技术领域
[0001] 本
发明涉及具有高质量的软骨细胞组合物，以及用于质量保证和质量控制软骨细胞组合物的方法。
[0002] 背景
[0003] 关节透明软骨的损害具有有限的固有的损伤后愈合能
力。这会导致
加速的关节退化和早发性骨关节炎。现今，保留天然关节软骨以延缓关节置换术的需求不断增长。
[0004] 人类成年关节软骨细胞是一种独特的细胞类型，其已经达到完全分化的状态作为发育的终点。在软骨基质内，软骨细胞调节软骨的内稳态，并使基质成分保持在平衡的低转换状态。
[0005] 软骨细胞，软骨中唯一的细胞类型，表达多种不同的整联蛋白。整联蛋白是介导细胞-细胞和细胞-基质相互作用的跨膜糖蛋白的一大家族。此超家族的所有已知成员都是由α-和β-亚基组成的非共价缔合的异二聚体。整联蛋白α10β1是软骨细胞上主要的结合
胶原蛋白的整联蛋白。它由分化的软骨细胞以及由具有软骨形成分化潜能的MSC表达。另一方面，整联蛋白α11β1是由
成纤维细胞(包括滑液成纤维细胞)表达的。整联蛋白α11β1也可以由
单层培养物中的软骨细胞中表达，该单层培养物可能已部分去分化并产生I型纤维性胶原蛋白而不是II型软骨胶原蛋白，并因此提供了测定软骨细胞制剂的纯度和质量的方法。
[0006] 基于软骨细胞的用于
治疗关节软骨损伤的
细胞疗法是一种旨在修复和恢复透明软骨的有前景的方法。
[0007] 基于软骨细胞的细胞疗法的主要限制与从软骨活检中以酶法去除软骨基质以分离软骨细胞的过程有关。在此过程中，来自非软骨组织(诸如滑膜)的细胞可污染软骨细胞制剂(Dai等2006,Stebuils等2005)，从而影响用于植入的软骨细胞制剂的纯度和质量。此外，软骨细胞一旦从软骨基质中分离出来，通常就会去分化(Rapko等2009)。这导致其专
门的软骨细胞特性的丧失，这可以将其检测为II型胶原蛋白向I型胶原蛋白的合成的转换。因此，需要有力的方法来质量控制软骨
细胞质量。
[0008] 概述
[0009] 本
发明人已经发现了细胞表面蛋白整联蛋白α10β1和整联蛋白α11β1的表达
水平与经分离并培养的软骨细胞的质量之间的关联，且因此发现了定义和质量保证和/或质量控制软骨细胞制剂的新方式。
[0010] 本公开内容基于以下发现：整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1指示高质量软骨细胞组合物和/或产品。虽然整联蛋白α10和整联蛋白α11表达水平根据培养条件而变化，但是它们的比率能够预测高质量软骨细胞组合物。
[0011] 此外，本发明人还已经发现：
[0012] ·整联蛋白α10的表达可指示软骨细胞同一性；
[0013] ·整联蛋白α10连同整联蛋白α11的表达可指示部分去分化的软骨细胞；
[0014] ·整联蛋白α10的表达和整联蛋白α11的低表达或基本上无表达可指示分化的软骨细胞，和
[0015] ·整联蛋白α11的表达和整联蛋白α10的低表达或基本上无表达可指示非软骨细胞同一性，包括高度去分化的软骨细胞、成纤维细胞样细胞和/或其它污染细胞。
[0016] 因此，在一方面中，本公开内容涉及包含软骨细胞的组合物，其中所述组合物具有的整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1。
[0017] 在另一方面中，本公开内容涉及一种用于测定包含软骨细胞的组合物的质量的方法，其中该质量测定包括以下标准中的一个或多个：
[0018] ·软骨细胞的同一性，
[0019] ·软骨细胞的分化状态，
[0020] ·软骨细胞的纯度，和
[0021] ·软骨细胞的潜能，
[0022] 该方法包括以下步骤：
[0023] a)提供包含软骨细胞的候选组合物；
[0024] b)分析所述组合物中整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达水平；
[0025] c)比较整联蛋白α10的表达水平与整联蛋白α11的表达水平，
[0026] 其中整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1指示
[0027] ·所述软骨细胞组合物中软骨细胞的软骨细胞同一性，
[0028] ·所述软骨细胞组合物中软骨细胞的分化状态，
[0029] ·所述软骨细胞组合物的纯度，和/或
[0030] ·所述软骨细胞组合物的软骨细胞的潜能，
[0031] 且从而指示高质量软骨细胞组合物。
[0032] 因此，本公开内容涉及用于质量保证和质量控制软骨细胞组合物的方法。
[0033] 在又一方面中，本公开内容涉及一种用于分离高质量软骨细胞群体的方法，该方法包括以下步骤：
[0034] a)提供包含软骨细胞的候选组合物；
[0035] b)分析所述组合物中整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达；和
[0036] c)富集软骨细胞，该软骨细胞具有的整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1，
[0037] 因此获得分离的高质量软骨细胞群体。
[0038] 在又一方面中，本公开内容涉及一种用于制备高质量软骨细胞群体的方法，该方法包括以下步骤：
[0039] a)提供包含软骨细胞的候选组合物；
[0040] b)分析所述组合物中整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达；和
[0041] c)扩增软骨细胞，该软骨细胞具有的整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1，
[0042] 因此制备高质量软骨细胞群体。
[0043] 在一方面中，本公开内容涉及一种用于优化包含软骨细胞的组合物的软骨细胞潜能的方法，该方法包括诱导整联蛋白α10的表达。
[0044] 在一方面中，本公开内容涉及一种增加软骨细胞的增殖速率的方法，该方法包括诱导整联蛋白α10的表达。
[0045] 在一方面中，本公开内容涉及软骨细胞的体外细胞制剂或细胞培养物，该软骨细胞具有的整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1。
[0046] 在一方面中，本发明涉及本文所述的任一方法用于以下各项的用途：
[0047] a)质量保证软骨细胞组合物；
[0048] b)监测软骨细胞组合物的一致性和/或再现性；
[0049] c)预测软骨细胞组合物和培养物的潜能；
[0051] e)进程内控制软骨细胞组合物的扩增；
[0052] f)进行软骨细胞组合物的潜能测定；
[0053] g)进行软骨细胞组合物的释放测试；和/或
[0054] h)预测软骨细胞组合物和/或软骨细胞组合物的临床结果。
[0056] 图1A.单层培养2-6代的两种人软骨细胞制剂853和854上的α10β1表达的流式细胞术分析。在添加或不添加
抗坏血酸(A)的含有人血清(HS)或血小板裂解物(PL)的培养基中培养软骨细胞。当仅在HS中培养软骨细胞时整联蛋白表达降低。
[0057] 图1B.在含有或不含抗坏血酸(A)的人血清(HS)、血小板裂解物(PL)中培养2-6代的4种人软骨细胞制剂853、854、875和876的流式细胞术分析。第2代细胞仅在HS中培养。结果显示了整联蛋白α10/整联蛋白α11(n＝2-4)的平均值±SEM比率。抗坏血酸(A)的添加在改变α10/α11比率以倾向于α10方面具有明显且即刻的作用。无论使用HS还是PL，此作用都是显而易见的。
[0058] 图2.生长动力学分析显示，在人血清(HS)，含有抗坏血酸的HS(HSA)，血小板裂解物(PL)或含有抗坏血酸的PL(PLA)中培养的853软骨细胞达到在第3-6代汇合的细胞培养时间。抗坏血酸(A)和PL的添加，尤其是A，对软骨
细胞增殖具有突出的作用。
[0059] 图3A.在人血清(HS)、含有抗坏血酸的人血清(HSA)或含有抗坏血酸的血小板裂解物(PLA)中培养的人软骨细胞制剂853、854、875和876上的α10β1的流式细胞术分析。整联蛋白α10β1-(α10)表达显示为4种软骨细胞制剂的平均值±SEM。在图4中的分化实验中使用这些细胞。
[0060] 图3B.在人血清(HS)、含有抗坏血酸的人血清(HSA)或含有抗坏血酸的血小板裂解物(PLA)中培养的人软骨细胞制剂853、854、875和876上的ITGA10的基因表达分析。相对的ITGA10基因表达显示为对于4种细胞系的平均值±SEM。GAPDH用作持家基因用于对照。
[0061] 图4A.通过免疫组织化学分析的软骨细胞沉淀的
组织切片中II型胶原蛋白表达的评估得分系统。II型胶原蛋白表达的程度以0-5数值范围评分。
[0062] 图4B.在HS中扩增并在存在再分化培养基TIDA的情况下在沉淀团
块培养物中生长1-4周的人软骨细胞制剂853、854、875和876的II型胶原蛋白(Col2)表达得分的总结。
[0063] 图4C.在HSA中扩增并在存在再分化培养基TIDA的情况下在沉淀团块培养物中生长1-4周的人软骨细胞制剂853、854、875和876的II型胶原蛋白(Col2)表达得分的总结。
[0064] 图4D.在PLA中扩增并在存在再分化培养基TIDA的情况下在沉淀团块培养物中生长1-4周的人软骨细胞制剂853、854、875和876的II型胶原蛋白(Col2)表达得分的总结。
[0065] 图5.在HS中以单层培养的人软骨细胞制剂853、854、875、876、803、811、816、842和914上整联蛋白α10β1表达(流式细胞术)与在沉淀团块培养物中2周后的II型胶原蛋白表达(免疫组织化学)之间的相关性。皮尔逊相关分析证明了高相关水平，系数(R2)为0.75。如果忽略样品914(其被视为是异常值)，则可实现R2为0.93(数据未显示)。
[0066] 图6A.在PLA中以单层生长，然后在含有再分化培养基TIDA的沉淀培养物中培养2周的软骨细胞制剂875上的II型胶原蛋白、I型胶原蛋白和整联蛋白α10β1的免疫组织化学分析。发现整联蛋白α10β1与II型胶原蛋白共
定位(colocalise)，而I型胶原蛋白主要在低整联蛋白α10β1或不存在整联蛋白α10β1的外部区域中表达。
[0067] 图6B.在PLA中单层培养，然后在含有TIDA的沉淀培养物中培养2周的875软骨细胞上的整联蛋白α11β1(B)、整联蛋白α10β1(C)、II型胶原蛋白(D)的免疫
荧光染色。(A)中显示了细胞核的DAPI染色，(E)中显示了不同染色的合并图片。通过共聚焦
显微镜可视化这些染色。标尺为50μm。发现整联蛋白α10β1与II型胶原蛋白共定位，而整联蛋白α11β1在发现I型胶原蛋白表达的沉淀的外部区域中表达(参见图6A)。
[0068] 图7A.人成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS)、软骨细胞制剂875、HFLS-OA(来自骨关节炎患者的成纤维细胞样细胞)和人鼻软骨细胞(HNC)上的整联蛋白α11β1(X轴)的流式细胞术分析。结果显示整联蛋白α11β1在成纤维细胞样细胞上表达，但不在软骨细胞上表达。Y轴上显示了侧向散射(SSC-A)。
[0069] 图7B.软骨细胞和滑液成纤维细胞样细胞的混合物上的整联蛋白α11β1的流式细胞术分析。向HNC(人鼻软骨细胞)的制剂添加0、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、25％、50％、100％HFLS-OA(来自骨关节炎患者的人成纤维细胞样软骨细胞)。结果显示整联蛋白α11β1甚至能够检测软骨细胞制剂中少量的成纤维细胞样细胞，且整联蛋白α11β1随着添加的成纤维细胞样细胞而增加。
[0070] 图7C.整联蛋白α11β1的表达和向软骨细胞制剂添加HFLS-OA(来自骨关节炎患者人成纤维细胞样软骨细胞)之间的相关性。向HNC(人鼻软骨细胞)的制剂添加0、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、25％、50％、和100％的HFLS-OA。这证明了整联蛋白α11β1能够用于检测并定量软骨细胞制剂中的污染的成纤维细胞样细胞。
[0071] 图8A.分析在沉淀团块培养物之前来自样品803和811的单层培养的人软骨细胞上的整联蛋白α10(α10)和α11(α11)的表达。流式细胞术分析显示样品811中的低整联蛋白α10/整联蛋白α11比率和样品803中的高整联蛋白α10/整联蛋白α11比率。
[0072] 图8B.来自在沉淀团块中培养2到3周的样品803和811的软骨细胞中Col2产生的
组织学评估。分析来自软骨细胞沉淀的组织切片中II型胶原蛋白(Col2)的表达，并以0-5的数值范围对Col2的表达程度评分。结果显示来自软骨细胞811的沉淀中无/很低Col2表达，以及来自软骨细胞803的沉淀中Col2的高表达。
[0073] 图9.人软骨细胞制剂803(高潜能参见图8)和842(低潜能)上的整联蛋白α10(X轴)、整联蛋白α11(Y轴)的流式细胞术分析。分别针对整联蛋白α10和α11的两种组合
抗体的结合用于证明抗体的单染色和双染色的程度。右下方的方块表示整联蛋白α10的高单一表达，左上方的方块表示整联蛋白α11的高单一表达，右上方表示具有整联蛋白α10和α11二者表达的细胞。结果显示相较于803，软骨细胞制剂842具有更多去分化的和非软骨细胞的细胞。
[0074] 详述
[0075] 定义
[0076] 如本文所用的“整联蛋白α10”是指异二聚体
蛋白质整联蛋白α10β1的α10亚基以及指异二聚体蛋白质整联蛋白α10β1。该意义并不排除与α10亚基结合的β1亚基的存在因此形成整联蛋白α10β1异二聚体。人整联蛋白α10链序列是已知的，且以GenBankTM/EBI
数据库登录号AF074015公开获得。
[0077] 如本文所用的“抗整联蛋白α10抗体”是指能够至少识别并结合整联蛋白α10亚基并且还结合异二聚体蛋白质整联蛋白α10β1的抗体。这些抗体可以是识别异二聚体蛋白质整联蛋白α10β1的表位的抗体，其中该表位包含α10和β1亚基二者的
氨基酸残基。这些抗体还可以是识别异二聚体蛋白质整联蛋白α10β1的表位的抗体，其中该表位仅包含α10亚基的氨基酸残基。
[0078] 如本文所用的“整联蛋白α11”是指异二聚体蛋白质整联蛋白α11β1的α11亚基以及异二聚体蛋白质整联蛋白α11β1。该意义并不排除与α11亚基结合的β1亚基的存在因此形成整联蛋白α10β1异二聚体。
[0079] 如本文所用的“抗整联蛋白α11抗体”是指能够至少识别并结合整联蛋白α11亚基并且还结合异二聚体蛋白质整联蛋白α11β1的整联蛋白α11亚基的抗体。这些抗体可以是识别异二聚体蛋白质整联蛋白α11β1的表位的抗体，其中该表位包含α11和β1亚基二者的氨基酸残基。这些抗体还可以是识别异二聚体蛋白质整联蛋白α11β1的表位的抗体，其中该表位仅包含α11亚基的氨基酸残基。
[0080] 术语“整联蛋白α10/11”是指整联蛋白α10或整联蛋白α11任一者，或指整联蛋白α10和整联蛋白α11二者。
[0081] 如本文所用的“抗坏血酸”包括其(R)-3,4-二羟基-5-((S)-1,2-二羟乙基)呋喃-2(5H)-1衍
生物，诸如L-抗坏血酸2-
磷酸盐-倍半镁盐水合物。
[0082] 如本文所用的术语“鉴定”是指识别细胞为某种类型的细胞(例如软骨细胞或成纤维细胞样细胞)的活动。鉴定的可替换术语是“检测”，其在本文中以相同的含义使用。
[0083] 如本文所用的术语“分离”、“分选”“选择”和“耗竭”是指鉴定细胞为某种类型的细胞并将其从不属于相同细胞类型或不属于一种分化状态的细胞中分离的活动。
[0084] 如本文所用的术语“组合物”可指细胞的制剂，诸如软骨细胞的制剂。如本文所用的术语“组合物”还可指细胞的培养物，诸如软骨细胞的培养物。软骨细胞的组合物还可以是软骨细胞产品。软骨细胞产品的实例是本领域技术人员已知的，且可以是在悬液中的分离的软骨细胞，单层培养的软骨细胞和三维(3D)培养物诸如球体、沉淀、细胞
片层和在
支架中培养的软骨细胞。例如可以使用3D水凝胶、胶原蛋白基质、乙酰透明质酸、聚
乙醇酸(PGA)-纤维蛋白和聚乳酸(PLA)来制造软骨
细胞支架。
[0085] 如本文所用的术语“潜能”或“细胞潜能”可以被定义为相关生物学功能的定量测量。潜能测定提供了一种机制，通过该机制可以仔细检查
制造过程和用于批量生产的最终细胞产品的质量、一致性和
稳定性。
[0086] 整联蛋白亚基α10和α11的表达的分析
[0087] 本发明的方法中的关键步骤是检测整联蛋白α10表达和整联蛋白α11表达。
[0088] 在一个实施方案中，通过选自以下的方法来进行表达的分析：流式细胞术、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀、斑点印迹、qPCR、
免疫测定、免疫荧光、免疫组织化学、基因表达分析和任何其它合适的方法。优选地，整联蛋白α10和/或α11的表达的分析是使用特异性抗体通过流式细胞术进行的。流式细胞术可以采用多色分析，这特别方便。对于每种单独的情况，本领域技术人员具有足够的资格来确定用于测定表达程度的选择方法。
[0089] 可以使用相同种类的方法来分析整联蛋白α10和/或整联蛋白α11的表达。在一个实施方案中，通过测量相应的蛋白质表达来分析整联蛋白α10/11表达。
[0090] 在另一实施方案中，通过测量整联蛋白α10/11mRNA表达来分析整联蛋白α10/11的表达。特定蛋白质的mRNA表达的检测是本领域技术人员公知的，且通常在探针不与其它mRNA分子杂交的杂交条件下，通过用对感兴趣的mRNA特异的DNA或RNA探针探测mRNA来完成的。还可使用不同
聚合酶链反应(PCR)，其对于本领域技术人员是显而易见的。
[0091] 在一个实施方案中，该分析包括定量确定整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达。
[0092] 本领域技术人员已知若干种用于检测细胞标志物的表达的方法。因此，在本公开内容的一个实施方案中，检测细胞的整联蛋白α10/11的表达是通过选自以下的方法确定的：免疫测定、流式细胞术、免疫荧光、免疫沉淀、免疫组织化学和蛋白质印迹。在又一另外的实施方案中，整联蛋白α10/11的表达是通过任一免疫测定法检测的，诸如Immunochemical protocols(Methods in molecular biology,Humana出版公司)中描述的方法。可通过多种方法，例如本领域技术人员已知的任何免疫方法，诸如免疫沉淀作用、蛋白质印迹、磁激活的细胞分选术(MACS)或流式细胞术方法，例如荧光激活的细胞分选术(FACS)进行检测。
[0093] 在一些实施方案中，所述整联蛋白α10/11蛋白质表达是通过抗整联蛋白α10/11抗体检测的，其中所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或其
片段。在另一实施方案中，所述抗体是非人抗体、
嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体或人抗体。
[0094] 所述抗体可与可检测的部分(诸如选自选自荧光团、酶或
放射性示踪物或放射性同位素的可检测的部分)共价结合。在优选的实施方案中，所述抗体是用一种或多种荧光团标记的。所述荧光团可选自藻红蛋白、别藻蓝蛋白、荧光素、德克萨斯红(Texas red)、Alexa Fluor 647和明亮染料(brilliant dye)。可使用许多其它荧光团，且技术人员将会根据具体的检测方法且还根据所用的抗体的特性选择最合适的荧光团。在一些实施方案中，具有非重叠的发射谱的荧光团与抗整联蛋白α10抗体和抗整联蛋白α11抗体结合。
[0095] 在一个实施方案中，所述抗体附接至固体支持物，例如附接至
磁珠。
[0096] 在一个实施方案中，所述抗体附接至生物素。
[0097] 此外，所述抗体可具有选自IgA、IgD、IgG和IgM的同种型。
[0098] 在一个实施方案中，所述抗体为：
[0099] a)单克隆抗体，其是由以登录号DSM ACC2583保藏在德国
微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH)的杂交瘤细胞系产生的；或
[0100] b)抗体，其竞争结合与由以登录号DSM ACC2583保藏在德国微生物菌种保藏中心的杂交瘤产生的单克隆抗体结合的表位相同的表位；或
[0101] c)a)或b)的片段，其中所述片段能够特异性结合整联蛋白α10的细胞外I-域。
[0102] 同样地，可通过特异性结合整联蛋白α10/11分子的任何特定分子(诸如蛋白质或肽)进行鉴定。此类蛋白质或肽的实例是结合整联蛋白α10/11分子的天然配体。可重组地、化学合成地，或从天然来源中纯化来制造此类天然配体。
[0103] 软骨细胞组合物
[0104] 发明人已经发现，特征在于整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1的软骨细胞组合物是高质量软骨细胞组合物。
[0105] 因此，本公开内容的一个方面涉及包含软骨细胞的组合物，其中所述组合物的整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1。
[0106] 在一个实施方案中，整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1，诸如至少5比1，诸如至少10比1，诸如至少15比1，诸如至少20比1，诸如至少25比1，诸如至少30比1，诸如至少35比1，诸如至少40比1，诸如至少45比1，诸如至少50比1，诸如至少60比1，诸如至少70比1，诸如至少80比1，诸如至少90比1，诸如至少100比1，诸如至少150比1，诸如至少200比
1。在另一实施方案中，所述整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率低于200比1，诸如低于150比1，诸如低于100比1，诸如低于50比1，诸如低于25比1。
[0107] 在一个实施方案中，整联蛋白α11表达最多为整联蛋白α10表达的25％，诸如最多为整联蛋白α10表达的20％，诸如最多为整联蛋白α10表达的15％，诸如最多为整联蛋白α10表达的10％，诸如最多为整联蛋白α10表达的5％，诸如最多为整联蛋白α10表达的4％，诸如最多为整联蛋白α10表达的3％，诸如最多为整联蛋白α10表达的2％，诸如最多为整联蛋白α10表达的1％，诸如最多为整联蛋白α10表达的0.5％。
[0108] 在另一个实施方案中，基本上不表达整联蛋白α11。
[0109] 在一个实施方案中，所述组合物可包含分化的软骨细胞，且所述分化的软骨细胞可表达整联蛋白α10且基本上不表达整联蛋白α11。
[0110] 如本文所用的“基本上无整联蛋白α11表达”意指表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10的细胞(即单一α11细胞)的百分比低于20％。在一些实施方案中，表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10的细胞的百分比低于15％，诸如低于10％，诸如低于5％，诸如低于4％，诸如低于3％，诸如低于2％，诸如低于1％，诸如低于0.5％。
[0111] 在一个实施方案中，所述组合物可包含部分去分化的软骨细胞，且所述部分去分化的软骨细胞可表达整联蛋白α10和整联蛋白α11二者。部分去分化的软骨细胞是已经恢复为更像成纤维细胞的细胞的软骨细胞。根据培养条件，它们可以能够再分
化成软骨细胞。
[0112] 在一个实施方案中，所述包含软骨细胞的组合物选自下组：软骨组织制剂、包含软骨细胞的组织制剂、单层软骨细胞细胞培养物和三维(3D)软骨细胞细胞培养物，诸如球体、沉淀或细胞片层。
[0113] 在一个实施方案中，所述包含软骨细胞的组合物衍生自软骨组织、包含软骨细胞的组合、单层软骨细胞细胞培养物和三维软骨细胞细胞培养物，诸如球体、沉淀、细胞片层，或来自在支架中培养的软骨细胞。
[0114] 在一个实施方案中，包含软骨细胞的组合物可包含
哺乳动物细胞。
[0115] 在一个实施方案中，包含软骨细胞的组合物可包含人细胞。
[0116] 在一个实施方案中，包含软骨细胞的组合物可包含
马细胞。
[0117] 在一个实施方案中，包含软骨细胞的组合物可包含犬细胞。
[0118] 在一个实施方案中，整联蛋白α10和/或整联蛋白α11在哺乳动物软骨细胞或成纤维细胞样细胞的细胞表面上表达。
[0119] 在一个实施方案中，整联蛋白α10和/或整联蛋白α11表达为与整联蛋白β1组合的异源二聚体。
[0120] 在一个实施方案中，包含软骨细胞的组合物可基本上无污染的细胞，其中该污染的细胞可表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10，即它们可以是单一α11细胞。表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10的细胞可以是污染的细胞、成纤维细胞样细胞或高度去分化的细胞。表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10的细胞可能是非功能性软骨细胞，且因此它们可能是软骨细胞组合物的次要组成。
[0121] 表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10的细胞的数目越低，组合物中软骨细胞的数目越高，因此软骨细胞组合物的纯度程度越高。
[0122] 优化去分化的软骨细胞的培养条件，以诱导整联蛋白α10的表达，从而使软骨细胞再分化，是有可能的。因此，当表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10的细胞的百分比低于20％时，包含软骨细胞的组合物可被定义为基本上无污染的细胞。在一些实施方案中，表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10的细胞的百分比可低于15％，诸如低于10％，诸如低于
5％，诸如低于4％，诸如低于3％，诸如低于2％，诸如低于1％，诸如低于0.5％。
[0123] 在一个实施方案中，包含软骨细胞的组合物可包含占细胞的全量组成或细胞群体的至少70％的软骨细胞，诸如至少75％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少98％，诸如至少99％，诸如100％的软骨细胞。
[0124] 在一个实施方案中，包含软骨细胞的组合物可包含占细胞的全量组成或细胞群体的至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少98％，诸如至少99％，诸如100％的软骨细胞。
[0125] 在一个实施方案中，包含软骨细胞的组合物可进一步表达选自下组的第二标志物：CEP-68/CRTAC1、GP-39软骨糖蛋白、CD44、CD166、IIA型胶原蛋白、IIB型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖、Alizarian Red(neg)、阿尔新蓝、CRTAC1、CEP-68、CD146、CD90、CD49e、CD63和Sca-1。
[0126] 本文公开的软骨细胞组合物可配制成细胞悬浮液、细胞培养物、细胞单层或三维(3D)支架，诸如球体、沉淀、细胞片层和在支架中培养的软骨细胞。3D支架的实例是本领域已知的，且可基于例如3D水凝胶、胶原蛋白基质、乙酰透明质酸、聚乙醇酸(PGA)纤维蛋白和聚乳酸(PLA)的使用。
[0127] 然后，本文公开的软骨细胞组合物可用于若干个应用，例如在软
骨再生和软
骨修复领域中。本文公开的软骨细胞组合物可适合于自体和同种异体使用。
[0128] 用于确定纯度质量、软骨细胞的同一性程度、功能潜能、分化状态和/或软骨细胞的表型的方法
[0129] 在一方面，本公开内容涉及一种用于测定包含软骨细胞的组合物的质量的方法，其中质量测定包含以下标准中的一个或多个：
[0130] ·软骨细胞的同一性，
[0131] ·软骨细胞的分化状态，
[0132] ·软骨细胞的纯度，和
[0133] ·软骨细胞的潜能，
[0134] 该方法包含以下步骤：
[0135] a)提供包含软骨细胞的候选组合物；
[0136] b)分析所述组合物中整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达水平；
[0137] c)比较整联蛋白α10的表达水平与整联蛋白α11的表达水平，
[0138] 其中整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1指示
[0139] ·软骨细胞组合物中的软骨细胞的软骨细胞同一性，
[0140] ·软骨细胞组合物中的软骨细胞的分化状态，
[0141] ·软骨细胞组合物的纯度，和/或
[0142] ·软骨细胞组合物的软骨细胞的潜能，
[0143] 从而指示高质量软骨细胞组合物。
[0144] 在一个实施方案中，所述方法可包括比较整联蛋白α10的表达水平与整联蛋白α11的表达水平，其中软骨细胞组合物中至多20％，诸如至多15％，诸如至多10％，诸如至多5％，诸如至多4％，诸如至多3％，诸如至多2％，诸如至多1％，诸如至多0.5％的细胞表达α
11且不表达或基本上不表达整联蛋白α10(即单一α11细胞)，指示软骨细胞组合物的纯度。
[0145] 事实上，表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10的细胞(单一α11细胞)的数目越低，组合物中软骨细胞的数目越高，因此软骨细胞组合物的纯度程度越高。
[0146] 在一个实施方案中，所述方法可包括比较整联蛋白α10的表达水平与整联蛋白α11的表达水平，其中整联蛋白α10连同整联蛋白α11的表达指示部分去分化的软骨细胞组合物。例如，表达整联蛋白α10和整联蛋白α11二者的软骨细胞可以是部分去分化的软骨细胞。
[0147] 在一个实施方案中，所述方法可包括比较整联蛋白α10的表达水平与整联蛋白α11的表达水平，其中整联蛋白α10的表达和整联蛋白α11的基本上无表达可指示分化的软骨细胞组合物。例如，表达整联蛋白α10但基本上不表达整联蛋白α11的软骨细胞可以是分化的软骨细胞。
[0148] 在一个实施方案中，所述方法可包括定量测定整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达。
[0149] 在一个实施方案中，所述方法可包括比较整联蛋白α10的表达水平与整联蛋白α11的表达水平，其中整联蛋白α10的表达和整联蛋白α11的基本上无表达可指示分化的软骨细胞组合物。“整联蛋白α11的基本上无表达”可指少于20％的包含在组合物中的表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10的细胞。在一些实施方案中，表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10的细胞的百分比低于15％，诸如低于10％，诸如低于5％，诸如低于4％，诸如低于3％，诸如低于2％，诸如低于1％，诸如低于0.5％。
[0150] 发明人还已经发现软骨细胞中整联蛋白α11的表达和整联蛋白α10的基本上无表达可指示成纤维细胞样细胞。
[0151] 在一个实施方案中，所述方法进一步包括检测第二软骨细胞或成纤维细胞标志物的表达，所述标志物选自CEP-68/CRTAC1、GP-39软骨糖蛋白、CD44、CD166、IIA型胶原蛋白、IIB型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖、Alizarian Red(neg)、阿尔新蓝、CRTAC1、CEP-68、CD146、CD90、CD49e、CD63和Sca-1。对于每种情况，本领域技术人员都有足够的资格确定用于检测所述标志物的表达的选择方法。
[0152] 在一个实施方案中，该方法是在体外进行的。
[0153] 在一个实施方案中，整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达的分析是在为诱导整联蛋白α10表达而优化的培养基中培养细胞后进行的。在本公开内容中在本文中描述了整联蛋白α10表达的诱导。
[0154] 在一个实施方案中，整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达的分析是同时进行的。在另一实施方案中，整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达的分析是分开进行的。参见例如在
实施例4和图7和9中报告的数据。
[0155] 用于分离高质量软骨细胞群体的方法
[0156] 在一方面中，本发明涉及一种用于分离高质量软骨细胞群体的方法，该方法包括以下步骤：
[0157] a)提供包含软骨细胞的候选组合物；
[0158] b)分析所述组合物中整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达；和
[0159] c)选择软骨细胞，该软骨细胞具有的整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1，
[0160] 因此获得高质量软骨细胞群体。
[0161] 在一个实施方案中，高质量软骨细胞群体可以是特征在于整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1的软骨细胞群体。
[0162] 在一个实施方案中，所述方法可包括定量测定整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达。
[0163] 在一个实施方案中，整联蛋白α10和/或整联蛋白α11可在哺乳动物软骨细胞和/或成纤维细胞样细胞的细胞表面上表达。
[0164] 在一个实施方案中，所述获得的分离的高质量软骨细胞群体可以是富集的和/或纯化的软骨细胞群体。优选地，所述获得的分离的软骨细胞群体可以是富集的和/或纯化的，因为所述群体中的软骨细胞具有高整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率。在一个实施方案中，在获得的分离的软骨细胞群体中的整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1，诸如至少5比1，诸如至少10比1，诸如至少15比1，诸如至少20比1，诸如至少25比1，诸如至少30比1，诸如至少35比1，诸如至少40比1，诸如至少45比1，诸如至少50比1，诸如至少60比1，诸如至少70比1，诸如至少80比1，诸如至少90比1，诸如至少100比1，诸如至少150比1，诸如至少200比1。
[0165] 在一个实施方案中，整联蛋白α11表达最多为整联蛋白α10表达的25％，诸如最多为整联蛋白α10表达的20％，诸如最多为整联蛋白α10表达的15％，诸如最多为整联蛋白α10表达的10％，诸如最多为整联蛋白α10表达的5％，诸如最多为整联蛋白α10表达的4％，诸如最多为整联蛋白α10表达的3％，诸如最多为整联蛋白α10表达的2％，诸如最多为整联蛋白α10表达的1％，诸如最多为整联蛋白α10表达的0.5％。
[0166] 在又一实施方案中，在获得的分离的软骨细胞群体中基本上不表达整联蛋白α11。
[0167] 在一个实施方案中，获得的组合物可包含占总细胞群体的至少70％的软骨细胞，诸如至少75％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少98％，诸如至少99％，诸如100％的软骨细胞。
[0168] 在又一实施方案中，获得的组合物可包含占总细胞群体的至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少98％，诸如至少99％，诸如100％的软骨细胞。
[0169] 在另一实施方案中，获得的群体可基本上不含污染的细胞。在本文中，污染的细胞可以是除软骨细胞之外的细胞，诸如成纤维细胞或成纤维细胞样细胞。在一个实施方案中，污染的细胞可能是表达整联蛋白α11但不表达整联蛋白α10的细胞。
[0170] 获得的组合物可包含高度去分化的软骨细胞和成纤维细胞样细胞，当这些细胞在最优条件下培养时，可再分化为软骨细胞。
[0171] 已在此公开内容中在本文中定义了“基本上不表达整联蛋白α11”和“基本上无污染的细胞”。
[0172] 在一个实施方案中，所述高质量软骨细胞群体可以是整联蛋白α10富集的软骨细胞群体。可通过包括耗竭表达整联蛋白α11的细胞的方法获得所述整联蛋白α10富集的群体。在一个实施方案中，高质量软骨细胞群体可基本上不表达整联蛋白α11。
[0173] 可通过包括选择表达整联蛋白α10的细胞的方法获得所述整联蛋白α10富集的群体。可以如本文所述的，例如通过使用抗整联蛋白α10抗体，或通过本领域技术人员已知的其它方法，来选择表达整联蛋白α10的细胞。
[0174] 可通过包括在诱导整联蛋白α10表达的条件下培养软骨细胞的组合物的方法获得所述整联蛋白α10富集的群体。在本公开内容中存在此类整联蛋白α10诱导条件的实例。可诱导整联蛋白α10表达的
试剂包括抗坏血酸和血小板裂解物。
[0175] 在一个实施方案中，所述选择具有的整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1的软骨细胞可通过分离表达整联蛋白α10的软骨细胞来进行。在另一实施方案中，所述选择是通过耗竭表达α11的软骨细胞完成的。
[0176] 高质量软骨细胞群体的分离可基于使表达整联蛋白α10的软骨细胞与基本上不表达整联蛋白α10的软骨细胞和/或与表达整联蛋白α11但不表达或基本上不表达整联蛋白α10的细胞分离的方案。所述分离可包括使
用例如抗体包被的磁珠和具有附接至固体基质的抗体的“平底盘(panning)”(例如，平板)的磁分离，或其它便捷技术。提供精确分离的技术包括荧光激活的细胞分选仪，其可以具有不同的复杂程度，例如，本领域技术人员已知的多个
颜色通道、光散射检测通道、阻抗通道等。
[0177] 如果抗体或其片段用于检测标志物，则它可附接至固体支持物，例如磁珠，以允许高特异性分离。所采用的特定分离程序，例如离心、机械分离(诸如柱、膜或磁力分离)应使待收集级分的活力最大化。可以采用本领域技术人员已知的具有功效不同的多个技术。所采用的具体技术将取决于分离效率、方法学的细胞毒性、操作的简便性和速度，以及复杂设备和/或技术技能的必要性。
[0178] 在一个实施方案中，高质量软骨细胞群体是从选自下组的候选组合物中分离的：软骨组织制剂、包含软骨细胞的组织制剂、单层软骨细胞细胞培养物和三维软骨细胞细胞培养物，诸如球体、沉淀、细胞片层和在多种支架中培养的软骨细胞。
[0179] 在一个实施方案中，高质量软骨细胞群体是从衍生自以下的候选组合物中分离的：软骨组织、包含软骨细胞的组织、单层软骨细胞细胞培养物和三维软骨细胞细胞培养物，诸如球体、沉淀、细胞片层和在多种支架中培养的软骨细胞。
[0180] 在一个实施方案中，本文所述的方法可进一步包括检测选自下组的第二标志物的表达：CEP-68/CRTAC1、GP-39软骨糖蛋白、CD44、CD166、IIA型胶原蛋白、IIB型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖、Alizarian Red(neg)、阿尔新蓝、CRTAC1、CEP-68、CD49e、CD63、CD146、CD90和Sca-1。
[0181] 诱导软骨细胞中的整联蛋白α10的表达
[0182] 本发明人已经证明了，在诱导整联蛋白α10表达后对增殖和潜能的作用。
[0183] 因此，在一方面，本发明涉及一种用于优化包含软骨细胞的组合物的质量和软骨细胞潜能的方法，该方法包括诱导整联蛋白α10的表达。在一个实施方案中，所述方法进一步包括抑制整联蛋白α11的表达。
[0184] 在另一方面中，本发明涉及一种增加软骨细胞增殖速率的方法，该方法包括诱导整联蛋白α10的表达。在一个实施方案中，所述方法进一步包括抑制整联蛋白α11的表达。
[0185] 在一个实施方案中，通过在包含可诱导整联蛋白α10表达和/或抑制整联蛋白α11的因子的培养基中培养表达整联蛋白α10的细胞而进行整联蛋白α10表达的诱导。
[0186] 在一个实施方案中，可通过在包含抗坏血酸和/或血小板裂解物的培养基中培养表达整联蛋白α10的细胞而进行整联蛋白α10的表达的诱导。
[0187] 在一个实施方案中，因此获得的整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1，诸如至少5比1，诸如至少10比1，诸如至少15比1，诸如至少20比1，诸如至少25比1，诸如至少30比1，诸如至少35比1，诸如至少40比1，诸如至少45比1，诸如至少50比1，诸如至少60比
1，诸如至少70比1，诸如至少80比1，诸如至少90比1，诸如至少100比1，诸如至少150比1，诸如至少200比1。
[0188] 在一个实施方案中，获得的整联蛋白α11表达最多为获得的整联蛋白α10表达的25％，诸如最多为获得的整联蛋白α10表达的20％，诸如最多为获得的整联蛋白α10表达的
15％，诸如最多为获得的整联蛋白α10表达的10％，诸如最多为获得的整联蛋白α10表达的
5％，诸如最多为获得的整联蛋白α10表达的4％，诸如最多为获得的整联蛋白α10表达的
3％，诸如最多为获得的整联蛋白α10表达的2％，诸如最多为获得的整联蛋白α10表达的
1％，诸如最多为获得的整联蛋白α10表达的0.5％。
[0189] 已知表达整联蛋白α10的细胞可根据它们所暴露的培养条件以不同的水平表达整联蛋白α10。因此，诱导软骨细胞中整联蛋白α10表达的一种方式可以是改变培养条件的方式，例如通过改变培养基。
[0190] 细胞制剂和细胞培养物
[0191] 在一方面中，本发明涉及软骨细胞的体外细胞制剂或细胞培养物，该软骨细胞具有的整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1。在一个实施方案中，所述整联蛋白α10与整联蛋白α1表达比率可以是至少4，诸如至少10，诸如至少15，诸如至少20，诸如至少
25，诸如至少30，诸如至少35，诸如至少40，诸如至少45，诸如至少50，诸如至少60，诸如至少
70，诸如至少80，诸如至少90，诸如至少100。在另一实施方案中，所述整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率可低于200，诸如低于150，诸如低于100。
[0192] 在一方面中，本发明涉及软骨细胞的体外细胞制剂或细胞培养物，其中整联蛋白α11表达最多为整联蛋白α10表达的25％，诸如最多为整联蛋白α10表达的20％，诸如最多为整联蛋白α10表达的15％，诸如最多为整联蛋白α10表达的10％，诸如最多为整联蛋白α10表达的5％，诸如最多为整联蛋白α10表达的4％，诸如最多为整联蛋白α10表达的3％，诸如最多为整联蛋白α10表达的2％，诸如最多为整联蛋白α10表达的1％，诸如最多为整联蛋白α10表达的0.5％。
[0193] 在一个实施方案中，本发明涉及整联蛋白α10富集的软骨细胞群体，其是使用抗整联蛋白α10抗体和抗整联蛋白α11抗体从细胞制剂/培养物中分离的。
[0194] 在一个实施方案中，可通过选择高表达整联蛋白α10的软骨细胞或诱导整联蛋白α10表达而获得所述富集的软骨细胞群体。在另一实施方案中，可通过耗竭高度去分化的表达整联蛋白α11的软骨细胞或成纤维细胞或抑制整联蛋白α11表达而获得所述富集的软骨细胞群体。
[0195] 在一个实施方案中，富集的群体具有的整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率可以为至少4比1，诸如至少5比1，诸如至少10比1，诸如至少15比1，诸如至少20比1，诸如至少25比1，诸如至少30比1，诸如至少35比1，诸如至少40比1，诸如至少45比1，诸如至少50比1，诸如至少60比1，诸如至少70比1，诸如至少80比1，诸如至少90比1，诸如至少100比1，诸如至少150比1，诸如至少200比1。
[0196] 在一个实施方案中，富集的群体具有的整联蛋白α11表达可以是最多为整联蛋白α10表达的25％，诸如最多为整联蛋白α10表达的20％，诸如最多为整联蛋白α10表达的15％，诸如最多为整联蛋白α10表达的10％，诸如最多为整联蛋白α10表达的5％，诸如最多为整联蛋白α10表达的4％，诸如最多为整联蛋白α10表达的3％，诸如最多为整联蛋白α10表达的
2％，诸如最多为整联蛋白α10表达的1％，诸如最多为整联蛋白α10表达的0.5％。
[0197] 所述方法的用途
[0198] 在一方面，本发明涉及本文所述的方法中的任一个的用于以下的用途：
[0199] a)质量保证软骨细胞组合物；
[0200] b)监测软骨细胞组合物的一致性和/或再现性；
[0201] c)预测软骨细胞组合物和培养物的潜能，从而预测其功能；
[0202] d)进程内控制软骨细胞组合物；
[0203] e)进程内控制软骨细胞组合物的扩增；
[0204] f)进行软骨细胞组合物的释放测试；
[0205] g)进行软骨细胞组合物的潜能测定；和/或
[0206] h)预测软骨细胞组合物的临床结果。
[0207] 因此，在一个实施方案中，包括以下步骤的用于测定质量包含软骨细胞的组合物的方法可用于质量保证软骨细胞组合物：
[0208] a)提供包含软骨细胞的候选组合物；
[0209] b)分析所述组合物中整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达水平；
[0210] c)比较整联蛋白α10的表达水平与整联蛋白α11的表达水平，
[0211] 其中整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1指示
[0212] ·软骨细胞组合物中软骨细胞的软骨细胞的同一性，
[0213] ·软骨细胞组合物中软骨细胞的分化状态，
[0214] ·软骨细胞组合物的纯度，和/或
[0215] ·软骨细胞组合物的软骨细胞的潜能。
[0216] 因此，在一个实施方案中，本公开内容涉及一种用于确定包含软骨细胞的组合物的质量的方法用于质量保证和/或质量控制软骨细胞组合物的用途，所述方法包括以下步骤：
[0217] a)提供包含软骨细胞的候选组合物；
[0218] b)分析所述组合物中整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达水平；
[0219] c)比较整联蛋白α10的表达水平与整联蛋白α11的表达水平，
[0220] 其中整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1指示
[0221] ·软骨细胞组合物中软骨细胞的软骨细胞同一性，
[0222] ·软骨细胞组合物中软骨细胞的分化状态，
[0223] ·软骨细胞组合物的纯度，和/或
[0224] ·软骨细胞组合物的软骨细胞的潜能。
[0225] 在一个实施方案中，本公开内容涉及一种用于确定包含软骨细胞的组合物的质量的方法用于进程内控制软骨细胞组合物和/或软骨细胞组合物的扩增的用途，所述方法包括以下步骤：
[0226] a)提供包含软骨细胞的候选组合物；
[0227] b)分析所述组合物中整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达水平；
[0228] c)比较整联蛋白α10的表达水平与整联蛋白α11的表达水平，
[0229] 其中整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1指示
[0230] ·软骨细胞组合物中软骨细胞的软骨细胞的同一性，
[0231] ·软骨细胞组合物中软骨细胞的分化状态，
[0232] ·软骨细胞组合物的纯度，和/或
[0233] ·软骨细胞组合物的软骨细胞的潜能。
[0234] 在一个实施方案中，本公开内容涉及一种用于确定包含软骨细胞的组合物的质量的方法用于进行软骨细胞组合物的释放测试的用途，所述方法包括以下步骤：
[0235] a)提供包含软骨细胞的候选组合物；
[0236] b)分析所述组合物中整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达水平；
[0237] c)比较整联蛋白α10的表达水平与整联蛋白α11的表达水平，
[0238] 其中整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比指示
[0239] ·软骨细胞组合物中软骨细胞的软骨细胞的同一性，
[0240] ·软骨细胞组合物中软骨细胞的分化状态，
[0241] ·软骨细胞组合物的纯度，和/或
[0242] ·软骨细胞组合物的软骨细胞的潜能。
[0243] 在一个实施方案中，本公开内容涉及一种用于确定包含软骨细胞的组合物的质量的方法用于进行软骨细胞组合物的潜能测定的用途，所述方法包括以下步骤：
[0244] a)提供包含软骨细胞的候选组合物；
[0245] b)分析所述组合物中整联蛋白α10和整联蛋白α11的表达水平；
[0246] c)比较整联蛋白α10的表达水平与整联蛋白α11的表达水平，
[0247] 其中整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率为至少4比1指示
[0248] ·软骨细胞组合物中软骨细胞的软骨细胞的同一性，
[0249] ·软骨细胞组合物中软骨细胞的分化状态，
[0250] ·软骨细胞组合物的纯度，和/或
[0251] ·软骨细胞组合物的软骨细胞的潜能。实施例
[0252] 实施例1：在添加或不添加抗坏血酸的人血清(HS)或血小板裂解物(PL)中培养的软骨细胞上的整联蛋白α10β1和整联蛋白α11β1的表达
[0253] 在含有或不含抗坏血酸(50μg/ml)的DMEM中10％HS或DMEM中5％PL的存在下培养来自4种不同制剂853、854、875和876的软骨细胞。在第2、3、4和6代后，使用以下单克隆抗体通过流式细胞术分析整联蛋白α10β1和α11β1表达：与藻红蛋白(PE)直接缀合的α10抗体和与Alexa Fluor A647(Xintela AB)直接缀合的α11抗体，所述抗体在FACS缓冲液(PBS，1％FBS，0.1％NaN3)中稀释，并被添加(1μg/mL)。
[0254] 结论：分析证明了，整联蛋白α10β1的表面表达随着在仅HS的存在下培养的软骨细胞传代而降低。当软骨细胞在PL的存在下培养时，整联蛋白α10的表面表达增加，并在所有6次传代中保持高水平。图1A显示来自软骨细胞制剂853和854的结果。向培养基中添加抗坏血酸维持并且甚至出乎意料地增加了HS培养物中整联蛋白α10β1的表达，尤其是在以后的传代中，但并没有改变整联蛋白α10β1已经在PL中培养的软骨细胞上的高表达(图1A)。流式细胞术分析出乎意料地显示，向培养基中添加抗坏血酸降低整联蛋白α11β1的表达，这从而增加了整联蛋白α10β1/整联蛋白α11β1比率。如图所示(图1B)，在抗坏血酸存在下的HS和PL培养物中均观察到了此作用，在图1B中总结了来自软骨细胞制剂853、854、875和875的结果。
[0255] 实施例2：生长动力学和不同培养条件的评估
[0256] 研究了软骨细胞比生长速率与不同培养基之间的关系。为此目的，来自制剂853的软骨细胞在仅含有HS的培养基中培养直至第2代。在第2代后，在缺少或存在抗坏血酸情况下在HS或PL中培养细胞。当细胞达到80％汇合时，
收获、计数细胞并以相同的
密度重新接种细胞。
[0257] 结论：抗坏血酸和PL增加软骨细胞的增殖速率。在抗坏血酸的存在下，相较于缺乏抗坏血酸的培养基，细胞在每个传代中的增殖更快(图2)。这在在含有HS和PL的培养基中具可见。较后的传代(5-6代)中的该作用比在较早的传代中更为突出。在不存在抗坏血酸的情况下，软骨细胞需要更长的时间以达到汇合。相较于HS，PL也增加增殖。
[0258] 实施例3.单层扩增过程中不同培养条件对软骨细胞的质量和潜能的影响。
[0259] 为了研究已知在软骨细胞的扩增过程中改变整联蛋白α10β1和α11β1的表达的培养条件是否会影响软骨细胞质量和潜能(再分化能力)，进行了以下实验。
[0260] 来自制剂853、854、875和876的软骨细胞在HS、HSA或PLA中培养4代，然后转移至沉淀团块培养物中。此外，在刚开始沉淀团块培养之前，通过流式细胞术和Q-PCR分析不同软骨细胞培养物的样品的整联蛋白α10β1表达。
[0261] 早期软骨形成分化的物质性质的分析
[0262] Q-PCR
[0263] 使用RNeasy Mini
试剂盒(Qiagen，Germany)分离软骨细胞mRNA，并从高质量总RNA样品合成cDNA、标准化，并在两次连续的qPCR分析中用GAPDH验证。使用基因特异性引物和TaqMan探针(来自Life Technology的基因表达测定HS00174623_m1和Hs02758991_g1)进行整联蛋白α10的实时PCR检测，并按照制造商的建议运行。检测系统是StepOne Plus(Biosystems供应的)。将整联蛋白α10表达针对对照GAPDH进行标准化，并计算整联蛋白α10的相对定量值(RQ)。
[0264] 沉淀团块培养
[0265] 在含有或不含L-抗坏血酸2-磷酸盐-倍半镁盐水合物(A)和抗生素-抗霉菌剂的具有3mM谷氨酰胺、HS(10％)或PL(5％)的培养基(来自Biochrom的α-最低限度必需培养基(α-MEM)和Ham氏F12，1:1比例)中以单层培养软骨细胞。在第4代后，离心分离细胞，并在TIDA培养基(具有高
葡萄糖(4.5g/L无酚红)、抗生素-抗霉菌剂(1x)、TGFβ1(13ng/ml)、胰岛素/转
铁蛋白/硒(ITS-X；1x)、地塞米松(10nM)、A(50μg/ml)和HS(2％)的DMEM F12)中重悬。将含有200000个细胞的样品转移至14ml falcon管中，并将细胞悬浮液离心以形成沉淀。随后，在含
氧量低的条件(4％O2、5％CO2和95％湿度)下培养细胞沉淀1-4周，然后通过免疫组织化学(IHC)进行分析。
[0266] 免疫组织化学
[0267] 软骨细胞沉淀被嵌入TissueTek并冷冻。将切片收集在
载玻片上，并用第一单克隆抗体(抗I型胶原蛋白、抗II型胶原蛋白或抗α10整联蛋白)进行免疫标记，然后用第二抗体抗小鼠-HRP(
聚合物，DAKO)免疫标记。
[0268] 结论(I)：
[0269] 单层培养后的结果证实了来自实施例2的发现，所述结果显示相较于仅HS，PL和抗坏血酸诱导整联蛋白α10的表达，并且在单层培养期间明显增加整联蛋白α10β1在软骨细胞上的表达。流式细胞术数据(图3A)表明，当使用含有抗坏血酸的PL和HS时，α10β1表达增加(图3A)。以整联蛋白α10基因转录物ITGA10为代表，在基因表达水平上也看到了类似的结果(图3B)。
[0270] 为了评估沉淀团块培养物中软骨细胞的质量和潜能，建立了基于免疫组织化学分析软骨特异性II型胶原蛋白表达的评分系统。代表增加II型胶原蛋白表达的分数的标称范围为0-5(图4A)。
[0271] 对于多种培养物条件HS、HSA和PLA的II型胶原蛋白得分总结在图4中。这些结果显示，当细胞在HS中培养时，不同软骨细胞制剂之间的II型胶原蛋白表达(再分化/潜能)的较大差异(图4B)。软骨细胞制剂853始终显示II型胶原蛋白的低表达，而876在一周后显示已经表达了一些II型胶原蛋白，在三周后显示高表达。
[0272] 在HSA(含有抗坏血酸的HS)中培养的软骨细胞证明了关于II型胶原蛋白表达的非一致行为。来自制剂875和876的软骨细胞在4周后显示高II型胶原蛋白表达，而853和854在4周测定期间并未达到高得分(图4C)。在另一方面，当细胞在PLA中培养时，所有软骨细胞制剂均遵循一致模式的II型胶原蛋白表达。II型胶原蛋白的表达迅速增加，并且所有四种软骨细胞制剂均已在3周后达到最高得分(图4D)。
[0273] 为了研究在HS中单层扩增后的软骨细胞上整联蛋白α10β1的表达与其潜能(再分化潜能)(如通过沉淀团块培养物中II型胶原蛋白表达来判断的(第二周和第三周))之间的可能相关性，对来自9种单独制剂(803、811、816、842、853、854、875、876和914)的在HS中培养的软骨细胞进行了皮尔逊相关分析。
[0274] 图5阐明了单层培养的软骨细胞上整联蛋白α10β1表达水平与其在沉淀团块培养物中的产生II型胶原蛋白的能力之间的高相关程度(2周后的R2值为0.75)。这证明了整联蛋白α10β1是软骨细胞质量的标志物，且可预测软骨细胞的潜能。
[0275] 此外，为了研究在HS中单层扩增后的软骨细胞上整联蛋白α10与整联蛋白α11表达比率(α10/α11比率)与其潜能(再分化能力，如通过沉淀团块培养中II型胶原蛋白表达来判断的(第二周和第三周))之间的可能的相关性，我们分析了具有低(811)和高(803)再分化能力的软骨细胞上的α10/α11比率。
[0276] 图8证实了，具有低α10/α11比率的软骨细胞制剂(811)具有低再分化能力，而具有高α10/α11比率的软骨细胞制剂(803)具有高再分化能力。这证实α10/α11比率可用于确定软骨细胞质量，且可预测软骨细胞的潜能，特别是软骨细胞组合物中的软骨细胞的软骨细胞同一性和分化状态。
[0277] 结论(II)：结果显示单层培养物中软骨细胞上的整联蛋白α10/整联蛋白α11比率与随后的沉淀团块培养物中的Col-II的表达相关联(图8)。这证实了整联蛋白α10/整联蛋白α11的比率可用于预测培养的软骨细胞的再分化潜能和功能，和确定软骨细胞组合物的软骨细胞的分化状态和功能潜能。
[0278] 实施例4.沉淀团块培养物显示整联蛋白α10β1和整联蛋白α11β1分别与II和I型胶原蛋白共定位。
[0279] 为了证明标志物整联蛋白α10β1和整联蛋白α11β1分别与软骨和纤维性胶原蛋白共定位，我们通过IHC和免疫荧光法研究了蛋白质表达模式。我们使用源自软骨细胞制剂875的在含有抗坏血酸的PL(PLA)中以单层扩增、随后在TIDA分化培养基的存在下在沉淀团块培养物中培养两周的沉淀。通过IHC(图6A)和免疫荧光(图6B)分析沉淀以证明整联蛋白和胶原蛋白的表达模式。
[0280] 免疫荧光程序
[0281] 将软骨细胞沉淀嵌入TissueTek(Sakura，Jpn)中并在
干冰上冷冻。在SuperFrost Plus载玻片上收集切片(8μm，在MICROM HM 500OM低温恒温器中制备)，并用于使用以下抗体进行免疫标记：与针对其它
抗原制备的抗体混合的第一抗体、以及荧光团缀合的第二Ab/Ab。
[0282] 在驴或山羊中制备了用于多重标记的针对兔、小鼠或山羊IgG或针对鸡IgY的第二抗体(高度亲和纯化的，主要是Fab2片段)，其在含1％BSA的PBS中稀释。为了同时对两个表位进行荧光可视化，第一和第二抗体作为混合物应用。
[0283] 结论：IHC染色显示，整联蛋白α10β1与II型胶原蛋白明显共定位于沉淀的中心区域，而I型胶原蛋白主要存在于不存在或低整联蛋白α10β1的沉淀的外部(图6A)。使用免疫荧光，我们确认整联蛋白α10β和II型胶原蛋白之间存在明显的共定位，此外，整联蛋白α11β1主要存在于富含I型胶原蛋白的沉淀的外部的细胞上(图6B)。
[0284] 实施例5.整联蛋白α10β1和整联蛋白α11β1流式细胞术分析以确定软骨细胞制剂的纯度和质量
[0285] 为了评估评定整联蛋白α10β1和整联蛋白α11β1的表达以确定同一性和纯度作为软骨细胞制剂的质量测定的可行性，使用了软骨细胞和成纤维细胞样滑膜细胞的组合。将不同量的成纤维细胞样滑膜细胞添加到软骨细胞制剂中，并通过流式细胞术分析整联蛋白α10β1和α11β1。使用来自健康受试者的成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS)和来自骨关节炎患者的成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS-OA)，以及来自制剂875的软骨细胞和来自人鼻软骨(HNC)的软骨细胞。为了研究测定的灵敏度，将增加量的滑膜细胞(HFLS-OA)添加至HNC细胞中，范围为0.5％至100％的HFLS-OA。
[0286] 结论(I)：流式细胞术分析证明了整联蛋白α11β1在HFLS和HFLS-OA上高表达，但不在来自制剂875或HNC的软骨细胞上高表达(图7A)。
[0287] 当通过增加HNC细胞制剂中滑膜细胞(HFLS-OA)的量来研究测定的灵敏度时(图7B和7C)，分析捕获了大多数添加的HFLS-OA，并且甚至能够检测最低含量(0.5％)的HFLS-OA细胞(图7C)。使用HFLS时，结果是相似的(数据未显示)。因此，通过流式细胞术分析整联蛋白α11β1用作检测软骨细胞制剂中潜在污染的成纤维细胞、成纤维细胞样细胞或其它表达整联蛋白α11β1的细胞的有效方法，并提供了一种用于分析软骨细胞制剂的纯度和质量的灵敏方法。
[0288] 此外，如图9中所示，对人软骨细胞制剂803(高潜能参见图8)和842(低潜能，数据未显示)上整联蛋白α10(X轴)、整联蛋白α11(Y轴)进行了流式细胞术分析。分别针对整联蛋白α10和α11的两种抗体组合的结合用于证明抗体的单染色和双染色的程度。
[0289] 结论(II)：流式细胞术分析证明了803主要具有整联蛋白α10的单一表达，这表明软骨细胞的纯群体和高分化状态。842具有更多的整联蛋白α11表达，这指示部分去分化状态(具有α11和α10二者的细胞)以及去分化和/或污染的细胞(仅α11)。这证明了，针对整联蛋白α10和α11的组合的抗体限定了整联蛋白α10与整联蛋白α11比率，并且可确定软骨细胞的分化状态和纯度，从而确定软骨细胞组合物的质量。
[0290] PCT
[0291] 打印出(
电子表格原件)(此表不是
国际申请表的一部分，且不视为
国际申请表)[0292]
