技术领域
[0001] 本
发明涉及肥料技术领域，具体是一种复合微
生物肥料及其制备方法。技术背景
[0002] 资源与环境问题是当今世界人类甚为重视的问题之一。中国作为世界上最大的发展中国家，人口众多，资源与环境问题日趋严重。近年来，由于过度砍伐、过度放牧、工业与生活
废水的大量排放、
农药化肥的大量使用，造成对环境的污染日趋严重，已严重的危害到人民的健康，威胁到人类的生存。特别是目前，由于全世界农业和化肥使用量的增长，对农药和化肥的依赖日益增强，造成了
有机肥使用不足、
土壤养分比例失调、土壤板结、土壤
质量下降、河流和
地下水污染等一系列问题。要避免重蹈发达国家“先污染破坏，后治理”的覆辙，发展“可持续发展”新农业，就要减少农药和化肥的使用量，寻找有效的替代品。
[0003] 复合微生物肥料具有肥效高、本身无毒、不污染环境而且成本低、可节约
能源等特点，是化肥的最有效的替代品。合理开发和利用微生物肥料，是我国农业可持续发展的重要途径。复合微生物肥料的核心是微生物，因此具有微生物的特性。微生物资源丰富，种类和功能繁多，可以开发成不同的功能，不同用途的肥料。而且微生物菌株可以经过人工选育并不断纯化、复壮以提高其活
力，特别是随着生物技术的进一步发展，通过基因工程的方法获得所需要的菌株成为可能。微生物肥料中含有微生物的一些次生代谢产物，其中一些是作物的生长
激素，可以在作物苗期刺激作物生长发育，在作物成熟期还可以提高作物的品质；还有一些则有防治病虫害的功能。另外，从环境资源来看，微生物肥料具有资源再利用，无毒、无害、无污染、成本低的特点。
[0004] 在复合微生物肥料的研制过程中微生物菌种的选育，目标菌株的驯化，复合微生物菌系的复配，目标微生物和有机肥、无机肥的复配技术，肥料中微生物的存活率等等问题都是必须考虑和研究的。其中，研究复合微生物肥料生产过程中各环节对产品中微生物存活率的影响至关重要。因为生产过程中离子浓度的升高、
温度的升高以及其他各种环境因素的变化都可能导致微生物失活。
[0005] 微胶囊技术是以天然或合成的高分子材料作为囊壁，通过化学法、物理法或物理化学法将一种或者多种活性物质包裹起来形成具有半透性或密封囊膜的微小粒子的技术。包裹的过程即为微胶囊化，形成的微小粒子即为微胶囊。微胶囊化的优势在于形成微胶囊时，囊芯物质被包覆而与外界环境隔离，它的功能被毫无影响的保留下来，在适当条件下，壁材被破坏时又能将囊芯释放出来，可使囊芯免受外界的温度、
氧气、紫外线等因素的影响。
[0006] 本发明通过将微生物细胞微胶囊化后与有机肥和/或无机肥混合，制备成复合微生物肥产品，从而能有效的防止无机肥中高盐等不良条件对微生物细胞的伤害，也能防止在肥料生产中
造粒和干燥过程中对微生物的伤害，从而提高复合微生物肥料中微生物的存活率，进而提高复合微生物肥料的品质。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的技术问题是为了克服
现有技术的不足，用微胶囊包埋的方式来提高复合微生物肥料中微生物存活率，从而提高复合微生物肥料的品质，本发明的另一个目的是提供该复合微生物肥料的制备方法及其在农业中的应用。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] 为了实现以上目的，本发明所述的微生物微胶囊其囊壁由新型有机高分子聚γ-谷
氨酸和明胶交联而成，囊心为活的微生物细胞。
[0010] 本发明中，上述聚γ-谷氨酸产品的制备方法参见华中农业大学的授权
专利：
发明名称为聚γ-谷氨酸生产菌及生产聚γ-谷氨酸的方法，公开号：CN1536071；专利号为ZL03118908.3。
[0011] 本发明中作为囊心的微生物可选自下列微生物，但不局限于下列微生物：
[0012] 巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)，保藏号：ACCC NO：10010，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)，通过
发酵获得其芽胞和菌体；
[0013] 胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)，保藏号：ACCC NO：10168，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)，通过发酵获得其芽胞和菌体；
[0014] 侧胞芽胞杆菌(Bacillus laterosporus)，保藏号：ACCC NO：11079，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)，从农业菌种保藏中心购买，通过发酵获得其芽胞和菌体；
[0015] 紫
云英根瘤菌(Rhizobium astragula)，保藏号：CICC NO：20026，购自中国工业微生物菌种保藏中心(地址：北京市朝阳区霄云路32号)，通过发酵获得其菌体。
[0016] 淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，保藏号：ACCC NO：30680，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)，通过发酵获得其菌体。
[0017] 本发明所用的无机肥为氮肥、磷肥、
钾肥和微量元素肥料中的一种或者任意几种的混合，所用的有机肥为市售常规有机肥。
[0018] 本发明的具体步骤如下：
[0019] (1)将所选的功能微生物制备成微生物微胶囊水剂或
固体制剂，例如：保藏号为ACCC NO：10010的巨大芽胞杆菌、保藏号为ACCC NO：10168胶冻样芽胞杆菌、保藏号：ACCC NO：11079的侧胞芽胞杆菌、保藏号为CICC NO：20026的紫云英根瘤菌和/或保藏号：ACCC NO：30680的淡紫拟青霉(具体制备方法见
实施例1)；
[0020] (2)有机-无机肥的混合。将无机肥(其包括：氮肥、磷肥、钾肥和微量元素肥料中的一种或者任意几种的组合)以及有机肥充分
粉碎后，以质量百分比为：有机肥10～100％，无机肥0～90％称取各组分，经混合均匀得有机-无机肥混合物；
[0021] (3)微生物微胶囊与有机-无机肥的混合。以质量百分比为：微生物微胶囊液体制剂或固体制剂1～90％，步骤(2)中所得的有机-无机肥的混合物10～99％称取各组分，经充分混合均匀得粉状的复合微生物肥；
[0022] (4)造粒。将粉状的复合微生物肥料传送至造粒机进行造粒，得颗粒状复合微生物肥；
[0023] (5)干燥。将粉状和颗粒状的复合微生物肥料于70℃～85℃干燥处理25～40min；
[0024] (6)分筛。将烘干处理后的样品进行分筛，粉状的复合微生物肥料粒度应不大于2.0mm，颗粒状的复合微生物肥料粒度应大于1.0mm小于4.75mm，对不合格的产品予以返料处理；
[0025] (7)检测复合微生物肥料中微生物的数量。
[0026] 本发明提供的复合微生物肥料及其制备方法与现有的复合微生物肥料相比具有以下显著优点：
[0027] (1)本发明的复合微生物肥料其微生物以聚γ-谷氨酸和明胶为壁材进行包裹使其微胶囊化，解决了微生物肥料生产过程中微生物存活率较低的问题；
[0028] (2)本发明的复合微生物肥料其微生物以聚γ-谷氨酸和明胶为壁材进行包裹使其微胶囊化，解决了肥料中的高盐环境导致的微生物存活率低的问题，提高复合微生物肥料的品质；
[0029] (3)本发明的复合微生物肥料其微生物以微胶囊的形式存在，使肥料中的微生物在土壤中具有一定的抵抗外界不良条件的能力，如抗紫外线等；
[0030] (4)本发明的复合微生物肥料其微生物以微胶囊的形式存在，在施入环境后对微生物具有缓
控释作用，能延长肥料的残效期。
附图说明
[0031] 图1：是本发明的复合微生物肥料制备工艺
流程图。
[0032] 图2：是本发明实施例六中紫外线对含淡紫拟青霉微胶囊复合微生物肥料和含淡紫拟青霉复合微生物肥料中淡紫拟青霉存活率的影响。
具体实施方式
[0033] 下面结合具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的
修改均落于本
申请所附
权利要求所限定的范围。
[0034] 实施例1
[0035] 本发明中的微生物微胶囊其囊壁外层可以采用甲
醛加固，甲醛用量为0.6ml/g明胶。上述
固化剂不只局限于甲醛，凡是小分子的醛类都适用于本发明，醛类与甲醛的用量为等摩尔数。微生物微胶囊以聚γ-谷氨酸和明胶通过交联形成囊壁，以活的微生物细胞作为囊心，最终制成的微生物微胶囊制剂是水剂或固体制剂。微生物微胶囊的具体制备步骤如下：
[0036] (1)微胶囊的囊壁材料水溶液的制备：按质量百分比配制1.5～4.0％的聚γ-谷氨酸水溶液；按质量百分比配制1.5～4.0％的明胶水溶液；
[0037] (2)菌悬液的制备：将作为囊心的微生物发酵液，于10000r/min离心收集沉淀，然后用0.9％的生理盐水稀释至所需浓度。其中：
[0038] 菌悬液巨大芽胞杆菌8×1010个芽胞/ml；
[0039] 菌悬液胶冻样芽胞杆菌6×109个芽胞/ml；
[0040] 菌悬液侧胞芽胞杆菌9×1010个芽胞/ml；
[0041] 菌悬液紫云英根瘤菌2×1011个芽胞/ml；
[0042] 菌悬液淡紫拟青霉7×109个孢子/ml；
[0043] (3)微胶囊固定液和pH调整液的配制：配制40.0％的甲醛溶液；配制3mol/L的Hcl和1mol/L的NaOH水溶液；
[0044] (4)微胶囊的制备：量取40体积份数由步骤(1)制备得到的质量百分比为1.5～4.0％的明胶水溶液，在35～50℃下，300～500r/min的磁力搅拌下缓慢加入步骤(2)得到5～20体积份数的菌悬液，然后在35～50℃，300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～
20min，然后慢速加入40体积份数由步骤(1)制备得到的质量百分比为1.5％～4.0％的聚γ-谷氨酸水溶液，在35～50℃，300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～20min，用步骤(3)制备的3mol/L的Hcl和1mol/L的NaOH水溶液调pH到3.8～4.2，在35～50℃，
300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～20min，按0.6ml/g明胶的量加入步骤(3)中的甲醛溶液，在35～50℃，300～500r/min的磁力搅拌下搅拌10～20min，得到微生物微胶囊水剂；
[0045] (5)将步骤(4)得到的微生物微胶囊水剂，采用
喷雾干燥或
真空干燥或真空
冷冻干燥得到固体微胶囊制剂，其中：
[0046] 喷雾干燥条件：进口温度为170±5℃，出口温度为70±5℃，进料速度为700±10ml/min；
[0047] 真空干燥条件：70℃，-0.1～-0.09MP；
[0048] 真空冷冻干燥条件：-110℃，-0.1～-0.09MP。
[0049] 实施例2
[0050] 含巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)微胶囊的复合微生物肥料，它是由无机肥、有机肥和巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)微胶囊组成。
[0051] 本发明所用的无机肥和有机肥均由市场上购买。
无机肥料生产厂家为湖北新洋丰肥业股份有限公司，成分为N-P2O5-K2O：15∶15∶15；有机肥料生产厂家为上海精科绿岛生物有机肥有限总公司，主要成分为：氮磷钾≥4％，有机质≥30％。
[0052] 本发明中作为囊心的微生物为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，保藏号：ACCC NO：10010，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)，通过发酵获得其芽胞和菌体。具体步骤如下所述：
[0053] (1)在斜面保存或者甘油冻存的巨大芽胞杆菌中挑取1-2环菌体，接种到
种子培养基(重量百分比含有0.5％的蛋白胨、0.5％的
酵母浸粉、1.0％的
氯化钠，调节pH至7.0-7.5，121℃高压灭菌30min)中，于37℃，180r/min摇瓶培养10h，得到一级种子液；
[0054] (2)在液体扩大LB培养基中以2％-5％的接种量接种一级种子液，于37℃，180r/min摇瓶培养8h，得到二级种子液；
[0055] (3)在发酵培养基(玉米
淀粉120g，蛋白胨90g，
豆粕180g，KH2PO412g，
碳酸
钙12g，
硫酸镁6g，硫酸锰3g，pH 7.2～7.6，121℃
蒸汽灭菌30min)中以2％-5％接种量接种二级种子。发酵条件为：10L
发酵罐装液量为6L，培养温度为37℃，搅拌桨转速为180r/min，发酵时间为36小时。发酵至终点既得巨大芽孢杆菌发酵液。
[0056]
申请人建立了一种制备含有巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)微胶囊的复合微生物肥料颗粒剂的方法，其步骤如下：
[0057] (1)将巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)制备成微胶囊固体制剂，并检测单11
位制剂中微生物的含量，其制剂中微生物的含量为1×10 cfu/g微胶囊固体制剂；
[0058] (2)有机-无机肥的混合：将无机肥和有机肥分别粉碎，后按质量比为无机肥：有机肥为7∶3称取各组分并混合均匀；
[0059] (3)微生物微胶囊与有机-无机肥的混合：将步骤(2)所得的有机-无机肥混合物与微胶囊固体制剂按照1∶1的比例称取各组分，并混合均匀。
[0060] (4)造粒：将混合均匀的复合微生物肥料传送至造粒机进行造粒。
[0061] (5)干燥：将混合均匀的复合微生物肥料传送至干燥设备，于120℃干燥处理15min。
[0062] (6)分筛：将干燥后的样品进行分筛，粒度大于1.0mm小于4.75mm的样品为合格产品，而粒度不大于1.0mm或不小于4.75mm的产品这予以返料处理。
[0063] (7)以平板计数法检测复合微生物肥料中微生物的含量为4.6×1010cfu/g。
[0064] 对照组直接以微生物的含量为1×1011cfu/g未经微胶囊包裹的巨大芽孢杆菌菌剂生产复合微生物肥料，肥料生产工艺相同，得到的复合微生物肥料其产品中微生物的含10
量为1.1×10 cfu/g。说明本发明的方法能有效的保护产品中的巨大芽孢杆菌的存活率，减少肥料生产过程对微生物的伤害，采用本发明的方法生产的复合微生物肥料中巨大芽孢杆菌的存活率与对照相比提高了76.09％。
[0065] 本方法生产的复合微生物肥料执行中华人民共和国农业行业标准《复合微生物肥料》，标准号为NY/T 789-2004，2004年4月16日发布，2004年6月1日实施。
[0066] 实施例3
[0067] 含胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)微胶囊的复合微生物肥料，它是由无机肥、有机肥和胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)微胶囊组成。
[0068] 本发明所用的无机肥和有机肥均由市场上购买。无机肥料生产厂家为湖北新洋丰肥业股份有限公司，成分为N-P2O5-K2O：14∶16∶15。
[0069] 有机肥料供应厂家为山东京援矿业建材公司有机肥厂，主要成分为及含量如下：总养分≥5％，有机质≥50％，腐植酸≥25％，水分≤20％。
[0070] 本发明中的胶冻样芽孢杆菌微胶囊其具体制备步骤参考实施例1。
[0071] 在本实施例中，所用微生物是胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)，保藏号：ACCC NO：10168，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)，通过发酵获得其芽胞和菌体。具体步骤如下所述：
[0072] (1)在斜面保存或者甘油冻存的胶冻样芽胞杆菌中挑取1-2环菌体，接种到种子培养基(重量百分比含有0.5％的蛋白胨、0.5％的酵母浸粉、1.0％的氯化钠，调节pH至7.0-7.5，121℃高压灭菌30min)中，于28℃，150-250r/min摇瓶培养10h，得到一级种子液；
[0073] (2)在液体扩大LB培养基中以2％-5％的接种量接种一级种子液，于28℃，180r/min摇瓶培养10h，得到二级种子液；
[0074] (3)在发酵培养基(豆粕粉45g，玉米淀粉12g，CaCO31.5g，K2HPO40.375g，FeCl30.02g，七水
硫酸镁3.6g，补充蒸馏水至1.5L，pH 7.0-7.2，121℃蒸汽灭菌30min)中以2％-5％接种量接种二级种子。发酵条件为：3L发酵罐装液量为1.5L，培养温度为28℃，搅拌桨转速为180r/min，发酵时间为24小时。发酵至终点既得胶冻样芽孢杆菌发酵液。
[0075] 申请人建立了一种制备含有胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)微胶囊的复合微生物肥料颗粒剂的方法，其步骤参考实施例1：
[0076] 其中步骤(1)中胶冻样芽孢杆菌微胶囊制剂为液体剂型，实测其微生物含量为8
1×10cfu/mL；步骤(2)中的无机肥与有机肥的质量比方1∶1；步骤(3)中有机-无机肥混合物与微胶囊液体制剂的质量比为2∶8；步骤(5)中的烘干温度为130℃，处理时间为
8
40min；步骤(7)中检测复合微生物肥料中胶冻样芽孢杆菌的含量为2.4×10cfu/g。
[0077] 对照组直接以微生物的含量为1×108cfu/mL未经微胶囊包裹的胶冻样芽孢杆菌液体制剂生产复合微生物肥料，肥料生产工艺相同，得到的复合微生物肥料其产品中胶冻8
样芽孢杆菌的含量为1.4×10cfu/g。说明本发明的方法能有效的保护产品中的胶冻样芽孢杆菌的存活率，减少肥料生产过程对微生物的伤害，采用本发明的方法生产的复合微生物肥料中胶冻样芽孢杆菌的存活率与对照相比提高了41.67％。
[0078] 本方法生产的复合微生物肥料执行中华人民共和国农业行业标准《复合微生物肥料》，标准号为NY/T 789-2004，2004年4月16日发布，2004年6月1日实施。
[0079] 实施例4
[0080] 含淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)微胶囊的复合微生物肥料，它是由无机肥、有机肥和淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)微胶囊组成。
[0081] 本发明所用的无机肥和有机肥均由市场上购买。无机肥料生产厂家为湖北新洋丰肥业股份有限公司，成分为N-P2O5-K2O：18∶18∶18；有机肥料供应厂家为贵州光勋生物肥业有限公司其指标为：有机质含量≥30％，总养分≥4.0％。
[0082] 本发明中的淡紫拟青霉微胶囊其具体制备步骤参考实施例1。
[0083] 在本实施例中，用于囊心的微生物为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，保藏号：ACCC NO：30680，购自中国农业微生物菌种保藏中心，(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)，通过发酵获得其菌体和孢子。具体制备步骤如下所述：
[0084] (1)在斜面保存的淡紫拟青霉中挑取1-2环菌体，接种到培养基中，摇瓶装液量为250mL三
角瓶装50mL，于28℃，100r/min摇瓶培养12h，得到一级种子液。培养基的配制如下：取200g
马铃薯于800mL沸水中煮沸10min，后用纱布过滤得滤液，向滤液中加入20g
蔗糖，然后用水定容至1L，pH 7.0-7.5，分装后于121℃蒸汽灭菌30min；
[0085] (2)在液体扩大培养基中以2％-5％的接种量接种一级种子液，摇瓶装液量为250mL三角瓶装50mL，于28℃，180r/min摇瓶培养10h，得到二级种子液，培养基的配制如步骤(1)；
[0086] (3)在发酵培养基(取1200g马铃薯于4.8L沸水中煮沸10min，后用纱布过滤得滤液，向滤液中加入120g蔗糖，然后用水定容至6L，pH 7.0-7.5，121℃蒸汽灭菌30min)中以2％-10％接种量接种二级种子。发酵条件为：10L发酵罐装液量为6L，培养温度为28℃，搅拌桨转速为100r/min，发酵时间为72小时。发酵至终点既得淡紫拟青霉发酵液。
[0087] 申请人建立了一种制备含有淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)微胶囊的复合微生物肥料粉剂的方法，其步骤参考实施例1：
[0088] 其中步骤(1)中微胶囊剂为固体制剂，其微生物含量为1×109cfu/g；步骤(2)中的无机肥与有机肥的质量比为1∶9；步骤(3)中有机-无机肥混合物与微胶囊固体制剂的质量比为4∶6；步骤(5)中的烘干温度为120℃，处理时间为20min；步骤(7)中检测复8
合微生物肥料中淡紫拟青霉的含量为5.7×10cfu/g。
[0089] 本方法生产的复合微生物肥料执行中华人民共和国农业行业标准《复合微生物肥料》，标准号为NY/T 789-2004，2004年4月16日发布，2004年6月1日实施。
[0090] 对照组直接以微生物的含量为1×109cfu/g未经微胶囊包裹的淡紫拟青霉固体制剂生产复合微生物肥料，肥料生产工艺相同，得到的复合微生物肥料其产品中淡紫拟青霉8
的含量为4.3×10cfu/g。说明本发明的方法能有效的保护产品中的淡紫拟青霉的存活率，减少肥料生产过程对微生物的伤害，采用本发明的方法生产的复合微生物肥料中胶冻样芽孢杆菌的存活率与对照相比提高了24.56％。
[0091] 实施例5应用实施例
[0092] 将实施例1的含巨大芽胞杆菌微胶囊的复合微生物肥料、含巨大芽孢杆菌的复合微生物肥料进行田间实验，考察两种肥料对小白菜产量的影响。试验组和对照组各一个处理每个处理三个平行，每个平行处理的面积为1亩，每亩复合微生物肥料的用量为30公斤，
播种及田间管理相同，不同的是试验组施用的含巨大芽孢杆菌微胶囊的复合微生物肥料，对照组施用含巨大芽孢杆菌的复合微生物肥料，收成后两组对比，结果如表1。
[0093] 表1不同的复合微生物肥料对小白菜产量的影响
[0094]
[0095] 实施例5
[0096] 将实施例2的含胶冻样芽胞杆菌微胶囊的复合微生物肥料、含胶冻样芽胞杆菌的复合微生物肥料进行田间实验，考察两种肥料对生菜产量和品质的影响。试验组和对照组各一个处理每个处理三个平行，每个平行处理的面积为1亩，播种及田间管理相同，不同的是试验组施用的含胶冻样芽胞杆菌微胶囊的复合微生物肥料，对照组施用含胶冻样芽胞杆菌的复合微生物肥料，收成后两组对比，结果如表2：
[0097] 表2不同的复合微生物肥料对生菜产量和品质的影响
[0098]
[0099] 实施例6
[0100] 将实施例3中所得的含淡紫拟青霉微胶囊的复合微生物肥料与对照组含淡紫拟青霉的复合微生物肥料分别用紫外线照射，观察两种复合微生物肥料中淡紫拟青霉的存活率。实验处理如下：取适量两种复合微生物肥料平铺于培养皿中，复合微生物肥料的厚度约1mm左右，后将平皿置于紫外灯下20cm处，用强度为30w的紫外线进行照射，每隔15min晃动一次平皿，照射一定时间后混匀样品并取1克样品检测其中淡紫拟青霉的含量，计算其存活率，结果见图2。
