155S)中构建Lm疫苗菌株。将表达盒设计为含有1和5拷贝的序列PASRALEEKKGNYVVTDHGSC(SEQ ID NO:4（) 在图1中表示为PvIII），每个拷贝侧接蛋白酶体裂解序列（图1中的黑框）。对表达盒进行密码子优化以使其在单核细胞增生李斯特菌中表达，并将表达盒作为BamHI-SpeI片段克隆到actA启动子的下游并与ActA的100氨基末端酸(“ActA-N100”)同框，并且在表达盒的羧基末端上标记SIINFEKL(SL8)，即，有利于评价所编码的异源抗原的表达和分泌的替代性T-细胞表位。将该构建体克隆到pPL2整合载体的衍生物中，并使其稳定地整合在细菌染色体的tRNAArg基因座处。
[0179] 测试的菌株概括在下表中：
[0180]菌株 构建体 背景
BH137 ActAN100-AH1A5-OVA Lm11(ΔactAΔinlB)
Lm11 阴性对照
PL712 ActAN100-PepVIIIx5-SL8 Lm11
PL714 ActAN100-PepVIIIx5-SL8 Lm677(prfA*)
PL716 ActAN100-PepVIIIx1-SL8 Lm11
PL717 ActAN100-PepVIIIx1-SL8 Lm677(prfA*)
BH137 ActAN100-AH1A5-OVA Lm11(ΔactAΔinlB)
Lm11 阴性对照
PL712 ActAN100-PepVIIIx5-SL8 Lm11
PL714 ActAN100-PepVIIIx5-SL8 Lm677(prfA*)
PL716 ActAN100-PepVIIIx1-SL8 Lm11
PL717 ActAN100-PepVIIIx1-SL8 Lm677(prfA*)
[0181] 实施例2.体外细胞培养
[0182] 在T细胞培养基（RPMI培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)，其中补充有10%FBS(Hyclone,Logan,UT)、青霉素/链霉素(Mediatech,Manassas,VA)、1x非必需氨基酸
(Mediatech,Manassas,VA)、2mM L-谷氨酰胺(Mediatech,Manassas,VA)、HEPES缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)、1mM丙酮酸钠(Sigma,St.Louis,MO)，和50μMβ-巯基乙醇(Sigma,St.Louis,MO)）中培养J774细胞。在不含青霉素/链霉素的T细胞培养基中培养B3Z杂交瘤细胞。
(Mediatech,Manassas,VA)、2mM L-谷氨酰胺(Mediatech,Manassas,VA)、HEPES缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)、1mM丙酮酸钠(Sigma,St.Louis,MO)，和50μMβ-巯基乙醇(Sigma,St.Louis,MO)）中培养J774细胞。在不含青霉素/链霉素的T细胞培养基中培养B3Z杂交瘤细胞。
[0183] 实施例4.免疫
[0184] 从Charles River Laboratories(Wilmington,MA)获得6-12周龄的雌性C3H/HeJ小鼠。根据合适的机构动物照顾与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的动物协议进行研究。由在酵母提取物培养基中过夜生长的培养物制备用于免疫的活减毒细菌。将细菌稀释在注射用Hank平衡盐溶液(HBSS)中。将活减毒细菌以200μL体积静脉内施用到尾静脉中。将活减毒细菌的注射储备液铺板，以确定集落形成单位(CFU)。间隔30天，用1x107CFU LmΔactAΔinlBprfA*-5xEGFRvIII20-40对雌性动物初免疫和加强免疫，并通过细胞内细胞因子染色确定EGFRvIII-特异性CD8+T细胞的频率。（图3）。
[0185] 实施例5.抗原表达和免疫应答的评估
[0186] a.蛋白质印迹
[0187] 对在酵母提取物培养基中生长至OD600为0.7（后对数期）的细菌培养物的等量TCA沉淀上清液执行肉汤培养物的蛋白质印迹。对于Lm感染的DC2.4细胞的蛋白质印迹，以10的感染复数(MOI)接种该细胞1小时，并将该细胞用PBS和补充有50μg/mL庆大霉素的DMEM培养基洗涤3次。在感染后7小时收获细胞。用SDS样品缓冲液裂解细胞，收集并在4-12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并将其转移至硝酸纤维素膜上用于蛋白质印迹分析。所有蛋白质印迹都利用针对ActA蛋白的成熟N-末端产生的多克隆抗体，并利用抗-p60单克隆抗体标准化至p60表达（不相关的Lm蛋白）。抗原检测要么通过增强化学发光(ECL)可视化，要么利用Licor Odyssey IR检测系统可视化和量化（图2）。
[0188] b.B3Z测定
[0189] 用选择的菌株感染DC2.4细胞，并将该细胞与OVA257-264特异性T细胞杂交瘤，B3Z一起温育。通过使用显色底物测量β-半乳糖苷酶表达来评估SIINFEKL表位在H-2Kb I类分子上的呈递（图4）。
[0190] c.用于流式细胞术的试剂
[0191] CD4FITC（克隆GK1.5）和MHC II类FITC（克隆M5/114.15.2）购自eBioscience(San Diego,CA)。CD8a抗体PerCP（克隆53-6.7）购自BD Biosciences(San Jose,CA)。Kk-EEKKGNYV(SEQ ID NO:3)四聚体利用NIH Tetramer Core折叠并与APC缀合。
[0192] d.EGFRvIII-特异性T细胞的四聚体染色
[0193] 将脾细胞（来自脾的淋巴细胞）与抗-CD4、抗-CD8、抗-MHC II类和Kk-EGFRvIII四聚体一起在室温下温育15分钟。用HBSS洗涤细胞三次。使用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)获取样品。对数据设门，以专门包括CD8+、CD4-II类事件，然后确定这些结合Kk-EEKKGNYV(SEQ ID NO:3)四聚体的细胞的百分比。利用FlowJo软件(Treestar,Ashland,OR)分析数据。
[0194] 实施例6.结果
[0195] 如从图2中可看出，在J774巨噬细胞内检测到所有的EGFRvIII20-40构建体。此外，我们发现增加EGFRvIII20-40的拷贝数似乎增强细胞内的分泌（图2）。分泌的5xEGFRvIII20-40的量超过“黄金标准”卵白蛋白的量。在接受5xEGFRvIII20-40构建体的动物中，在加强免疫后5天，脾中大于30%的CD8+T细胞具有EGFRvIII-特异性（图3）。B3Z T细胞识别出测试的所有EGFRvIII20-40构建体，指示单核细胞增生李斯特菌菌株成功表达和呈递大致相当于模型卵白蛋白抗原的水平的T细胞表位（图4）。
[0196] 这些数据揭示，EGFRvIII20-40表达构建体，特别是多聚EGFRvIII20-40表达构建体非常适合于在这种单核细胞增生李斯特菌疫苗平台中使用。
[0197] 实施例7.评价利用EEKKGNYV(SEQ ID NO:3)的免疫应答
[0198] I类限制性表位的精确鉴定提供了用于评估在体内的免疫原性，从而简化我们的疫苗候选物的比较的方法。为了鉴定小鼠I类限制性表位，以及为了执行免疫原性的粗略评估，用1x107集落形成单位(CFU)的每种EGFRvIII20-40表达菌株免疫C57BL/6(H-2b)、BALB/c(H-2d)、C3H/HeJ(H-2k)和SJL(H-2s)小鼠，并通过IFN-γ细胞内细胞因子染色(ICS)确定EGFRvIII-特异性T细胞的频率和特异性。可能由于我们的疫苗中的EGFRvIII20-40肽的短序列，并期望地由于与这些文库关联的已知N-末端加工问题，这个文库使用跨越14-AA的15-AA肽。C3H小鼠菌株(H-2k)中的反应最强，其中脾中>1%的总CD8+T细胞对15-AA肽中的一种作出应答（数据未示出）。
[0199] 为了证实这一研究结果并完善I类结合肽的确切序列，用Lm-EGFRvIIIx5菌株给C3H小鼠队列初免疫和加强免疫，然后利用肽文库再次筛选。另外，我们引入根据在最初的免疫原性测定中鉴定的15-mer完善的肽。来自这些经初免和加强免疫的小鼠的CD8+T细胞识别出数种15-AA肽，并且反应性取决于两个N-末端谷氨酸残基。假设这两个谷氨酸残基是MHC结合所必需的，我们使用这个序列的7-mer、8-mer和9-mer并针对反应性进行筛选（图5）。
[0200] 在C3H小鼠中I类限制性EGFRvIII表位的鉴定.用Lm-EGFRvIIIx5给雌性C3H小鼠初免疫和加强免疫，然后在五天后收获脾，并利用EGFRvIII肽文库以及来源于在初步筛选中具有最强反应性的肽的7-mer、8-mer和9-mer针对反应性进行测试。数据表示为在CD8+T细胞门内的%IFN-γ+事件。这些实验表明，来自经免疫的C3H小鼠的CD8+T细胞识别出8-AA肽EEKKGNYV(SEQ ID NO:3)。
[0201] TAP-缺陷的T2细胞不能加载I类分子和肽，导致不稳定及从细胞表面再循环。当添加可结合所表达的MHC分子的外源肽时，该分子与Lm-EGFRvIII一起在细胞表面上稳定化。为了证实EEKKGNYV(SEQ ID NO:3)肽与kk的结合，基本上按照以下文献中所描述的那样使用测量在肽结合后此种对I类表达的诱导的T2细胞测定：Hansen和Myers(2003)Peptide induction of surface expression of class I MHC,p.18.11.1-18.11.8，见
J.E.Colgan,A.M.Kruisbeer,D.H.Marguiles，和W.Strober（编），Current Protocols in Immunology,vol.4.John Wiley & Sons,New York,N.Y。将表达Kk的T2细胞与图6中所指示的肽浓度的每种EGFRvIII肽一起温育过夜。洗涤细胞，并使用I类特异性抗体针对表面Kk表达进行染色。该数据表明，EEKKGNYV结合Kk，并且相对于含有这种序列的较大肽是最优的。
这些数据支持，定义的EEKKGNYV肽基于它结合Kk的能力在离体细胞测定中的应用，并提供了可被CD8+T细胞识别的MHC-肽复合物。
J.E.Colgan,A.M.Kruisbeer,D.H.Marguiles，和W.Strober（编），Current Protocols in Immunology,vol.4.John Wiley & Sons,New York,N.Y。将表达Kk的T2细胞与图6中所指示的肽浓度的每种EGFRvIII肽一起温育过夜。洗涤细胞，并使用I类特异性抗体针对表面Kk表达进行染色。该数据表明，EEKKGNYV结合Kk，并且相对于含有这种序列的较大肽是最优的。
这些数据支持，定义的EEKKGNYV肽基于它结合Kk的能力在离体细胞测定中的应用，并提供了可被CD8+T细胞识别的MHC-肽复合物。
[0202] 使用这种定义的I类限制性肽，我们比较了在用每种菌株免疫后，最初的EGFRvIII-特异性CD8+T细胞应答的强度。用1x105CFU的1x或5x菌株给雌性C3H小鼠免疫，并在7天后收获脾，并通过ICS确定EGFRvIII26-33–特异性CD8+T细胞的频率。与我们的假设一致，多个拷贝的EGFRvIII20-40的引入导致相对于单一拷贝变体增强的CD8+T细胞初免（图7）。
[0203] 这些数据证明表达编码重复表位序列但改变密码子使用从而使遗传稳定性和抗原表达/分泌最大化的构建体的能力。这种途径在不增加对患者的潜在风险的情况下允许增加效价（即，通过给予大剂量疫苗）。
[0204] 本领域技术人员容易意识到，本发明非常适于实现目标以及获得所提及的目的和优点，以及本文固有的目的和优点。本文所提供的实施例是优选实施方案的代表，是示例性的，而不意欲限制本发明的范围。
[0205] 对于本领域技术人员显而易见，可在不背离本发明的精神和范围的情况下对本文所公开的本发明作出不同的取代和修改。
[0207] 本文示意性描述的本发明可在缺乏本文具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下适当地实施。因此，例如，在本文的每个例子中，术语“包含”、“基本上由......组成”及“由......组成”中的任一种可用其他两种术语中的任一种替换。已采用的术语和表达用作描述的术语，而非限制性的，并且使用此类术语和表达并非意欲排除所示和所描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应意识到，在本发明所要求保护的范围内的各种修改均是可能的。因此，应理解，尽管通过优选实施方案和任选特征具体地公开本发明，但本领域技术人员可采用本文所公开的概念的修改和变化形式，并且此类修改和变化形式均被认为在由所附权利要求书限定的本发明范围之内。
[0208] 其他实施方案阐述于所附权利要求书中。
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