技术领域
[0001] 本
发明属于朱槿木尔坦棉花曲叶病毒病防治方法技术领域；尤其涉及木尔坦棉花曲叶病毒的特异性检测引物和β卫星分子引物；还包括朱槿的病毒的综合防治方法。
背景技术
[0002] 朱槿Hibiscus rosa-sinense，又称扶桑、大红花等，属锦葵科木槿属。朱槿主要分布于华南、西南及华东的部分地区，是华南地区一种重要的园林观赏
植物。木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMuV)是一种引起朱槿曲叶病的重要病毒，当植株感病后，其症状表现为全株叶脉明显肿大(图1A)、
叶片向上卷曲(图1B)，严重时叶脉肿大形成叶
耳，最终植株长势衰弱，开花少或不开花，叶片黄化，最终枯死(图1C)。自然条件下，朱槿曲叶病主要由烟粉虱以持久方式带毒传播，另外扦插繁殖及带毒种苗也远距离人为传播，但不能通过机械摩擦和
种子带毒传播。在国内除发现木尔坦棉花曲叶病毒侵染朱槿以外，还可侵染棉花、黄秋葵、垂花悬铃花和蔟生黄麻等寄主植物并引起曲叶病症状。2006年在我国广东省首次发现CLCuMuV侵染引起的朱槿曲叶病，此后陆续在广西、海南、福建、
云南、江苏及新疆等地发现近年来，朱槿作为重要的园林绿化植物及家庭盆栽花，在全国各地大范围调运，广东广西及福建地区有大量生产朱槿苗木的园林
苗圃和基地，而携毒朱槿苗木运输和传毒介体烟粉虱扩散极大增加了CLCuMuV向我国棉区扩散及暴发的潜在
风险。在准确鉴定其病原种类及其分类地位的前提下，针对致病病毒及传毒介体[烟粉虱(图
1D)]开展了田间发生动态的追踪监测，明确了朱槿曲叶病毒长距离播散主要是由于感病寄主跨区调运，短距离自然播散主要是由于带毒介体及带毒宿主传播，针对该病毒或随带毒寄主植物、或借助带毒媒介昆虫被动携带传播的问题探索出了病害防控的关键点。
发明内容
[0003] 本发明正是为了解决上述问题
缺陷，提供一种朱槿木尔坦棉花曲叶病毒病防治方法。
[0004] 本发明采用如下技术方案实现。
[0005] 一种木尔坦棉花曲叶病毒的特异引物，本发明所述的特异引物为CL-F：CAGGAAGCAGGAAAATACGAGA；CL-R：TGGCAGTCCAACACAAAATACG。
[0006] 一种木尔坦棉花曲叶病毒的β卫星分子特异引物，本发明所述的β卫星分子特异引物beta-F：AAGTCGAATGGAACGTGAATGT；beta-R：GGAGACCAAAAGAGGAGAGAGA。
[0007] 使用上述引物检测木尔坦棉花曲叶病毒的方法，本发明该方法为PCR检测，所述的PCR条件为：25μLPCR反应体系：DNA模板2μL(10ng～20ng)、PCR Mixer 12.5μL、10μmol/L上下游引物各1μL、灭菌
水8.5μL；PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性45s，52℃
退火45s，52℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。
[0008] 使用上述检测方法进行朱槿综合防治的方法，本发明该方法步骤为，1)划分朱槿病毒病病情分级标准；2)进行木尔坦棉花曲叶病毒PCR检测，判断是否已感染木尔坦棉花曲叶病毒和感染轻重；3)根据步骤1的分级标准和步骤2的感染确认在来年对朱槿进行综合防治。
[0009] 本发明所述的朱槿病毒病病情分级标准为，
[0010]
[0011]
[0012] 本发明所述的综合防治包括：生根及上盆时间：在南方，20天后多数生根，生长一个多月即可上盆。在寒冷的地方，采用取暖使
温度保持在20-25℃，扦插入沙盆中，一天喷水1-3次，40多天即生根，60天上盆；移栽：插苗生根后，上盆；盆底通水孔用瓦片盖好，底层装基肥，再装混合土，然后栽苗，浇透水，每天浇1次水，并遮荫；缓苗后，将其放在阳光充足的地方，经过2-3年培育后换盆，换盆时间为春末和夏初出房时进行。
[0013] 进一步，本发明所述的综合防治包括：田间管理：室外栽培和室内栽培，扦插后初期都要遮荫，保持
相对湿度85％-95％，
温度控制在18-25℃，光照充足，半月追一次肥。如在北方寒冷地区，10月末进
温室，室温控制在15-22℃。
[0014] 进一步，本发明所述的综合防治包括：在种苗期和成株期，用挂黄板监测烟粉虱数2
量。当烟粉虱低
密度时，可在棚内或田间挂置黄色粘虫板，悬挂高度与植株同高，每20m 悬挂1片。
[0015] 进一步，本发明所述的综合防治包括：使用高效氯氟氰菊脂对MEAM1隐种和AsiaⅡ7隐种进行杀灭。
[0016] 进一步，本发明所述的综合防治包括：使用阿维菌素对MEAM1隐种和AsiaⅡ7隐种进行杀灭。
[0017] 本发明的有益效果为，本发明方法步骤环环相扣，在首先设置朱槿病毒病病情分级标准的
基础上设计木尔坦棉花曲叶病毒的特异引物的β卫星分子特异引物对该病毒进行特异性检测，在
电泳图上可以根据条带确认植株感染病毒，结合步骤1的分级标准和步骤2的病毒确认在来年对朱槿进行综合防治。所述的综合防治涉及朱槿植物的生长发育阶段，尤其是在生根阶段、移栽阶段的农业防治措施；进行四种毒
力测试试验，仅周密的试验发现高效氯氟氰菊脂和阿维菌素在对致病朱槿植物的靶标
生物---烟粉虱防治上具有非常突出的效果。本发明的手段和方法可以在业界进行广泛推广，亦可为其他植物及其病毒的防治方法提供理论依据。
[0018] 下面结合
附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
[0019] 图1A为朱槿曲叶病叶脉变绿并肿大症状表现图。
[0020] 图1B为朱槿曲叶病叶片向上卷曲症状表现图。
[0021] 图1C为朱槿曲叶病导致整株枯死表现图。
[0022] 图1D为传播朱槿曲叶病毒的传播介体—烟粉虱图。
[0023] 图2为朱槿曲叶病植株的木尔坦棉花曲叶病毒检测电泳图，1-6号分别为6个不同地点发病朱槿样品。
[0024] 图3为朱槿曲叶病植株的β卫星分子检测电泳图，1-6号分别为6个不同地点发病朱槿样品。
[0025] 图4为疑似曲叶病的朱槿植株检测电泳图，1-6号分别为6个不同地点的朱槿植株。
具体实施方式
[0026] 朱槿病毒病病情分级标准
[0027]
[0028]
[0029] 朱槿叶片CLCuMuV检测
[0030] 采用植物细胞组织基因组
试剂盒EF111-12，北京全式金生物技术有限公司，提取朱槿植株叶片总DNA，具体操作按试剂盒说明进行。采用CLCuMuV特异引物CL-F、CL-R和β卫星分子特异引物beta-F、beta-R(表1)，分别进行PCR检测。
[0031] 25μLPCR反应体系：DNA模板2μL(～20ng)、PCR Mixer 12.5μL、10μmol/L上下游引物各1μL、灭菌水8.5μL。
[0032] PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性45s，52℃退火45s，52℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。
[0033] PCR反应结束后，取10μLPCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
[0034] 表1 PCR分析中引物
[0035]
[0036] 朱槿曲叶病防控技术
[0037] 以“
预防为主，综合防治”的指导思想，开展朱槿曲叶病防控。
[0038] 1、加强种苗检疫，保障种苗生产安全
[0039] (1)生产上多采用扦插繁殖，室外栽培结合早春
修剪，在5-6月份进行扦插，但如果是室内扦插，一般在早春1-2月结合修剪进行。
[0040] (2)选地整地：选向阳的、
土壤肥沃、疏松排水良好的弱酸性土壤。
[0041] (3)种苗选择：选用健壮、无病症的朱槿成株为插穗的母株。选一年生半木质粗壮的枝条，插穗长8-l0cm，除尽下端叶片，上部叶可剪除一半，留下3-4片叶，将其扦插到营养基质或沙钵中。
[0042] (4)种苗管理：插进粗沙中1/3后浇透水，株行距4cm×4cm。为了保持空气温度，上面
覆盖薄膜。
[0043] (5)生根及上盆时间：在南方，20天后多数生根，生长一个多月即可上盆。在寒冷的地方，采用取暖使温度保持在20-25℃，扦插入沙盆中，一天喷水1-3次，40多天即生根，60天上盆，成活率60％。
[0044] (6)其它日常管理：有烟粉虱时，及时进行化学药剂防除。当发现有明显病症的植株时，立即将其销毁，并对该批种苗进行杀虫防护。
[0045] (7)苗木种植环境的清洁：清理枯萎枝叶，拔除周边
杂草，带至室外集中处理，控制传毒介体-烟粉虱大量繁殖及其携带的潜在毒源。
[0046] 2、加强成株期苗木生产安全
[0047] (1)移栽：插苗生根后，上盆。盆底通水孔用瓦片盖好，底层装基肥，再装混合土，然后栽苗，浇透水，每天浇1次水，并遮荫。缓苗后，将其放在阳光充足的地方，经过2-3年培育后换盆，换盆时间为春末和夏初出房时进行。
[0048] (2)田间管理：室外栽培和室内栽培，扦插后初期都要遮荫，保持相对湿度85％-95％，温度控制在18-25℃，光照充足，半月追一次肥。如在北方寒冷地区，10月末进温室，室温控制在15-22℃，注意
通风，肥少施或培施。
[0049] 3、传毒介体烟粉虱防治
[0050] 在种苗期和成株期，挂黄板监测烟粉虱数量。当烟粉虱低密度时，可在棚内或田间挂置黄色粘虫板，悬挂高度与植株同高，每20m2悬挂1片，及时清理更换。当其高密度时，可选用已登记的
杀虫剂及其复配剂进行喷雾防控。达到病虫兼防的目的。
[0051] 朱槿上的烟粉虱为入侵隐种MEAM1和本地隐种AsiaⅡ7，本地隐种AsiaⅡ7可传播朱槿曲叶病毒，为了明确常用烟粉虱药剂对朱槿上烟粉虱的防治效果，本发明对这两个烟粉虱隐种进行了防控试验。选用药剂为：50％啶虫脒(Acetamiprid)
乳油，20％吡虫啉(Imidacloprid)可溶液剂，1％高效氯氟氰菊脂(Lambda-cyhalothrin)水乳剂，1.8％阿维菌素(Avermectins)乳油，药剂敏感性试验在温度为26±2℃、湿度80％±5％、光周期L：D＝14：10的温室内进行。
[0052] 每个药剂设置5个浓度及1组空白对照，MEAM1隐种分别为各药剂2000-5000倍液，AsiaⅡ7隐种分别为各药剂5000-9000倍液。采用琼脂保湿浸叶法，根据Feng等(2009)的方法改进，在平底玻璃管(直径28mm×高12cm)底部加入5mL的1.5％的琼脂液，待琼脂自然冷却
凝固后，使用打孔器将棉花叶片打成直径为26mm的圆叶片，将叶片浸入到各浓度药液里15s后，取出晾干，然后将叶片背面朝上，平放在平底玻璃管中的琼脂胶上，清
水处理作为对照。每管接入30-40头烟粉虱成虫，用120目纱网封口。将玻璃管倒置于温度为26±2℃、光周期L：D＝14：10的光照
培养箱内，48h后检查各处理的死亡率。
[0053] 室内
毒力测定结果表明(表2)，对于MEAM1隐种，高效氯氟氰菊脂和阿维菌素LC50分别为2.163mg/L和2.867mg/L，吡虫啉LC50为41.136mg/L，啶虫脒LC50为84.013mg/L，是高效氯氟氰菊脂的39倍。
[0054] 对于AsiaⅡ7隐种，高效氯氟氰菊脂和阿维菌素LC50分别为1.624mg/L和1.672mg/L，吡虫啉LC50为27.136mg/L，啶虫脒LC50为57.163mg/L，是高效氯氟氰菊脂的35倍。MEAM1和AsiaⅡ7隐种对4种药剂的敏感度基本相同，毒力大小依次为高效氯氟氰菊脂>阿维菌素>吡虫啉>啶虫脒，其中前两个药剂的控制效果较好。
[0055] 表2四种杀虫剂对MEAM1和AsiaⅡ7烟粉虱的毒力测定
[0056]
[0057] 因此，防治朱槿曲叶病毒病介体AsiaⅡ7烟粉虱，建议选用高效氯氟氰菊脂5000倍液或阿维菌素5000倍液。施药时，要均匀地喷到叶的
正面、背面，连续喷洒2-3次，每次间隔5-7天。
[0058] 以上所述的仅是本发明的部分具体
实施例(由于本发明的配方属于数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围以本发明的数值范围和其他技术要点范围为准)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本
申请要求的保护范围应当以其
权利要求的内容为准，
说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
