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抗-IGF-1R抗体和其它化合物的治疗联合
申请号 CN200980122583.2 申请日 2009-04-10 公开(公告)号 CN102065895A 公开(公告)日 2011-05-18
申请人 比奥根艾迪克MA公司; 发明人 砍德萨米·哈里哈兰; 董建英;
摘要 本 发明 涉及使用 联合 治疗 的治疗方法，其中多种治疗上有用的化合物可联合结合胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)的 抗体 。提供了抑制IGF-1R-介导的促生存和 肿瘤 增殖途径的特异性人和鼠单克隆抗体及其变体、 片段 和衍 生物 。还提供了阻断配体、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素样生长因子2(IGF-2)结合IGF-1R的能 力 的特异性人和鼠单克隆抗体、以及该种抗体的片段、变体和衍生物。本发明还包括编码上述抗体或其片段、变体或衍生物的多聚核苷酸、以及包含该种多聚核苷酸的载体和宿主细胞。本发明尤其包括使用本发明的利用IGF-1R抗体的联合治疗来治疗癌症的方法。
权利要求

1.一种治疗动物中的过度增殖病症的方法，该方法包括向需要治疗的动物施用一种或多种组合物，所述组合物包含：
a)第一制剂，其中所述制剂是分离的IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)抗体或其片段，其中所述抗体其片段抑制IGF-1R介导的信号转导；以及
b)第二制剂，其中所述第二制剂是治疗上用于治疗过度增殖病症的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二制剂抑制一个或多个生物进程，所述生物进程选自由下列生物进程构成的组：
a)细胞生长；
b)细胞增殖；和
c)细胞存活，
或者其中所述第二制剂抑制调节一个或多个生物进程的一种或多种信号转导途径，所述生物进程选自由下列生物进程构成的组：
d)细胞生长；
e)细胞增殖；和
f)细胞存活。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二制剂是第二分离的抗体或其片段。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二制剂是小分子。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二制剂是选自由下列物质构成的组的大分子：
a)蛋白；
b)多聚核苷酸；
c)脂质；和
d)碳水化合物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述过度增殖病症选自由下列疾病构成的组：癌症、赘生物、肿瘤、恶性肿瘤、或其转移性病灶。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述过度增殖病症是位于下列部位的赘生物：前列腺、结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝脏、胰脏、腹膜、肾上腺、甲状旁腺、垂体腺、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺、眼、头、颈、中枢神经系统、周围神经系统、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部或泌尿生殖道。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述过度增殖病症是癌症，所述癌症选自由下列疾病构成的组：上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、白血病、骨髓瘤、胃癌、脑癌、骨癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌、肉瘤和骨肉瘤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是选自由下列物质构成的组的分离的抗体或其片段：
a)M13-C06.G4.P；
b)M14-G11.G4.P；
c)M14-C03.G4.P；
d)M14-B01.G4.P；
e)M12-E01.G4.P；
f)M12-G04.G4.P；
g)M13-C06.G4.P.agly；
h)M14-G11.G4.P.agly；
i)M14-C03.G4.P.agly；
j)M14-B01.G4.P.agly；
k)M12-E01.G4.P.agly；和
l)M12-G04.G4.P.agly。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是选自由下列物质构成的组的分离的Fab抗体：
a)M13-C06；
b)M14-G11；
c)M14-C03；
d)M14-B01；
e)M12-E01；和
f)M12-G04。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是由杂交瘤细胞系制备的分离的抗体，所述杂交瘤细胞系选自由下列物质构成的组：
a)P2A7.3E11；
b)20C8.3B8；
c)P1A2.2B11；
d)20D8.24B11；
e)P1E2.3B12；和
f)P1G10.2B8。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是由细胞系制备的分离的抗体，所述细胞系选自由下列物质构成的组：
a)以美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号PTA-7444保藏的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系；
b)指定以ATCC保藏号PTA-7445保藏的CHO细胞系；
c)以ATCC保藏号PTA-7855保藏的CHO细胞系；
d)以ATCC保藏号PTA-7485保藏的杂交瘤细胞系；
e)以ATCC保藏号PTA-7732保藏的杂交瘤细胞系；
f)以ATCC保藏号PTA-7457保藏的杂交瘤细胞系；
g)以ATCC保藏号PTA-7456保藏的杂交瘤细胞系；
h)以ATCC保藏号PTA-7730保藏的杂交瘤细胞系；和
i)以ATCC保藏号PTA-7731保藏的杂交瘤细胞系。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是由权利要求14所述的细胞系制备的分离的抗体，其中所述细胞系由ATCC保藏说明指定，所述ATCC保藏说明选自由下列保藏说明构成的组：
a)中华仓鼠卵巢(CHO)：C06-40B5；CHO DG44Biogen Idec EA03.14.06；
b)中华仓鼠卵巢(CHO)：C03-2CHO DG44Biogen Idec DA 03.14.06；
c)中华仓鼠卵巢细胞系：G11 70 8e6细胞08.09.2006；
d)杂交瘤8.P2A7.3D11；
e)杂交瘤细胞系：7.20C8.3B8；
f)杂交瘤：5.P1A2.2B11；
g)杂交瘤：7.20D8.24.B11；
h)杂交瘤细胞系：9.P1E2.3B12；和
i)杂交瘤细胞系：5P1G10.2B8。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合多肽结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，所述多肽结构域由胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的纤连蛋白III型结构域-1(FNIII-1)构成。
17.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是抑制胰岛素样生长因
子-1(IGF-1)和胰岛素样生长因子-2(IGF-2)与IGF-1R结合的分离的抗体或抗原结合片段。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抑制是变构性的。
19.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合多肽结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，所述多肽结构域由IGF-1R的富半胱氨酸区域(CRR)构成。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗体抑制IGF-1和IGF-2配体与IGF-1R的结合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述抑制是竞争性的。
22.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合多肽结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，所述多肽结构域由IGF-1R的富半胱氨酸区域(CRR)和第二富亮氨酸重复结构域(L2)构成。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗体抑制IGF-1而不抑制IGF-2配体与
IGF-1R的结合。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述抑制是变构性的。
25.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合和参考单克隆Fab抗体片段或由杂交瘤制备的参考单克隆抗体相同的胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)表位的分离的抗体或其抗原结合片段，所述参考单克隆Fab抗体片段选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组，所述杂交瘤选自由P2A7.3E11、
20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组。
26.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段竞争性地抑制参考单克隆Fab抗体片段或由杂交瘤制备的参考单克隆抗体与IGF-1R的结合，所述参考单克隆Fab抗体片段选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组，所述杂交瘤选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组。
27.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含和单克隆Fab抗体片段或由杂交瘤制备的单克隆抗体的抗原结合域等同的抗原结合域，所述单克隆Fab抗体片段选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组，所述杂交瘤选自由P2A7.3E11、
20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述抗体重链和轻链可变域
来自单克隆Fab抗体片段，所述单克隆Fab抗体片段选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组。
29.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述抗体重链和轻链可变域是鼠源。
30.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述抗体重链和轻链可变域
来自由杂交瘤制备的单克隆抗体，所述杂交瘤选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、
20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物包含除了所述第一和第二制剂之外的多种制剂，其中所述多种其它制剂是治疗上用于治疗过度增殖病症的。
说明书全文

抗-IGF-1R抗体和其它化合物的治疗联合

背景技术

[0001] 联合治疗化合物(诸如，例如生物和小分子)在癌症治疗中已日益成为人们关注的方案。参见例如：
[0002] Bianco，R.，et al.，″Combination of biological therapies in non-small cell lung cancer，″Ann Oncol.，17，Suppl 2：ii52-54(2006)；
[0003] Rodriguez，J.，et al.，″Combining chemotherapy and targeted therapies in metastatic colorectal cancer，″World J Gastroenterol.，13(44)：5867-76(2007)；
[0004] Gligorov，J.，et al.， ″ Novel therapeutic strategies combining antihormonal and biological targeted therapies in breast cancer：focuson clinical trials and perspectives， ″ Crit Rev Oncol Hematol.，64(2)：
115-28(2007)；
[0005] Bracci，L.，et al.，″ IFN-alpha and novel strategies of combination therapy for cancer，″Ann NY Acad Sci.，1112：256-268(2007)；
[0006] Ho，C.，et al.， ″ Dual inhibition：combining epidermal growthfactor-targeted therapies in non-small-cell lung cancer，″Clin Lung Cancer，
8(7)：420-4(2007)；
[0007] Leonetti，C.，et al.， ′ Targeting different signaling pathways with antisense oligonucleotides combination for cancer therapy，″Curr Pharm Des.，13(5)：463-70(2007)；和
[0008] Cascone，T.，et al.，″Combined targeted therapies in non-small cell lung cancer：a winner strategy？，″Curr Opin Oncol.，19(2)：98-102(2007)。
[0009] 本发明涉及在过度增殖病症(例如癌症)的治疗中、特别是在靶向由胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)介导的信号转导途径以及另外的细胞生长、细胞增殖和细胞存活信号转导途径中的联合治疗方案。
[0010] 一系列流行病学研究显示高于正常循环水平的IGF-1与多种常见癌症风险的增加有关，所述癌症包括乳腺癌(Hankinson et al，Lancet 1998.351：1393-6)、前列腺癌(Chan et al，Science.1998.279：563-6)、肺癌(Yu et al，J.Natl.Cancer Inst.1999.91：151-6)和结肠直肠癌(Ma et al，J.Natl.Cancer Inst.1999.91：620-5)。
IGF-2循环水平的上升同样显示与子宫内膜癌的风险上升有关(Jonathan et al，Cancer Biomarker & Prevention.2004.13：748-52)。与此相反，据观察IGF结合蛋白、IGF-BP3之一和癌症风险的水平上升呈负相关。另外，还在癌症患者中发现了IGF的水平上升(Peyrat et al Eur.J.Cancer.1993.351：1393-6；Jonathan et al，Cancer Biomarker & Prevention.2004.13：748-52)。
[0011] IGF系统在调节细胞增殖、分化、凋亡和转化中扮演了重要的角色(Jones et al，Endocrinology Rev.1995.16：3-34)。IGF系统包含了两种不相关的受体-胰岛素样生长因子受体1(IGF-1R；CD221)和胰岛素样生长因子受体2(IGF-2R；CD222)；两种配体-胰岛素样生长因子1(IGF-1和IGF-2)；多种IGF结合蛋白(IGFBP-1至IGFBP-6)。此外，多种IGFBP蛋白酶(例如，胱天蛋白酶、金属蛋白酶、前列腺-特异性抗原)水解IGF结合的IGFBP以释放游离IGF，后者随后与IGF-1R和IGF-2R相互作用。IGF系统还可紧密结合胰岛素和胰岛素受体(InsR)(Moschos et al.Oncology 2002.63：317-32；Baserga et al.，Int J.Cancer.2003.107：873-77；Pollak et al.，Nature Reviews Cancer.2004.4：505-516)。
[0012] 在癌症细胞中，受体酪氨酸激酶(TK)在胞外肿瘤微环境和控制多种细胞功能(例如，细胞分裂周期、存活、凋亡、基因表达、细胞骨架结构、细胞附着以及细胞迁移)的胞内信号转导途径的联系中扮演重要的角色。由于控制细胞信号转导的机制已经得到了较好地理解，因而可通过靶向信号转导事件中的配体结合、受体表达/循环、受体激活和所涉及蛋白的水平来开发破毁一种或多种该类细胞功能的治疗策略(Hanahan and Weinberg，Cell2000.100：57-70)。
[0013] I型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R，CD221)属于受体酪氨酸激酶(RTK)家族(Ullrich et al.，Cell.1990.，61：203-12)。IGF-1R被广泛表达，其配体IGF-1和IGF-2在出生前和出生后发育、生长激素响应、细胞转化、存活中具有重要作用，并与扩散和转移肿瘤表型的获得具有关联(Baserga，Cell.1994.79：927-30；Baserga et al.，Exp.Cell Res.1999.253：1-6，Baserga et al.，Int J.Cancer.2003.107：873-77).。免疫组化研究显示一系列人肿瘤表达更高水平的IGF-1R。
[0014] IGF-1R的分子构造包含两个胞外α亚基(130-135kD)和两个包含胞浆催化激酶区的跨膜β亚基(95kD)。与胰岛素受体(InsR)相同，IGF-1R由于具有共价二聚体(α2β2)结构而区别于其它RTK家族成员。IGF-1R在结构上与InsR过度相关(Pierre De Meyts and Whittaker，Nature Reviews Drug Discovery.2002，1：769-83)。IGF-1R在激酶区与InsR具有84％的序列一致性，而在近膜区和N-末端区分别占有61％和44％的序列一致性(Ulrich et al.，EMBO J.，1986，5：2503-12；Blakesley et al.，Cytokine Growth Factor Rev.，1996.7：153-56)。
[0015] IGF-1和IGF-2是IGF-1R的两个激活配体。IGF-1和IGF-2与α链的结合诱发构型变化，从而导致在特定酪氨酸残基的各β-链发生自身磷酸化，将受体由未磷酸化状态转化为激活状态。激酶区活化环中三个酪氨酸残基(在1131、1135和1136的Tyr残基)的活化导致增强催化活性，该活性引发如IRS-1和She衔接蛋白等底物的对接和磷酸化。
这些底物的活化导致了存活(PI3K、AKT、TOR、S6)和/或增殖(丝裂原活化的蛋白激酶，p42/p44)的信号转导级联中涉及的另外蛋白的磷酸化(Pollak et al.，Nature Reviews Cancer.2004.4：505-516；Baserga et al.，Biochem Biophys Act.1997.1332：F105-F126；
Baserga et al，Int.J.Cancer.2003.107：873-77)。
[0016] 尽管在IGF-1R和InsR之间具有过度的同源性，但是有证据显示这两种受体具有截然不同的生物作用；InsR是葡萄糖运输和糖原和脂肪生物合成等生理功能的关键调节剂，而IGF-1R是细胞生长和分化的有效调节剂。与InsR不同，IGF-1R在组织中普遍表达并对组织生长产生作用，它受到调节IGF-1的生长激素(GH)的控制。尽管据显示IGF-1R活化促进正常细胞生长，但是实验证据提示IGF-1R并非绝对必需(Baserga et al，Exp Cell Res.1999.253：1-6；Baserga et al，Int.J.Cancer.2003.107：873-77)。
[0017] IGF在调节细胞增殖、分化和凋亡中具有至关重要的作用。据显示对IGF-1R介导的信号转导的抑制降低肿瘤生长率，增加凋亡，提高化疗和其它分子靶向治疗对肿瘤的杀伤(综述参见Pollak et al.，Nature Reviews Cancer.2004.4：505-516；Zhang et al.，Breast Cancer Res.2000.2：170-75；Chakravarti et al，Cancer Res.2002.62：200-07)。
[0018] 抑制肿瘤中IGF-1R功能的实验方案取得了鼓舞人心但也颇为有限的成就，且它们在治疗癌症中的作用尚待临床检验。这些实验方案包括：针对IGF-1R的抗体(Kull et al.，J.Biol.Chem.1983，258：6561-66；Kalebic et al.，Cancer Res.1994.54：5531-4)，针对IGF-1或IGF-2的中和抗体(Fang et al，Mol.Cancer Therapy.2006.5：114-20；Miyamoto et al，Clin.Cancer Res.2005，11：3494-502)，小分子酪氨酸激酶抑制剂(Garcia-Escheverria et al，Cancer Cell.2004.5：231-9；Scotlandi et al，Cancer Res.2005.65：3868-76)，反义寡聚核苷酸(Shapiro et al，J.Clin.Invest.1994.94：
1235-42；Wraight et al.Nature Biotech.2000.18：521-26；Scotlandi et al，Cancer Gene Therapy.2002.9：296-07)，IGF-1R的显性-阴性突变体(Prager et al，Proc.Natl.Acad.Sci.1994，91：2181-85；Kalebic et al.，Int.J.Cancer 1998.76：223-7；Scotlandi et al.，Int.J.Cancer.2002：101：11-6)，IGF配体类似物(Pietrzkowski et al，Mol.Cell.Biol.1992.12：3883-89)，重组IGF结合蛋白(Yee et al.Cell growth Differ.1994.5：
73-77；Van Den Berg et al，Eur.J.Cancer.1997，33：1108-1113；Jerome et al AACR
2004，Abstract # 5334)，GH释放激素拮抗剂GHRH(Szereday et al，Cancer Res.2003.63：
7913-19；Letsh et al，Proc Natl.Acad.Sci.USA.2003.100：1250-55)以及GII(Kopchick et al，2002.Endocr.Rev.23，623-46)。
[0019] 抗体抑制IGF-1R功能的能力首先通过靶向IGF-1R的α亚基中未知表位的小鼠单克隆抗体(αIR3)得到证实(Kull et al.，J.Biol.Chem.1983，258：6561-6)。后续开发的针对IGF-1R的α亚基的其它抗体在不同的实验癌症模型中显示了对IGF-1R功能不同程度的抑制(Maloney et al.Cancer Res.2003.63：5073-83；Burtrum et al，Cancer Res.2003.63：8912-21；Sachdev D et al，Cancer Res.2003.63，627-35；Cohen et al，Clin.Cancer Res.2005.11：3065-74；Goetsch et al，Intl.J.Cancer.2005.113：316-28.Lu et al，J.Biol.Chem.2004.280：19665-72)。
[0020] 在癌症细胞中，除了促生存和增殖信号转导，IGF-1R的活化还显示参与运动和侵入(Ress et al.，Oncogene 2001.20：490-00，Nolan et al，Int.J.Cancer.1997.72：828-34，Stracke et al，J.Biol.Chem.1989.264：21544-49；Jackson et al，Oncogene，
2001.20：7318-25)。
[0021] 据显示肿瘤细胞生产IGF系统的一种或多种成分(IGF-1、IGF-2、IGF-1R、IGF-2R和IGF-BP)。尽管体外研究表明肿瘤可以生产IGF-1或IGF-2，但是翻译研究表明IGF-2在肿瘤中为更加相关的更普遍表达的IGF。这是由于肿瘤中沉默IGF-2等位基因因为表遗传变异而印迹丢失((LOI)时导致了IGF-2基因的双等位基因表达(Fienberg et al.，Nat.Rev.Cancer 2004.4：143-53；Giovannucci et al，Horm.Metab.Res.2003.35：694-04；De Souza et al，FASEB J.et al，1997.11：60-7)。这反过来向癌症细胞和支持肿瘤生长的微环境提供了更多的IGF-2。
[0022] IGF-1R敏感肿瘤接受来自循环的IGF-1(肝生成)和来自肿瘤的IGF-2的受体活化信号，因此目标为同时破坏IGF-1和IGF-2介导的生物活性的方法应提供更好的抗肿瘤应答。因此，同时有效阻断IGF-1和IGF-2介导的生物功能的抗-IGF-1R抗体方法可相对其它未能有效阻断肿瘤微环境中IGF-1和IGF-2介导的IGF-1R信号转导的生物功能的方法提供更好的疗效。
[0023] 对于安全性，IGF-1R有着普遍表达，因此靶向IGF-1R的抗体对于避免由普通组织中ADCC和CDC活性产生的毒性应具有极小的或不具有效应功能。开发该类抗体的一种可能是包含不介导ADCC或CDC功能的人gamma 4Fc区的非糖基化形式。
[0024] 另外，下列特性也值得注意：IGF-1R与致癌基因介导的细胞转化有关。IGF/IGF-1R活化介导癌症细胞中的促分裂和促生存信号转导。IGF-1R活化还促进细胞运动和转移。IGF-1R在多种癌症中过量表达。具有高于正常循环IGF水平的个体患上癌症的风险增加。在许多癌症患者中发现了增加的IGF1和2的血浆水平。人肿瘤产生的IGF-2作为自分泌生长因子。以单一制剂和联合化疗和生物制剂均证实了肿瘤生长的抑制。
[0025] 在本领域仍存在对用于治疗各种肿瘤性疾病(包括癌症及其转移瘤)的具有不同或改善的结合、功效和安全特征的IGF-1R抗体的需求。

发明内容

[0026] 本发明涉及联合治疗，并且特别是涉及通过联合使用两种或多种治疗剂来治疗增殖病症(例如癌症)。特别地，本发明涉及联合抗-IGF-1R抗体和其它抗癌治疗剂以减轻或消除细胞生长和增殖、致癌作用、肿瘤发生和/或转移性病灶。当和使用单一制剂治疗的效果比较时，本发明的联合治疗可在治疗癌症和减轻细胞过度增殖、致癌作用、肿瘤发生和/或转移性病灶中具有协同效果。
[0027] 本发明部分基于IGF系统在调节细胞增殖、分化、凋亡和转化中的重要作用。特别地，I型胰岛素样生长因子受体((IGF-1R)及其配体(IGF-1和IGF-2)在出生前和出生后发育、生长激素响应、细胞转化、存活中具有重要作用，并与扩散和转移肿瘤表型的获得具有关联。本发明一般涉及IGF-1R抗体、其抗原结合片段或衍生物。某些特定的IGF-1R抗体和抗原结合片段抑制IGF-1R功能或阻断IGF-1和IGF-2介导的IGF-1R信号转导的生物功能。此外，本发明一般涉及各种肿瘤性疾病(包括癌症和转移瘤)、以及各种与IGF-1R信号转导相关的过度增殖疾病、病症或损伤的治疗方法。
[0028] 在一些实施方案中，本发明涵盖与选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段。
[0029] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1RIGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段竞争性地抑制选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的参考单克隆Fab抗体片段或是选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的参考单克隆抗体结合IGF-1R。
[0030] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含与选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的单克隆Fab抗体片段或是选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的单克隆抗体相同的抗原结合域。
[0031] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的重链可变区(VH)包含与选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
[0032] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的轻链可变区(VL)包含与选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
[0033] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了20个或更少保守氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[0034] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了20个或更少保守氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[0035] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的氨基酸序列。
[0036] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的氨基酸序列。
[0037] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含与选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：
98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
[0038] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含除了各有20个或更少保守氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：
48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；
和SEQ ID NO：63和118构成的组的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[0039] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118构成的组的氨基酸序列。
[0040] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了两个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64构成的组的参考VH-CDR1氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-1(VH-CDR1)氨基酸序列。在另外的实施方案中，VH-CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64构成的组。
[0041] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65构成的组的参考VH-CDR2氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-2(VH-CDR2)氨基酸序列。在另外的实施方案中，VH-CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65构成的组。
[0042] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66构成的组的参考VH-CDR3氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-3(VH-CDR3)氨基酸序列。在另外的实施方案中，VH-CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66构成的组。
[0043] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119构成的组的参考VL-CDR1氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-1(VL-CDR1)氨基酸序列。在另外的实施方案中，VL-CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119构成的组。
[0044] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了两个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120构成的组的参考VL-CDR2氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-2(VL-CDR2)氨基酸序列。在另外的实施方案中，VL-CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120构成的组。
[0045] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121构成的组的参考VL-CDR3氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-3(VL-CDR3)氨基酸序列。在另外的实施方案中，VL-CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121构成的组。
[0046] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了在至少一个所述VH-CDR中一个、两个、三个或四个氨基酸替换外选自由SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；SEQ ID NO：27、28和29；SEQ ID NO：33、34和35；SEQ ID NO：39、40和41；.SEQ ID NO：44、45和46；SEQ ID NO：49、50和51；SEQ ID NO：54、55和56；SEQ ID NO：
59、60和61；以及SEQ ID NO：64、65和66构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。
[0047] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含选自由SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；SEQ ID NO：27、28和29；SEQ ID NO：33、34和35；SEQ ID NO：39、40和41；.SEQ ID NO：44、45和46；SEQ ID NO：49、50和51；SEQ ID NO：54、55和56；SEQ ID NO：59、60和61；以及SEQ ID NO：64、65和66构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。
[0048] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了在至少一个所述VL-CDR中一个、两个、三个或四个氨基酸替换外选自由SEQ ID NO：69、70和71；SEQ ID NO：74、75和76；SEQ ID NO：79、80和81；SEQ ID NO：84、85和86；SEQ ID NO：89、90和91；SEQID NO：94、95和96；SEQ ID NO：99、100和101；SEQ ID NO：104、105和106；SEQ ID NO：109、110和111；SEQ ID NO：114、115和116；
以及SEQ ID NO：119、120和121构成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。
[0049] 在一些实施方案中，本发明涵盖特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含选自由SEQ ID NO：69、70和71；SEQ ID NO：74、75和76；SEQ ID NO：79、80和81；SEQ ID NO：84、85和86；SEQ ID NO：89、90和91；SEQ ID NO：94、95和96；SEQ ID NO：99、100和101；SEQ ID NO：104、105和106；SEQ ID NO：109、110和111；SEQ ID NO：114、115和116；以及SEQ ID NO：119、120和121构成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。
[0050] 在上述抗体或其片段的多种实施方案中，VH框架区和/或VL框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[0051] 在一些实施方案中，上述抗体或其片段结合线性表位或非线性构型表位。
[0052] 在一些实施方案中，上述抗体或其片段为多价体，并包含至少两条重链和至少两条轻链。
[0053] 在一些实施方案中，上述抗体或其片段是多特异性的。在另外的实施方案中，上述抗体或其片段是双特异性的。
[0054] 在上述抗体或其片段的多种实施方案中，重链和轻链可变域为完全人源。在另外的实施方案中，重链和轻链可变域来自选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的单克隆Fab抗体片段。
[0055] 在上述抗体或其片段的多种实施方案中，重链和轻链可变域是鼠源。在另外的实施方案中，重链和轻链可变域来自由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的单克隆抗体。
[0056] 在多种实施方案中，上述抗体或其片段是人源化、嵌合、灵长源化、或完全人源的。在某些实施方案中，上述抗体或其片段是Fab片段、Fab′片段、F(ab)2片段或Fv片段。在某些实施方案中，上述抗体是单链抗体。
[0057] 在某些实施方案中，上述抗体或其片段包含选自由人kappa恒定区和人lambda恒定区构成的组的轻链恒定区。
[0058] 在某些实施方案中，上述抗体或其片段包含重链恒定区或其片段。在另外的实施方案中，重链恒定区或其片段是人IgG4。在某些其它实施方案中，该IgG4被突变以去除糖基化位点。在另外的实施方案中，该IgG4突变包含Kabat编号系统的S241P和T318A。
[0059] 在一些实施方案中，上述抗体或其片段通过以解离常数(KD)低于对所述参考单克隆抗体的KD表征的亲和力特异性结合IGF-1R多肽或其片段或IGF-R1变体多肽。在另外的-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5实施方案中，该解离常数(KD)不大于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、或10 M。
[0060] 在一些实施方案中，上述抗体或其片段相对于鼠IGF-1R多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-1R多肽或其片段优先结合人IGF-1R多肽或其片段。
[0061] 在某些其它实施方案中，上述抗体或其片段结合人IGF-1R多肽或其片段，并且还结合非-人灵长动物IGF-1R多肽或其片段。
[0062] 在一些实施方案中，上述抗体或其片段结合在细胞表面上表达的IGF-1R。在另外的实施方案中，细胞是恶性肿瘤细胞、肿瘤性细胞、肿瘤细胞或转移细胞。
[0063] 在一些实施方案中，上述抗体或其片段阻断胰岛素生长因子与IGF-1R的结合。在另外的实施方案中，胰岛素生长因子是胰岛素生长因子-1(IGF-1)或胰岛素生长因子-2(IGF-2)。在某些实施方案中，上述抗体或其片段同时阻断IGF-1和IGF-2与IGF-1R的结合。
[0064] 在一些实施方案中，上述抗体或其片段抑制IGF-1R-介导的细胞增殖、IGF-1或IGF-2-介导的IGF-1R磷酸化、肿瘤细胞生长或IGF-1R内在化。
[0065] 在另外的实施方案中，上述抗体或其片段还包含与其融合的外源多肽。
[0066] 在一些实施方案中，上述抗体或其片段结合至选自由细胞毒素剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、外源抗体或其片段、可检测的标记、聚乙二醇(PEG)构成的组的制剂、以及两种或多种任意所述制剂的组合，或联合使用。在另外的实施方案中，该细胞毒素剂(和IGF-1R抗体结合或联合使用)选自由放射性核、生物毒素、酶活毒素、细胞抑制或细胞毒性治疗剂、前药、免疫活性配体、生物应答调节剂构成的组、或是两种或多种任意所述细胞毒素剂的组合。在另外的实施方案中，该可检测的标记选自由酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射活性标记构成的组、或是两种或多种任意所述可检测的标记的组合。
[0067] 在另外的实施方案中，本发明涵盖包含上述抗体或其片段和载体的组合物。
[0068] 本发明的某些实施方案涵盖包含编码抗体VH多肽的核酸的分离的多聚核苷酸，其中VH多肽的氨基酸序列与选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性；并且包含该VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。在另外的实施方案中，VH多肽的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组。
[0069] 在某些实施方案中，编码该VH多肽的核苷酸序列在不改变该VH多肽的氨基酸序列的情况下进行优化以提高表达。在另外的实施方案中，该优化包括鉴别并去除剪接供体和剪接受体位点和/或用于表达该多聚核苷酸的细胞的密码子的优化。在另外的实施方案中，该核酸包含选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：62构成的组的核苷酸序列。
[0070] 在一些实施方案中，本发明涵盖包含编码抗体VL多肽的核酸的分离的多聚核苷酸，其中该VL多肽的氨基酸序列与选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性；
并且其中包含该VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。在另外的实施方案中，该VL多肽的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组。
[0071] 在某些实施方案中，编码该VL多肽的核苷酸序列在不改变所述VL多肽的氨基酸序列的情况下进行优化以提高表达。在另外的实施方案中，该优化包括鉴别并去除剪接供体和剪接受体位点和/或用于表达该多聚核苷酸的细胞的密码子的优化。在另外的实施方案中，该核酸包含选自由SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：117构成的组的核苷酸序列。
[0072] 在某些其它实施方案中，本发明涵盖包含编码抗体VH多肽的核酸的分离的多聚核苷酸，其中该VH多肽的氨基酸序列除了20个或更少的保守氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的参考氨基酸序列一致；并且其中包含所述VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0073] 在一些实施方案中，本发明涵盖包含编码抗体VL多肽的核酸的分离的多聚核苷酸，其中该VL多肽的氨基酸序列除了20个或更少的保守氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的参考氨基酸序列一致；并且其中包含所述VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0074] 在一些实施方案中，本发明涵盖分离的多聚核苷酸，其包含除了两个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64构成的组的参考VH-CDR1氨基酸序列一致的VH-CDR1氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VH-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。在另外的实施方案中，VH-CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：
15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64构成的组。
[0075] 在一些实施方案中，本发明涵盖分离的多聚核苷酸，其包含除了四个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65构成的组的参考VH-CDR2氨基酸序列一致的VH-CDR2氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VH-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。在另外的实施方案中，VH-CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：
16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65构成的组。
[0076] 在一些实施方案中，本发明涵盖分离的多聚核苷酸，其包含除了四个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66构成的组的参考VH-CDR3氨基酸序列一致的VH-CDR3氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VH-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。在另外的实施方案中，VH-CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：
17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66构成的组。
[0077] 在一些实施方案中，本发明涵盖分离的多聚核苷酸，其包含除了四个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119构成的组的参考VL-CDR1氨基酸序列一致的VL-CDR1氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VL-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。在另外的实施方案中，VL-CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119构成的组。
[0078] 在一些实施方案中，本发明涵盖分离的多聚核苷酸，其包含除了两个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120构成的组的参考VL-CDR2氨基酸序列一致的VL-CDR2氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VL-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。在另外的实施方案中，VL-CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：
80、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120构成的组。
[0079] 在一些实施方案中，本发明涵盖分离的多聚核苷酸，其包含除了四个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121构成的组的参考VL-CDR3氨基酸序列一致的VL-CDR3氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。在另外的实施方案中，VL-CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：
81、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121构成的组。
[0080] 在一些实施方案中，本发明涵盖分离的多聚核苷酸，其包含编码抗体VH多肽的核酸，其中所述VH多肽包含选自由SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；SEQ ID NO：27、28和29；SEQ ID NO：33、34和35；SEQ ID NO：39、40和41；SEQ ID NO：44、45和46；SEQ ID NO：49、50和51；SEQ ID NO：54、55和
56；SEQ ID NO：59、60和61；以及SEQ ID NO：64、65和66构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列；并且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0081] 在一些实施方案中，本发明涵盖包含编码抗体VL多肽的核酸的分离的多聚核苷酸，其中所述VL多肽包含选自由SEQ ID NO：69、70和71；SEQ ID NO：74、75和76；SEQ ID NO：79、80和81；SEQ ID NO：84、85和86；SEQ ID NO：89、90和91；SEQ ID NO：94、95和96；SEQ ID NO：99、100和101；SEQ ID NO：104、105和106；SEQ ID NO：109、110和111；
SEQ ID NO：114、115和116；以及SEQ ID NO：119、120和121构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列；并且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0082] 在一些实施方案中，上述多聚核苷酸还包含融合至抗体VH多肽或抗体VL多肽的信号肽的编码核酸。
[0083] 在某些其它实施方案中，上述多聚核苷酸还包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH1结构域、编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH2结构域、编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH3结构域、或编码融合至所述VH多肽的重链铰链区的核酸。在另外的实施方案中，重链恒定区是人IgG4。在某些其它实施方案中，该IgG4被突变以去除糖基化位点。在另外的实施方案中，该IgG4突变包含使用Kabat编号系统的S241P和T318A。
[0084] 在一些实施方案中，上述多聚核苷酸包含编码融合至所述VL多肽的轻链恒定区结构域的核酸。在另外的实施方案中，轻链恒定区是人kappa。
[0085] 在上述多聚核苷酸的各种实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含由该核酸编码的、与选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的参考单克隆Fab抗体片段或与由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位的多肽。
[0086] 在上述多聚核苷酸的多种实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含由该核酸编码的、竞争性地抑制选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的参考单克隆Fab抗体片段或由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的参考单克隆抗体的多肽。
[0087] 在上述多聚核苷酸的多种实施方案中，该VH多肽或VL多肽的框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[0088] 在上述多聚核苷酸的各种实施方案中，本发明涵盖包含由该核酸编码的、结合线性表位或非线性构型表位的多肽的抗体或其抗原结合片段。
[0089] 在上述多聚核苷酸的各种实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为多价体，且包含了至少两条重链和至少两条轻链。
[0090] 在上述多聚核苷酸的某些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为多特异性的。在另外的实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为双特异性的。
[0091] 在上述多聚核苷酸的各种实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含完全人源的重链和轻链可变域。在另外的实施方案中，重链和轻链可变域与选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的单克隆Fab抗体片段一致。
[0092] 在上述多聚核苷酸的某些其它实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含鼠源的重链和轻链可变域。在另外的实施方案中，重链和轻链可变域与由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的单克隆抗体一致。
[0093] 在上述多聚核苷酸的各种实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
[0094] 在上述多聚核苷酸的各种实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是灵长源化的。
[0095] 在上述多聚核苷酸的各种实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
[0096] 在上述多聚核苷酸的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是完全人源的。
[0097] 在上述多聚核苷酸的各种实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是Fab片段、Fab′片段、F(ab)2片段或Fv片段。在上述多聚核苷酸的某些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是单链抗体。
[0098] 在上述多聚核苷酸的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5结合片段通过以解离常数(KD)不大于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、或10 M表征的亲和力特异性结合IGF-R1多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽。
[0099] 在上述多聚核苷酸的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段相对于鼠IGF-1R多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-1R多肽或其片段优先结合人IGF-1R多肽或其片段。
[0100] 在上述多聚核苷酸的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合人IGF-1R多肽或其片段，并且还结合非-人灵长动物IGF-1R多肽或其片段。
[0101] 在上述多聚核苷酸的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合在细胞表面上表达的IGF-1R。在另外的实施方案中，细胞是恶性肿瘤细胞、肿瘤性细胞、肿瘤细胞或转移细胞。
[0102] 在上述多聚核苷酸的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段阻断胰岛素生长因子与IGF-1R的结合。在另外的实施方案中，胰岛素生长因子是胰岛素生长因子-1(IGF-1)或胰岛素生长因子-2(IGF-2)。在上述多聚核苷酸的某些其它实施方案中，所述抗体或其片段同时阻断IGF-1和IGF-2与IGF-1R的结合。
[0103] 在上述多聚核苷酸的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制IGF-1R-介导的细胞增殖、抑制IGF-1或IGF-2-介导的IGF-1R磷酸化、抑制肿瘤细胞生长或抑制IGF-1R内在化。
[0104] 在一些实施方案中，上述多聚核苷酸还包含编码外源多肽的核酸。
[0105] 在上述多聚核苷酸的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合至选自由细胞毒素剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、外源抗体或其片段、可检测的标记、聚乙二醇(PEG)构成的组的制剂、以及两种或多种任意所述制剂的组合，或联合使用。在另外的实施方案中，该细胞毒素剂(和IGF-1R抗体结合或联合使用)选自由放射性核、生物毒素、酶活毒素、细胞抑制或细胞毒性治疗剂、前药、免疫活性配体、生物应答调节剂构成的组、或是两种或多种任意所述细胞毒素剂的组合。在某些其它实施方案中，该可检测的标记选自由酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射活性标记构成的组、或是两种或多种任意所述可检测的标记的组合。
[0106] 在一些实施方案中，本发明涵盖包含上述多聚核苷酸的组合物。
[0107] 在某些其它实施方案中，本发明涵盖包含上述多聚核苷酸的载体。在另外的实施方案中，多聚核苷酸和启动子可操作地关联。在另外的实施方案中，本发明提供包含这种载体的宿主细胞。在另外的实施方案中，本发明提供其中多聚核苷酸和启动子可操作地关联的载体。
[0108] 在另外的实施方案中，本发明涵盖制备特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的方法，包括培养包含上述多聚核苷酸的载体的宿主细胞；以及回收所述抗体或其片段。在另外的实施方案中，本发明提供由上述方法制备的分离的多肽。
[0109] 在一些实施方案中，本发明涵盖由上述多聚核苷酸编码的分离的多肽。
[0110] 在上述多肽的另外的实施方案中，包含所述多肽的抗体或其片段特异性结合IGF-1R。其它实施方案包括包含上述多肽的分离的抗体或其片段。
[0111] 在一些实施方案中，本发明涵盖包含分离VH编码多聚核苷酸和分离VL编码多聚核苷酸的组合物，其中该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸分别包含与选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：
48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；
以及SEQ ID NO：63和118构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列的编码核酸；并且其中由该VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段特异性结合IGF-1R。在另外的实施方案中，该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸分别包含选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：
32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；
SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；以及SEQ ID NO：63和118构成的组的氨基酸序列的编码核酸。
[0112] 在某些其它实施方案中，本发明的涵盖部分提供包含分离VH编码多聚核苷酸和分离VL编码多聚核苷酸的组合物，其中该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸分别包含除了少于20个保守氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；以及SEQ ID NO：63和118构成的组的参考氨基酸序列一致性的氨基酸序列的编码核酸；并且其中由该VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段特异性结合IGF-1R。在另外的实施方案中，该VH编码多聚核苷酸编码包含选自由SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：15、16和17；
SEQ ID NO：21、22和23；SEQ ID NO：27、28和29；SEQ ID NO：33、34和35；SEQ ID NO：39、
40和41；SEQ ID NO：44、45和46；SEQ ID NO：49、50和51；SEQ ID NO：54、55和56；SEQ ID NO：59、60和61；以及SEQ ID NO：64、65和66构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列的VH多肽；其中该VL编码多聚核苷酸编码包含选自由SEQ ID NO：69、70和71；
SEQ ID NO：74、75和76；SEQ ID NO：79、80和81；SEQ ID NO：84、85和86；SEQ ID NO：89、
90和91；SEQ ID NO：94、95和96；SEQ ID NO：99、100和101；SEQ ID NO：104、105和106；
SEQ ID NO：109、110和111；SEQ ID NO：114、115和116；以及SEQ ID NO：119、120和121构成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列的VL多肽；并且其中由该VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段特异性结合IGF-1R。
[0113] 在上述组合物的各种实施方案中，VH编码多聚核苷酸还包含融合至抗体VH多肽的信号肽的编码核酸。
[0114] 在上述组合物的各种实施方案中，VL编码多聚核苷酸还包含融合至抗体VL多肽的信号肽的编码核酸。
[0115] 在上述组合物的一些实施方案中，VH编码多聚核苷酸还包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH1结构域的核酸、还包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH2结构域的核酸、还包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH3结构域的核酸、或还包含编码融合至所述VH多肽的重链铰链区的核酸。在另外的实施方案中，重链恒定区是人IgG4。在某些其它实施方案中，该IgG4被突变以去除糖基化位点。在另外的实施方案中，该IgG4突变包含使用Kabat编号系统的S241P和T318A。
[0116] 在上述组合物的一些实施方案中，VL编码多聚核苷酸还包含编码融合至所述VL多肽的轻链恒定区结构域的核酸。在另外的实施方案中，轻链恒定区是人kappa。
[0117] 在上述组合物的一些实施方案中，由VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段与选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的参考单克隆Fab抗体片段或与由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B 12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位。
[0118] 在上述组合物的一些实施方案中，由VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段竞争性地抑制选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的参考单克隆Fab抗体片段或由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B 12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的参考单克隆抗体与IGF-1R的结合。
[0119] 在上述组合物的一些实施方案中，该VH和VL多肽的框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[0120] 在上述组合物的一些实施方案中，由VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段结合线性表位或非线性构型表位。
[0121] 在上述组合物的一些实施方案中，由VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段为多价体，且包含了至少两条重链和至少两条轻链。
[0122] 在上述组合物的一些实施方案中，由VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是多特异性的。在另外的实施方案中，由VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是双特异性的。
[0123] 在上述组合物的一些实施方案中，由VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段包含完全人源的重链和轻链可变域。在另外的实施方案中，重链和轻链可变域与选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的单克隆Fab抗体片段一致。
[0124] 在上述组合物的一些实施方案中，由VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段包含鼠源的重链和轻链可变域。在另外的实施方案中，重链和轻链可变域与由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的单克隆抗体一致。
[0125] 在上述组合物的各种实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
[0126] 在上述组合物的各种实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是灵长源化的。
[0127] 在上述组合物的各种实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
[0128] 在上述组合物的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是完全人源的。
[0129] 在上述组合物的各种实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是Fab片段、Fab′片段、F(ab)2片段或Fv片段。在上述组合物的某些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是单链抗体。
[0130] 在上述组合物的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5合片段通过以解离常数(KD)不大于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、或10 M表征的亲和力特异性结合IGF-R1多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽。
[0131] 在上述组合物的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段相对于鼠IGF-1R多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-1R多肽或其片段优先结合人IGF-1R多肽或其片段。
[0132] 在上述组合物的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合人IGF-1R多肽或其片段，并且还结合非-人灵长动物IGF-1R多肽或其片段。
[0133] 在上述组合物的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合在细胞表面上表达的IGF-1R。在另外的实施方案中，细胞是恶性肿瘤细胞、肿瘤性细胞、肿瘤细胞或转移细胞。
[0134] 在上述组合物的一些实施方案中，包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段阻断胰岛素生长因子与IGF-1R的结合。在另外的实施方案中，胰岛素生长因子是胰岛素生长因子-1(IGF-1)或胰岛素生长因子-2(IGF-2)。在上述组合物的某些其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段同时阻断IGF-1和IGF-2与IGF-1R的结合。
[0135] 在上述组合物的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制IGF-1R-介导的细胞增殖、抑制IGF-1或IGF-2-介导的IGF-1R磷酸化、抑制肿瘤细胞生长或抑制IGF-1R内在化。
[0136] 在一些实施方案中，上述组合物、VH编码多聚核苷酸、VL编码多聚核苷酸或VH和VL编码多聚核苷酸还包含编码外源多肽的核酸。
[0137] 在上述组合物的一些实施方案中，包含由该核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合至选自由细胞毒素剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、外源抗体或其片段、可检测的标记、聚乙二醇(PEG)构成的组的制剂、以及两种或多种任意所述制剂的组合，或联合使用。在另外的实施方案中，该细胞毒素剂(和IGF-1R抗体结合或联合使用)选自由放射性核、生物毒素、酶活毒素、细胞抑制或细胞毒性治疗剂、前药、免疫活性配体、生物应答调节剂构成的组、或是两种或多种任意所述细胞毒素剂的组合。在某些其它实施方案中，该可检测的标记选自由酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射活性标记构成的组、或是两种或多种任意所述可检测的标记的组合。
[0138] 在上述组合物的一些实施方案中，该VH编码多聚核苷酸包含于第一载体，而该VL编码多聚核苷酸包含于第二载体。在另外的实施方案中，该VH编码多聚核苷酸和第一启动子可操作地关联而该VL编码多聚核苷酸和第二启动子可操作地关联。在某些其它实施方案中，该第一和第二启动子为同一启动子的拷贝。在另外的实施方案中，该第一和第二启动子不一致。
[0139] 在上述组合物的各种实施方案中，该第一和第二载体包含于单个宿主细胞。
[0140] 在上述组合物的某些其它实施方案中，该第一和第二载体包含于独立的宿主细胞。
[0141] 在一些实施方案中，本发明涵盖制备特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的方法，包括培养上述宿主细胞；以及回收所述抗体或其片段。
[0142] 在其它的实施方案中，本发明涵盖制备特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的方法，包括共培养独立的宿主细胞，；以及回收所述抗体或其片段。在上述方法的另外的实施方案中，本发明提供了合并该VH和VL编码多肽，以及回收所述抗体或其片段。
[0143] 在一些实施方案中，本发明涵盖由上述制备的特异性结合IGF-1R的抗体或其片段。
[0144] 在一些实施方案中，本发明涵盖其中该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸在相同载体上的组合物、及其中的载体。
[0145] 在上述载体的多种实施方案中，该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸均和启动子可操作地关联。
[0146] 在上述载体的多种实施方案中，该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸进行框内融合，从与之可操作地关联的单个启动子进行共同转录，并共同翻译成单链抗体或其抗原结合片段。
[0147] 在上述载体的多种实施方案中，该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸从与之可操作地关联的单个启动子进行共同转录，但单独翻译。在另外的实施方案中，载体还包含位于该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸之间的IRES序列。在某些其它实施方案中，该编码VH的多聚核苷酸和该编码VL的多聚核苷酸分别可操作地关联单独启动子并单独转录。在另外的实施方案中，该独立的启动子为同一启动子的拷贝或该独立的启动子不一致。
[0148] 在一些实施方案中，本发明涵盖包含上述载体的宿主细胞。
[0149] 在其它的实施方案中，本发明涵盖制备特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的方法，包括培养上述宿主细胞；以及回收所述抗体或其片段。
[0150] 在一些实施方案中，本发明涵盖由上述方法制备的特异性结合IGF-1R的抗体或其片段。
[0151] 在一些实施方案中，本发明涵盖在动物中治疗过度增殖病症的方法，包括向需要治疗的动物施用包含以下成分的组合物：a)上述分离的抗体或其片段；以及b)药学上可接受的载体。在另外的实施方案中，本发明涵盖在动物中治疗过度增殖病症的方法，包括向需要治疗的动物施用包含以下成分的组合物：a)上述分离的抗体或其片段；以及b)一种或多种用于治疗过度增殖病症的另外的制剂；c)药学上可接受的载体。在另外的实施方案中，本发明涵盖在动物中治疗过度增殖病症的方法，包括向需要治疗的动物施用：a)包含上述分离的抗体或其片段和药学上可接受的载体的组合物；b)包含一种或多种用于治疗过度增殖病症的另外的制剂和药学上可接受的载体的一种或多种单独组合物(其中所述单独组合物以任何的顺序、以任何的时间段同时或顺序施用)。在另外的实施方案中，过度增殖病症选自由癌症、赘生物、肿瘤、恶性肿瘤或其转移性病灶构成的组。
[0152] 在上述方法的各种实施方案中，抗体或其片段特异性结合在恶性肿瘤细胞的表面上表达的IGF-1R。在另外的实施方案中，抗体或其片段结合恶性肿瘤细胞导致恶性肿瘤细胞的生长抑制。
[0153] 在上述方法的各种实施方案中，抗体或其片段抑制IGF和恶性肿瘤细胞的结合。在另外的实施方案中，IGF是IGF-1或IGF-2。
[0154] 在上述方法的各种实施方案中，抗体或其片段抑制IGF-1结合所述恶性肿瘤细胞，但不抑制IGF-2。在某些其它实施方案中，抗体或其片段抑制IGF-2结合所述恶性肿瘤细胞，但不抑制IGF-1。
[0155] 在上述方法的各种实施方案中，抗体或其片段促进IGF-1R内在化进入所述恶性肿瘤细胞。
[0156] 在上述方法的各种实施方案中，抗体或其片段抑制IGF-1R磷酸化或抑制肿瘤细胞增殖。在另外的实施方案中，肿瘤细胞增殖通过预防或延缓转移生长而受到抑制。
[0157] 在上述方法的各种实施方案中，抗体或其片段抑制肿瘤细胞转移。在另外的实施方案中，肿瘤细胞增殖通过预防或延缓肿瘤扩散至邻近组织而受到抑制。
[0158] 在上述方法的各种实施方案中，过度增殖疾病或病症是位于下列部位的赘生物：前列腺、结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝脏、胰脏、腹膜、肾上腺、甲状旁腺、垂体腺、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺、眼、头、颈、中枢神经系统、周围神经系统、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部或泌尿生殖道。
[0159] 在上述方法的各种实施方案中，过度增殖疾病或病症是癌症，所述癌症选自由下列疾病构成的组：上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、白血病、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌和头颈癌。在另外的实施方案中，所述癌症选自由下列疾病构成的组：胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
[0160] 在上述方法的各种实施方案中，动物是哺乳动物。在另外的实施方案中，哺乳动物是人。附图说明
[0161] 图1：IGF-1R特异性Fab的结合活性。(A)由ELISA所得的纯化抗-IGF-1R Fab抗体对重组IGF-1R-his和IGF1R-Fc蛋白的结合。(B)通过流式细胞仪所得的纯化抗-IGF-1R Fab抗体对在3T3上表达的人IGF-1R的结合。
[0162] 图2：Fab对MCF-7细胞上表达的IGF-1R的结合活性。
[0163] 图3：抗-IGF-1R Fab在MCF7细胞中抑制(A)IGF-1和(b)IGF-2诱导的磷酸化。
[0164] 图4：由ELISA所得的IGF-1R Fab片段抗体与可溶性IGF-1R(A)和INSR(B)的结合。
[0165] 图5：对G4.P.agly型完全人源M13-C06和M14-C03抗体的非还原型和还原型SDA PAGE分析。
[0166] 图6：由ELISA测定的完全人源G4.P(A)和G4.P.agly(B)型抗-IGF-1R抗体的结合活性。
[0167] 图7：由流式细胞仪测定的完全人源抗体对MCF-7(A)、IGF-1R/3T3(B)细胞上表达的IGF-1R的结合。在MCF-7上的结合EC50在2.7-12x10-10nM范围内。
[0168] 图8：由RIA测定的G4型完全人源抗体阻断IGF-1(A)和IGF-2(B)结合IGF-1R的能力。
[0169] 图9：(A)G4型完全人源抗体对H-23肿瘤细胞响应IGF-1的增殖的抑制；(B)G4型完全人源抗体对H-23肿瘤细胞响应IGF-2的增殖的抑制；(C)G4型完全人源抗体对Calu-6肿瘤细胞响应IGF-1的增殖的抑制。
[0170] 图10：M13.C06.G4.P.agly、M14.C03.G4.P.agly和M14.G11.P抗体IGF-1(A)和IGF-2(B)驱动的受体磷酸化的抑制。
[0171] 图11：M13.C06.G4.P.agly对下游信号转导的抑制。(A)磷酸化Akt(Thr308)和总Akt分别在顶部和底部行中显示，(B)顶部磷酸化p44/42 MAPK和总p44/42 MAPK分别在顶部和底部行显示。
[0172] 图12：选择的IGF-1R mAbs对IGF-1介导的肿瘤细胞生长的抑制。(A)H23；(B)Calu-6；(C)Panc-1；(D)BxPC3；(E)MaPaCa；和(F)Colo205。柱表示平均值和SD。
[0173] 图13：抗-IGF-1R抗体对IGF-1和IGF-2驱动的H-23细胞的增殖的抑制。
[0174] 图14：M13-C06.G4.P.agly抗体对BxPC3细胞增殖(由重组人IGF-1和IGF-2驱动)的抑制。
[0175] 图15：M13-C06.G4.P.agly抗体对NCI-H23细胞增殖(由重组人IGF-1和IGF-2驱动)的抑制。
[0176] 图16：M13-C06.G4.P.agly抗体对A549细胞增殖(由重组人IGF-1和IGF-2驱动)的抑制。
[0177] 图17：完全人源IGF-1R抗体对IGF-1和IGF-2诱导的Akt的氨基酸残基Ser473磷酸化的抑制。
[0178] 图18：完全人源M13.C06.G4.P.agly抗体在胰腺癌模型中显示了体内剂量依赖性肿瘤生长抑制。
[0179] 图19：完全人源M13.C06.G4.P.agly抗体在肺癌模型中显示了体内剂量依赖性肿瘤生长抑制。
[0180] 图20：完全人M13.C06.G4.P.agly抗体联合吉西他滨施用在抑制肿瘤生长中显示了增强的效力。
[0181] 图21：完全人源M13.C06.G4.P.agly抗体与食蟹猴成纤维细胞系上表达的IGF-1R的结合。
[0182] 图22：IGF-1R抗体结合表位的交叉竞争性结合分析。
[0183] 图23：IRS-1和p85(PI3K的调节亚基)的共免疫沉淀证实了M13-C06.G4.P.agly介导的IGF-1R信号转导抑制。
[0184] 图24：IGF-1R和INSR在哺乳动物细胞中的免疫沉淀证实了M13.C06.G4.P.agly抗体结合IGF-1R但不结合胰岛素受体。以采用鼠抗-人IR(A)或鼠抗-人IGF-1R(B)免疫印迹(Western印迹)分析检测IGF-1R和INSR蛋白。
[0185] 图25：M13-C06Fab对(A)hIGF-1R-Fc和(B)mIGF-1R-Fc的相对结合亲和力测定。(A)和(B)的x-和y-轴比例相同。在各图的底部显示了用于结合拟合的残余物以表明该
1∶1结合模型在测定M13-C06对各个受体的相对亲和力中的适用性。
[0186] 图26：M13.C06抗体在SPR测定中结合hIGF-1R-Fc和mIGF-1R-Fc对照与抗体结合IGF-1R突变蛋白SD006(结合阳性)和SD015(结合阴性)的实施例。
[0187] 图27：IGF-1R和INSR的结构表示：A)IGF-1R的结构示意图。FnIII-2包含如图所示的体内蛋白水解处理的环状结构。跨膜区显示为横跨磷脂双层图的螺旋环。IGF-1R中的IGF-1/IGF-2结合位点的位置以星号显示。经证明仅一种IGF-1/IGF-2分子结合至各IGF-1R异源二聚分子。B和C)定位至同源INSR结构表面的M13-C06 IGF-1R结合表位。M13-C06 IGF-1R结合表位基于过度同源性INSR晶体结构建模。B)具有对应IGF-1R中同源性位置V462-H464的氨基酸残基位置(即INSR中的L472-K474)的INSR结构的表面表
示以黑色阴影显示。对应IGF-1R的前三个结构域(即L1-CR-L2)(例如包含在本文中所述平头IGF-1R(1-462)-Fc构建体)显示为灰色阴影。C)具有暴露表面区域至溶剂以及在对应IGF-1R的462-464(即INSR的472-474)的残基的 (埃)半径(或 直径)之内
的残基的INSR结构的表面表示以黑色阴影显示。对应IGF-1R氨基酸462-464的残基的具有灰色阴影以显示实验确认的该目标表位的表面区域。
[0188] 图28：在以M13.C06.G4.P.agly抗体处理的鼠肿瘤中体内1GF-1R表达的免疫印迹(Western印迹)分析。
[0189] 图29：由原发人结肠肿瘤生成的肿瘤中M13-C06.G4.P.agly的体内抗肿瘤活性。
[0190] 图30：由乳腺癌(MCF-7)细胞生成的肿瘤中M13-C06.G4.P.agly的体内抗肿瘤活性。
[0191] 图31：M13-C06抗体体外不显示ADCC活性。
[0192] 图32：抗体M13-C06、M14-C03、M14-G11和IR3对人IGF-1His结合生物素化hIGF-1R-Fc的抑制。
[0193] 图33：抗体M13-C06、M14-C03、M14-G11、P1E2和IR3对人IGF-2His结合生物素化hIGF-1R-Fc的抑制。
[0194] 图34：ELISA分析来检测人IGF-1His与生物素化hIGF-1R的结合。人IGF-1His在PBST(圆圈)和含有2μM M13-C06的PBST(方块)中连续稀释。
[0195] 图35：突变影响M13-C06与hIGF-1R-Fc结合的残基被图示至同源IR胞外结构域的结构。IGF-1R氨基酸残基415、427、468、478和532的突变对于M13-C06抗体结合具有无法检测的影响。IGF-1R氨基酸残466、467、533、564和565的突变对于M13-C06抗体结合具有微弱不利影响。IGF-1R氨基酸残基459、460、461、462、464、482、483、490、570和571的突变对于M13-C06抗体结合具有强烈不利影响。参见表20编辑的突变分析结果。
[0196] 图36：突变影响M14-G11与hIGF-1R-Fc结合的残基被图示至人IGF-1R的前三个胞外结构域的结构。IGF-1R氨基酸残基28、227、237、285、286、301、327和412的突变对于M14-G11抗体结合具有无法检测的影响。IGF-1R氨基酸残基257、259、260、263和265的突变对于M14-G11抗体结合具有微弱不利影响。IGF-1R氨基酸残基254的突变对于M14-G11抗体结合具有中等不利影响。IGF-1R氨基酸残基248和250的突变对于M14-G11抗体结合具有强烈不利影响。参见表20编辑的突变分析结果。
[0197] 图37：突变影响IR3和P1E2与hIGF-1R-Fc结合的残基被图示至人IGF-1R的前三个胞外结构域的结构。IGF-1R氨基酸残基28、227、237、250、259、260、264、285、286、306和412的突变对于抗体结合具有无法检测的影响。IGF-1R氨基酸残基257、263、301、303、308、327和389的突变对于抗体结合具有微弱不利影响。IGF-1R氨基酸残基248和254的突变对于M14-G11抗体结合具有中等不利影响。IGF-1R氨基酸残基265的突变对于抗体结合具有强烈不利影响。参见表20编辑的突变分析结果。
[0198] 图38：示出在无血清的条件下通过联合不同IGF-1R表位的抗体靶向而增强抑制由IGF-1/IGF-2刺激的BXPC3(胰腺癌细胞系)细胞生长。
[0199] 图39：示出和在相同对于抗体浓度处单独使用抗体观察到的情况相比，在500nM至5nM之间的浓度处联合等摩尔量的M13.C06.G4.P.agly(C06)和M14.G11.
G4.P.agly(G11)抗体导致明显增强抑制BXPC3细胞生长。
[0200] 图40：示出在存在10％胎牛血清的标准细胞培养条件下生长的H322M中观察到的效果的例子，其中和单独抗体相比，由于C06/G11抗体而导致明显更强地抑制细胞生长。
[0201] 图41A和B：示出M13-C06和埃罗替尼单独和联合对于NSCLC细胞生长的影响。
[0202] 图42：示出M13-C06和埃罗替尼单独和联合对于胰腺癌细胞生长的影响。
[0203] 图43：示出M13-C06和埃罗替尼单独和联合对于结肠癌细胞生长的影响。
[0204] 图44：示出M13-C06和埃罗替尼单独和联合在NSCLC细胞系中对于AKT和MAPK信号转导的影响。
[0205] 图45A和B：示出在弥散的A549肺肿瘤模型中M13-C06作为单一制剂介导抗肿瘤活性(A)和增强Tarceva的抗肿瘤活性(B)。
[0206] 图46A和B：示出M13-C06和雷帕霉素单独和联合对于NSCLC细胞生长的影响。
[0207] 图47：示出M13-C06和雷帕霉素单独和联合对于胰腺癌细胞生长的影响。
[0208] 图48：示出M13-C06和雷帕霉素单独和联合对于结肠癌细胞生长的影响。
[0209] 图49：示出M13-C06和雷帕霉素单独和联合对于肉瘤细胞生长的影响。
[0210] 图50：示出M13-C06和雷帕霉素单独和联合在NSCLC细胞系中对于AKT和S6K信号转导的影响。
[0211] 图51：示出M13-C06和雷帕霉素单独和联合在肉瘤系中对于AKT和S6K信号转导的影响。
[0212] 图52：示出在SK-ES-1肉瘤模型中M13-C06作为单一制剂抑制肿瘤生长。
[0213] 图53A和B：示出M13-C06和PD0325901单独和联合对于NSCLC细胞生长的影响。
[0214] 图54：示出M13-C06和PD0325901单独和联合对于胰腺癌细胞生长的影响。
[0215] 图55：示出M13-C06和PD0325901单独和联合对于结肠癌细胞生长的影响。
[0216] 图56A和B：示出M13-C06和PI-103单独和联合对于NSCLC细胞生长的影响。
[0217] 图57：示出M13-C06和PI-103单独和联合对于胰腺癌细胞生长的影响。
[0218] 图58：示出M13-C06和PI-103单独和联合对于结肠癌细胞生长的影响。
[0219] 图59：示出M13-C06和索拉非尼单独和联合对于两种肝细胞癌细胞系生长的影响。

具体实施方式

[0220] 下列申请通过引用的方式全部并入本文中：美国临时专利申请No.60/786,347(2006年3月28日提交)；美国临时专利申请No.60/876,554(2006年12月
22日提交)；美国专利申请No.11/727,887(2007年3月28日提交)；美国临时专利申请No.60/968,540(2007年8月28日提交)；美国专利申请No.12/200,766(2008年8月28日提交)；美国临时专利申请No.61/071,087(2008年4月11日提交)；国际PCT公开No.WO
2007/126876(PCT/US2007/007664；2007年3月28日提交；2007年11月8日公开)和国际PCT公开No.WO 2009/032145(PCT/US2008/010176；2008年8月28日提交；2009年3月12日公开)。
[0221] 本发明涉及联合治疗，特别是涉及通过联合使用两种或多种治疗剂来治疗过度增殖病症(例如癌症)。特别地，本发明涉及联合结合IGF-1R的抗体和其它治疗剂以减轻或消除细胞生长和增殖、致癌作用、肿瘤发生和/或转移性病灶。当和使用单一制剂治疗的效果比较时，本发明的联合治疗可在治疗癌症和减轻细胞过度增殖、致癌作用、肿瘤发生和/或转移性病灶中具有协同效果。本发明的联合包括联合结合IGF-1R的抗体(或其片段)和任何治疗上用于治疗过度增殖疾病或病症的另外的制剂，而无论所述另外的制剂是否具有抗过度增殖活性。例如，在另外的制剂不具有任何抗癌活性的情况下，联合IGF-1R抗体的另外的制剂可用于通过减轻或缓解征兆来治疗癌症。因此，本发明的联合包括提供IGF-1R抗体(或其片段)和另外的一种或多种制剂，其中所述另外的一种或多种制剂通过有益于被治疗的受试者的活性而支持癌症的治疗，尽管这种活性可能不是抗过度增殖的。例子是联合具有抗过度增殖活性的IGF-1R抗体(或其片段)和促红细胞生成素(EPO)，所述促红细胞生成素刺激血红细胞产生，但是其借助于其抗贫血活性而在癌症治疗中是有益的。
[0222] 联合IGF-1R抗体(或其片段)的另外的制剂也不限于在本说明书中特定或一般鉴定的具体药物、化合物、化学品或分子中的任一种。当然，可以在治疗上用于治疗过度增殖疾病或病症的任何另外的药物、化合物、化学品或分子都可以联合IGF-1R抗体(或其片段)以起到所述疾病或病症的治疗效果。因此，在本说明书中特定或一般鉴定的所有药物、化合物、化学品和分子都仅仅是以提供例子的方式来鉴定，无论如何并不意欲以任何方式限制本发明的联合。另外，本发明的实施方案包括联合可以用于治疗过度增殖疾病或病症的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和任何更多数量的另外的制剂(例如10-20、20-100、100-1000、1000-1000000、或多于1,000,000的范围内的任何数量的另外的制剂)。
[0223] 可以联合IGF-1R抗体(或其片段)使用的化疗化合物的一些特定例子包括但不限于：
[0224]
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232] 除了上述示出和本文中讨论的例子，还认识到将继续开发另外的化学治疗剂(和本文中引用的例子相比，其和相同的细胞靶相互作用，也和新的和不同的细胞靶相互作用)。因此，还涵盖将来开发的另外的化学治疗剂，所述另外的化学治疗剂可联合IGF-1R抗体以用于治疗过度增殖病症。
[0233] 本领域普通技术人员认识到存在许多关于可联合使用IGF-1R抗体(或其片段)来治疗过度增殖疾病和病症的化合物的信息来源。这些参考文献的一些例子包括但不限于：
[0234] ●2008 PHYSICIANS′DESK REFERENCE (PDR)(ISBN-101563636603)；
[0235] ●Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence Evaluations，[0236] (a.k.a.″The Orange Book″)28th Edition，U.S.Dept.of Health and Human Services，Food and Drug Administration，Center for Drug Evaluation and Research，Office of Pharmaceutical Science，Office of Generic Drugs；
[0237] ● Electronic Orange Book Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence Evaluations，available on the World Wide Web(Internet)at：www.fda.gov/cder/ob/；和
[0238] ● Biopharmaceutical Products in the U.S.and Eu ropean Markets，6th Edition，by Ronald A.Rader，BioPlan Associates，Inc.，2volumes，1602 pages，September 2007(ISBN：2 vol.set：978-1-934106-04-4(之前格式1-934106-04-6))。
[0239] 上述引用的资源通过引用的方式并入本文中。
[0240] I.定义
[0241] 应当注意术语“一个”或“一种”实体指一个或多个该种实体；例如，“一种IGF-1R抗体”应理解为代表一个或多个IGF-1R抗体。因此，术语“一个”(或“一种”)，“一个或多个”以及“至少一个”在本文中可进行互换。
[0242] 本文中所用的术语“制剂”(如使用的，例如参考和一种或多种抗-IGF-1R抗体联合的“治疗”、“抗过度增殖”或“抗癌”制剂)包括任何治疗上有用的化合物；例如但不限于小分子(例如小有机分子)、大分子(例如有机聚合物)和所有种类和类型的生物大分子(例如蛋白、核酸、碳水化合物、脂质)。
[0243] 本文中所用的术语“多肽”意欲同时包括了单数和复数的“多肽”，并指由酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)所构成的一种分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任何链，且不指定产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”或任何其它用来指代两个或多个氨基酸链的术语都包含在“多肽”的定义之内，且术语“多肽”可用来取代任何上述术语或与之互换。术语“多肽”还意欲指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，或通过非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可衍生自天然的生物来源或通过重组技术生产，但不一定需要转译自指定的核酸序列。它可通过任何方式生成，包括化学合成。
[0244] 本发明的多肽的大小可约为3个或更多，5个或更多，10个或更多，20个或更多，25个或更多，50个或更多，75个或更多，100个或更多，200个或更多，500个或更多，1000个或更多，或者2000个或更多的氨基酸。多肽可具有一种指定的三维结构，但并非必须具有该种结构。具有指定三维结构的多肽被称为折叠结构，而不具有指定三维结构、但可采用多种构型的多肽被称为未折叠结构。本文中所用的术语糖蛋白指一种至少与一个碳水化合物部分连接的蛋白，该碳水化合物部分通过一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基)的含氧或含氮侧链与蛋白连接。
[0245] “分离的”多肽或其片段，变体或衍生物指一种不存在于其天然环境中的多肽。不要求达到特定的纯化水平。例如，一种分离的多肽可取自其自然的或天然的环境中。在宿主细胞中表达的重组生产的多肽和蛋白被认为对于本发明的目的而言是分离的，因为它们是通过任何合适的技术分离、分割、或者部分或充分纯化的天然或重组多肽。
[0246] 本文中所用的术语“衍生自”指定蛋白是指多肽的来源。在一个实施方案中，衍生自特定起始多肽的多肽或氨基酸序列是可变区序列(例如VH或VL)或其相关序列(例如CDR或框架区)。在一个实施方案中，衍生自特定起始多肽的氨基酸序列不是连续的。例如，在一个实施方案中，一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR衍生自起始抗体。在一个实施方案中，衍生自特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列所具有的氨基酸序列和所述起始序列或其部分基本上一致，其中所述部分由下列构成：至少3-5氨基酸、5-10个氨基酸、至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸、或至少30-50个氨基酸、或本领域普通技术人员鉴别为具有在起始序列中的来源的。
[0247] 本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任意组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”在涉及本发明的IGF-1R抗体或抗体多肽时包括任何至少保留了相应天然抗体或多肽的部分抗原结合性能的多肽。除在本发明其它地方讨论的特定抗体片段之外，本发明的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的IGF-1R抗体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，还包括具有由氨基酸替换、缺失或插入所得的变更氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或是非天然存在的。非天然存在的变体可通过本领域已知的突变技术进行制备。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸替换、缺失或添加。本发明的IGF-1R抗体和抗体多肽的衍生物为经过变更后可显示出未在天然多肽上发现的附加特性的多肽。其例子包括融合蛋白。变体多肽在本文中也可称为“多肽类似物”。本文中所用的IGF-1R抗体或抗体多肽“衍生物”指具有经过功能性侧基团反应化学衍生得到的一个或多个残基的主体多肽。“衍生物”还包括包含了二十个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可替换脯氨酸；5-羟基赖氨酸可替换赖氨酸；3-甲基组氨酸可替换组氨酸；高丝氨酸可替换丝氨酸；以及鸟氨酸可替换赖氨酸。
[0248] 术语“多聚核苷酸”意欲包括单数或复数的核酸，并指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多聚核苷酸可包括常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如于肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。术语“核酸”指在多聚核苷酸中存在的任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多聚核苷酸指从其天然环境中分离的核酸分子、DNA或RNA。例如，包含在载体中的编码IGF-1R抗体的重组多聚核苷酸被认为对于本发明的目的而言是分离的。分离的多聚核苷酸的进一步例子包括存在于外源宿主细胞中的重组多聚核苷酸或在溶液中(部分或完全)纯化的多聚核苷酸。分离的RNA分子包括对本发明多聚核苷酸的体内或体外RNA转录物。本发明包括的分离的多聚核苷酸或核酸进一步包括合成制备的该种分子。此外，多聚核苷酸或核酸可以是启动子、核糖体结合位点或转录终止子等调节元件或是包含该种调节元件。
[0249] 本文中所用的“编码区”指由转译氨基酸的密码子组成的一部分核酸。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，它仍可被认为是编码区域的一部分，但如启动子、核糖体结合位点、转录终止子等侧翼序列不是编码区域的一部分。本发明的两个或多个编码序列可存在于一个单独的多聚核苷酸构建体(例如单独的载体)中或分离的多聚核苷酸构建体(例如分离的(不同)载体)中。此外，任何载体可包含一个单独的编码区或包含两个或多个编码区，例如，单独载体可分别编码免疫球蛋白的重链可变区和免疫球蛋白的轻链可变区。此外，本发明的载体、多聚核苷酸或核酸可编码与编码IGF-1R抗体或其片段、变体或衍生物的核酸融合或未融合的外源编码区域。外源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌腺信号肽或外源功能性区域。
[0250] 在某些实施方案中，该多聚核苷酸或核酸为DNA。当为DNA时，包含编码多肽的核酸的多聚核苷酸通常可包括与一个或多个编码区域可操作连接的启动子和/或其它转录或转译控制元件。可操作的连接指当某种基因产物(例如多肽)的编码区域与一个或多个调节序列以特定方式连接时，基因产物的表达受到调节序列的影响或控制。如果启动子功能的诱导可使mRNA的转录编码靶基因产物，并且如果两个DNA片段之间的接头的性质不干扰表达调节序列引导基因产物表达的能力或干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(例如多肽编码区域和与之连接的启动子)被“可操作地连接”。因此，如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录，则该启动子区域将被可操作地连接至该核酸。该启动子可以是仅能在预定细胞中引导DNA的充分转录的细胞特异性启动子。除启动子外的其它转录控制元件，如增强子、操作子、阻遏子以及转录终止信号可与多聚核苷酸进行可操作连接以引导细胞特异性转录。本文中披露了合适的启动子和其它转录控制区。
[0251] 各种转录控制区域已为本领域技术人员所熟知。其包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区域，例如但不限于来自细胞巨化病毒的启动子和增强子片段(立即早期启动子，与内含子-A相连接)、猿病毒40(早期启动子)以及逆转录酶病毒(例如禽劳斯肉瘤病毒)。其它的转录控制区域包括衍生自肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白的脊椎动物基因的区域以及其它能够在真核细胞中控制基因表达的序列。其它合适的转录控制区域包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子-诱导型启动子(例如受干扰素或白介素诱导的启动子)。
[0252] 类似地，各种转译控制元件已为本领域普通技术人员所熟知。其包括但不限于核糖体结合位点、转译启动和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或是IRES，也被称为CITE序列)。
[0253] 在其它的实施方案中，本发明的多聚核苷酸为RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式存在。
[0254] 本发明包括的多聚核苷酸和核酸编码区可与编码分泌腺或信号肽的附加编码区(引导本发明的多聚核苷酸编码的多肽的分泌)相连接。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌型前导序列，后者在生长蛋白链向粗面内质网的输出被启动时从成熟蛋白上被裂解。本领域普通技术人员均了解由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合到多肽N末端的信号肽，它从完整或“全长”多肽序列裂解以生产分泌或“成熟”型多肽。在某些实施方案中采用了如免疫球蛋白重链或轻链信号肽等天然信号肽，或保留了引导与之可操作连接的多肽分泌能力的该序列的功能性衍生物。可选择地，还可以使用外源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织型纤溶酶原激活剂(TPA)或鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列替换。
[0255] 本发明包括某些IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非另外指明为天然存在的抗体等全长抗体，术语“IGF-1R抗体”包含全长抗体以及该种抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如，天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或工程改造的抗体分子或以与抗体分子类似方式结合抗原的片段。
[0256] 术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以替换使用。抗体或免疫球蛋白至少包含重链的可变区，并通常至少包含重链和轻链的可变区。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构已得到较为充分的了解。例如参见Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)。
[0257] 如将在下文具体讨论的那样，术语“免疫球蛋白”包含可以以生化方式区分的多种大类的多肽。本领域的技术人员均了解重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。由该链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白小类(同型)如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等均得到了很好的区分并赋予了功能定位。熟练的技术人员能够轻易辫别这些类别和同型的各修饰型，且它们均在本发明的范围之内。本发明范围内的所有免疫球蛋白类别均非常明确，且下述讨论将一般指向免疫球蛋白分子的IgG分类。对于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含了两个相同的分子量约为23,000道尔顿的轻链多肽、以及两个相同的分子量为53,000-70,000的重链多肽。这四条链通常通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链自“Y”的嘴部支持重链并持续至可变区域。
[0258] 轻链被分类为kappa或lambda(κ、λ)。各重链分类均能与kappa或lambda轻链的任意一种相结合。一般而言，轻链和重链彼此共价连接，而两条重链的“尾”部以二硫键彼此共价连接或当免疫球蛋白产自杂交瘤时，B细胞或遗传工程改造的宿主细胞彼此非共价连接。在重链中，氨基酸序列自Y构型叉端的N末端延续至各链底部的C末端。
[0259] 轻链和重链均被划分为具有结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”具有功能性含义。就此而言，将意识到轻(VL)和重(VH)链区的可变区决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区则赋予了重要的生物功能，例如分泌、经胎盘活动性、Fc受体结合、补体结合等。根据惯例随恒定区域越为远离抗体的抗原结合位点或氨基酸末端，其数量有所上升。N末端区为可变区而C末端区为恒定区；CH3和CL区实际分别包含了重链和轻链的羧基末端。
[0260] 如上文指出，可变区允许抗体选择性识别特异性结合抗原上的表位。即，抗体的VL区和VH区、或决定簇互补区(CDR)的亚群结合形成定义三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成了存在于各个Y臂末端的抗原结合位点。更具体而言，该抗原结合位点可通过各VH和VL链上的三个CDR定义。在一些情况下，例如对于源自骆驼类或基于骆驼类免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可能仅由重链组成，而不含轻链。例如参见Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993)。
[0261] 在自然存在的抗体中，各抗原结合区的六个“决定簇互补区”或“CDR”是当抗体在水环境中呈现三维构型时经特别定位形成抗原结合域的非相邻的短序列。抗原结合域的剩余氨基酸称为“框架”区，显示了较低的分子间可变性。框架区大体呈β-折叠构型，而CDR形成与β-折叠结构连接(在某些情况下形成其部分)的环形。因此，框架区通过链间非共价相互作用形成了支持CDR以正确方向定位的支架。由定位CDR形成的抗原结合域定义了免疫反应性抗原上的表位补体。该互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。由于已有明确的描述，本领域的普通技术人员可简单地在任何给定重或轻链可变区鉴别该种分别包含了CDR和框架区的氨基酸(参见″Sequences of Proteins of Immunological Interest，″Kabat，E.，et al.，U.S.Department of Health and Human Services，(1983)；和Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)，其以引用的方式全部并入本文中)。
[0262] 当一个术语有两个或更多地定义为本领域所使用和/或接受时，除非另外指明，此处所用的术语定义意欲包括所有该种含义。具体的例子为使用术语“决定簇互补区”(“CDR”)描述重链和轻链多肽的可变区范围内均发现的非邻近抗原结合位点。该特定区域的描述参见Kabat et al.，U.S.Dept.of Health and Human Services，″Sequences of Proteins of Immunological Interest″(1983)和Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)，其以引用的方式并入本文中，其中该定义在彼此进行比较时包括氨基酸残基的重叠或亚群。然而，抗体或其变体的CDR的任意定义的采用均意在落入此处所定义和使用的术语的范围之内。下文表I中列举了包含分别由上述引用的参考文献定义的CDR的适当氨基酸残基以供比较。包含特定CDR的确切残基数将随着该CDR的序列和大小而变化。
本领域技术人员可在给定抗体可变区氨基酸序列的情况下确定包含特定CDR的残基。
[0263] 表1.CDR定义1
[0264]Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
[0265] 1表1中所有CDR定义的编号均参照Kabat等人(参见下文)。
[0266] Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列编号系统。本领域普通技术人员可毫无疑义地将该“Kabat编号”系统指定给任意可变域序列，且无需依赖该序列本身以外的任何实验数据。本文中所用的“Kabat编号”指由Kabat et al.，U.S.Dept.of Health and Human Services，″Sequence of Proteins of Immunological Interest″(1983)提出的编号系统。除非另外指明，对本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的特定氨基酸残基位置的编号均参照Kabat编号系统。
[0267] 在骆驼类物种中，该重链可变区(称为VHH)形成了完整的抗原结合区。骆驼类VHH可变区和来自常规抗体(VH)的可变区的主要区别包括(a)与VHH中的相应区域相比，VH的轻链接触表面中具有更多的疏水氨基酸，(b)VHH中具有更长的CDR3，以及(c)VHH中的CDR1和CDR3之间二硫键出现的频率。
[0268] 本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人类的、人源化的、灵长动物源化的或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段(如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fvs)、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接Fvs(sdFv)、包含VL或VH区的片段、由Fab表达库制备的片段、以及抗独特型(抗Id)抗体(例如包括本文中披露的IGF-1R抗体的抗Id抗体)。ScFv分子已为本领域所知，其描述参见美国专利5,892,019。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何形式(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或小类。
[0269] 包括单链抗体在内的抗体片段可以仅单独包含可变区，或是包含铰链区、CH1、CH2和CH3区的全部或部分。本发明的实施方案还包括了同样包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3区任意组合的抗原结合片段。本发明的抗体或其免疫特异性片段可来自包括禽类和哺乳动物的任何动物来源。该抗体优选人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、羊驼、马或鸡抗体。在另一个实施方案中，可变区可来自不同的来源(例如来自鲨鱼)。本文中所述的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体、以及包括从人免疫球蛋白库或从表达一种或多种人免疫球蛋白且不表达内源免疫球蛋白的转基因动物分离的抗体，如下文描述，并可参见Kucherlapati et al 的美国专利No.5,939,598。
[0270] 本文中所用的术语“重链部分”包括来自于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽至少包含CH1区、铰链区(例如上、中和/或下铰链区)、CH2区、CH3区、或其变体或片段之一。例如，本发明中采用的结合多肽可以包括含有CH1区的多肽链；含有CH1区，至少铰链区的一部分，以及CH2区的多肽链；含有CH1区和CH3区的多肽链；含有CH1区，至少铰链区的一部分，以及CH3区的多肽链，或含有CH1区，至少铰链区的一部分，CH2区以及CH3区的多肽链。在另一个实施方案中，本发明的多肽包括含有CH3区的多肽链。本发明中所采用的结合多肽可进一步至少缺失CH2区的一部分(例如CH2区的全部或部分)。如上所述，本领域的普通技术人员应当可以理解这些区域(例如重链部分)可以进行修饰从而不同于天然存在的免疫球蛋白分子中的氨基酸序列。
[0271] 本文中所披露的某些IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链中的重链部分与该多聚体的其它多肽链的重链部分相同。可选择地，本发明中含重链部分的单体并不相同。例如，各单体可包含不同的靶结合位点，形成(例如)双特异性抗体产物。
[0272] 本文中披露的用于诊断和治疗方法的结合多肽的重链部分可来自于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含了来自IgG1分子的CH1和来自IgG3分子的铰链区。在另外的例子中，重链部分可包含部分来自于IgG1分子及部分来自于IgG3分子的铰链区。在另外的例子中，重链部分可包含部分来自于IgG1分子及部分来自于IgG4分子的嵌合铰链。
[0273] 本文中所用的术语“轻链部分”包括来自于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。该轻链部分优选至少包含VL或CL区之一。
[0274] 本文中披露的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可通过抗原的表位或部分(例如可被它们识别或特异结合的靶多肽(IGF-1R))进行描述或说明。靶多肽中与抗体的抗原结合区特异性相互作用的部分为“表位”或“抗原决定簇”。根据抗原的大小、构型和类型，靶多肽可能包含单个表位，但通常包含至少两个表位，并可能包含任意数量的表位。另外，应当注意靶多肽上的“表位”可以是非多肽元件或包括非多肽元件，例如，“表位”可包括碳水化合物侧链。
[0275] 抗体的肽或多肽表位的最小大小约为4-5个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至少七个氨基酸，更优选至少包含九个氨基酸，最优选包含约15至约30个氨基酸。由于CDR可在其三级形态识别抗原性肽或多肽，因此包含表位的氨基酸不需要相邻，并且在某些情况下，甚至不需要在同一肽链上。在本发明包括的实施方案中，由本发明的IGF-1R抗体识别的肽或多肽表位包含IGF-1R的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选至少8个、至少9个、至少10、至少15个、至少20个、至少25个、或是约15至约30个邻近或非邻近的氨基酸的序列。
[0276] “特异性结合”通常指抗体通过其抗原结合域与表位结合，且该种结合需要抗原结合域和表位之间的补体。根据该定义，当抗体通过其抗原结合域与表位的结合比它与任意不相关的表位的结合更为容易时，则称该抗体“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本文中用于限定某些抗体与某些表位结合的相对亲和力。例如，抗体“A”可被认为比抗体“B ”对给定表位具有更高的特异性，或是可认为抗体“A”与表位“C”的结合比其与相关表位“D”的结合具有更高的特异性。
[0277] “优先结合”指抗体与表位的特异性结合比它与相关的、相似的、同源的或是类似的表位的结合更为容易。因此，与给定表位“优先结合”的抗体与该表位的结合比与相关的表位更为容易，即使该种抗体可能与该相关表位交叉反应。
[0278] 通过非限定例子，如抗体与第一表位结合的解离常数(KD)小于该抗体对第二表位的KD，则认为该抗体优先结合该第一抗体。在另一非限定例子中，如抗体与第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的KD小一个数量级，则认为该抗体优先结合该第一抗体。在另一非限定例子中，如抗体与第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的KD小两个数量级，则认为该抗体优先结合该第一表位。
[0279] 在另一非限定例子中，如抗体与第一表位结合的解离速率(k(off))小于该抗体对第二表位的(k(off))，则认为该抗体优先结合该第一表位。在另一非限定例子中，如抗体与第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的(k(off))小一个数量级，则认为该抗体优先结合该第一表位。在另一非限定例子中，如抗体与第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的(k(off))小两个数量级，则认为该抗体优先结合该第一表位。
[0280] 本文中披露的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可认为与本文中披露的靶多肽-2 -1 -2 -1 -3 -1 -3 -1或其片段或变体结合的解离速率小于或等于5X10 sec 、10 sec 、5X10 sec 或10 sec 。
本文中包括的抗体更优选可认为与本文中披露的靶多肽或其片段或变体结合的解离速率-4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1 -7 -1
小于或等于5X10 sec 、10 sec 、5X10 sec 或10 sec 、5X10 sec 、10 sec 、5X10 sec-7 -1
或10 sec 。
[0281] 本文中披露的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可认为与本文中披露的靶多肽3 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1
或其片段或变体结合的结合速率(k(on))大于或等于10M sec 、5X10M sec 、10M sec
4 -1 -1
或5X10M sec 。本发明包括的抗体更优选可认为与本文中披露的靶多肽或其片段或变体
5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1 6 -1 -1
结合的结合速率(k(on))大于或等于10M sec 、5X10M sec 、10M sec 或5X10M sec
7 -1 -1
或10M sec 。
[0282] 如果抗体以一定程度阻断参考抗体与特定表位结合的方式与该表位优先结合，则认为该抗体竞争性地抑制该参考抗体与该表位的结合。竞争性抑制可通过竞争ELISA分析等任何本领域已知的方法进行测定。当抗体对参考抗体与给定表位的结合的抑制为至少90％、至少80％、至少70、至少60％或至少50％时，则认为该抗体竞争性地抑制该参考抗体与该表位的结合。
[0283] 本文中所用的术语“亲和性”指个体表位与免疫球蛋白分子的CDR结合强度的量度。例如参见Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)，页码27-28。本文中所用的术语“亲和力”指一组免疫球蛋白和抗原的复合物的整体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度。例如参见Harlow，第29-34页。亲和力既与该组中的个体免疫球蛋白分子与特定表位的亲和性相关，也与该免疫球蛋白和该抗原的化合价相关。例如，二价单克隆抗体与聚合体等具有过度重复表位结构的抗原的相互作用将具有较高的亲和力。
[0284] 本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物同样可根据它们的交叉反应性进行描述或说明。本文中所用的术语“交叉反应性”指对某种抗原特异的抗体与第二抗原反应的能力；两种不同的抗原性物质之间相关性的衡量。因此，当抗体能与未包含在其构成中的表位结合时该抗体具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含有与诱导表位相同的多个互补结构特征，在某些情况下可能比原始表位更为匹配。
[0285] 例如，某些抗体具有一定程度地交叉反应性，因此它们可以结合相关但并不相同的表位，例如，与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％的一致性(通过本领域已知的并在此处描述的方法进行计算)的表位。如果抗体不结合与参考表位具有小于95％、小于90％、小于
85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％的一致性(通过本领域已知的并在此处描述的方法进行计算)的表位，则认为该抗体不具有或具有极小的交叉反应性。如果抗体不与某种表位的任何其它类似物、直系同源物或同源物相结合，则可认为该抗体对该表位具有“过度特异性”。
[0286] 本发明包括的IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物同样可根据它们与-2靶多肽的结合亲和性进行描述或说明。优选结合亲和性包括解离常数或Kd小于5x10 M、-2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-14 -14 -15 -15
5x10 M、10 M、5x10 M或10 M的亲和性。
[0287] 本发明包括的IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以具有“多特异性”，例如双特异性、三特异性或更大的多特异性，这意味着它可同时识别和结合在一个或多个不同的抗原(例如蛋白)上的两个或多个不同的表位。因此，IGF-1R抗体为“单特异性”或“多特异性”(例如“双特异性”)指结合多肽反应的不同表位的数量。多特异性抗体可对本文中所述的靶多肽的不同表位具有特异性，或可能对靶多肽和外源表位(如外源多肽或固相支持材料)具有特异性。
[0288] 本文中所用的术语“化合价”指IGF-1R抗体、结合多肽或抗体中的潜在结合区(例如抗原结合区)的数量。每个结合区特异性结合一个表位。当IGF-1R抗体、结合多肽或抗体包含了超过一个结合区时，对于带有两个结合区且各结合区可特异性结合相同的表位，称为“双价单特异性”，对于带有两个结合区且各结合区特异性结合不同表位，称为“双价双特异性”。抗体对每一种特异性也可以是双特异性和双价的(称为“双特异性四价抗体”)。在另一个实施方案中，可制备缺失四价微抗体或区域的抗体。
[0289] 双特异性二价抗体及其制备方法可参见(例如)美国专利No.5,731,168；5,807,706；5,821,333；和美国申请公开No.2003/020734和2002/0155537，其通过引用的方式全部并入本文中。双特异性四价抗体及其制备方法的描述可参见(例如)
WO 02/096948和WO 00/44788，其公开通过引用的方式并入本文中。一般参见PCT公开WO93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt et al.，J.Immunol.147：
60-69(1991)；美国专利No.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；
Kostelny et al.，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
[0290] 如前文所述，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型已众所周知。本文中所用的术语“VH区”包含了免疫球蛋白重链的氨基末端可变区，而术语“CH1区”包含了免疫蛋白重链的第一(大多数为氨基末端)恒定区。该CH1区邻近VH区，并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
[0291] 本文中所用的术语“CH2区”包含重链分子的一部分，例如采用常规编号方案时从抗体的约残基244至残基360(Kabat编号系统中为残基244至360；EU编号系统中为残基231-340；参见Kabat EA et al.op.cit)。CH2区的独特之处在于它不与其它区域紧密配对。但有两条N末端连接的分支碳水化合物链插入完整的自然IgG分子的两个CH2区域之间。另有记录显示CH3区由CH2区延伸至IgG分子的C末端并包含约108个残基。
[0292] 本文中所用的术语“铰链区”包含将CH1区连接至CH2区的重链分子部分。该铰链区包含了约25个残基并且是柔性的，从而使得两个N末端抗原结合区可以独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的区域：上、中、下铰链区(Roux et al.，J.Immunol.61：
4083(1998))。
[0293] 本文中所用的术语“二硫键”包括两个硫分子间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含能与第二硫醇基团形成二硫键或桥的硫醇基团。在多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，且两条重链在Kabat编号系统的239和242位置(EU编号系统的226或229位置)通过二硫键相连接。
[0294] 本文中所用的术语“嵌合抗体”将用于指代任何免疫反应性区域或位点来自于一个种类而(根据本发明为完整的、部分的或修饰的)恒定区来自于另一种类的抗体。在优选实施方案中，该靶结合区域或位点来自于非人类来源(例如鼠或灵长动物)而恒定区来自人类。
[0295] 本文中所用的术语“工程抗体”指重链和轻链中的一个或全部可变区通过被来自已知特异性的抗体的一个或多个CDR至少部分替换，或在需要时通过部分框架区替换和序列更改所修饰得到抗体。尽管CDR可来自于与获得该框架区的抗体相同的类别或小类，但是应考虑来自于不同类别抗体的CDR，并优先考虑来自于不同种类抗体的CDR。将一个或多个来自于已知特异性的非人类抗体的“供体”CDR嫁接至人重链或轻链框架区的工程抗体在此称为“人源化抗体”。无需将来自供体可变区的完整CDR替换所有的CDR以将一个可变区的抗原结合能力转换至另一个。事实上仅需要转移那些维持该目标结合位点活性所必需的残基。通过美国专利No.5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370等所给出的解释，本领域的技术人员应当能够通过常规试验或试错法试验获取功能性的工程或人源化抗体。
[0296] 本文中所用的术语“正确折叠的多肽”包括所有由多肽组成的功能区均具有明显活性的多肽(例如IGF-1R抗体)。本文中所用的“不正确折叠的多肽”包括至少一个多肽功能区没有活性的多肽。在一个实施方案中，正确折叠的多肽包含至少由一个二硫键连接的多肽链，不正确折叠的多肽包含未经至少一个二硫键连接的多肽链。
[0297] 本文中所用的术语“工程改造的”包括通过人工方法(例如，通过重组技术、体外肽合成、肽的酶催化或化学偶合或这些技术的组合)处理核酸或多肽分子。
[0298] 本文中所用的术语“连接的”、“融合的”或“融合”可相互替换。这些术语指通过化学连接或重组技术等任何方法连接两个或多个元件或成分。“框内融合”指以能够维持原始开放阅读框架(ORF)的正确翻译阅读框的方式连接两个或多个多聚核苷酸ORF以形成更长的连续ORF。因此，重组融合蛋白是含有两个或更多与原始ORF所编码的多肽相应的片段的单独蛋白(该片段一般在天然状态下不进行该种连接)。尽管该阅读框架在融合片段中彼此连续，但是该片段可被框内接头序列等序列物理或空间分隔。例如，编码免疫球蛋白可变区CDR的多聚核苷酸可框内融合，但只要该“融合的”CDR被共转译为连续多肽的一部分，它可被编码至少一个免疫球蛋白框架区或附加CDR区的多聚核苷酸所分隔。
[0299] 在有关多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”指多肽中的由氨基向羧基末端方向排列的氨基酸，其中序列内彼此相邻的残基在多肽的一级结构内邻近。
[0300] 本文中所用的术语“表达”指基因生产RNA或多肽等生化物质的通过过程。该过程包括该基因的功能存在的任何显现，包括但不限于基因阻抑以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于将基因转录为信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物、以及将mRNA翻译为多肽。如果该最终产物是生化产物，则表达包括该种生化产物和任何前体的生成。基因的表达产生了“基因产物”。本文中所用的基因产物既可以是核酸(例如由基因转录生成的信使RNA)，也可以是通过转录物翻译得到的多肽。本文中所述的基因产物还包括经过转录后修饰(例如多聚腺苷酸化)的核酸，或是经转译后修饰(例如，甲基化，糖基化，以及脂质的添加，与其它蛋白亚基的结合，蛋白水解裂解等)的多肽。
[0301] 本文中所用的术语“治疗”指治疗性或预防性措施，其目的为预防或延缓(减轻)有害的生理变化或病症，例如癌症的形成或扩散。有益或目标临床结果包括但不限于可测或不可测的症状的缓和、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻、以及(部分或完全)消除。“治疗”还指与未接受治疗的预计存活相比更长的存活时间。需要接受治疗的受试者包括已经患有疾病或病症以及容易患该疾病或病症的受试者或是需要预防该疾病或病症的受试者。
[0302] “受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需要进行诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、驯养动物、畜牧动物以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、家畜、牛等。
[0303] 本文中所用的短语如“可由结合分子的施用获益的受试者”和“需要治疗的动物”等包括了可从用于(例如)对结合分子识别的抗原的检测(例如用于诊断过程)和/或用于治疗(即通过特异性结合给定靶蛋白的结合分子对癌症等疾病的减轻或预防)的结合分子的施用受益的受试者，包括哺乳动物受试者。如本文中更具体描述，该结合分子可在与药物、前药或同位素等物质相结合或不相结合的形式下进行使用。
[0304] 本文中所用的术语“结合分子”指结合(例如特异性结合或优先结合)目标靶分子(例如抗原)的分子。在特定的实施方案中，本发明包括的结合分子是特异性或优先结合IGF-1R的至少一个表位的多肽。本发明的范围内的结合分子还包括小分子、核酸、肽、肽模拟物、树状高分子、非免疫球蛋白分子和其它特异性结合本文中所述的IGF-1R表位的分子。
[0305] 非-免疫球蛋白结合分子
[0306] 在某些实施方案中，本发明包括的结合分子是非免疫球蛋白结合分子。本文中所用的术语“非免疫球蛋白结合分子”是这样的结合分子，该结合分子的结合位点包含衍生自除了免疫球蛋白的多肽的部分(例如，支架或框架)，但是其可被工程改造(例如诱变)以赋予期望的结合特异性。
[0307] 非免疫球蛋白结合分子可包含这样的结合位点部分，所述结合位点部分衍生自不是免疫球蛋白的免疫球蛋白大家族的成员(例如，T-细胞受体或细胞粘附蛋白(例如，CTLA-4、N-CAM、端蛋白))。这样的结合分子包含这样的结合位点部分，所述结合位点部分保持免疫球蛋白的折叠构型，并且能够特异性结合IGF-1R表位。在其它的实施方案中，本发明包括的非免疫球蛋白结合分子还包含具有蛋白拓扑的结合位点，所述蛋白拓扑不是基于免疫球蛋白折叠(例如，例如锚蛋白重复蛋白或纤连蛋白)，然而其能够特异性结合靶(例如，IGF-1R表位)。
[0308] 非免疫球蛋白结合分子可以通过从具有人工多样化的结合位点的结合分子的库中选择或分离靶-结合变体来进行鉴别。多样化的库可以使用完全随机的方案(例如，错配PCR、外显子改组或定向进化)或通过本领域识别的设计策略的帮助来产生。例如，在结合位点和其同源靶分子相互作用时通常涉及的氨基酸位置可以通过插入简并密码子、三核苷酸、随机肽或在编码结合位点的核酸内的相应位置处的整个环而随机化(参见例如，美国公开No.20040132028)。氨基酸位置的定位可通过研究和靶分子复合的结合位点的晶体结构来鉴定。用于随机化的候选位置包括环、平坦表面、螺旋和结合位点的结合腔。在某些实施方案中，可能用于多样化的候选者的结合位点内的氨基酸可以通过它们和免疫球蛋白折叠的同源性来鉴定。例如，纤连蛋白的CDR样环内的残基可随机化以产生纤连蛋白结合分子的库(参见例如Koide et al.，J.Mol.Biol.，284：1141-1151(1998))。可随机化的结合位点的其它部分包括平坦表面。在随机化后，多样化的库可以进行选择或筛选工序以获得具有期望的结合特性(例如特异性结合上文所述的IGF-1R表位)的结合分子。例如可以通过本领域识别的方法(例如噬菌体展示、酵母菌展示或核糖体展示)来进行选择。
[0309] 在一个实施方案中，本发明包括的结合分子包含来自纤连蛋白结合分子的结合位点。纤连蛋白结合分子(例如，包含纤连蛋白I、II或III型结构域的分子)展示CDR样环，与免疫球蛋白相反，其不依赖链内的二硫键。FnIII环包含可进行随机突变以及靶的结合、选择和进一步突变的迭代途径的定向进化方案的区域，以开发有用的治疗工具。纤连蛋白基“可寻址的”治疗性结合分子(“FATBIM”)可被开发以特异性或优先结合本文中所述的IGF-1R表位。FATBIM包括(例如)纤连蛋白基结合分子类，其被Compound Therapeutics，Inc称为Adnectins。制备纤连蛋白结合多肽的方法例如在WO 01/64942与美国专利No.6,673,901、6,703,199、7,078,490和7,119,171中有所描述，其通过引用的方式并入本文中。
[0310] 在另一个实施方案中，本发明包括的结合分子包含来自affibody的结合位点。Affibodies衍生自金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的免疫球蛋白结合域(参见例如Nord et al.，Nat.Biotechnol.，15：772-777(1997))。用作本发明的实施方案的Affibody结合位点可通过下列步骤合成：使衍生自SPA的域(例如域B)的SPA-相关蛋白(例如蛋白Z)突变，然后选择对于IGF-1R表位具有结合亲和性的突变的SPA-相关多肽。制备affibody结合位点的其它方法在美国专利6,740,734和6,602,977以及WO 00/63243中有所描述，其均通过引用的方式并入本文中。
[0311] 在另一个实施方案中，本发明包括的结合分子包含来自anticalin的结合位点。anticalins(也称为lipocalins)是多样的β-桶蛋白家族(其功能是在它们的桶/环区域结合靶分子)成员。Lipocalin结合位点可通过使连接桶的链的环序列随机化而工程改造，以结合IGF-1R表位(参见例如Schlehuber et al.，Drug Discov.Today，10：23-33(2005)；
Beste et al.，PNAS，96：1898-1903(1999)。本发明包括的结合分子中使用的anticalin结合位点可从lipocalin家族的多肽起始而获得，所述多肽在四个链段中进行突变，所述四个链段对应于包含欧洲粉蝶的Bilin-结合蛋白(BBP)的氨基酸位置28至45、58至69、86至99和114至129的线性多肽序列的序列位置。制备anticalin结合位点的其它方法在WO99/16873和WO 05/019254中有所描述，其均通过引用的方式并入本文中。
[0312] 在另一个实施方案中，本发明包括的结合分子包含来自富半胱氨酸多肽的结合位点。本发明的实施中使用的富半胱氨酸域通常不形成α-螺旋、β-片或β-桶结构。典型地，二硫键促进域折叠成三维结构。通常，富半胱氨酸域具有至少两个二硫键，更典型具有至少三个二硫键。示例性富半胱氨酸多肽是A域蛋白。A域(有时称为“互补型重复”)含有约30-50或30-65个氨基酸。在一些实施方案中，所述结构域包含约35-45个氨基酸，在有些情况下包含约40个氨基酸。在30-50个氨基酸内有约6个半胱氨酸残基。在6个半胱氨酸中，二硫键典型地在下列半胱氨酸之间找到：C1和C3、C2和C5、C4和C6。A域构成配体结合部分。所述域的半胱氨酸残基是连接以形成紧密、稳定和功能独立的部分的二硫化物。这些重复部分的聚集构成配体结合域，并且不同的聚集可赋予相对于配体结合的特异性。含有A域的示例性蛋白包括(例如)补体成分(例如，C6、C7、C8、C9和因子I)、丝氨酸蛋白酶(例如，肠激酶、matriptase和corin)、跨膜蛋白(例如，ST7、LRP3、LRP5和LRP6)和胞吞受体(例如，选蛋白-相关受体、LDL-受体、VLDLR、LRP1、LRP2和ApoER2)。制备具有期望的结合特异性的A域蛋白的方法在(例如)WO 02/088171和WO 04/044011中有所披露，其均通过引用的方式并入本文中。
[0313] 在其它的实施方案中，本发明包括的结合分子包含来自重复蛋白的结合位点。重复蛋白是含有小(例如，约20至约40个氨基酸残基)结构单元或重复(其堆叠在一起形成连续域)的连续拷贝的蛋白。重复蛋白可通过调节蛋白中的重复数而被修饰以适应特定的靶结合位点。示例性重复蛋白包括指定的锚蛋白重复蛋白(即DARPin)(参见例如，Binz et al.，Nat.Biotechnol.，22：575-582(2004))或富亮氨酸重复蛋白(即LRRP)(参见例如，Pancer et al.，Nature，430：174-180(2004))。所有这样确定的三级结构的锚蛋白重复单元共享下列特性：由β-发夹和随后两个反向平行α-螺旋构成，并且使用使重复单元和下一者连接的环进行编码。锚蛋白重复单元的域的构造通过将重复单元堆叠成延伸和弯曲结构而形成。来自海洋七鳃鳗和其它无颌鱼类的适应性免疫系统的部分的LRRP结合位点的抗体类似，因为它们都是通过在淋巴细胞成熟过程中重组富亮氨酸重复基因的组而形成的。制备DARpin或LRRP结合位点的方法在WO 02/20565和WO 06/083275中有所描述，其均通过引用的方式并入本文中。
[0314] 本发明包括的结合分子中可使用的其它非免疫球蛋白结合位点包括衍生自下列分子的结合位点：Src同源结构域(例如SH2或SH3域)、PDZ域、β-内酰胺酶、高亲和性蛋白酶抑制剂或小的二硫化物结合蛋白支架(例如蝎毒素)。制备衍生自这些分子的结合位点的方法在本领域已经披露，参见例如Panni et al，J.Biol.Chem.，277：
21666-21674(2002)，Schneider et al.，Nat.Biotechnol.，17：170-175(1999)；Legendre et al.，Protein Sci.，11：1506-1518(2002)；Stoop et al.，Nat.Biotechnol.，21：
1063-1068(2003)；和Vita et al.，PNAS，92：6404-6408(1995)。然而其它结合位点可衍生自选自由下列物质构成的组的结合域：EGF样域、Kringle域、PAN域、Gla域、SRCR域、Kunitz/牛胰腺的胰蛋白酶抑制剂域、Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂域、Trefoil(P-型)域、von Willebrand因子型C域、过敏毒素样域、CUB域、甲状腺球蛋白I型重复、LDL-受体类别A域、Sushi域、Link域、血小板反应蛋白I型域、免疫球蛋白样域、C-型凝集素域、MAM域、von Willebrand因子型A域、生长调节素B域、WAP-型四个二硫化物核心域、F5/8型C域、血红素结合蛋白域、层粘连蛋白型EGF样域、C2域、和本领域普通技术人员已知的这种域、及其衍生物和/或变体。示例性非免疫球蛋白结合分子及其制备方法还可在下列参考文献中找到：Stemmer et al.，″Protein scaffolds and uses theref″，美国专利公开No.20060234299(Oct.19，2006)和Hey，et al.，Artificial，Non-Antibody Binding Proteins for Pharmaceutical and Industrial Applications，TRENDS in Biotechnology，vol.23，No.10，表2和pp.514-522(Oct.2005)；还参见本文中提供的参考文献。
[0315] 相对于结合分子结合IGF-1R，本文中所用的术语“在更大程度上阻断IGF-1R-介导的信号转导”指下列情况，其中结合IGF-1R的第一表位的第一结合部分(阻断IGF-1和IGF-2中的至少一个结合IGF-1R)和结合IGF-1R的第二不同表位的第二结合部分(阻断IGF-1和IGF-2中的至少一个结合IGF-1R)的结合较单独第一或第二部分的结合更加阻断IGF-1R-介导的信号转导。IGF-1R-介导的信号转导的抑制可以以多种不同方式来测量，例如，下调肿瘤生长(例如肿瘤生长延迟)、减小肿瘤尺寸或转移、使癌症的临床损害或征兆改善或最小化、延长受试者的存活超过在缺乏这种治疗时预计的时间、和在施用前在缺乏任何肿瘤形成的动物中预防肿瘤生长(即，预防施用)。本文中所用的术语“下调(downmodulate)”、“下调(downmodulating)”或“下调(downmodulation)”指减小特定过程发生、抑制特定过程、反转特定过程和/或预防引发特定过程的速率。因此，如果特定过程是肿瘤生长或转移，术语“下调”包括但不限于减小肿瘤生长和/或转移发生、抑制肿瘤生长和/或转移、反转肿瘤生长和/或转移(包括肿瘤缩小和/或消除)和/或预防肿瘤生长和/或转移的速率。
[0316] 在一个实施方案中，当在更大程度上阻断IGF-1R-介导的信号转导时，观察到累加效应。本文中所用的术语“累加效应”指这样的情况，其中联合结合第一和第二结合部分的效果总和约等于在第一或第二结合部分单独结合时观察到的效果。累加效应典型地在这样的条件下测量，其中第一或第二结合部分(单独)和IGF-1R的摩尔比约等于第一和第二结合部分(一起)和IGF-1R的摩尔比。
[0317] 在一个实施方案中，当在更大程度上阻断IGF-1R-介导的信号转导时，观察到协同效应。本文中所用的术语“协同效应”指大于在结合第一和第二结合部分时产生的累加效应，并且其超过个体单独施用第一或第二结合部分时所产生的情况。协同效应典型地在这样的情况下测量，其中第一或第二结合部分(单独)与IGF-1R的摩尔比约等于第一和第二结合部分(一起)与IGF-1R的摩尔比。本发明包括的实施方案包括通过使用所述第一和第二IGF-1R结合部分在下调IGF-1R-介导的信号转导中产生协同效应的方法，其中所述效应比相应的累加效应至少大5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
[0318] 在一个实施方案中，协同效应使用基于中效原理的Chou和Talalay的协同指数(CI)法来测量(参见Chang et al.，Cancer Res.45：2434-2439，(1985))。该方法计算在各种水平的细胞毒性时两种药物之间的协同、累加或拮抗程度。如果CI值小于1，在两种药物之间有协同效应。如果CI值为1，在两种药物之间有累加效应但没有协同效应。CI值大于1表示拮抗效应。CI值越小，协同效应越大。在另一个实施方案中，协同效应通过使用微量抑制浓度(FIC)来测定。微量值通过将联合作用的药物的IC50表示为单独作用的药物的IC50的函数来确定。对于两种相互作用的药物，各药物的FIC值之和表示协同作用的量度。如果FIC小于1，在两种药物之间有协同效应。FIC值为1表示累加效应。FIC值越小，协同相互作用越大。
[0319] 在某些可选择的实施方案中，当联合两种单独化合物(例如单独结合部分或其它治疗剂)时产生的调节大于当使用有限或饱和浓度或剂量的各化合物时产生的调节时，观察到协同效应。如果单独结合部分(或其它治疗剂)本身不能够导致完全效应(例如，不论使用多高浓度的药物都无法达到所述生物效应的100％下调或变更(例如抑制或增强))，可能产生这种形式的协同效应。在该情况下，通过分析EC50或IC50值而不足够获取协同效应。如果两种化合物(例如结合部分或其它治疗剂)的联合导致的所述生物效应与单独化合物所可能产生的相比导致更大下调或变更(例如抑制或增强)，这被认为是强效的协同效应。
[0320] 过度增殖疾病或病症
[0321] “过度增殖疾病或病症”指所有的肿瘤细胞生长和增殖(不管是恶性还是良胜)，包括所有转化的细胞和组织以及所有的癌症细胞和组织。过度增殖疾病或病症包括但不限于癌前病变、异常细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤以及“癌症”。在本发明包括的某些实施方案中，过度增殖疾病或病症，例如癌前病变、异常细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤或“癌症”包含表达、过量表达或异常表达IGF-1R的细胞。
[0322] 过度增殖疾病、病症和/或症状的其它例子包括但不限于处于如下位置的良性或恶性的赘生物：前列腺、结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝脏、胰脏、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼部及头颈部、神经(中枢和外周)、淋巴系统、盆腔、皮肤、软组织、脾脏、胸以及泌尿生殖道。在某些实施方案中，该赘生物表达、过量表达或异常表达IGF-1R。
[0323] 其它的过度增殖病症包括但不限于位于上述器官的高丙球蛋白血症、淋巴细胞增生性紊乱、病变蛋白血症、紫癜、肉状瘤病、Sezary综合征、Waldenstron巨球蛋白血症、Gaucher病、组织细胞增多病、以及除了肿瘤外的其它任何过度增殖疾病。在本发明包括的某些实施方案中，该疾病包含表达、过量表达或异常表达IGF-1R的细胞。
[0324] 本文中所用的术语“肿瘤”或“肿瘤组织”指由过量细胞分裂产生的异常组织块，在特定的情况下该组织包含表达、过量表达或异常表达IGF-1R的细胞。肿瘤或肿瘤组织包含具有异常生长性能且没有有用的身体功能的“肿瘤细胞”。肿瘤、肿瘤组织和肿瘤细胞可以是良性或恶性的。肿瘤或肿瘤组织还可包含“肿瘤相关的非肿瘤细胞”，例如，形成血管供应肿瘤或肿瘤组织的血管细胞。非肿瘤细胞可由肿瘤细胞诱导复制和发育，例如，在肿瘤或肿瘤组织中诱导血管形成。
[0325] 本文中所用的术语“恶性肿瘤”指非良性肿瘤或癌症。本文中所用的术语“癌症”指代包括以反常或失控细胞生长表征的恶性肿瘤的一类过度增殖疾病。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病或淋巴系统恶性肿瘤。下文指出了该种癌症更特定的例子，其包括：鳞状细胞癌(如上皮鳞状细胞癌)、肺癌、包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌与肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝癌、胃癌(包括胃肠道癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺肿瘤、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、以及头部和颈部癌症。术语“癌症”包括原发恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞未转移至对象体内原始恶性肿瘤或肿瘤位点以外的位点的恶性细胞或肿瘤)以及次生恶性细胞或肿瘤(例如，来自恶性细胞或肿瘤细胞转移至与原始肿瘤位点不同的其它位点的转移肿瘤的恶性细胞或肿瘤)。适于本发明的治疗方法的癌症包括表达、过量表达或异常表达IGF-1R的细胞。
[0326] 癌症或恶性肿瘤的其它例子包括但不限于：位于上述列举的器官的儿童急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴性白血病、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发)肝癌、成人(原发)肝癌、成人急性淋巴细胞白血病、成人急性髓系白血病、成人Hodgkin病、成人Hodgkin淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非Hodgkin淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关的淋巴瘤、艾滋病相关的恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆道癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发)肝癌、儿童(原发)肝癌、儿童急性淋巴细胞白血病、儿童急性髓细胞性白血病、儿童脑干胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤的童年、儿童颅外生殖细胞肿瘤、儿童Hodgkin病、童年Hodgkin林巴瘤的、儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤、儿童淋巴细胞白血病、儿童髓母细胞瘤、儿童非Hodgkin淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童的视觉途径和下丘脑胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、Ewing肉瘤和相关的肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管肿瘤、眼癌、女性乳癌、Gaucher症、胆囊癌、胃癌、胃肠道良性肿瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊振滋养细胞肿瘤、毛细胞白血病、头部和颈部癌症、肝癌、Hodgkin病、Hodgkin淋巴瘤、高丙球蛋白血症、下咽骨癌、肠道癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、Kaposi肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴细胞增生性疾病、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、恶性黑色素瘤、间皮瘤、转移隐匿性原发性鳞状头颈癌、转移性原发性鳞状头颈癌、转移性鳞状颈部癌症、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、粒细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增殖性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、怀孕期间的非Hodgkin淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、不明的原发转移性鳞状头颈癌、口咽癌、骨恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨的骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能的肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、紫癜、甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺肿瘤、结节病肉瘤、Sezary综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠肿瘤、软组织肉瘤、鳞状颈部癌症、胃癌、幕上原始神经及松果体肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、过渡性肾盂和输尿管癌、滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂肾细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑胶质瘤、外阴癌症、Waldenstrom巨球蛋白血症、Wilms肿瘤、以及除肿瘤外任何其它过度增殖疾病。
[0327] 本发明的方法可用于治疗癌变前症状，并用于预防肿瘤或恶性状态进展，包括但不限于上述的病症。该种用途体现在肿瘤或癌症的症状或在先进展，特别地，由增生、转化组成的非肿瘤细胞的生长，更特别地，已发生的发育不良(有关该异常生长条件的综述参见Robbins and Angell，Basic Pathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79(1976))。该种细胞开始表达、过量表达或异常表达IGF-1R的症状特别适于本发明的方法进行治疗。
[0328] 增生是一种受控制的细胞增殖形式，其涉及在组织或器官内细胞数量的增长，且不明显改变结构或功能。可通过本发明的方法治疗的增生性病症包括但不限于血管纵隔淋巴结增生、伴有嗜酸性粒细胞性非典型黑色素细胞增生的血管淋巴增生、基底细胞增生、良性巨大淋巴结增生、牙骨质增生症、先天性肾上腺增生症、先天性皮脂腺增生、囊性增生症、囊性增生症的乳房、全口义齿增生、导管增生、子宫内膜增生、纤维增生、局灶性上皮增生、牙跟增生、炎症骨纤维异常增殖症、炎性乳头状增生、血管内乳头状内皮增生症、结节性前列腺增生症、结节性再生性增生、假性增生症、老年性皮脂腺增生和疣状增生。
[0329] 化生是一种受控的细胞生长形式，其中一类成熟或完全分化细胞取代了另一类成熟细胞。可被本发明的方法治疗的化生型紊乱包括但不限于病因不明性髓性化生、顶浆化生、非典型化生、字体实质性化生、结缔组织化生、上皮化生、肠内化生、变形性贫血、化生骨化、化生息肉、髓样化生、原生髓性化生、次生髓性化生、鳞状化生、鳞状化生羊膜以及症状髓化生。
[0330] 发育不良常是癌症的前兆，并主要发现于上皮；它是非肿瘤细胞生长最紊乱的形式，包括个体细胞均一性和细胞构筑取向的丧失。发育不良细胞通常异常增大，具有深度染色的细胞核，并显示出多型性。发育不良典型出现在出现慢性刺激或炎症时。可通过本发明的方法治疗的发育不良包括但不限于无汗性外胚层发育不良、前面部发育不良、窒息性胸廓发育不良、心-指发育不良、肺支气管发育不良、脑发育不良、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅面骨干发育不良、颅腕跗骨发育不良、颅干骼发育不良、牙齿发育不良、骨干结构发育不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不全、脑眼发育不良、偏侧骨骼发育不良、多发性骨骸发育不良、点状骨骼发育不良、上皮发育不良、面-指-生殖器发育不良、家族性颌骨纤维发育不良、家族性白色折叠发育不良、肌纤维发育不良、骨纤维发育不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾脏视网膜发育不良、汗外胚层发育不良、少外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、领面部发育不良、干髓端软骨发育不良、Mondini发育不良、单骨纤维性骨发育不良、肌上皮发育不良、多发性骨骸发育不良、眼耳脊推发育不良、眼-齿-指发育不良、眼脊椎发育不良、齿源性发育不良、眼下颌肢发育不良、根尖周牙骨质发育不良、多骨性纤维性结构不良、假性软骨发育发育不良、视网膜发育不良、隔-视神经发育不良、脊柱骨骼发育不良以及脑室径向发育不良。
[0331] 其它可通过本发明的方法治疗的肿瘤前病症包括但不限于良性过度增殖病症(例如良性肿瘤、纤维囊性症状、组织肥大、肠息肉、结肠息肉、以及食管发育不良)、粘膜白斑病、角化病、Bowen病、农户皮肤病、日光性唇炎以及日光性角化病。
[0332] 在优选的实施方案中，本发明的方法用于抑制癌症、特别是上述癌症的生长、进展和/或转移。
[0333] 其它的过度增殖疾病、病症和/或症状包括但不限于恶性肿瘤的进展和/或转移瘤以及相关的病症，如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病(包括成髓细胞、前髓细胞、髓单核细胞、单核细胞以及红白血病))和慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如Hodgkin和非Hodgkin病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链疾病、以及实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆道癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎瘤、Wilm瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血母细胞瘤、听神经瘤、胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、以及视网膜母细胞瘤。
[0334] II.IGF-1R
[0335] 天然存在的胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)IGF-1R是由二硫键连接的两个α-亚基(各为130kDa)和两个β-亚基(各为90kDa)构成的异四聚体质膜糖蛋白。Massagué，J.和Czech，M.P.J.Biol.Chem.257：5038-5045(1992)。IGF-1R在本领域中还以CD221和JTK13的名称出现。人IGF-1R mRNA的核酸序列可通过GenBank登陆号NM_000875获得，并作为SEQ ID NO：1在下文显示。
[0336] SEQ ID NO：1
[0337] >gi|11068002|ref|NM_000875.2|人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)，mRNA[0338] 该前体多肽序列可通过GenBank登录号NP_000866获得，并作为SEQ ID NO：2在下文显示。
[0339] SEQ ID NO：2
[0340] >gi|4557665|ref|NP_000866.1|胰岛素样生长因子1受体前体[人]
[0341] 据报道SEQ ID NO：2的氨基酸1至30编码IGF-1R信号肽，SEQ ID NO：2的氨基酸31至740编码IGF-1R α-亚基，而SEQID NO：2的氨基酸741至1367编码IGF-1R β-亚基。NP_000866 GenBank登记项目所报导的人IGF-1R的以上和其它特征显示于表2。
[0342] 表2
[0343]SEQ ID NO：2 特征(来自NP_000866)
1至30 信号肽
31至740 胰岛素样生长因子1受体α链
51至161 受体L结构域
230至277 Furin-样重复
372至467 受体L结构域
494至606 3型纤连蛋白结构域
611至＞655 3型纤连蛋白结构域
741至1367 胰岛素样生长因子1受体β
835至924 3型纤连蛋白结构域
931至955 跨膜区
973 磷酸化
980 磷酸化
991至1268 酪氨酸激酶，催化域
1161 磷酸化
1165 磷酸化
1166 磷酸化
[0344] 本发明还包括特异性、优先或竞争性结合非人IGF-1R蛋白(例如来自啮齿动物或非人灵长动物的IGF-1R)的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。
[0345] IGF-1R在多种肿瘤细胞中表达，包括但不限于以下某些肿瘤：膀胱肿瘤(Hum.Pathol.34：803(2003))；脑部肿瘤(Clinical Cancer Res.8：1822(2002))；乳腺肿瘤(Eur.J.Cancer 30：307(1994)和Hum Pathol.36：448-449(2005))；结肠肿瘤，如腺癌、转移瘤和腺瘤(Human Pathol.30：1128(1999)，Virchows.Arc.443：139(2003)和Clinical Cancer Res.10：843(2004))；胃部肿瘤(Clin.Exp.Metastasis 21：755(2004))；肾脏肿瘤，如透明细胞、不染色细胞和乳突RCC(Am.J.Clin.Pathol.122：931-937(2004))；肺 部 肿 瘤 (Hum.Pathol.34：803-808(2003) 和 J.Cancer Res.Clinical Oncol.119：
665-668(1993))；卵巢肿瘤(Hum.Pathol.34：803-808(2003))；胰腺肿瘤，例如导管腺 癌 (Digestive Diseases.Sci.48：1972-1978(2003) 和 Clinical Cancer Res.11：
3233-3242(2005))；以及前列腺肿瘤(Cancer Res.62：2942-2950(2002))。
[0346] III.IGF-1R抗体
[0347] 在一个实施方案中，本发明包括IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。例如，本发明至少包括表3和表4中显示的特定的单克隆抗体、及其片段、变体和衍生物的抗原结合区。表3列举了从噬菌体展示库鉴定的人抗-人IGF-1R Fab区以及该抗体的各种结合性能，该内容在实施例中有具体的描述。表4列举了通过杂交瘤技术鉴定的鼠抗-人IGF-1R单克隆抗体以及该抗体的各种结合性能，该内容在实施例中有具体的描述。
[0348] 表3：IGF-1R特异性Fab的功能性能。
[0349]
[0350]
[0351] 表4：鼠单克隆抗体的功能性能
[0352]
[0353] 1.MCF-7＝乳腺癌细胞；H-23和Calu-6＝肺癌细胞；Panc-1＝胰腺癌细胞；Colo205＝结肠癌细胞
[0354]
[0355] 表达全长抗体M13-C06和M14-C03的中国仓鼠卵巢细胞系于2006年3月28日保藏在美国典型培养物保藏中心(″ATCC″)，其ATCC保藏编号分别为PTA-7444和
PTA-7445。表达全长Fab抗体片段M14-G11的中国仓鼠卵巢细胞系于2006年8月29日保藏在美国典型培养物保藏中心(″ATCC″)，其ATCC保藏编号为PTA-7855。
[0356] 表达全长人源抗体P2A7.3E11、20C8.3B8和P1A2.2B11的杂交瘤细胞系分别于2006年3月28日、2006年6月13日和2006年3月28日保藏在ATCC，其ATCC保藏编号
分别为PTA-7458、PTA-7732和PTA-7457。表达全长人源抗体20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤细胞系分别于2006年3月28日、2006年7月11日和2006年7月11
日保藏在ATCC，其ATCC保藏编号分别为PTA-7456，PTA-7730和PTA-7731。参见ATCC保藏表(下文)以了解抗体和保藏细胞系之间的关系。
[0357] ATCC位于美国弗吉尼亚州20110-2209，马纳萨斯，大学路10801号。该ATCC保藏系参照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约进行。
[0358] 本发明的某些实施方案保藏于美国典型培养物保藏中心，如下表(“ATCC保藏表”)所示。
[0359] ATCC保藏表
[0360]
[0361] 本文中所用的术语“抗原结合域”包括特异性结合抗原上的表位(例如，IGF-1R的表位)的位点。抗体的抗原结合域通常包括至少部分的免疫球蛋白重链可变区和至少部分的免疫球蛋白轻链可变区。由这些可变区形成的结合位点决定了该抗体的特异性。
[0362] 本发明包括IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该IGF-1R抗体与选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位。
[0363] 本发明还包括IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该IGF-1R抗体竞争性抑制选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体结合IGF-1R。
[0364] 本发明还包括IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该IGF-1R抗体包含与选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体具有一致的抗原结合域。
[0365] M13-C06、M14-G11、M14-C03和M14-B01的初始和修饰型VH和VL链的核苷酸和氨基酸序列示于序列表中。SEQ ID NO：13示出重链M13-C06的单链DNA序列。SEQ ID NO：77示出轻链M13-C06的单链DNA序列。SEQ ID NO：14示出重链M13-C06的氨基酸序列。
SEQ ID NO：78示出轻链M13-C06的氨基酸序列。SEQ ID NO：25示出重链M14-C03的单链DNA序列。SEQ ID NO：87示出轻链M14-C03的单链DNA序列。SEQ ID NO：26示出重链M14-C03的氨基酸序列。SEQ ID NO：88示出轻链M14-C03的氨基酸序列。SEQ ID NO：31示出重链M14-G11的单链DNA序列。SEQ ID NO：92示出轻链M14-G11的单链DNA序列。SEQ ID NO：32示出重链M14-G11的氨基酸序列。SEQ ID NO：93示出轻链M14-G11的氨基酸序列。SEQ ID NO：19示出重链M14-B01的单链DNA序列。SEQ ID NO：82示出轻链M14-B01的单链DNA序列。SEQ ID NO：20示出重链M14-B01的氨基酸序列。SEQ ID NO：83示出轻链M14-B01的氨基酸序列。SEQ ID NO：18示出序列优化的重链M13-C06的单链DNA序列。
SEQ ID NO：14示出序列优化的重链M13-C06的氨基酸序列。SEQ ID NO：30示出序列优化的重链M14-C03的单链DNA序列。SEQ ID NO：26示出序列优化的重链M14-C03的氨基酸序列。SEQ ID NO：36示出序列优化的重链M14-G11的单链DNA序列。SEQ ID NO：32示出序列优化的重链M14-G11的氨基酸序列。SEQ ID NO：24示出序列优化的重链M14-B01的单链DNA序列。SEQ ID NO：20示出序列优化的重链M14-B01的氨基酸序列。SEQ ID NO：153示出轻链恒定域的单链DNA序列。SEQ ID NO：154示出轻链恒定域的氨基酸序列。SEQ ID NO：
155示出重链agly.IgG4.P恒定域的单链DNA序列。SEQ ID NO：156示出重链aglyIgG4.P恒定域的氨基酸序列。
[0366] 制备抗体的方法在本领域公知并在本文中描述。一旦对各种片段或对无信号序列的全长IGF-1R的抗体制备得到，该抗体或抗原结合片段所结合的IGF-1R的
氨基酸或表位可通过此处所述并为本领域公知的表位定位方案(例如在″Chapter
11-Immunology，″Current Protocols in Molecular Biology，Ed.Ausubel et al.，v.2，John Wiley & Sons，Inc.(1996)中描述的双抗体夹心ELISA)进行测定。其它的表位定位方案可参见Morris，G.Epitope Mapping Protocols，New Jersey：Humana Press(1996)，其通过引用的方式全部并入本文中。表位定位还可以采用市售方式(即ProtoPROBE，Inc.(Milwaukee，Wisconsin))进行。
[0367] 此外，所生产的结合IGF-1R任意部分的抗体可通过其作为IGF-1R拮抗剂的能力(例如，抑制胰岛素生长因子与例如IGF-1、IGF-2的结合、或抑制IGF-1和IGF-2两者与IGF-1R的结合、促进IGF-1R的内在化、抑制IGF-1R的磷酸化、抑制例如Akt或p42/44MAPK的下游磷酸化、或是抑制肿瘤细胞增殖、运动或转移)进行筛选。可参照实施例中详细描述的方法通过这些或其它的性能筛选抗体。本发明的抗体的其它功能可采用此处实施例中描述的其它测定方法进行测试。
[0368] 在其它实施方案中，本发明包括特异性或优先结合IGF-1R的至少一个表位的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该表位包含、主要包含、或由SEQ ID NO：2的至少四至五个、至少七个、至少九个、或介于至少约15至约30个氨基酸组成。所述的SEQ ID NO：2的给定表位的氨基酸可以是(但并非必需)邻近或线性的。在某些实施方案中，IGF-1R的至少一个表位包括、主要包括、或由在细胞表面表达的或作为可溶性片段的IGF-1R胞外区形成的(例如，融合至IgG Fc区)非线性表位组成。因此，在某些实施方案中，IGF-1R的至少一个表位包括、主要包括、或由SEQID NO：2的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20、至少25、介于至少约15至约30、或至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个邻近或非邻近氨基酸组成，其中非邻近氨基酸通过蛋白折叠形成表位。
[0369] 在其它的实施方案中，本发明包括特异性或优先结合IGF-1R至少一个表位的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该表位在上述的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个SEQ ID NO：2的邻近或非邻近氨基酸的基础上包含、主要包含、或由修饰蛋白的附加部分(例如，可包括糖部分，从而使IGF-1R抗体能够对修饰目标蛋白以高于未修饰蛋白的亲和性进行结合)组成。可选择地，该IGF-1R抗体完全不与未经修饰的该靶蛋白相结合。
[0370] 在某些方面中，本发明包括与解离常数(KD)小于给定参考单克隆抗体KD的亲和性特征的IGF-1R多肽或其片段、或IGF-1R变体多肽特异性结合的抗体、其抗原结合片段、变体或衍生物。
[0371] 在某些实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物特异性结合上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位(即，与不相关的或随机表位相比更轻易地与该表位结合)；优先结合上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位(即，与不相关的、相近的、同源的或类似表位相比更轻易地与该表位结合)；竞争性抑制本身与上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位或片段或变体的特定表位结合的参考抗体的结合；或以解离常数-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5KD小于约5x10 M、约10 M、约5x10 M、约10 M、约5x10 M、约10 M、约5x10 M、约10 M、约-6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 -10
5x10 M、约10 M、约5x10 M、约10 M、约5x10 M、约10 M、约5x10 M、约10 M、约5x10 M、-10 -11 -11 -12 -12 -13 -13 -14
约10 M、约5x10 M、约10 M、约5x10 M、约10 M、约5x10 M、约10 M、约5x10 M、约-14 -15 -15
10 M、约5x10 M或约10 M表征的亲和性结合上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表
位。在特定的方面，该抗体或其片段相对鼠IGF-1R多肽或其片段优先结合人IGF-1R多肽或其片段。在另一特定的方面，该抗体或其片段优先结合一种或多种IGF-1R多肽或其片段(例如，一种或多种哺乳动物IGF-1R多肽)，但不结合胰岛素受体(InsR)多肽。不希望受限于理论，已知胰岛素受体多肽具有部分与IGF-1R多肽类似的序列，且与InsR交叉反应的抗体可在体内产生有害副作用，例如干扰葡萄糖代谢。
[0372] 在抗体结合解离常数上下文所用的术语“约”允许了用于测量抗体亲和性的方法的内在变差程度。例如，依据所用仪器的精度，基于所测样品的样品数的标准误差，以及常-2规误差，术语“约10 M”可包括如从0.05M至0.005M。
[0373] 在特定实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物以小于或等-2 -1 -2 -1 -3 -1 -3 -1于5X10 sec 、10 sec 、5X10 sec 或10 sec 的解离速率与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。可选择地，本发明包括的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物以小于或等于-4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1 -7 -1 -7 -1
5X10 sec 、10 sec 、5X10 sec 、或10 sec 5X10 sec 、10 sec 、5X10 sec 或10 sec的解离速率与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。
[0374] 在其它的实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物以大于或3 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 4 -1 -1
等于10M sec 、5X10M sec 、10M sec 或5X10M sec 的结合速率与IGF-1R多肽或其
片段或变体相结合。可选择地，本发明包括的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物以大
5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1 6 -1 -1 7 -1 -1
于或等于10M sec 、5X10M sec 、10M sec 、或5X10M sec 或10M sec 的结合速率与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。
[0375] 在各实施方案中，此处所述的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物为IGF-1R活性的拮抗剂。例如，在某些实施方案中，拮抗剂IGF-1R抗体与肿瘤细胞上表达的IGF-1R的结合抑制胰岛素生长因子(例如，IGF-1、IGF-2、或IGF-1和IGF-2两者)与IGF-1R的结合，促进IGF-1R的内在化，从而抑制其信号转导能力，抑制IGF-1R的磷酸化，抑制该信号转导途径下游分子(例如，Akt或p42/44MAPK)的磷酸化，或抑制肿瘤细胞增殖、运动和转移。
[0376] 除非另外指出，此处所用的“其片段”指与一种抗原结合片段有关的抗体，即与该抗原特异性结合的该抗体的部分。在一个实施方案中，IGF-1R抗体(如本发明包括的抗体)为对超过一个表位(例如，超过一个抗原或超过一个在相同抗原上的表位)具有结合特异性的双特异性IGF-1R抗体(例如双特异性抗体)，微抗体，区域删除抗体或融合蛋白。在一个实施方案中，双特异性IGF-1R抗体对本文中披露的靶多肽(例如，IGF-1R)的至少一个表位具有至少一个特异性的结合区域。在另一个实施方案中，双特异性IGF-1R抗体对靶多肽的一个表位具有至少一个特异性的结合区域，或对药物或毒素具有至少一个特异性的靶结合区。在另一个实施方案中，一种双特异性IGF-1R抗体对此处所述的靶多肽的一个表位具有至少一个特异性的结合区域，或对一种前药具有至少一个特异性的结合区。双特异性IGF-1R抗体可以是一种四价抗体，其带有两个对此处所述的靶多肽的表位具特异性的靶结合区，以及两个对第二靶具有特异性的靶结合区。因此，四价双特异性IGF-1R抗体可以对各特异性为双价。
[0377] 如本领域普通技术人员所知，本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段，变体或衍生物可包含介导一种或多种效应功能的恒定区。例如，补体的Cl成分与抗体恒定区的结合可激活补体系统。补体的激活对于细胞病原体的调理和溶解非常重要。补体的激活还刺激炎症应答，并且还可参与自身免疫超敏性。此外，抗体通过Fc区结合各种细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。有多种Fc受体对不同类别的抗体具有特异性，包括IgG(gamma受体)、IgE(epsilon受体)、IgA(alpha受体)和IgM(mu受体)。抗体与细胞表面上Fc受体的结合可引发一系列重要的和多样的生物应答，包括抗体包裹粒子吞没和破坏，免疫复合物的清除，杀伤细胞对抗体包裹的目标细胞的溶解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒，或ADCC)，炎症介质的释放，胎盘转移和免疫球蛋白生产的控制。
[0378] 因此，本发明的某些实施方案包括IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中一个或多个恒定区域的至少一个部分被删除或以其它方式改造从而提供所需的生化性质，例如下降的效应功能，非共价二聚化的能力，提高的肿瘤位点定位能力，下降的血清半衰期，或是与具有大致相同免疫原性的完整，未改造的抗体相比具有提高的血清半衰期。例如，本文中所述的诊断和治疗方法中采用的某些抗体为包含了与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但缺失了一个或多个重链区的至少一部分的区域缺失抗体。例如，在某些抗体中，修饰抗体的恒定区中的一个完整区域将被删除，例如，CH2区的全部或部分将被删除。在其它实施方案中，本文中所述的诊断和治疗方法中采用的某些抗体的恒定区(例如，IgG4重链恒定区)经改造去除了糖基化，在本文别处称为“agly”抗体。不希望受限于理论，据认为“agly”抗体体内具有提高的安全性和稳定性。
[0379] 在本文中所述的某些IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，可采用本领域已知技术对Fc部分进行突变以降低效应功能。例如，(通过点突变或其它方法)对恒定区域的删除或灭活可降低循环修饰抗体的Fc受体结合从而提高肿瘤定位。在其它情况下恒定区修饰与本发明的适度互补结合相一致从而减少了血清半衰期以及与结合细胞毒素的非特异性结合。恒定区的另一种修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分从而通过提高抗原特异性或抗体灵活性来增强定位。通过修饰得到的生理功能，生物相容性以及其它生化作用(例如肿瘤定位、生物分布以及血清半衰期)可通过公知的免疫技术在不采取附加试验的情况下轻易地进行检测和定量。
[0380] 本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的修饰形式可采用本领域已知技术由完整前体或亲代抗体制备得到。此处对示例性技术进行了更具体的讨论。
[0381] 在某些实施方案中，IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的可变和恒定区均为完全人源。完全人源抗体可通过本领域已知的以及本文中描述的技术进行制备。例如，针对特异性抗原的完全人源抗体可通过向经修饰在应答抗原性攻击时生产该种抗体同时其内源性基因座被灭活的转基因动物施用抗原进行制备。可用于制备该种抗体的示例性技术参见美国专利6,150,584、6,458,592、6,420,140。其它的技术已为本领域所知。如本文其它部分将作更具体讨论，完全人源抗体还可通过各种展示技术进行制备，例如噬菌体展示或其它病毒展示系统。
[0382] 本发明的IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可通过本领域已知的技术进行制备或生产。在某些实施方案中，抗体分子或其片段可进行“重组生产”，即，采用重组DNA技术进行生产。制备抗体分子或其片段的示例性技术将在本文其它部分作更详细的讨论。
[0383] 本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物还包括经修饰的衍生物，例如，将任何类型的分子共价连接至该抗体，并使该共价连接不阻止抗体特异性结合其同源表位。例如但不限于该抗体衍生物包括通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酰化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，与细胞配体或其它蛋白连接等方法修饰得到的抗体。各种化学修饰中的任意一种均可通过已知技术实现，包括但不限于特异性化学裂解，乙酰化，甲酸化，衣霉素代谢合成等。此外，该衍生物可包含一个或多个非传统氨基酸。
[0384] 在某些实施方案中，本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物不会引起待治疗动物(例如，人)体内的有害免疫应答。在一个实施方案中，本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可通过本领域认可的技术进行修饰以降低其免疫原性。例如，可对抗体进行人源化，灵长源化，去免疫化，或可制备嵌合抗体。这些抗体类型来自于非人源抗体，通常为保留或充分保留了父代抗体的抗原结合功能，但在人体内具有更低免疫原性的鼠或灵长动物抗体。这可通过多种方法实现，包括(a)将完整非人类可变区嫁接至人恒定区以生成嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类决定簇互补区(CDR)的至少一部分嫁接至保留或未保留关键框架残基的人框架和恒定区；或(c)移植整个非人类可变区，但通过替换表面残基以类人切片将其“包覆”。该类方法参见Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855(1984)；Morrison at al.，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)，和美国专利No.5,585,089，5,693,761，5,693,762和6,190,370，所有文献都通过引用的方式全部并入本文中。
[0385] 去免疫化还可用于降低抗体的免疫原性。本文中所用的术语“去免疫化”包括对抗体进行改造以修饰T细胞表位(例如，参见WO9852976A1、WO0034317A2)。例如，对来自起始抗体的VH和VL序列进行分析，由各V区“定位”的人T细胞表位显示了与序列内的决定簇互补区(CDR)和其它关健残基相关的表位定位。对来自于T细胞表位图谱的单独T细胞表位进行分析，以在不轻易改变终抗体活性的情况下鉴定选择性的氨基酸替代物。经设计得到了一系列包括氨基酸替代物组合物的替代VH和VL序列，随后这些序列被整合进入一系列的结合多肽(例如，IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段)以用于本文中所述的诊断和治疗方法，并对功能进行测验。通常可生成和测验12-24个变体抗体。然后将包含修饰后的V区和人C区的完整重链和轻链基因克隆进入表达载体，将该后续质粒导入细胞系进行全抗体生产。对该类抗体通过适当的生化和生物侧定进行比较，鉴定得到最佳变体。
[0386] 本发明包括的IGF-1R抗体、或其抗原结合片断、变体或衍生物可通过本领域已知的任何方法生成。针对目标抗原的多克隆抗体可通过各种本领域公知的方法生产。例如，IGF-1R抗体(如IGF-1R特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可给用至各种宿主动物，包括但不限于兔子、小鼠、大鼠、鸡、仓鼠、山羊、驴等，以诱导包含了对该抗原特异的多克隆抗体的血浆的生产。依据宿主种类不同，各种佐剂可用于提高免疫应答，其包括但不限于弗氏制剂(完全或不完全)，矿物凝胶(如氢氧化铝)，表面活性物质如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白，二硝基酚以及潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。该类佐剂也是本领域熟知的。
[0387] 单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备，包括杂交瘤，重组和噬菌体展示技术的应用及其组合。例如，单克隆抗体可通过本领域已知的杂交瘤技术进行生产，该技术还在许多文献中得到描述，例如Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.(1988)；Hammerling et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier，N.Y.，563-681(1981)(所述参考文献以引用的方式全部并入)。本文中所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”指由单个克隆(包括真核、原核或噬菌体克隆)得到的抗体，而非它的生产方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。
单克隆抗体可采用IGF-1R敲除小鼠生产以增加表位识别的区域。单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备，包括本文其它部分所述的杂交瘤和重组和噬菌体展示技术的应用。
[0388] 在一个实施例中，采用本领域认可的方案，可通过多次皮下或腹腔注射相关抗原(例如，纯化的IGF-1R抗原，如包含IGF-1R的细胞或细胞萃取物)和佐剂在哺乳动物体内产生抗体。该免疫作用通常可引发包含了从激活的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应抗体的免疫应答。尽管可从动物血浆获取所得的抗体以进行多克隆制备，通常可从脾脏、淋巴结或外周血分离单独的淋巴细胞以进行单克隆抗体(MAbs)的均一制备。优选地，该淋巴细胞从脾脏中获取。
[0389] 在该种总所周知的方法中(Kohler et al.，Nature 256：495(1975))，该取自注射了抗原的哺乳动物的相对短命或终会死亡的淋巴细胞与一个永生肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)相融合，从而得到了永生的并能生产B细胞的转基因编码抗体的杂交细胞或“杂交瘤”。所得的杂交物通过对包含了能够形成单独抗体的特定基因的单独株系进行挑选，稀释和再生而分离得到单独遗传株系。它们可生产针对目标抗原的相似抗体，并由于其单纯的遗传亲缘而被称为“单克隆”。
[0390] 将由此制备的杂交瘤细胞接种和培养至适当的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的，亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域的技术人员均了解用于杂交瘤形成，挑选和培养的制剂，细胞系和介质可从多个来源购买，且已充分建立了标准化的方案。通常对杂交瘤细胞生长的培养基进行分析以测定针对目标抗原的单克隆抗体的生产。优选地，由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀，放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸收分析(ELISA)等体外分析进行测定。当杂交瘤经鉴定能够生产具有所需特异性，亲和性和/或活性的抗体后，该克隆可通过有限稀释法进行亚克隆并以标准方法培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp 59-103(1986))。进一步会了解，由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过蛋白-A、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等传统方法进行纯化，从培养基，腹水或血浆中分离。
[0391] 识别特定表位的抗体片段可通过已知技术生成。例如，可采用木瓜蛋白酶(生产Fab片段)或胃蛋白酶(生产F(ab′)2片段)等酶通过蛋白水解裂解免疫球蛋白分子或重组生产Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段包含了可变区，轻链恒定区和重链CH1区。
[0392] 本领域技术人员还可理解编码抗体或抗体片段(例如，抗原结合位点)的DNA还可以从抗体库(例如噬菌体展示库)获得。该种噬菌体可特别用于展示由抗体库或组合抗体库(例如，人或鼠)表达的抗原结合区。表达能够结合目标抗原的抗原结合区的噬菌体可通过抗原(例如，采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原)进行选择或鉴别。在这些方法中使用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13结合区，该结合区可由Fab，Fv OE DAB(单独轻或重链Fv区)或二硫键稳定的Fv抗体区融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的噬菌体进行表达。示例性方法可参见例如EP 368 684 B1；
美国专利5,969,108，Hoogenboom，H.R.和Chames，Immunol.Today 21：371(2000)；Nagy et al.Nat.Med.8：801(2002)；Huie et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2682(2001)；
Lui et al.，J.Mol.Biol.315：1063(2002)，其均通过引用的方式并入本文中。许多文献(例如Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992))均已描述了通过链替换，以及作为构建大型噬菌体库的策略的组合感染和体内重组对高亲和性人抗体的生产。在另一实施方案中，可采用核糖体展示替代噬菌体作为展示平台(例如参见Hanes et al.，Nat.Biotechnol.18：1287(2000)；Wilson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：3750(2001)；
或Irving et al.，J.Immunol.Methods 248：31(2001))。在另一实施方案中，可通过细胞表面库筛选抗体(Boder et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：10701(2000)；Daugherty et al.，J.Immunol.Methods 243：211(2000))。该类方法可为用于单克隆抗体的分离和后续克隆的传统杂交瘤技术提供替代方法。
[0393] 在噬菌体展示方法中，功能性抗体区被展示在携带了对其编码的多聚核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。例如，可从动物cDNA库(例如，人或鼠淋巴组织cDNA库)或合成cDNA库扩增或以其它方式分离编码VH和VL区的DNA序列。在某些实施方案中，该编码VH和VL区的DNA在PCR中通过scFv接头相连接并被克隆进入噬菌粒载体(例如，p CANTAB6或pComb 3HSS)。将该载体导入E.coli并以辅助噬菌体感染该E.coli。这些方法中所用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13，通常将VH或VL区重组融合至噬菌体基因III或基因VIII。表达能够结合目标抗原(即，IGF-1R多肽或其片段)的抗原结合区的噬菌体可通过抗原(例如，采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原)进行选择或鉴别。
[0394] 可用于制备该抗体的噬菌体展示方法的附加示范可参见Brinkman et al.，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames et al.，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic et al.，Gene 187：9-18(1997)；Burton et al.，Advances in Immunology 57：
191-280(1994)；PCT 申 请 No.PCT/GB91/01134；PCT 公 开 WO 90/02809；WO 91/10737；
WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和 美 国 专 利No.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；
5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；其均以引用的方式全部并入本文中。
[0395] 如上述参考文献所述，在噬菌体筛选后，可从该噬菌体分离该抗体编码区并用于生成包括人抗体或任何其它目标抗原结合片段的完整抗体，并在包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌的目标宿主中表达。例如，用于重组生产Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术也可采用本领域已知的技术，例如参见PCT公开WO 92/22324；Mullinax et al.，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；和Sawai et al.，AJRI 34：26-34(1995)；和Better et al.，Science 240：1041-1043(1988)(所述参考文献以引用的方式全部并入)。
[0396] 可用于生产单链Fvs和抗体的技术例子可参见美国专利No.4,946,778和5,258,498；Huston et al.，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu et al.，PNAS
90：7995-7999(1993)；和Skerra et al.，Science 240：1038-1040(1988)。对于某些用途，包括抗体在人体的体内应用和体外检测分析，优选使用嵌合，人源化或人源抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如包含了鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法在已为本领域所知。例如参见Morrison，Science
229：1202(1985)；Oi et al.，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies et al.，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利No.5,807,715；4,816,567；和4,816397，其以引用的方式全部并入本文中。人源化抗体指能够与具有一个或多个来自非人类决定簇互补区(CDR)和人免疫球蛋白分子框架区的目标抗原相结合的由非人类抗体衍生的抗体分子。
人框架区的框架残基通常可被CDR供体抗体的相应残基所替代从而改变，优选提高抗原结合。这些框架替换可通过本领域公知的方法进行鉴定，例如，可通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，可通过序列比较鉴定在特定位点的反常框架残基。(例如参见Queen et al.，美国专利No.5,585,089；Riechmann et al.，Nature
332：323(1988)，其以引用的方式全部并入本文中。抗体可通过多种本领域已知的技术进行人源化，例如，CDR-嫁接(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利No.5,225,539；
5,530,101；和5,585,089)，镶饰或重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka et al.，Protein Engineering 7(6)：
805-814(1994)；Roguska.et al.，PNAS 91：969-973(1994))，以及链替换(美国专利No.5,565,332)。
[0397] 完整人类抗体可特别用于人类患者的治疗。人类抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括上述采用来自人免疫球蛋白序列的抗体库进行的噬菌体展示方法。还可参见美国专利No.4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645，WO 98/50433，WO98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735，和WO 91/10741；其均以引用的方式全部并入本文中。
[0398] 人类抗体还可采用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因的转基因鼠进行生产。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可随机导入或通过同源重组进入鼠胚胎干细胞。可选择地，除人重链和轻链基因外，还可将人可变区，恒定区和多样区导入鼠胚胎干细胞。鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可通过同源重组导入的人免疫球蛋白基因座进行单独或同时的非功能性修饰。特别地，JH区纯合子的删除防止了内源抗体的生产。扩增该修饰后的胚胎干细胞并注射进入胚泡以生产嵌合鼠。然后饲养该嵌合鼠以生产表达人抗体的纯合子型后代。该转基因鼠以选择抗原(例如所需靶多肽的全部或部分)通过常规方式进行免疫。针对该抗原的单克隆抗体可采用常规杂交瘤技术从免疫后的转基因鼠获取。转基因鼠包含的人免疫球蛋白转基因在B-细胞分化时重排，随后进行类型转换和体细胞突变。因此，通过该种技术可生产治疗有效的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。该技术生产人类抗体的综述可参见Lonberg and Huszar Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。对技术用于生产人类抗体和人类单克隆抗体以及生产该类抗体的方案的具体讨论可参见PCT公开WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利No.5,413,923；5,625,126；
5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，其以引用的方式全部并入本文中。此外，可委托Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和GenPharm(San Jose，Calif.)等公司通过与上述类似的技术提供针对选定抗原的人类抗体。
[0399] 识别选定表位的完整人类抗体可通过称为“定向选择”的技术进行生产。在该方法中采用一种选定的非人类单克隆抗体(例如，鼠抗体)引导识别相同表位的完整人类抗体的筛选。(Jespers et al.，Bio/Technology 12：899-903(1988)。还可参见美国专利No.5,565,332)。
[0400] 此外，针对本发明的靶多肽的抗体反过来可通过本领域技术人员公知的技术用于生成“模仿”靶多肽的抗个体型抗体(例如参见Greenspan & Bona，FASEB J.7(5)：437-444(1989)和Nissinoff，J.Immunol.147(8)：2429-2438(1991))。例如，结合和竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明多肽与配体的结合的抗体可用于生成“模仿”该抗体多聚化和/或结合区，从而结合和中和多肽和/或其配体的抗独特型。该中和性抗独特型或该抗独特型的Fab片段可用于在治疗领域中和多肽配体。例如，该抗独特型抗体可用于结合所需的靶多肽和/或结合其配体/受体，从而阻断其生物活性。
[0401] 在另一个实施方案中，编码所需单克隆抗体的DNA可采用常规方法简单分离和测序(例如，可采用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链基因的寡聚核苷酸探针)。分离的亚克隆杂交瘤细胞可用作该DNA的优选来源。该DNA在分离后可导入表达载体，随后将后者转染进入不生产免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞，例如但不限于，大肠杆菌细胞，猿COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更具体的说，如1995年1月25日Newman等人提交的美国专利No.5,658,570所述(通过引用的方式并入本本文中)，该分离DNA(如本文中所述，可为合成DNA)可用于为制备抗体克隆恒定和可变区序列。简要而言，将来自该选定细胞的RNA遗传提取物转化为cDNA，然后以Ig特异性引物进行PCR扩增。能够完成该目的的合适引物还可参见美国专利No.5,658,570。如下文所将详述，可相对大量培养该表达所需抗体的转化细胞以提供临床或商业所需的免疫球蛋白。
[0402] 在一个实施方案中，本发明包括的IGF-1R抗体包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方案中，本发明包括的IGF-1R抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方案中，本发明包括的IGF-1R抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方案中，本发明包括的IGF-1R抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方案中，本发明包括的IGF-1R抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方案中，本发明包括的IGF-1R抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。示例性抗体分子至少包含一个能包含在本文中所述的对象IGF-1R抗体的CDR。
[0403] 在特定的实施方案中，该重链和/或轻链可变区的氨基酸序列可通过本领域公知的方法检查以确定决定簇互补区(CDR)的序列，例如，可通过比较已知氨基酸序列和其它重链和轻链可变区以确定高可变序列区。可采用常规重组DNA技术将一个或多个CDR插入框架区，例如，插入人框架区以将非人类抗体人源化。该框架区可以是天然存在的或为共有框架区，且优选人框架区(例如参见Chothia et al.，J.Mol.Biol.278：457-479(1998)的人框架区列表)。由框架区和CDR的组合生成的多聚核苷酸优选编码一种能与所需多肽(例如，IGF-1R)的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可优选进行一个或多个氨基酸替换，该氨基酸替换优选能够提高抗体与其抗原的结合。此外，该类方法可用于对参与链间二硫键的半胱氨酸残基的一个或多个可变区进行氨基酸替换或删除，从而生成缺失一个或多个链间二硫键的抗体分子。其它对多聚核苷酸的改造在本发明和本领域的现有技术范围内。
[0404] 此外，可采用通过拼接具有适当抗原特异性的鼠抗体分子基因和具有适当生物活性的人类抗体分子基因生产“嵌合抗体”的技术(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；Neuberger et al.，Nature 312：604-608(1984)；Takeda et al.，Nature 314：452-454(1985))。本文中所用的嵌合抗体是一种抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如包含了鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，如人源化抗体。
[0405] 可选择地，根据描述用于生产单链抗体的技术(美国专利No.4,694,778；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：
5879-5883(1988)；以及Ward et al.，Nature 334：544-554(1989))也可用于生成单链抗体。可通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段生成单链抗体。也可采用在大肠杆菌内组装功能性Fv片段的技术(Skerra et al.，Science 242：1038-1041(1988))。
[0406] 本发明包括的另一实施方案包含在不能生成内源免疫球蛋白的转基因动物(例如，鼠)体内生成人或实质人抗体(例如，参见美国专利No.6,075,181，5,939,598，
5,591,669和5,589,369，均通过引用的方式并入本文中)。例如，据描述在嵌合和胚系突变小鼠中的抗体重链结合区的纯合子缺失可导致内源抗体生产的完全抑制。人免疫球蛋白基因阵列向该胚系突变小鼠的转移可导致在抗原攻击下的人抗体生产。另一使用SCID鼠生成人抗体的优选方法可参见美国专利No.5,811,524，该文献通过引用的方式并入本文中。
应当可以理解与这些人抗体相关的遗传材料也可以依照此处所述进行分离和操作。
[0407] 用于生成重组抗体的另一高效方法可参见Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)。该技术可特别生成包含了猴可变区和人恒定区的灵长动物源化抗体。该文献通过引用的方式并入本文中。此外，该技术还可参见共同受让的美国专利No.5,658,570，5,693,780和5,756,096，该文献通过引用的方式并入本文中。
[0408] 在另一个实施方案中，可通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，可从免疫哺乳动物分离外周血单核细胞并在体外培养7天。筛选该培养物以获得达到筛选标准的IgG。可对阳性孔的细胞进行分离。可通过FACS或补体介导的溶血空斑检测的鉴定分离得到生产Ig的单独B细胞。可通过显微操作将生成Ig的B细胞转移至试管，并可采用RT-PCR等方法扩增VH和VL基因。将VH和VL基因克隆至抗体表达载体并转染进入细胞(例如，真核或原核细胞)以进行表达。
[0409] 可选择地，可采用本领域技术人员公知的技术筛选抗体生成细胞系并进行培养。该类技术可从各种试验手册和出版物中得到描述。在此方面，适用于本发明的技术的描述可见下文，并可参见Current Protocols in Immunology，Coligan et al.，Eds.，Green Publishing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)，其通过引用的方式全文(包括附录)并入本文中。
[0410] 本发明包括的抗体可通过本领域已知的任何抗体合成方法，特别是化学合成方法或是优选此处所述的重组表达技术进行制备。
[0411] 在一个实施方案中，本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物包含了其中一个或多个结构域被部分或全部删除的合成恒定区(“结构域删除抗体”)。在某些实施方案中的相容性修饰抗体包含了整个CH2区被去除的结构域删除构建体或变体(ΔCH2构建体)。在其它实施方案中可采用短连接肽替换缺失区域以提供可变区的灵活性和自由移动性。本领域的技术人员将可以理解由于CH2区对抗体分解率的调节性能，因而特别优选该构建体。结构域删除构建体可由编码IgG1人恒定区的载体获得(例如参见WO02/060955A2和WO02/096948A2)。该载体经工程改造缺失了CH2区并提供了表达区域缺失IgG1恒定区的合成载体。
[0412] 在某些实施方案中，本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物为微抗体。微抗体可通过本领域已描述的方法进行制备(例如，参见美国专利5,837,82或WO94/09817A1)。
[0413] 在一个实施方案中，本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物包含了一种具有能支持单体亚基间结合的数个或者甚至单个氨基酸缺失或替换的免疫球蛋白重链。例如，在CH2区选定部位的单个氨基酸突变可足以降低Fc结合并从而增强肿瘤定位。类似地，可能仅需要删除控制带调节效应功能(例如，补体结合)的一个或多个恒定区。该恒定区的部分缺失可能提高该抗体的选定特性(血浆半衰期)，同时保留其它与对象恒定区相关的所需功能的完整性。此外，如上文指出，所披露抗体的恒定区可通过对增强所得构建体作用的一个或多个氨基酸的突变或替换进行合成。就此而言，可以在破坏保守结合位点(例如，Fc结合)的活性的同时充分保留修饰抗体的构型和免疫原性作用。另一实施方案包含了向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强所需的特性(例如效应功能)或者提供更多细胞毒素或糖附着。在该实施方案中可能需要插入或复制来自选定恒定区的特定序列。
[0414] 本发明还包括包含、主要包含、或由此处所述的抗体分子(例如，VH区和或VL区)的变体(包括衍生物)组成的抗体，该抗体或其片段免疫特异性结合IGF-1R多肽或其片段或变体。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码IGF-1R抗体的核苷酸序列引入突变，包括但不限于可导致氨基酸替换的定点突变和PCR-介导的突变。优选地，该变体(包括衍生物)相对参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3编码少于50个氨基酸替换，少于40个氨基酸替换，少于30个氨基酸替换，少于25个氨基酸替换，少于20个氨基酸替换，少于15个氨基酸替换，少于10个氨基酸替换，少于5个氨基酸替换，少于4个氨基酸替换，少于3个氨基酸替换，或少于2个氨基酸替换。“保守氨基酸替换”是以具有类似电荷侧链的氨基酸残基替换其中一个氨基酸残基。本领域内已经定义了有类似电荷侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未带电极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，无极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。可选择地，该突变可沿全部或部分编码序列进行(例如饱和突变)，对所得的突变进行生物活性筛选以鉴定保留活性(例如，结合IGF-1R多肽的能力)的突变体。
[0415] 例如，可以仅在抗体分子的框架区或CDR区引入突变。所引入的突变可以是同义或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有或具有很少的影响，事实上该种突变有些不改变任何氨基酸序列。这些类型的突变可能对优化密码子用途或提高杂交瘤的抗体生产非常有用。编码本发明IGF-1R抗体的密码子优化编码区在本文别处披露。可选择地，非中性错义突变可改抗体结合抗原的能力。多数同义或中性错义突变的位点可能在框架区中，而多数非中性错义突变的位点可能在CDR中，尽管这并非绝对。本领域的技术人员均能设计和测试具有所需性能(例如未改变抗原结合活性或改变了结合活性(例如，提高了抗原结合活性或改变了抗体特异性)的突变分子。突变后可对编码蛋白进行常规表达，编码蛋白的功能性和/或生物活性(例如，免疫特异性结合IGF-1R多肽的至少一个表位的能力)可通过此处所述的技术或本领域已知的常规修饰技术进行测定。
[0416] IV.编码IGF-1R抗体的多聚核苷酸
[0417] 本发明还包括编码本发明IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的核酸分子。
[0418] 在一个实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成的分离多聚核苷酸，其中该重链可变区的至少一个CDR或该重链可变区的至少两个VH-CDR与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。可选择地，该VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。因此，如该实施例所述的本发明的重链可变区具有与表5中多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列：
[0419] 表5：参考VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列*
[0420]
[0421]
[0422]
[0423]
[0424]
[0425]
[0426]
[0427]
[0428]
[0429]
[0430]
[0431]*
[0432] 通过Kabat系统确定(见上文)
[0433] N＝核苷酸序列，P＝多肽序列。
[0434] 如本领域所知，两个多肽或两个多聚核苷酸之间的“序列一致性”通过将一个多肽或多聚核苷酸的氨基酸或核酸序列与另一个多肽或多聚核苷酸的序列比较得到。本文中讨论的任何特定多肽与另一多肽是否具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的一致性可通过本领域已知的方法和计算机程序/软件(例如但不限于，BESTFIT程序(WisconsinSequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711))进行测定。BESTFIT采用了Smith和Waterman，Applied Mathematics 2：
482-489(1981)的局部同源性算法以发现两个序列间的最佳同源性片段。在采用BESTFIT或任何其它序列比对程序测定特定序列与如本发明所述的参考序列是否具有如95％的一致性时，该参数当然会设定为对参考多肽序列的全长计算相似度百分比且允许最大同源性差距为参考序列中总氨基酸数的5％。
[0435] 在某些实施方案中，包含该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。在某些实施方案中，该编码VH多肽的核苷酸序列进行了改造，但不改变其编码的氨基酸序列。例如，该序列的改造可用于提高密码子在给定物种中的用途，去除剪接位点，或是去除限制性酶切位点。该种序列优化已在实施例中描述并已熟知，且可由本领域普通技术人员常规实施。
[0436] 在另一个实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成的分离的多聚核苷酸，其中该VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与表5所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团已知的多肽序列。在某些实施方案中，包含该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0437] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含、主要包含、或由一种或多种上述多聚核苷酸编码的VH，或与选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12、和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位的VH，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R的VH所组成。
[0438] 在某些实施方案中，包含、主要包含、或通过由一个或多个上述多聚核苷酸编码-2 -2 -3 -3的VH组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)不大于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M 或-15
10 M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段、或IGF-1R变体多肽。
[0439] 在另一个实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成的分离的多聚核苷酸，其中该轻链可变区的至少一个VL-CDR或该轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。可选择地，该VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。因此，如该实施例所述的本发明的轻链可变区具有与表6中多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列：
[0440] 表6：参考VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列*
[0441]
[0442]
[0443]
[0444]
[0445]
[0446]
[0447]
[0448]
[0449] *通过Kabat系统确定(见上文)
[0450] PN＝核苷酸序列，PP＝多肽序列。
[0451] 在某些实施方案中，包含了该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0452] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含、主要包含、或由编码一种免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成的分离的多聚核苷酸，其中该VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与表6所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3基团已知的多肽序列。在某些实施方案中，包含该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0453] 在进一步的方面，本发明提供了包含、主要包含、或由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成的分离的多聚核苷酸，其中该VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与编码表6所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3的核苷酸序列一致的编码核苷酸序列。在某些实施方案中，包含该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0454] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含、主要包含、或由一种或多种上述多聚核苷酸编码的VL，或与选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B 12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性或优先结合相同IGF-R1表位的VL，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R的VL所组成。
[0455] 在某些实施方案中，包含、主要包含、或通过由一个或多个上述多聚核苷酸编码-2 -2 -3 -3的VL组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)不大于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M 或-15
10 M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段、或IGF-1R变体多肽。
[0456] 在另外的实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由编码与选自SEQ ID NO：4、9、14、20、26、32、38、43、48、53、58和63的参考VH序列至少具有80％、85％、90％、95％或
100％一致性的VH的核酸组成的分离的多聚核苷酸。在某些实施方案中，包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0457] 在另一个方面中，本发明包括包含、主要包含、或由编码具有选自SEQ ID NO：4、9、14、20、26、32、38、43、48、53、58和63的多肽序列的VH的核酸组成的分离多聚核苷酸。在某些实施方案中，包含该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0458] 在另外的实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由与选自SEQ ID NO：3、8、13、18、19、24、25、30、31、36、37、42、47、52、57和62的参考核酸序列至少具有80％、85％、
90％、95％或100％一致性的VH-编码核酸组成的分离多聚核苷酸。在某些实施方案中，包含该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0459] 在另一个方面中，本发明包括包含、主要包含、或由编码本发明VH的核酸序列组成的分离的多聚核苷酸，其中该VH的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4、9、14、20、26、32、38、43、48、53、58和63。本发明还包括包含、主要包含、或由编码本发明VH的核酸序列组成的分离多聚核苷酸，其中该核酸序列选自SEQ ID NO：3、8、13、18、19、24、25、30、31、36、37、42、
47、52、57和62。在某些实施方案中，包含该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0460] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含、主要包含、或由一种或多种上述多聚核苷酸编码的VH，或与选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性或优先结合相同IGF-R1表位，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R，或是竞争性抑制该种单克隆抗体结合IGF-1R的VH所组成。
[0461] 在某些实施方案中，包含、主要包含、或通过由一个或多个上述多聚核苷酸编码-2 -2 -3 -3的VH组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)不大于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M 或-15
10 M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段、或IGF-1R变体多肽。
[0462] 在另外的实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由编码与具有选自SEQ ID NO：68、73、78、83、88、93、98、103、108、113和118的参考VL多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％一致性的VL的核酸组成的分离多聚核苷酸。在另外的实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由与具有选自SEQ ID NO：67、72、77、82、87、92、97、102、107、112和117的参考核酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％一致性的VL编码核酸组成的分离多聚核苷酸。在某些实施方案中，包含该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0463] 在另一个方面中，本发明包括包含、主要包含、或由编码本发明VL的核酸序列组成的分离的多聚核苷酸，其中该VL的氨基酸序列选自SEQ ID NO：68、73、78、83、88、93、98、103、108、113和118。本发明还包括包含、主要包含、或由编码本发明VL的核酸序列组成的分离的多聚核苷酸，其中该核酸序列选自SEQ ID NO：67、72、77、82、87、92、97、102、107、112和117。在某些实施方案中，包含该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0464] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含、主要包含、或由一种或多种上述多聚核苷酸编码的VL，或与选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位的VL，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R的VL所组成。
[0465] 在某些实施方案中，包含、主要包含、或通过由一个或多个上述多聚核苷酸编码-2 -2 -3 -3的VL组成的抗体或其抗原结合片段以解离常数(KD)不大于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M 或-15
10 M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段、或IGF-1R变体多肽。
[0466] 上述多聚核苷酸的任意一种还可包括附加核苷酸，其可编码如引导编码多肽分泌的信号肽、本文中所述的抗体恒定区、或本文中所述的其它外源多肽等。
[0467] 此外，如本文中所作的具体描述，本发明包括包含上述一个或多个多聚核苷酸组合物。在一个实施方案中，本发明包括包含第一多聚核苷酸和第二多聚核苷酸的组合物，其中所述的第一多聚核苷酸编码本文中所述的VH多肽，而所述的第二核苷酸编码本文中所述的VL多肽。特别是包含、主要包含、或由VH多聚核苷酸、以及VL多聚核苷酸组成的组合物，其中该VH多聚核苷酸和该VL多聚核苷酸编码与选自SEQ ID NO：4和68、8和73、14和78、20和83、26和88、32和93、38和98、43和103、48和108、53和103、58和113以及63和118的参考VL和VL多肽氨基酸序列分别具有至少80％、85％、90％、95％或100％一致性的多肽。或者可选择地，包含、主要包含、或由与选自SEQ ID NO：3和67、8和72、13和
77、18和77、19和82、24和82、25和87、30和87、31和92、36和92、37和97、42和102、47和107、58和102、57和112以及62和117的参考VL和VL序列分别具有至少80％、85％、
90％、95％或100％一致性的VH多聚核苷酸和VL多聚核苷酸的组合物。在某些实施方案中，包含了该组合物中的多聚核苷酸编码的VH和VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0468] 如别处所述，本发明还包括本发明多聚核苷酸的片段。此外如本文中所述的编码融合多聚核苷酸的多聚核苷酸、Fab片段、以及其它衍生物同样在本发明的预期之内。
[0469] 该多聚核苷酸可通过任何本领域已知的方法进行生产或制备。例如，如果已知该抗体的核苷酸序列，编码该抗体的多聚核苷酸可通过化学合成的寡聚核苷酸进行装配(例如Kutmeier et al.，BioTechniques 17：242(1994)所述)，其主要包括包含编码该抗体的部分序列的重叠寡聚核苷酸的合成，该寡聚核苷酸的退火和连接，以及通过PCR对连接寡聚核苷酸进行扩增。
[0470] 可选择地，编码IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多聚核苷酸可通过来自于适当来源的核酸生成。如果没有包含编码特定抗体的核酸的克隆，但已知抗体分子的序列，编码该抗体的核酸可通过化学合成，或采用从该序列的3′到5′端杂交的合成引物通过PCR扩增从适当来源(例如，抗体cDNA库，或从任何表达该抗体或其它IGF-1R抗体的组织或细胞(例如经选定用于表达一种抗体的杂交瘤细胞)分离得到的cDNA库或和核酸，优选poly A+RNA)获取，或采用对待鉴定的特定基因序列(例如，来自编码该抗体或其它IGF-1R抗体的cDNA库的cDNA克隆)具有特异性的寡聚核苷酸探针进行克隆。然后可用本领域公知的任何技术将PCR生成的扩增核酸克隆进入可复制克隆载体。
[0471] 当对该核苷酸序列和该IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的相应氨基酸进行测定后，可采用本领域公知的操作核苷酸序列的方法(如重组DNA技术、定点突变、PCR等(例如参见Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)and Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1998)所述的技术，其通过引用的方式全文并入本文中)对其核苷酸序列进行操作，以生成具有不同氨基酸序列的抗体，例如形成氨基酸替换，删除，和/或插入。
[0472] 编码IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多聚核苷酸可由任何可以是未修饰RNA或DNA或者修饰RNA或DNA的多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸组成。例如，编码IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多聚核苷酸可由单链和双链DNA，由单链和双链区混合得到的DNA，单链和双链RNA，以及由单链和双链区混合得到的RNA，包含了可能是单链，或者更典型为双链或单链和双链区混合物的DNA和RNA的杂交分子所组成。此外，编码IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多聚核苷酸可由包含RNA或DNA或者同时包含RNA和DNA的三链区所组成。编码IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多聚核苷酸还可包含为稳定或为其它目的进行修饰的一个或多个修饰碱基或者DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和异常碱基如肌苷。DNA和RNA可进行多种修饰；因此，“多聚核苷酸”包括了化学，酶或代谢修饰的形式。
[0473] 通过对免疫球蛋白的核苷酸序列引入一个或多个核苷酸替代，添加或删除可生成编码免疫球蛋白多肽(例如，免疫球蛋白重链区或轻链区)非天然变体的分离多聚核苷酸，从而在编码蛋白中引入一个或多个氨基酸替换，添加或删除。可通过定点突变和PCR介导突变等标准技术引入突变。优选在一个或多个非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸替换。
[0474] V.IGF-1R抗体多肽
[0475] 本发明还包括构成IGF-1R抗体的分离多肽、以及编码该多肽的多聚核苷酸。本发明的IGF-1R抗体包含了如编码来自免疫球蛋白分子的IGF-1R-特异性抗原结合区的氨基酸序列等多肽。多肽或氨基酸序列“来自于”指定蛋白指出了具有特定氨基酸序列的多肽的来源。在某些情况下，来自于特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与该其实序列或其部分充分一致的氨基酸序列，其中该部分至少由10-20个氨基酸，至少20-30个氨基酸，至少30-50个氨基酸组成，或者本领域的普通技术人员可以确认其来源于该起始序列。
[0476] 在一个实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离多肽，其中该重链可变区的至少一个VH-CDR或该重链可变区的至少两个VH-CDR与来自此处披露的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。可选择地，该VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自此处披露的单克隆IGF-1R抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。因此，如该实施方案所述的本发明的重链可变区具有与上文表5中所示的基团相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。尽管表5显示了通过Kabat系统定义的VH-CDR，本发明还包括了其它VH-CDR，例如通过Chothia系统定义的VH-CDR。在某些实施方案中，包含该VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0477] 在另一个实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离多肽，其中该VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与表5所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团一致的多肽序列。在某些实施方案中，包含该VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0478] 在另一个实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离多肽，其中该VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有除了在任意一个VH-CDR中的一个，两个，三个，四个，五个或六个氨基酸替换外与表5所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团一致的多肽序列。在更大的(例如，VH-CDR-3)中，只要包含该VH-CDR的VH能够特异性或优先结合IGF-1R，可在CDR中进行附加替换。在某些实施方案中，该氨基酸替换为保守替换。在某些实施方案中，包含该VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0479] 在另外的实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由与选自SEQ ID NO：SEQ ID NO：4、9、14、20、26、32、38、43、48、53、58和63的参考VH序列至少具有80％、85％、90％、95％或100％一致性的VH多肽组成的分离多肽。在某些实施方案中，包含VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0480] 在另一方面，本发明包括包含、主要包含、或由选自SEQ ID NO：SEQ ID NO：4、9、14、20、26、32、38、43、48、53、58和63的VH多肽组成的分离多肽。在某些实施方案中，包含了该VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0481] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含、主要包含、或由上述与选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性或优先结合相同IGF-R1表位，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R的VH多肽所组成。
[0482] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含、主要包含、或由以解离常数-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6(KD) 不 大 于 5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-7 -7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M或10 M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽的上述一种或多种VH多肽组成。
[0483] 在另一个实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成的分离多肽，其中该轻链可变区的至少一个VL-CDR或该轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。可选择地，该VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自此处所述的单克隆IGF-1R抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。因此，如该实施方案所述本发明的轻链可变区具有与上文表6中多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列：尽管表6显示了通过Kabat系统定义的VL-CDR，本发明还包括了其它VL-CDR，例如通过Chothia系统定义的VL-CDR。在某些实施方案中，包含该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0484] 在另一个实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成的分离多肽，其中该VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与表6所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3基团一致的多肽序列。在某些实施方案中，包含该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0485] 在另一个实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由免疫球蛋白重链可变区(VL)组成的分离多肽，其中该VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有除了在任意一个VL-CDR中的一个，两个，三个，四个，五个或六个氨基酸替换外与表6所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3基团一致的多肽序列。在更大的，只要包含该VL-CDR的VL能够特异性或优先结合IGF-1R，可在VL-CDR中进行附加替换。在某些实施方案中，该氨基酸替换为保守替换。在某些实施方案中，包含该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0486] 在另外的实施方案中，本发明包括包含、主要包含、或由与选自SEQ ID NO：68、73、78、83、88、93、98、103、108、113和118的参考VL序列至少具有80％、85％、90％、95％或
100％一致性的VL多肽组成的分离多肽。在某些实施方案中，包含VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0487] 在另一个方面中，本发明包括包含、主要包含、或由选自SEQ ID NO：68、73、78、83、88、93、98、103、108、113和118的VL多肽组成的分离多肽。在某些实施方案中，包含该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0488] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含、主要包含、或由上述与选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性或优先结合相同IGF-R1表位，或是竞争性抑制该种单克隆抗体或片段结合IGF-1R的一种或多种上述VL多肽所组成。
[0489] 在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含、主要包含、或由以解离常数-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6(KD) 不 大 于 5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-7 -7 -8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M或10 M为特征的亲和性特异性或优先结合IGF-1R多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽的一个或多个上述VL多肽组成。
[0490] 在其它的实施方案中，抗体或抗原结合片段包含、主要包含、或由VH多肽和VL多肽组成，其中该VH多肽和VL多肽与选自SEQ ID NO：4和68、8和73、14和78、20和83、26和88、32和93、38和98、43和103、48和108、53和103、58和113以及63和118的参考VL和VL多肽氨基酸序列分别具有至少80％、85％、90％、95％或100％一致性。在某些实施方案中，包含该VH和VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性或优先结合IGF-1R。
[0491] 上述多肽的任意一种可进一步包括附加多肽，例如，引导编码多肽分泌的信号肽，本文中所述的抗体恒定区，或本文中所述的其它外源多肽。此外，本发明的多肽包括别处所述的多肽片段。本发明的附加多肽包括此处所述的融合多肽，Fab片段，以及其它衍生物。
[0492] 此外，如本文中更为具体的描述，本发明包括包含上述多肽的组合物。
[0493] 本领域的普通技术人员应当能够理解此处披露的IGF-1R抗体多肽可进行修饰，从而与作为其来源的天然结合多肽具有不同的氨基酸序列。例如，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列具有一定的一致性，例如，它可与起始序列具有60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的一致性。
[0494] 此外，还可通过核苷酸或氨基酸替换，删除或插入进行保守替换或“非必需”氨基酸区的改变。例如，除了一个或多个单独氨基酸替换，插入或删除外(例如，一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，十五个，二十个或更多单独氨基酸替换，插入或删除)，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列相一致，除了一个或多个单独氨基酸替换，插入或删除外(例如，一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，十五个，二十个或更多单独氨基酸替换，插入或删除)，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列相一致。在其它实施方案中，除了两个或更少，三个或更少，四个或更少，五个或更少，六个或更少，七个或更少，八个或更少，九个或更少，十个或更少，十五个或更少，或者二十个或更少的单独氨基酸替换，插入，或删除外，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列相一致。在某些实施方案中，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列相对起始序列具有一至五个，一至十个，一至十五个，或一至二十个单独氨基酸替换，插入或删除。
[0495] 本发明的某些IGF-1R抗体多肽包含来自人氨基酸序列的氨基酸序列，主要由其组成、或由其组成。然而，某些IGF-IR抗体多肽包含一个或多个来自另一哺乳动物种类的邻近氨基酸。例如，本发明的IGF-1R抗体可包括灵长类动物的重链区、铰链区、或抗原结合区。在另外的例子中，非鼠抗体多肽(例如，IGF-1R抗体的抗原结合位点)中可能存在一个或多个鼠源氨基酸。在另外的例子中，IGF-1R抗体的抗原结合位点为全鼠源。在特定的治疗应用中，IGF-1R-特异性抗体、或其抗原结合片段、变体或类似物经设计对施用该抗体的动物没有免疫原性。
[0496] 在某些实施方案中，IGF-1R抗体多肽包含通常与抗体无关的氨基酸序列或者一个或多个部分。下文更为具体地描述了示例性修饰。例如，本发明的一种单链fv抗体片段可包含柔性接头序列，或经修饰添加功能性部分(例如PEG、药物、毒素或标记)。
[0497] 本发明的IGF-1R抗体多肽可包括融合蛋白，主要由其组成、或由其组成。融合蛋白为嵌合蛋白，其包括，例如具有至少一个靶结合位点和至少一个外源部分(即，天然情况下不与其连接的部分)的免疫球蛋白抗原结合区。在融合多肽中，通常存在于单独蛋白中的氨基酸序列被放在一起，或是通常在同一蛋白的氨基酸序列被重新排列。融合蛋白可通过化学合成，生成和翻译以所需关系编码肽区的多聚核苷酸等方法生成。
[0498] 应用于多聚核苷酸或多肽的术语“外源”指该多聚核苷酸或多肽来自与其余实体相比不同的实体。例如，如本文中所述，融合至IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体或类似物的“外源多肽”来自于相同物种的非免疫球蛋白多肽、或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
[0499] “保守氨基酸替换”是以具有类似侧链的氨基酸残基替换其中一个氨基酸残基。本领域内已经定义了有类似侧链的氨基酸残基家族，包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未带电极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酸胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，无极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸优选被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基所替代。在另一个实施方案中，一连串氨基酸可通过与侧链家族成员顺序和/或组成不同的结构类似串进行替换。
[0500] 可选择地，在另一个实施方案中，也可通过饱和突变等引入任意长度的全部或部分免疫球蛋白编码序列，将突变体整合进入IGF-1R抗体以用于此处披露的诊断和治疗方法，并对其结合所需抗原(例如，IGF-1R)的能力进行筛选。
[0501] VI.融合蛋白和抗体结合物
[0502] 如本文别处更为具体的描述，本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物还可在N或C末端重组融合至外源多肽或者化学结合(包括共价和非共价结合)至多肽或其它组合物。例如，IGF-1R-特异性IGF-1R抗体可重组融合或结合至可用于检测测定标记的分子或外源多肽，药物，放射性核，或毒素等效应分子。例如，参见PCT公开WO92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624、美国专利No.5,314,995和EP 396,387。
[0503] 本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物包括经修饰的衍生物，即，将任何类型的分子共价连接至该抗体，并使该共价连接不阻碍抗体结合IGF-IR。例如但非限制，该抗体衍生物包括通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，与细胞配体或其它蛋白连接等方法修饰得到的抗体。各种化学修饰中的任意一种均可通过已知技术实现，包括但不限于特异性化学裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素代谢合成等。此外，该衍生物可能包含一个或多个非传统氨基酸。
[0504] 本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可由通过肽键或修饰肽键(即，肽等排物)彼此连接的氨基酸所组成，并可包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。IGF-1R-特异性抗体可通过转译后作用等自然作用，或通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。该修饰在基本文本和更具体的专著，以及大量的研究文献中得到了具体的描述。IGF-1R-特异性抗体的任何部位均可进行修饰，包括肽骨架，氨基酸侧链以及氨基或羧基末端，或在碳水化合物等部分上。应当可以理解在给定IGF-1R-特异性抗体的多个位点可出现相同或不同程度的相同类型的修饰。此外，给定IGF-1R-特异性抗体可包含多种类型的修饰。IGF-1R-特异性抗体可因为泛素化等原因而带有分支，它们也可呈带或不带分支的环状。环状，分支和带分支的环状IGF-1R-特异性抗体可通过转译后自然作用或合成方法形成。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价结合，亚铁血红素部分的共价结合，核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合，脂质或脂质衍生物的共价结合，磷脂酰肌醇的共价结合，交联，环化，形成二硫键，脱甲基，共价交联的形成，半胱氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚形成，羟基化，碘处理，甲基化，豆蔻酰化，氧化，聚乙二醇化，蛋白水解作用，磷酸化，异戊烯化，外消旋，硒化，硫酸盐化，如精胺酰化等经转移RNA介导向蛋白添加氨基酸，泛素化。(例如参见Proteins-Structure And Molecular Properties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York 2nd Ed.，(1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter et al.，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；
Rattan et al.，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。
[0505] 本发明还包括包含IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物以及外源多肽的融合蛋白。该抗体融合的外源多肽可具有功能性或可用于靶向IGF-1R多肽表达细胞。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包括具有本发明抗体任意一个或多个VH区氨基酸序列或本发明抗体或其片段或变体的任意一个或多个VL区氨基酸序列，以及外源多肽序列的多肽，主要由其组成、或由其组成的。在另一个实施方案中，用于此处披露的诊断和治疗方法的融合蛋白包括具有IGF-1R-特异性抗体或其片段、变体或衍生物的任意一个，两个，三个VH-CDR氨基酸序列，或一种IGF-1R-特异性抗体或其片段，变体或衍生物的任意一个，两个，三个VL-CDR氨基酸序列，以及外源多肽序列的多肽，主要由其组成、或由其组成。
在一个实施方案中，该融合蛋白包含了本发明IGF-1R-特异性抗体或其片段、变体或衍生物的VH-CDR3氨基酸序列，以及外源多肽序列的多肽，该融合蛋白特异性结合IGF-1R的至少一个表位。在另一实施方案中，融合蛋白包含具有本发明IGF-1R-特异性抗体的至少一个VH区氨基酸序列和本发明IGF-1R-特异性抗体或其片段、衍生物或变体的至少一个VL区氨基酸序列，以及外源多肽序列的多肽。该融合蛋白的VH和VL区优先对应特异性结合IGF-1R至少一个表位的单独来源抗体(或scFv或Fab片段)。在另一实施方案中，用于此处披露的诊断和治疗方法的融合蛋白包括具有IGF-1R-特异性抗体的任意一个，两个，三个或更多VH CDR氨基酸序列以及IGF-1R-特异性抗体或其片段或变体的任意一个，两个，三个或更多VL CDR氨基酸序列，以及外源多肽序列的多肽，主要由其组成、或由其组成。优选对应本发明单独来源抗体(或scFv或Fab片段)的两个，三个，四个，五个，六个，或更多VH-CDR或VL-CDR。本发明还包括编码这些融合蛋白的核酸分子。
[0506] 文献报导的示例性融合蛋白包括与T细胞受体(Gascoigne et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936-2940(1987))；CD4(Capon et al.，Nature 337：525-531(1989)；Traunecker et al.，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl et al.，DNA Cell Biol.USA 9：347-353(1990)；和Byrn et al.，Nature 344：667-670(1990))；L-选择素(归巢 受 体 )(Watson et al.，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和 Watson et al.，Nature 349：164-167(1991))；CD44(Aruffo et al.，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley et al.，J.Exp.Med.173：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley et al.，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic et al.，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Lesslauer et al.，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)； 和 Peppel et al.，J.Exp.Med.174：
1483-1489(1991))；和IgE受体a(Ridgway and Gorman，J.Cell.Biol.Vol.115，Abstract No.1448(1991))相融合。
[0507] 如本文别处讨论，本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可通过本领域已知方法融合至外源多肽以提高该多肽的体内半衰期或用于免疫测定。例如，在一个实施方案中，可将PEG连接至本发明包括的IGF-1R抗体提高其体内半衰期。Leong，S.R.，et al.，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；or Weir et al.，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
[0508] 此外，本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可融合至标记序列(如肽)以促进其纯化或检测。在优选实施方案中，该标记氨基酸序列为六组氨酸肽，例如pQE载体中所提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)，其中多数已上市销售。如Gentz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：
821-824(1989)所述，例如，用于融合蛋白快速纯化的六组氨酸。其它可用于纯化的肽标签包括但不限于对应来自流感血凝集素蛋白的表位的“HA”标签(Wilson et al.，Cell 37：
767(1984))以及“flag”标签。
[0509] 融合蛋白可通过本领域公知的方法进行制备(例如，参见美国专利No.5,116,964和5,225,538)。可根据经验选择进行融合的精确位点以优化该融合蛋白的分泌或结合特性。然后将编码该融合蛋白的DNA转染进入表达宿主细胞。
[0510] 本发明包括的IGF-1R抗体可以非结合形式使用或与多种分子中的至少一种相结合，例如，可提高该分子的治疗性能，促进靶标检测，或患者的显像或治疗。本发明的IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可在纯化前或纯化后、纯化进行时进行标记或连接。
[0511] 特别地，本发明包括的IGF-1R抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物可连接至治疗剂，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药剂或PEG。
[0512] 本领域的技术人员应能理解根据待连接的选定制剂的不同，可通过多种技术实现该连接。例如，与生物素的连接物可通过结合多肽与生物素的活化酯N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应得到。类似的，与荧光标记的结合物可在偶合剂(例如，此处所列举的偶合剂)的存在下，或通过与异硫氰酸(优选荧光素-硫氰酸)的反应进行制备。本发明包括GF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的结合物可以类似方式进行制备。
[0513] 本发明还包括与诊断或治疗剂相结合的本发明IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物。该IGF-1R抗体可在作为检测特定治疗和/或预防方案的有效性的临床测试步骤中，用于检测神经疾病的发展或进展。可通过将该IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物与可测物质偶合以促进检测。可测物质的例子包括各种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，放射性材料，使用各种正电子发射断层的正电子发射金属，以及非放射性顺磁性金属离子。例如，可连接至抗体并用于本发明所述诊断的金属离子可参见美国专利No.4,741,900。适用酶的例子包括辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或是乙酰胆碱酯酶；适用辅基的例子包括抗生蛋白链菌素-生物素和亲和素-生物素；适用荧光材料的例子包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸萤光素，丹磺酰，二氯三嗪野芝麻碱荧光素，丹磺酰氯或藻红素；发光材料的例子包括发光氨；生物发光材料的例子包括荧光素酶，125 131 111 99
虫荧光素和发光蛋白质；适用放射性物质的例子包括 I、 I、In或 Tc。化合物，例如上述的例子，还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0514] IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物还可通过与化学发光化合物偶合进行可测标记。然后可通过检测化学反应过程中产生的发光以测定化学发光标记IGF-1R抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子为发光氨，异鲁米诺，theromatic，吖啶酯，咪唑，吖啶盐和草酸酯。
[0515] 对IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物进行可测标记的方法之一为将其连接至酶并将连接产物用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，″The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)″Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller et al.，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.et al.，(eds.)，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo(1981))。该种与IGF-1R抗体连接的酶将以特定方式适当的底物(优选发色底物)反应从而生成可通过分光光度计，荧光计或视觉方法检测的化学部分。可用于可测标记该抗体的酶包括但不限于，苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，delta-5-类固醇异构酶，酵母乙醇脱氢酶，alpha-甘油磷酸脱氢酶，丙糖磷酸盐异构酶，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，beta-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可通过采用针对该酶的发色底物的比色法实现该检测。还可通过对底物的酶反应程度与类似建立的标准的视觉比较实现该检测。
[0516] 还可通过多种其它免疫测定方法实现该检测。例如，在放射性标记该IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物后，可采用放射性免疫测定(RIA)检测该抗体(例如参见Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，(March，1986)，其通过引用的方式并入本文中)。该放射性同位素的检测手段包括但不限于伽马计数器，闪烁计数器，自动射线摄影。
[0517] IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物还可采用152Eu或其它镧系元素等荧光发射金属进行可测标记。这些金属可通过二乙烯三胺五乙酸((DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属鳌合基团连接该抗体。
[0518] 将各种部分连接至IGF-1R抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的技术已熟知，例如参见Amon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，pp.623-53(1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies ′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，Academic Press pp.303-16(1985)，and Thorpe et al.，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
[0519] 特别地，用于此处披露的诊断和治疗方法的结合分子(例如，IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可被结合至细胞毒性(例如放射性同位素，细胞毒性药物，或毒素)治疗剂，细胞抑制剂，生物毒素，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药剂，免疫活性配体(例如，淋巴因子或其它抗体，其中所得的分子同时结合肿瘤细胞和效应细胞(如T细胞))，或PEG。在另一实施方案中，用于此处披露的诊断和治疗方法的结合分子(例如，IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可被结合至降低肿瘤血管形成的分子。在其它实施方案中，所披露的组合物可包含结合分子，例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽。本发明的其它实施方案包含了结合分子的用途，例如，与特异性生物毒素或其细胞毒性片段(例如，蓖麻毒素，白树毒素，假单胞菌外毒素或白喉毒素)结合的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽的用途。结合或未结合的结合分子的使用选择将依赖于癌症的类型和阶段，辅助治疗的使用(例如，化疗或外部辐射)以及患者的状态。可以理解本领域的技术人员将能够根据此处的教导容易地作出选择。
[0520] 可以理解，在过去的研究中，带有同位素标记的抗肿瘤抗体曾成功地被用于破坏动物模型、部分情况下在人体内的实体肿瘤和淋巴瘤/白血病中的细胞。示例性放射性同90 125 131 123 111 105 153 67 67 166 177 186 188
位素包括：Y、 I、I、 I、In、 Rh、Sm、Cu、Ga、 Ho、Lu、 Re。 Re。该放射性核通过生成致电离辐射，在核DNA中引起多条链的断裂，从而导致细胞死亡。用于生成治疗性结合物的同位素通常可产生具有短光程长的高能量α-或β-粒子。该种放射性核可以杀死它们极为接近的细胞，例如该结合物吸附或进入的肿瘤细胞。它们对于非定域细胞作用很小或没有作用。放射性核基本上为非免疫原性。放射性核，例如上述的例子，可以和IGF-1R抗体或其片段结合或联合使用。
[0521] 对于在本发明中使用放射标记结合物或和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用的放射标记分子，结合分子，例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽可直接标记(例如通过碘化)或可以通过使用鳌合剂间接标记。本文中所用的短语“间接标记”和“间接标记方法”均指鳌合剂被共价吸附至结合分子，且至少一个放射核与该鳌合剂结合。该种鳌合剂通常指双功能鳌合剂，因为它们同时结合多肽和放射性同位素。特别优选的鳌合剂包括1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(“MX-DTPA”)和环己基二乙烯三胺五乙酸(“CHX-DTPA”)衍生物。其它的鳌合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。特别111 90
优选的用于间接标记的放射性核包括 In和 Y。
[0522] 本文中所用的短语“直接标记”和“间接标记方法”同时指放射性核被共价直接吸附至多肽(通常通过氨基酸残基)。更具体地，这些连接技术包括随机标记和定点标记。对于后者，该标记发生在多肽上的特定位点，例如仅在该结合物的Fc部分存在的N-连接的糖残基。此外，各种直接标记技术和方案在本发明适用。例如，碍-99标记的多肽可通过-配体交换过程制备，其中通过锡粒子溶液还原高得酸(TcO4)，将还原的得鳌合至Sephadex柱，并向该柱应用结合多肽，或者也可采用批量标记技术，例如，孵育高锝酸，还原剂(例如SnCl2)，缓冲溶液(例如邻苯二甲酸钠-钾溶液)以及抗体。在任何情况下，优选用于直接标记抗体的放射性核已为本领域公知，并特别优选的用于直接标记的放射性核为通过酪氨
131
酸残基共价吸附的 I。用于此处披露的诊断和治疗方法的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可通过过放射活性碘化钠或钾以及化学氧化剂(例如，次氯酸钠，氯胺T等)，或是酶氧化剂(例如乳过氧化酶，葡萄糖氧化酶和葡萄糖)进行衍生。
[0523] 有关鳌合剂和鳌合剂结合物的专利已为本领域所知。例如，Gansow的美国专利No.4,831,175涉及多取代二乙烯三胺五乙酸鳌合剂以及包含它的蛋白结合物，以及它们的制备方法。Gansow的美国专利No.5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287和5,124,471同样涉及多取代DTPA鳌合剂。这些专利均通过引用的方式并入本文中。适用金属鳌合剂的其它例子为乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)、1，4，8，11-四氮杂十四烷、1，4，8，11-四氮杂十四烷-1，4，8，11-四乙酸，或特别优选并在下文多次体现的类似物环己基-DTPA或CHX-DTPA。其它的适用鳌合剂包括尚待发现的鳌合剂，这些鳌合剂可由技术人员简单地辨别，且明确包含在本发明的范围之内。化合物，例如上述的例子，还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0524] 优先选择相容性鳌合剂(包括用于促进鳌合的特异性双功能鳌合剂)，美国专利No.6,682,134、6,399,061和5,843,439，这些专利均通过引用的方式并入本文中，以提供对三价金属的高亲和性，显示更高的肿瘤对非肿瘤比例，更低的骨吸收以及放射性核在靶点(即，B-细胞淋巴瘤位点)更大的体内保留。然而，具有或不具有所有这些特征的其它的双功能鳌合剂已为本领域所知并可在肿瘤治疗中形成益处。化合物，例如上述的例子，还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0525] 还可以认识到，根据此处的教导，结合分子可因诊断和治疗目的被结合至不同的放射性标记。为此前述美国专利No.6,682,134，6,399,061和5,843,439披露了放射性标记的治疗性结合物，用于在治疗性抗体施用前的肿瘤诊断“成像”。“In2B8”结合物包含通过双功能鳌合剂，即MX-DTPA(二乙烯三氨五乙酸)(其包含1-异硫氰苄基-3-甲基-DTPA111
和1-甲基-3-异硫氰苄基-DTPA的1∶1混合物)连接至 In的特异性针对人CD20抗
111
原的鼠单克隆抗体2B8。 In是特别优选的诊断性放射性核，因为在约1至约10mCi的放
90
射性核可以安全施用而没有可测的毒性；且该成像数据可一般预测后续 Y标记的抗体分
111
布。大部分成像研究采用5mCi In标记的抗体，因为该剂量既安全又与更低剂量相比具有更大的成像效率，在抗体施用后三至六日出现最佳成像。例如参见Murray，J.Nuc.Med.26：
3328(1985)and Carraguillo et al.，J.Nuc.Med.26：67(1985)。化合物，例如上述的例子，还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0526] 如上文所指出，多种放射性核适用于本发明，且本领域技术人员可以在不同的条131
件下容易地确定何种放射性核最为适当。例如， I是公知的用于标靶型免疫疗法的放射性
131
核。然而， I的临床使用可受到多种因素限制，包括八天物理半衰期；在血液和肿瘤位点中碘化抗体的脱卤；以及排放特性(例如，大伽玛组成)，它可以次优化在肿瘤中局部剂量沉积。随着优势鳌合剂的出现，将金属鳌合基团连接至蛋白的机会提高了采用其它放射性
111 90 90 90
核如 In和 Y的机会。 Y在放射免疫治疗应用中提供了多种益处：Y的64小时半衰期
131 90
足以允许肿瘤积聚抗体，且与 I等不同，Y是纯高能β-发射体，在其衰减过程中不伴有
90
γ辐射，且在组织中的范围为100至1000细胞直径。此外，最小的穿透辐射量允许 Y标记抗体的门诊施用。另外，细胞杀死不要求标记抗体的内在化，且电离辐射的局部排放对缺乏目标分子的部近肿瘤细胞是致命的。放射性核，例如上述的例子，还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0527] 其它优选的针对结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)的结合制剂为细胞毒性药物，特别是用于癌症治疗的细胞毒性药物。本文中所用的“细胞毒素或细胞毒性剂”指对细胞的生长和增殖不利且能减少，抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的任意制剂。示例性细胞毒素包括但不限于，放射性核，生物毒素，酶活毒素，细胞抑制或细胞毒性治疗剂，前药，免疫活性配体和生物应答调节剂如细胞因子。延迟或减缓免疫活性细胞或恶性细胞生长的任何细胞毒素均在本发明的范围之内。细胞毒素，例如上述的例子，还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0528] 一般来说，示例性细胞毒素包括细胞抑制剂，烷基化剂，抗代谢剂，抗增殖剂，微管蛋白结合剂，激素和激素拮抗剂等。适用于本发明的示例性细胞抑制剂包括烷基化物质，如氮芥，三亚乙基磷酰胺，环磷酸胺，异环磷酰胺，苯丁酸氮芥，白消安，美法仑或三亚胺苯，以及亚硝基脲化合物，如卡氮芥，罗莫司丁或司莫司汀。其它优选的细胞毒性剂类别包括，例如，美登醇家族药物其它优选的细胞毒性剂类别包括，例如，蒽环类家族药物，长春花药物，丝裂霉素，博莱霉素，细胞毒性核苷，蝶啶家族药物，二炔和足叶草毒素。这些类别中特别有用的成员包括，例如，阿霉素，洋红霉素，柔红霉素(柔毛霉素)，阿霉素，氨喋呤，氨甲喋呤，甲喋呤，光神霉素，链黑菌素，二氯氨甲喋呤，丝裂霉素C，放线菌素D、紫莱霉素，5氟尿嘧啶，氟尿苷，氟嘧啶，6-巯嘌呤，阿糖胞苷，阿糖胞苷，鬼臼毒素，或鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷或依托泊苷磷酸盐，美法仑，长春碱，长春新碱，异长春碱，长春地辛，长春罗新等。适用于此处教导的其它细胞毒素包括紫杉醇，紫杉烷，细胞松弛素B，短杆菌肽D，澳化乙锭，替尼泊苷，秋水仙碱，羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，嘌呤霉素及其类似物或同系物。激素和激素拮抗剂如皮质类固醇，例如泼尼松，孕酮，例如羟孕酮或安宫孕酮，雌激素，例如己烯雌酚，抗雌激素，例如他莫昔芬，雄激素，例如睾酮以及芳香酶抑制剂，例如氨鲁米特同样适用于此处的教导。本领域的技术人员可对目标化合物进行化学修饰以该化合物的反应更利于制备本发明结合物的目的。化合物，例如上述的例子，还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0529] 特别优选的细胞毒素的一个例子包括抗肿瘤抗生素烯二炔家族的成员或衍生物，包括卡奇霉素，埃斯培拉霉素或动力霉素(dynemicins)。这些毒素非常有效，并通过裂解核DNA，导致细胞死亡产生作用。与能在体内裂解产生许多无活性但具有免疫原性的多肽片段的蛋白毒素不同，如卡奇霉素，埃斯培拉霉素和其它烯二炔等毒素为基本无免疫原性的小分子。这些非肽毒素被通过前述用于标记单克隆抗体和其它分子的技术化学连接至二聚体或四聚体。该类连接技术包括通过仅存在于该构建体Fc部分的N-连接的糖残基进行的位点特异性连接。该种定点连接方法具有减少对构建体结合性能上的连接键的可能影响的优势。化合物，例如上述的例子，还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0530] 如上文指出，用于制备结合物的相容性细胞毒素可包括前药。本文中所用的术语“前药”指与母体药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性更小，且能够被酶活化或转化成为更具活性的母体形式的药物活性物质的前体或衍生形式。适用于本发明的前药包括但不限于能被转化为更具活性的细胞毒性游离药物的含磷酸盐前药，含硫代磷酸盐前药，含硫酸盐前药，含肽前药，含β-内酰胺前药，含可选取代的苯氧乙酰胺的前药，或含可选取代的苯乙酰胺的前药，5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药。可被衍生成为在本发明中使用的前药形式的细胞毒性药物的其它例子包括上述化学治疗剂。化合物，例如上述的例子，还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0531] 除了其它细胞毒素外，可以理解此处披露的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫原性片段等结合多肽)也可被连接或结合至蓖麻毒素A，相思豆毒素，白喉毒素，肉毒杆菌，蓝藻毒素，蛤蚌毒素，志贺毒素，破伤风，河豚毒素，单端孢霉烯，青霉颤抖毒素或有毒的酶等生物毒素。优选地，该构建体可通过允许抗体-毒素构建体直接表达的遗传工程技术进行制备。其它可与此处披露的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫原性片段等结合多肽)连接的生物应答调节剂包括细胞因子，例如淋巴因子和干扰素。鉴于本发明的披露，可以认为本领域的技术人员能够通过常规的技术容易地形成该类构建体。化合物，例如上述的例子，还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0532] 其它可与所披露的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫原性片段等结合多肽)连接或结合的适用细胞毒素的种类为能够有效导向肿瘤或免疫活性细胞的放射敏感性药物。该种药物增强对电离辐射的敏感型，从而提高放射治疗的效力。被肿瘤细胞内在化的抗体结合物可将放射敏化剂传递至更靠近放射敏化作用最大的细胞核处。连接了游离放射敏化剂的本发明的结合分子将被快速从血液中清除，剩余放射敏化剂将定位在目标肿瘤中，并提供正常组织中的最小吸收。从血液中快速清除后，将通过以下三种方法中的一种施用辅助放射治疗：1)特异性针对肿瘤的外部辐射束，2)移植进入肿瘤的放射能，或者3)通过相同的靶向抗体进行全身放射免疫治疗。对该方法存在潜在吸引力的变化为将治疗性放射性同位素连接至放射敏化免疫结合物，从而提供向患者施用单种药物的便利。放射敏感性药物还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0533] 在特定的实施方案中，可结合能提高结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)稳定性或效力的部分。例如，在一个实施方案中，可向本发明的结合分子结合PEG以提高其体内半衰期。Leong，S.R.，et al.，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；or Weir et al.，Biochem.Soc.Transactions
30：512(2002)。PEG还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0534] 本发明还包含与诊断或治疗剂结合的结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)的用途。例如，该结合分子可在作为检测特定治疗和/或预防方案的有效性的临床测试步骤中，用于检测肿瘤的发展或进展。可通过将结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)偶合至可测物质帮助检测。可测物质的例子包括各种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，放射性材料，使用各种正电子发射断层的正电子发射金属，以及非放射性顺磁性金属离子。例如，可连接至抗体并用于本发明所述诊断的金属离子可参见美国专利No.4,741,900。适用酶的例子包括辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或是乙酰胆碱酯酶；适用辅基的例子包括抗生蛋白链菌素-生物素和亲和素-生物素；适用荧光材料的例子包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸萤光素，丹磺酰，二氯三嗪野芝麻碱荧光素，丹磺酰氯或藻红素；发光材料的例子包括发光氨；生物发光材料的例子包括荧光素酶，虫荧光素和发光蛋白质；适用放射性物质的例子125 131 111 99
包括 I、 I、In或 Tc。化合物，例如上述的例子，还可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖病症。
[0535] 结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)还可通过与化学发光化合物偶合进行可测标记。然后可通过检测化学反应过程中产生的发光以测定化学发光标记结合分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子为发光氨，异鲁米诺，theromatic，吖啶酯，咪唑，吖啶盐和草酸酯。
[0536] 对结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)进行可测标记的方法之一为将其连接至酶并将连接产物用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，″The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)″Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller et al.，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enrymol.73：
482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.et al.，(eds.)，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo(1981)。
该种与结合分子连接的酶将以特定方式适当的底物(优选发色底物)反应从而生成可通过分光光度计，荧光计或视觉方法检测的化学部分。可用于可测标记该抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，delta-5-类固醇异构酶，酵母乙醇脱氢酶，alpha-甘油磷酸脱氢酶，丙糖磷酸盐异构酶，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，beta-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可通过采用针对该酶的发色底物的比色法实现该检测。还可通过对底物的酶反应程度与类似建立的标准的视觉比较实现该检测。
[0537] 还可通过多种其它免疫测定方法实现该检测。例如，在放射性标记该结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)后，可采用放射性免疫测定(RIA)检测该抗癌剂(例如参见Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，(March，1986)，其通过引用的方式并入本文中)。该放射性同位素的检测手段包括但不限于伽马计数器，闪烁计数器，自动射线摄影。
[0538] 结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)还可采用152Eu或其它镧系元素等荧光发射金属进行可测标记。这些金属可通过二乙烯三胺五乙酸((DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属鳌合基团连接该抗体。
[0539] 将各种部分连接至结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)的技术已熟知，例如参见Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy ″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom et al.， ″ Antibodies For Drug Delivery ″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，pp.623-53(1987)；
Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies ′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，Academic Press pp.303-16(1985)，and Thorpe et al.，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
[0540] VII.抗体多肽的表达
[0541] 众所周知，RNA可通过标准技术(例如在异硫氰酸胍萃取和沉淀后进行离心或层析)从原始杂交瘤细胞或其它转化细胞分离。在需要时可通过oligo dT纤维素层析等标准技术从总RNA分离mRNA。适用的技术已为本领域熟知。
[0542] 在一个实施方案中，编码该抗体轻链和重链的cDNA可参照公知的方法采用逆转录酶和DNA聚合酶同时或单独制备。可通过共有恒定区引物或基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更具特异性的引物启动PCR。如上文讨论，PCR还可用于分离编码该抗体轻链和重链的DNA克隆。在此处可用共有引物或更具同源性探针如鼠恒定区探针筛选该库。
[0543] DNA，通常是质粒DNA，可采用本领域已知技术从细胞分离，并参考标准的，公知技术(例如，其具体内容可参见前述有关重组DNA技术的参考文献)获得限制性酶图谱和测序。当然，该DNA可在分离过程或后续分析中参照本发明在任意点进行合成。
[0544] 在对分离的遗传物质进行操作以提供本发明IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物后，编码该IGF-1R抗体的多聚核苷酸通常被插入表达载体并引导进入可用于生产所需数量IGF-1R抗体的宿主细胞。
[0545] 抗体，或其片段，衍生物或类似物，例如结合此处所述的目标分子(例如，IGF-1R)的抗体的重链或轻链的重组表达需要构建包含了编码该抗体的多聚核苷酸的表达载体。在获得编码本发明抗体分子或者抗体的重链或轻链，或其部分(优选包含该重链或轻链可变区)的多聚核苷酸后，可通过本领域公知的重组DNA技术制备生产该抗体分子的载体。因此，此处描述了通过表达包含抗体编码核苷酸序列的多聚核苷酸制备蛋白的方法。
可采用本领域技术人员公知的方法构建包含抗体编码序列和适当的转录和转译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体内重组DNA技术，合成技术，以及体内遗传重组。因此，本发明提供了包含可操作地连接至启动子的编码本发明抗体分子，或其重链或轻链，或重链或轻链可变区的核苷酸序列的可复制载体。该类载体可包含编码该抗体分子恒定区的核苷酸序列(例如，参见PCT公开WO 86/05807；PCT公开WO 89/01036以及美国专利No.5,122,464)，且该抗体的可变区可被克隆进入该种载体以表达完整的重或轻链。
[0546] 该宿主细胞可被两个本发明的表达载体共转染，该第一载体编码重链衍生多肽，该第二载体编码轻链衍生多肽。这两种载体可包含相同的能使重和轻链多肽同等表达的可选择标记。可选择地，也可使用同时编码重和轻链多肽的单独载体。在该种情况下，该轻链被优先放置在重链之前以防止过量的无毒重链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。该重和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
[0547] 此处所用的术语“载体”或“表达载体”指根据本发明所用的作为导入和在宿主细胞表达目标基因的工具的载体。如本领域技术人员所知，该种载体可从由质粒，噬菌体，病毒和逆转录病毒构成的组合简单地进行选择。一般而言，适用本发明的载体将包含选择性标记，帮助目标基因进行克隆的适当限制性酶切位点以及进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
[0548] 可采用多种表达载体系统实现本发明目的。例如，一类利用来自动物病毒(例如牛乳头瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，痘苗病毒，杆状病毒，逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒)的DNA元件的载体。其它包括了具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的应用。此外，将该DNA整合至其染色体的细胞可通过导入一个或多个支持转染宿主细胞选择的标记进行选择。该标记可向营养缺陷型宿主提供原营养，耐受抗微生物剂(例如，抗生素)或耐受铜等重金属。该选择性标记基因既可直接连接至待表达的DNA序列，也可通过共转化导入相同的细胞。为优化mRNA的合成可能还需要附加的元件。这些元件可包括信号序列，剪接信号，以及转录启动子，增强子，以及终止信号。
[0549] 在特定优选实施方案中该克隆可变区基因与上述方法合成的(优选人)重和轻链恒定区一起插入表达载体。在一个实施方案中，这可通过称为NEOSPLA(披露于美国专利6,159,730)的Biogen IDEC，Inc.的专有表达载体作用。该载体包含了细胞巨化病毒启动子/增强子，小鼠beta球蛋白主启动子，SV40复制起始区，牛生长激素多聚腺苷酸化序列，新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2，二氢叶酸还原酶基因和前导序列。据发现通过结合可变和恒定区基因，在CHO细胞内转染，在含6418培养基筛选并通过氨甲喋呤扩增时，该载体可导致极高水平的抗体表达。当然，任何能在真核细胞引发表达的表达载体均可用于本发明。适用载体的范例包括但不限于质粒pcDNA3，pHCMV/Zeo，pCR3.1，pEF1/His，pIND/GS，pRc/HCMV2，pSV40/Zeo2，pTRACER-HCMV，pUB6/V5-His，pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，San Diego，CA购买)，以及质粒pCI(可从Promega，Madison，WI购买)。一般而言，对大量的转染细胞进行筛选以确定其是否表达了适当高水平免疫球蛋白重和轻链是常规实验，其可通过机器人系统等形式开展。载体系统的描述还可参见美国专利No.5,736,137和
5,658,570，其通过引用的方式全文并入本文中。该系统提供了很高的表达水平，例如，＞
30pg/细胞/天。其它示例性载体系统披露于美国专利6,413,777。
[0550] 在其它优选实施方案中，本发明的IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物可采用多顺反子构建体进行表达，例如可参见2002年11月18日提交的美国专利申请公开No.2003-0157641A1，其通过引用的方式全文并入本文中。在这些新型表达系统中，多个目的基因产物例如抗体的重和轻链可通过单个多顺反子构建体生产。这些系统利用了内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞内提供相对高水平的IGF-1R抗体，例如，结合多肽，例如，IGF-1R特异性抗体或其免疫特异性片段。适用IRES序列可参见在此引用的美国专利No.6,193,980。本领域技术人员应当可以理解该种表达系统可被用于有效生产本发明披露的全系列的IGF-1R抗体。
[0551] 更普遍而言，一旦制备得到编码IGF-1R抗体的单体亚基的载体或DNA序列，该表达载体可被导入合适的宿主细胞。质粒相宿主细胞的导入可采用本领域技术人员公知的多种技术实现。这些技术包括但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)，原生质体融合，磷酸钙沉淀，带有套膜DNA的细胞融合，显微注射以及用完整病毒感染。参见Ridgway，A.A.G.″Mammalian Expression Vectors″Vectors，Rodriguez and Denhardt，Eds.，Butterworths，Boston，Mass.，Chapter 24.2，pp.470-472(1988)。质粒通常通过电穿孔导入宿主细胞。在适于轻链和重链生产的条件下培养带有表达构建体的宿主细胞，并对重和/或轻链蛋白合成进行测定。示例性检测技术包括酶联免疫吸附分析(ELISA)，放射性免疫测定(RIA)，或荧光激活细胞分类分析(FACS)，免疫组化等。
[0552] 该表达载体通过常规技术转入宿主细胞，然后以常规技术培养该转染细胞以生产用于此处所述方法的抗体。因此，本发明包括了包含可操作地连接至外源启动子的编码本发明抗体，或其重或轻链的多聚核苷酸的宿主细胞。在针对表达双链抗体的优选实施例中，如下文详述，同时编码重和轻链的载体可在宿主细胞中共表达以表达完整免疫球蛋白分子。
[0553] 此处所述的“宿主细胞”指能够接受使用重组DNA技术构建并至少编码一种外源基因的载体的细胞。在对从重组宿主分离抗体的方法的描述中所用的术语“细胞”和“细胞培养物”可相互替换地说明抗体的来源(除非另行清楚指明)。换言之，可回收多肽的“细胞”即可指离心得到的全细胞，也可指包含了培养基和悬浮细胞的细胞培养。
[0554] 可采用多种宿主表达载体系统来表达用于此处所述方法的抗体分子。该种宿主表达系统代表了可生产和后续纯化目标编码序列的载体，还代表了在以适当核苷酸编码序列进行转化或转染后原位表达本发明抗体分子的细胞。其包括但不限于微生物，如以包含了抗体编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA表达载体转染的细菌(例如，大肠杆菌，枯草芽袍杆菌)；以包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转染的酵母(例如，毕赤酵母)；以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转染的植物细胞系统；或包含了带有哺乳动物细胞基因组启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5k启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS，CHO，BLK，293，3T3细胞)。优选地，可使用细菌细胞如大肠杆菌，更优选使用真核细胞表达重组抗体分子，特别是完整重组抗体分子。例如，结合来自人细胞巨化病毒的中间早期基因启动子元件等载体的哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是一种有效的抗体表达系统(Foecking et al.，Gene 45：101(1986)；Cockett et al.，Bio/Technology 8：2(1990))。
[0555] 该用于蛋白表达的宿主细胞系通常来源于哺乳动物；本领域技术人员应当具有优选适用于表达目标基因产物的特定宿主细胞系的能力。示例性宿主细胞系包括但不限于，CHO(中国仓鼠卵巢细胞)，DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR缺陷型)，HELA(人子宫颈癌)，CVI猴肾细胞系)，COS(带有SV40T抗原的CVI衍生物)，VERY，BHK(幼仓鼠肾)，MDCK，293，WI38，81610(中国仓鼠纤维原细胞)，BALBC/3T3(鼠成纤维)，HAK(仓鼠肾细胞系)，SP2/O(小鼠骨髓瘤)，P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)，RAJI(人淋巴细胞)以及293(人肾)。特别优选CHO细胞。通常可从商业服务机构，美国组织培养物保藏中心或公开文献获取。
[0556] 此外，还可选择以特定形式调节插入序列表达，或修饰和处理基因产物的宿主细胞株。对该蛋白产物的该种修饰(例如，糖基化)和处理(例如，裂解)可对该蛋白的功能非常重要。不同的宿主细胞可对蛋白和基因产物的转译后处理和修饰均有不同的特性和特殊的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的正确修饰和处理。为此，可使用具有正确处理基因产物的初级转录，糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。
[0557] 优选稳定表达以进行重组蛋白的长期高产量生产。例如，可通过工程改造得到稳定表达该抗体分子的细胞系。宿主细胞可通过由适当表达控制元件(例如，启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的进行转化，而非使用包含病毒复制起始区的表达载体。在导入外源DNA后，将工程细胞在富集培养基中培养1-2天，然后转入选择性培养基。重组质粒中的选择性标记可带来对选择因素的耐受并使细胞将该质粒稳定整合进入其染色体，然后生长得到可进行后续克隆并扩展入细胞系的病灶。该方法可用于工程改造可稳定表达抗体分子的细胞系。
[0558] 多种选择系统可供使用，包括但不限于可分别应用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，Cell 11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))，以及腺喋呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.，Cell 22：817 1980)基因。此外，抗代谢物抗性可用作下列基因选择的基础：具有对氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler et al.，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；O ′ Hare et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；具有对麦考酚酸的抗性的gpt(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
78：2072(1981))；具有对氨基糖苷G-418的抗性的neo(Clinical Pharmacy 12：488-505；
Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：
573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；and Morgan and Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；TIB TECH 11(5)：155-215(1993年 5月 )；具 有对潮霉素的抗性的hygro(Santerre et al.，Gene 30：147(1984))。本领域公知的可供使用的重组DNA技术可参见Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；and in Chapters 12 and 13，Dracopoli et al.(eds)，Current Protocols in 人 Genetics，John Wiley & Sons，NY(1994)；
Colberre-Garapin et al.，J.Mol.Biol.150：1(1981)，其通过引用的方式全文并入本文中。
[0559] 抗体分子的表达水平可通过载体扩增得到提高(其综述参见Bebbington and Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Academic Press，New York，Vol.3.(1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可进行扩增时，宿主细胞培养中抑制剂水平的提升可提高标记基因拷贝数。由于扩增区与抗体基因关联，因而抗体的产量也会得到提高(Crouse at al.，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
[0560] 体外生产可以放大，以获得大量的所需多肽。在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术已为本领域所知并包括均匀悬浮培养(例如，在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或是固定化或包埋细胞培养(例如，在中空纤维，微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷芯上)。在必须和/或需要时，例如，在合成铰链区多肽的生物合成后，或在此处所述的HIC层析步骤前后，该多肽溶液可通过常规层析方法进行纯化，例如凝胶过滤，离子交换层析，DEAE-纤维素层析或(免疫-)亲和层析。
[0561] 编码本发明IGF-1R抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物的基因还可通过非哺乳动物细胞(例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞)进行表达。较容易接受核酸的细菌包括肠杆菌成员，例如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌，以及流感嗜血杆菌。应当进一步指出，在细菌中表达时该外源多肽通常作为包含体的一部分。该外源多肽可进行分离，纯化然后组装入功能性分子。在需要抗体的四价形式时，该亚基将自动装配进入四价抗体(WO 02/096948 A2)。
[0562] 在细菌系统中，根据被表达的抗体分子的目标用途，可选择使用多种表达载体。例如，当需要生产大量该种蛋白，以得到抗体分子的药物组合物时，可采用能够引导高水平表达易纯化融合蛋白产物的载体。该类载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.，EMBO J.2：1791(1983))，其中该抗体克隆序列可在与lacZ编码区同框的情况下单独连接至该载体从而生产融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))等。pGEX载体也可用于将外源多肽以谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白的形式进行表达。一般而言，该种融合蛋白具有可溶性，并能通过吸附，结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠，然后在自由谷胱甘肽存在下洗脱进行简单的纯化。通过设计该pGEX载体包括了凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，从而使该克隆的目标基因产物可以从GST部分释放。
[0563] 除了原核生物外，还可采用真核微生物。尽管许多其它的菌株(例如，毕赤酵母)已上市销售，酿酒酵母，或普通面包酵母在真和微生物中最为常用。
[0564] 通常可使用质粒YRp7(Stinchcomb et al.，Nature 282：39(1979)；Kingsman et al.，Gene 7：141(1979)；Tschemper et al.，Gene 10：157(1980))等在酵母中进行表达。该质粒已包含了可为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变菌株(例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics 85：12(1977))提供选择性标记的TRP1基因。然后作为酵母宿主细胞基因组特征的Trp1病斑的存在为色氨酸缺失生长下转化的检测提供了有效的环境。
[0565] 在昆虫系统中，通常使用蓿苜尺蠖核多角体病毒(AcNP V)作为表达外源基因的载体。该病毒生长于草地夜蛾细胞。该抗体编码序列可单独克隆进入该病毒的非必须区(例如多角体蛋白基因)并位于AcNPV启动子(例如该多角体蛋白启动子)的控制下。
[0566] 当本发明的抗体分子被重组表达后，可通过本领域已知的任意免疫球蛋白分子纯化方法对其进行纯化，例如，层析(例如，离子交换层析，亲和层析，特别是对蛋白A特异性抗原的亲和层析，筛分柱层析)，离心，微分溶出，或通过任何其它蛋白纯化标准技术。可选择地，提高本发明抗体亲和性的优选方法参见US 2002 0123057 A1。
[0567] VIII.采用治疗性特异性IGF-1R-抗体或其免疫特异性片段的治疗方法
[0568] 本发明的一种实施方案提供在患有该种疾病或易于染上该种疾病的动物体内治疗过度增殖疾病或病症(例如癌症、恶性肿瘤、肿瘤或其转移性病灶)的方法，该方法包括、主要包括、或由向该动物施用有效量的结合IGF-1R或IGF-1R变体的抗体或其免疫特异性片段组成。
[0569] 本发明的另一种实施方案提供在患有该种疾病或易于染上该种疾病的动物体内治疗过度增殖疾病或病症(例如癌症、恶性肿瘤、肿瘤或其转移性病灶)的方法，该方法包括、主要包括、或由向该动物施用有效量的作为第一制剂的结合IGF-1R或IGF-1R变体的抗体或其免疫特异性片段，和联合所述第一制剂施用一种或多种治疗上也用于治疗中过度增殖疾病或病症的另外的制剂(其中所述一种或多种另外的制剂相对于所述第一制剂同时、并行或单独，但是顺序施用(以任何次序，在任何时间段)组成。
[0570] 本发明的联合包括联合结合IGF-1R的抗体(或其片段)和任何治疗上用于治疗过度增殖疾病或病症的任何一种或多种另外的制剂，而无论所述另外的制剂是否具有抗过度增殖活性。例如，在另外的制剂不具有任何抗癌活性的情况下，联合IGF-1R抗体的另外的制剂可用于通过减轻或缓解征兆来治疗癌症。因此，本发明的联合包括提供IGF-1R抗体(或其片段)和另外的一种或多种制剂，其中所述另外的一种或多种制剂通过有益于被治疗的受试者的活性而支持癌症的治疗，尽管这种活性可能不是抗过度增殖的。例子是联合具有抗过度增殖活性的IGF-1R抗体(或其片段)和促红细胞生成素(EPO)，所述促红细胞生成素刺激血红细胞产生，但是其借助于其抗贫血活性而在癌症治疗中是有益的。
[0571] 联合IGF-1R抗体(或其片段)的另外的制剂也不限于在本说明书中特定或一般鉴定的具体药物、化合物、化学品或分子中的任一种。当然，可以在治疗上用于治疗过度增殖疾病或病症的任何另外的药物、化合物、化学品或分子都可以联合IGF-1R抗体(或其片段)以起到所述疾病或病症的治疗效果。因此，在本说明书中特定或一般鉴定的所有药物、化合物、化学品和分子都仅仅是以提供例子的方式来鉴定，无论如何并不意欲以任何方式限制本发明的联合。另外，本发明的实施方案包括联合可以用于治疗过度增殖疾病或病症的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和任何更多数量的另外的制剂(例如10-20、20-100、100-1000、1000-1000000、或多于1,000,000的范围内的任何数量的另外的制剂)。
[0572] 合适的IGF-1R抗体包括本文中所述的所有IGF-1R抗体及其抗原特异性片段。例子包括但不限于与选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异结合相同IGF-R1表位的分离抗体或其抗原结合片段；特异性结合IGF-R1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段竞争性抑制选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体结合IGF-R1；或是特异性结合IGF-R1的分离抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含与选自M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04的参考单克隆Fab抗体片段或是与选自P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8的杂交瘤生产的参考单克隆抗体一致的抗原结合域。
[0573] 在特定的实施方案中，本发明的特异性结合IGF-1R或其变体的抗体抑制一种或多种胰岛素生长因子(例如，IGF-1、IGF-2或IGF-1和IGF-2两者)与IGF-1R的结合。在其它实施方案中，本发明的特异性结合IGF-1R或其变体的抗体抑制IGF-1R在结合一种或多种胰岛素生长因子时的磷酸化。在进一步的实施方案中，在细胞上(特别地，在肿瘤细胞上)表达的本发明的特异性结合IGF-1R或其变体的抗体抑制涉及细胞增殖，运动和/或转移的下游信号转导分子的磷酸化。该种分子包括但不限于Akt和p42/44 MAPK。在进一步的实施方案中，在细胞上表达的本发明的特异性结合IGF-IR或其变体的抗体促进表面表达的IGF-1R的内在化，限制其与IGF的相互作用的有效性。在更进一步的实施方案中，在细胞上(特别地，在肿瘤细胞上)表达的本发明的特异性结合IGF-1R或其变体的抗体抑制细胞增殖，运动和/或转移。
[0574] 可在此处披露的治疗方法中采用的本发明的特异性结合IGF-1R或其变体的抗体可作为停止，减少，防止或抑制涉及细胞增殖的细胞活性(例如，通常与过度增殖疾病或病症相关的可诱导血管形成模式改变或异常的细胞活性)的治疗剂进行制备和使用。
[0575] 本发明的抗体或其免疫特异性片段包括但不限于特异性结合肿瘤相关蛋白如IGF-1R的单克隆，嵌合或人源化抗体，以及抗体的片段。该抗体可以是单价，双价，多价或双功能抗体，且该抗体片段包括Fab F(ab′)2和Fv。
[0576] 如本发明所述的治疗性抗体可作为未标记或未结合形式使用，或可被偶合或连接至细胞毒性部分(例如放射性标记和生化细胞毒素)以生成发挥治疗性作用的制剂。
[0577] 在特定的实施方案中，本发明的抗体，或其抗原特异性片段包括抗原结合区。抗原结合区由随抗体变化的抗体可变区形成。天然存在的抗体包含至少两个抗原结合区，即，它们至少为双价。此处所用的术语“抗原结合区”包括特异性结合抗原上的表位(例如，细胞表面或可溶性抗原)的位点。抗体的抗原结合区通常包括至少部分的免疫球蛋白重链可变区和至少部分的免疫球蛋白轻链可变区。由这些可变区形成的结合位点决定了该抗体的特异性。
[0578] 本发明包括通过抑制肿瘤生长等手段在哺乳动物中治疗各种过度增殖病症的方法，其包括，主要包括，或由向该哺乳动物施用有效量的特异性或优先结合IGF-1R(例如人IGF-1R)的抗体或其抗原结合片段组成。
[0579] 本发明还包括通过抑制肿瘤生长等手段在哺乳动物中治疗各种过度增殖病症的方法，其包括，主要包括，或由向哺乳动物施用有效量的特异性或优先结合IGF-1R(例如人IGF-1R)抗体或其抗原结合片段联合有效量的一种或多种另外的治疗剂组成。
[0580] 本发明更具体地涉及在动物(例如，哺乳动物(例如人))中治疗过度增殖疾病(例如，抑制或防止肿瘤形成，肿瘤生长，肿瘤侵染和/或转移瘤形成)的方法，其包括，主要包括，或由向有此需要的动物施用有效量的特异性或优先结合IGF-1R的一个或多个表位的抗体或其免疫特异性片段组成。
[0581] 本发明进一步更具体地涉及在动物(例如，哺乳动物(例如人))中治疗过度增殖疾病(例如，抑制或防止肿瘤形成，肿瘤生长，肿瘤侵染和/或转移瘤形成)的方法，其包括，主要包括，或由向有此需要的动物施用有效量的特异性或优先结合IGF-1R的一个或多个表位的抗体或其免疫特异性片段联合有效量的一种或多种另外的治疗剂组成。
[0582] 在其它实施方案中，本发明包括了在动物(例如，人类患者)中治疗过度增殖疾病(例如，抑制肿瘤形成，肿瘤生长，肿瘤侵染和/或转移瘤形成)的方法，其中该方法包括向需要该种治疗的动物施用有效量的组合物，该组合物除了药学上可接受的载体外包含，主要包含，或由特异性结合IGF-1R的至少一个表位的抗体，或其免疫特异性片段组成，其中该表位包含，主要包含，或由SEQID NO：2的至少约四个至五个氨基酸，SEQ ID NO：2的至少约九个，或至少约15至约30个氨基酸组成。SEQ ID NO：2的给定表位氨基酸可以，但不必需是相邻的。在特定的实施方案中，GF-1R的至少一个表位包括，主要包括，或由在细胞表面表达的GF-1R胞外区形成的非线性表位组成。因此，在特定的实施方案中，IGF-1R的至少一个表位包括SEQ ID NO：2的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少25个、介于至少约15至约30个、或至少10、15、20、25、30、35，40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个邻近或非邻近氨基酸，主要由其组成，或由其组成，其中非邻近氨基酸通过蛋白折叠形成表位。本发明还包括上述方法，其中上述方法还包括联合特异性结合IGF-1R的至少一个表位的所述抗体或其免疫特异性片段施用一种或多种另外的治疗剂。
[0583] 在其它实施方案中，本发明包括在动物(例如，人类患者)中治疗过度增殖疾病(例如，抑制肿瘤形成，肿瘤生长，肿瘤侵染和/或转移瘤形成)的方法，其中该方法包括向需要该种治疗的动物施用有效量的组合物，该组合物除了药学上可接受的载体外包含，主要包含，或由特异性结合IGF-1R的至少一个表位的抗体，或其免疫特异性片段组成，其中该表位除了如上所述的SEQ ID NO：2的一个，两个，三个，四个，五个，六个或更多个邻近或非邻近氨基酸外包含，主要包含，或由修饰该蛋白的附加部分组成，例如，可包括碳水化合物部分，从而使该结合分子以高于对未修饰蛋白类型的亲和性结合修饰的目标蛋白。可选择地，该结合分子完全不与未经修饰的该目标蛋白相结合。本发明还包括上述方法，其中上述方法还包括联合特异性结合IGF-1R的至少一个表位的所述抗体或其免疫特异性片段施用一种或多种另外的治疗剂。
[0584] 更具体而言，本发明包括治疗人中的癌症的方法，其包括向需要该种治疗的人施用组合物，该组合物包含有效量的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段和药学上可接受的载体。本发明还包括治疗人中的癌症的方法，其包括向需要该种治疗的人施用：第一制剂，其包含有效量的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段和药学上可接受的载体；以及一种或多种另外的治疗上有用的制剂和药学上可接受的载体(其中所述第一制剂和所述一种或多种另外的治疗上有用的制剂可以一起施用(即，同时联合)或以任何顺序顺序和在任何时间段单独联合施用)。待治疗的癌症类型包括但不限于胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、和前列腺癌。
[0585] 在特定实施方案中，抗体或其结合片段特异性地结合上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位，即，与该表位的结合比它与不相关的，随机的表位的结合更容易；优先结合上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位，即，与该表位的结合比它与相关的，相似的，同源的，或类似的表位的结合更容易；竞争性地抑制(自身与上述特定IGF-1R或片段或-2 -2变体的表位特异性或优先结合的)参考抗体的结合；或以解离常数KD小于5x10 M、10 M、-3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13 -14
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-14 -15 -15
10 M、5x10 M或10 M为特征的亲和性与上述IGF-1R或片段或变体的至少一个表位相结合。在抗体结合解离常数上下文所用的术语“约”允许了用于测量抗体亲和性的方法的内在变差程度。例如，依据所用仪器的精度，基于所测样品的样品数的标准误差，以及常规误-2
差，术语“约10 M”可包括，如从0.05M至0.005M。在特定的实施方案中，本发明的抗体或其片段与来自其它物种的IGF-1R蛋白交叉反应，例如，特异性结合人IGF-1R的抗体或其片段也结合灵长动物IGF-1R和/或鼠IGF-1R。本发明的其它适用抗体或其片段包括具有过度物种特异性的抗体或片段。
[0586] 在特定的实施方案中，此处披露的抗体或其免疫特异性片段以小于或等于-2 -1 -2 -1 -3 -1 -3 -1
5X10 sec 、10 sec 、5X10 sec 或10 sec 的解离速率与IGF-1R多肽或其片段或变体-4 -1 -4 -1
相结合。此处披露的其它抗体或其免疫特异性片段以小于或等于5X10 sec 、10 sec 、-5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1 -7 -1 -7 -1
5X10 sec 或10 sec 、5X10 sec 、10 sec 、5X10 sec 或10 sec 的解离速率与IGF-1R多肽或其片段或变体相结合。
[0587] 在其它实施方案中，此处披露的抗体或其免疫特异性片段以大于或等于3 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 4 -1 -1
10M sec 、5X10M sec 、10M sec 或5X10M sec 的结合速率与IGF-1R多肽或其片
5 -1 -1
段或变体相结合。此处披露的其它抗体或其免疫特异性片段以大于或等于10M sec 、
5 -1 -1 6 -1 -1 6 -1 -1 7 -1 -1
5X10M sec 、10M sec 或5X10M sec 或10M sec 的结合速率与IGF-1R多肽或其片段
或变体相结合。
[0588] 在不同的实施方案中，如上所述的一种或多种结合分子为IGF-1R活性的拮抗剂，例如，拮抗剂IGF-1R抗体与肿瘤细胞上表达的IGF-1R的结合抑制胰岛素生长因子(例如，IGF-1、IGF-2或IGF-1和IGF-2两者)与IGF-1R的结合，促进IGF-1R的内在化，从而抑制其信号转导能力，抑制IGF-1R的磷酸化，抑制该信号转导途径下游分子(例如，Akt或p42/44 MAPK)的磷酸化，或抑制肿瘤细胞增殖，运动和转移。
[0589] IX.采用IGF-1R-特异性结合分子和核酸扩增测定的诊断或预断方法
[0590] IGF-1R-特异性抗体，或其片段，衍生物，或类似物可用于诊断目的，以检测，诊断或监测与IGF-1R异常表达和/或活性相关的疾病，病症，和/或症状。IGF-1R表达在肿瘤组织或其它肿瘤症状中上升。
[0591] IGF-1R-特异性抗体或其片段可用于对哺乳动物(优选人)体内的过度增殖病症进行诊断，治疗，预防和/或预后。该种病症包括但不限于，癌症，瘤，赘生物和/或本文别处所述，特别是IGF-1R-相关的癌症，例如胃癌，肾癌，脑癌，膀胱癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌和前列腺癌。
[0592] 例如，如此处所述，IGF-1R表达至少与胃，肾，脑，膀胱，结肠，肺，乳腺，胰腺，卵巢和前列腺肿瘤组织相关。相应地，针对IGF-1R的抗体(和抗体片段)可用于检测表达上升水平的IGF-1R的特定组织。这些诊断测定可在体内或体外进行，例如，在血液样品，切片组织或解剖组织上进行。
[0593] 因此，本发明提供了可用于癌症或其它过度增殖病症诊断的诊断方法，其包括检测个体的组织或其它细胞或体液中的IGF-1R蛋白或转录物表达水平，并将测得的表达水平与普通组织或体液中的标准IGF-1R表达水平相比较，表达水平与标准相比的提高变意味着病症。
[0594] 一个实施方案中提供了在体液或组织样品中检测异常过度增殖细胞(例如，癌前或癌细胞)存在的方法，其包括测定个体的组织或体液样品中的IGF-1R表达水平，并将该样品中测得的IGF-1R的存在或水平与一组标准组织或体液样品中的IGF-1R的存在或水平相比较，但测得IGF-1R表达或IGF-1R表达比标准更高则意味着异常过度增殖细胞生长。
[0595] 更特定地，本发明提供了在体液或组织样品中检测异常过度增殖细胞(例如，癌前或癌细胞)存在的方法，其包括(a)通过使用本发明中IGF-1R一特异性抗体或其免疫特异性片段测定一种个体的组织或体液样品中的IGF-1R表达水平，并(b)将该样品中测得的IGF-1R的存在或水平与一组标准组织或体液样品中的IGF-1R的存在或水平相比较，但测得IGF-1R表达或IGF-1R表达比标准更高则意味着异常过度增殖细胞生长。
[0596] 对于癌症，来自个体的切片组织中相对大量的IGF-1R蛋白的存在可能意味着肿瘤或其它恶性生长的存在，可能意味着该种恶性肿瘤或肿瘤的易患病体制，或可能提供在实际临床症状出现以前检测疾病的手段。更确定的该种类型的诊断可允许健康专家更早地采用预防性措施或积极治疗，从而防止癌症的形成或进一步进展。
[0597] 本发明的IGF-1R-特异性抗体可通过本领域技术人员已知的经典免疫组化方法用于测定生物样品中的蛋白水平(例如参见Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell Biol.105：3087-3096(1987))。其它可用于检测蛋白表达的基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸收分析(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。适用的抗体测定标记已为本领域所知并包括酶标记，例如，葡萄糖氧化酶；
125 121 14 35 3 112 99
放射性同位素，例如碘( I， I)、碳( C)、硫( S)、氚(H)、铟( In)以及锝( Tc)；发光标记，例如发光氨；以及荧光标记，例如荧光素和若丹明，以及生物素。适用测定在本文别处有更具体的描述。
[0598] 本发明的一方面是在动物(优选哺乳动物，最优选人)体内检测或诊断与IGF-1R异常表达相关的过度增殖疾病或病症的方法。在一个实施方案中，诊断包括：a)向受试者施用(例如，肠胃外，皮下或腹腔内)有效量的本发明特异性结合IGF-1R的标记抗体或其片段；b)在施用后等待一定时间，以允许标记抗体结合分子在受试者体内表达IGF-1R的位点优先浓缩(以及允许未结合标记分子被清除至背景水平)；c)测定背景水平；以及d)检测受试者体内的标记分子，在背景水平以上的标记分子的测得意味着该受试者具有与IGF-1R的异常表达相关的特定疾病或病症。背景水平可通过多种方法进行测定，包括将测得的标记分子的量与对之前测得的特定系统的标准值相比较。
[0599] 本领域中将可理解对象的大小以及所用的成像系统将决定生成诊断图像所需的成像部分的数量。对于放射性同位素部分和人类对象，所注射的放射能的
99
数量通常在约5至29mCi的范围内，例如 Tc。标记的结合分子(例如，抗体或抗
体片段)将优先在包含该特异性蛋白的细胞的位置聚集。体内肿瘤成像可参见
S.W.Burchiel et al.，″Immunopharmacokinetics of Radiolabeled抗体and Their Fragments. ″ (Chapter 13 in Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel and B.A.Rhodes，eds.，Masson Publishing Inc.(1982)。
[0600] 依赖于多种变量，包括所用标记的类型和施用的模式，在施用后允许标记分子在受试者体内位点优先浓缩并使未结合标记分子清除至背景水平的时间间隔为6至48小时或6至24小时或6至12小时。在另一实施方案中，该施用后的时间间隔为5至20天或7至10天。
[0601] 患者体内标记分子的存在可通过本领域已知的体内扫描的方法进行检测。这些方法取决于所用标记的类型。技术人员将能够确定用于检测特定标记的适当方法。可用于本发明的诊断方法的方法和仪器包括，但不限于，计算机断层扫描(CT)，全身扫描如正电子发射断层成像(PET)，磁共振成像(MRI)以及超声波扫描术。
[0602] 在特定的实施方案中，该结合分子以放射性同位素标记并采用辐射响应手术器械在患者体内检测(Thurston et al.美国专利No.5,441,050)。在另一实施方案中，该结合分子以荧光化合物标记并采用荧光响应扫描器械在患者体内检测。在另一实施方案中，该结合分子以正电子发射金属标记并采用正电子发射断层扫描在患者体内检侧。在另一实施方案中，该结合分子以顺磁性材料标记并采用磁共振成像(MRI)在患者体内检侧。
[0603] 用于IGF-1R表达的体内成像的抗体标记包括通过X光、核磁共振成像(NMR)、MRI、CAT-扫描或电子自旋共振成像(ESR)可测的标记。对于X光，适用的标记包括放射性同位素，例如钡或铯，其能发射出可测的辐射，但不明显损伤受试者。适用的NMR和ESR的标记包括具有可测的特征自旋的标记，例如氘，该标记可通过标记相关杂交瘤的营养物质被整合进入抗体。当使用体内成像检侧提高的IGF-1R表达以进行人体诊断时，优选使用人抗体或本文别处所述的“人源化”嵌合单克隆抗体。
[0604] 在上述相关的实施方案中，对已经诊断的疾病或病症可通过重复任意一种用于诊断该疾病或紊乱的方法在例如首次诊断后一个月，首次诊断后六个月，首次诊断后一年进行监测。
[0605] 当已经根据常规方法进行病症诊断(包括肿瘤诊断)时，本文中所述的检测方法可作为有用的预断指示，其中继续显示提高的IGF-IR表达的患者相对其表达水平下降至更接近标准水平的患者将获得更差的临床结果。
[0606] “测定肿瘤相关的IGF-1R多肽的表达水平”意在直接地(例如，测量或估计绝对蛋白水平)或相对地(例如，与第二生物样品的癌症相关多肽水平相比较)定性或定量测量或估计IGF-1R多肽在第一生物样品中的水平。优选地，第一生物样品中的IGF-1R多肽表达水平被测量或估计后与标准IGF-1R多肽水平相比较，该标准取自于来自未患有病症的个体的第二生物样品，或由未患该病症的群体的平均水平制定。如本领域所能理解，一旦已知该“标准”IGF-1R多肽水平，它可作为比较的标准重复使用。
[0607] “生物样品”指任何取自于潜在表达IGF-1R的个体，细胞系，组织培养，或其它细胞来源的生物样品。如上所示，生物样品包括体液(例如血清，血浆，尿液，关节滑液以及脊髓液)，以及包含潜在表达IGF-1R的细胞的其它组织来源。从哺乳动物获取组织切片和体液的方法已为本领域公知。
[0608] 在附加的实施方案中，针对IGF-1R的构型表位的抗体或抗体的免疫特异性片段可用于定性或定量检测IGF-1R基因产物或其保守变体或肽片段的存在。这可通过，例如，结合了光镜，流式细胞仪，或荧光检测的采用荧光标记抗体的免疫荧光技术得以实现。
[0609] 可采用此处所述的方法进行诊断和/或预测的癌症包括但不限于胃癌，肾癌，脑癌，膀胱癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌和前列腺癌。
[0610] X.免疫测定
[0611] 此处披露的IGF-1R-特异性抗体，或其免疫特异性片段可通过本领域的任何已知方法测定其免疫特异性结合。可采用的免疫测定包括但不限于，使用western印迹，放射性免疫测定，ELISA(酶联免疫吸收分析)，“夹心”免疫测定，免疫沉淀分析，沉淀素反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散测定，凝集测定，补体-固定测定，免疫放射分析，荧光免疫测定，蛋白A免疫测定等技术的竞争性和非竞争性测定系统。这些均为常规测定并在本领域公知(例如参见Ausubel et al.，eds，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，Vol.1(1994)，其通过的引用的方式全部并入本文中)。下文简述了示例性免疫测定(但并非通过限制的方式)。
[0612] 免疫沉淀方案通常包括在添加了蛋白磷酸酯酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA，PMSF，抑肽酶，钒酸钠)的溶解缓冲液如RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸盐，0.1SDS，0.15M NaCl，pH7.2的0.01M磷酸钠，1％特血尔(Trasylol))中溶解一定量的细胞，向细胞溶解产物添加目标抗体，在4摄氏度下培养一定时间(例如，1-4小时)，向细胞溶解产物添加蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠，在4摄氏度下培养一小时或更多时间，以溶解缓冲液洗涤珠子并将珠子重新悬浮于SDS/样品缓冲液中。目标抗体免疫沉淀特定抗原的能力可通过例如western印迹分析进行评估。本领域的技术人员应能理解可对该参数进行调整以提高抗体与抗原的结合，并降低背景干扰(例如，以琼脂糖珠预先去除细胞溶解产物)。有关免疫沉淀方案的进一步讨论可参见例如Ausubel et al.，eds，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，Vol.1(1994)at10.16.1。
[0613] Western印迹分析通常包括制备蛋白样品，将蛋白样品在聚丙烯酰胺凝胶(例如，根据抗原的分子量选择8％-20SDS-PAGE)中进行电泳，将蛋白样品从聚丙烯酸胺凝胶转移到一种膜(例如硝化纤维、PVDF或尼龙)上，在封闭液(例如，带有3％BSA或脱脂牛奶的PBS)中封闭膜，以洗涤缓冲液(例如，PBS-Tween 20)清洗膜，以稀释于封闭缓冲液的一抗(该目标抗体)封闭膜，以洗涤缓冲液清洗膜，以稀释于封闭缓冲液的结合至酶底物(例如，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶)或放射性分子(例如，32p或1251)的二抗(可识别该一抗，例如，抗人抗体)封闭膜，以洗涤缓冲液清洗膜，并检测抗原的存在。本领域的技术人员应能理解可对该参数进行调整以提高侧得信号并降低背景噪音。有关western印迹方案的进一步讨论可参见例如Ausubel et al.，eds，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York Vol.1(1994)at 10.8.1。
[0614] ELISA包括制备抗原，以抗原包覆96孔微量滴定板的孔，向孔中添加与可测化合物如酶底物(例如，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶)结合的目标抗体并培养一段时间，检测抗原的存在。在ELISA中该目标抗体并非必须连接至可测化合物；事实上可向孔中添加一种结合了可测化合物的第二抗体(可识别目标抗体)。此外，除了用抗原包覆孔外，也可以使用抗体包覆孔。在这一情况下，在添加目标抗原后可能要向包覆孔添加结合了可测化合物的一种第二抗体。本领域的技术人员应能理解可对该参数进行调整以提高测得信号以及其它本领域已知的ELISA变量。有关ELISA的进一步讨论可参见例如Ausubel et al.，eds，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，Vol.1(1994)at 11.2.1。
[0615] 抗体与抗原的结合亲和性以及抗体-抗原相互作用的解离速率可通过竞争性结合测定进行检测。竞争性结合测定的一个例子是放射性免疫测定，其包括在未标记抗原的3 125
数量不断增长的情况下培养标记抗原(例如 H或 I)和目标抗体，并检测结合至标记抗原的抗体。目标抗体对特定抗原的亲和性以及结合解离速率可通过Scatchard作图分析的数据测定。与一种第二抗体的竞争性也可通过放射性免疫测定进行检测。此时，该抗原与结
3 125
合了标记化合物(例如 H或 I)的目标抗体在未标记第二抗体逐渐增加的情况下进行培养。
[0616] 此外，IGF-1R-特异性抗体还可以通过免疫荧光，免疫电镜或非免疫学分析等组织学方法原位测定癌症抗原基因产物或其保留变体或肽片段。原位检测可通过从患者体内取出组织学样品，并使其接触标记的IGF-1R-特异性抗体或其片段，优选将标记抗体(或片段)包覆至组织学样品上得以实现。通过采用该种方法不仅可以检测IGF-1R蛋白，或其保守变体或肽片段的存在，还可测得其在被检组织中的分布。通过本发明，普通技术人员均能理解可对各种各样的组织学方法(例如染色法)中的任意方法进行改造以实现该种原位检测。
[0617] 对IGF-1R基因产物或其保守变体或肽片段的免疫测定或非免疫测定通常包括在能够结合IGF-1R基因产物或其保守变体或肽片段的标记抗体的存在下培养样品(例如，生物流体，组织萃取物，新鲜采集的细胞或经细胞培养后的细胞溶解产物)，并通过本领域公知的任意技术检测结合抗体。
[0618] 该生物样品可接触或固定至固相支持物或载体(例如硝化纤维)，或其它能够固定细胞，细胞颗粒或可溶蛋白的固相支持物。使用适当的缓冲液洗涤支持物后以可检测标记的IGF-1R-特异性抗体进行处理。然后以缓冲液在此清洗该固相支持物以去除未结合抗体。该抗体可根据需要进行后续标记。然后可通过常规方法检测固相支持物上结合标记的数量。
[0619] “固相支持物或载体”指任何能够结合抗原或抗体的支持物。公知支持物或载体包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，右旋糖苷，尼龙，淀粉酶，天然或修饰纤维素，聚丙烯酰胺，辉长岩，以及磁铁矿。根据本发明的目的，该载体的性质可以是一定程度可溶的或是不溶的。只要偶合分子能够集合抗体或抗原，该支持材料可采用任何可能的构造。因此，该支持物的构型可以是球形(例如，珠子)，或圆柱形(例如试管的内表面或是棒的外表面)。此外，该表面可以是平面的，例如薄片，试纸等。优选支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员将了解多种能够结合抗体或抗原的适用载体，或可通过常规实验进行验证。
[0620] 给定量的IGF-1R-特异性抗体的结合活性可通过公知技术进行测定。本领域的技术人员应当能够进行有效测定并通过常规实验优化每次侧定的测试条件。
[0621] 多种方法可用于测定抗体-抗原相互作用的亲和性，但可测定速率常数的则相对较少。多数方法依赖于标记抗体或抗原，从而不可避免地使常规测定复杂化，并对测定数量引入了不确定性。
[0622] 运行于BIAcore的表面等离子共振仪(SPR)相对传统的侧量抗体-抗原相互作用亲和性的方法带来了多种优点：(i)无需标记抗体或抗原；(ii)无需事先纯化抗体，可直接使用细胞培养悬浮液；(iii)实时检测，支持对不同单克隆抗体相互作用进行快速半定量比较，可支持和满足多种评估用途；(iv)生物特异性表面可再生，从而使一系列不同的单克隆抗体可在相同的条件下简单地进行比较；(v)分析过程完全自动化，多种测量可在无用户干涉的情况下进行。BIAapplications Handbook，version AB(reprinted 1998)，BIACORE code No.BR-1001-86；BIAtechnology Handbook，version AB(1998 再 版 )，BIACORE code No.BR-1001-84。
[0623] 基于SPR的结合研究要求将一定量的结合对固定在传感器表面上。固定的结合伴侣指配体。溶液中的结合伴侣指分析物。在某些情况下，该配体通过与另一固定化分子(称为捕获分子)的结合间接附着在表面上。SPR响应反映了当分析物结合或解离时探测器表面质量浓度的变化。
[0624] 基于SPR，实时BIAcore测量可在相互作用发生时对其直接监测。该技术非常适于检测动力学参数。相对亲和性排序可极为简单的实现，动力学和亲和性常数均可从感应图数据获得。
[0625] 当被分析物以不连续脉冲注射至配体表面时，所得的感应图可分为三个基本阶段：(i)样品注射过程中被分析物与配体的结合；(ii)样品注射过程中的平衡或稳定状态，此时被分析物的结合与其从复合物的解离向平衡；(iii)缓冲液流过时被分析物从表面的解离。
[0626] 该结合和解离阶段提供了有关被分析物-配体相互作用的动力学信息(ka和kd，复合物形成和解离速率，kd/ka＝KD)。该平衡阶段提供了有关被分析物-配体相互作用的亲和性信息(KD)。
[0627] BIAevaluation软件提供了使用数值积分和全面拟合算法进行曲线拟合的全面的工具。通过对数据的适当分析可从单次BIAcore考察获得相互作用的分离速率和亲和常数。该技术可检测的亲和性范围非常宽广，可从mM到pM。
[0628] 表位特异性是一种单克隆抗体的重要性质。与采用放射性免疫测定，ELISA或其它表面吸附方法的传统技术不同，通过BIAcore进行的表位定位不需要标记或纯化抗体，并支持采用一种多个单克隆抗体的序列进行多位点特异性测试。此外，还可自动化处理大量的分析。
[0629] 成对结合实验测试了两个MAb同时结合相同抗原的能力。针对不同表位的MAb可单独结合，而针对相同或相近表位的MAb则会干扰彼此的结合。这一通过BIAcore进行的结合实验非常易于开展。
[0630] 例如，可采用一种捕获分子结合该第一Mab，然后先后添加抗原和第二Mab。该感应图可以显示：1.多少抗原与第一Mab结合，2.第二MAb与表面附着抗原的结合程度，3.如果该第二MAb未结合，逆转成对测试的顺序是否改变结果。
[0631] 肽抑制是另一种用于表位定位的技术。该方法可完善成对抗体结合研究，并能在抗原的初级序列已知的情况下关联功能性表位与结构特征。该方法将对肽或抗原片段对不同MAb与固定化抗原结合的抑制进行测试。能干扰给定MAb结合的肽被认为与该MAb所定义的表位结构相关。
[0632] XI.药物组合物和施用方法
[0633] IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段和另外的治疗剂的制备以及向需要该药物的受试者进行施用的方法已为本领域技术人员熟知。治疗剂，例如结合分子(例如结合多肽，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)的施用途径可以是(例如)口服，肠胃外，通过吸入或局部施用。此处所用的术语肠胃外施用包括(例如)静脉内，动脉内，腹膜内，肌肉内，皮下，直肠或阴道施用。尽管所有这些施用的剂型均明确在本发明的预期范围内，但是其中一种给药剂型可以是供注射，特别是供静脉或动脉注射或者滴注的溶液。注射用的合适的药物组合物通常可包含缓冲液(例如，醋酸盐，磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)，表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)，任选的稳定剂(例如，人白蛋白)等。然而，在另一种与此技术一致的方法中，治疗剂和结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可直接传递至有害细胞群的位点，从而提高该疾病组织对该治疗剂的暴露。
[0634] 肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液，乳剂。非水溶液的例子为丙二醇，聚乙二醇，植物油(例如橄榄油)，以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水溶液载体包括水，酒精/水溶液，乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。本发明中药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M，优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常用的肠胃外载体包括磷酸钠溶液，Ringer右旋糖，右旋糖和氯化钠，Ringer乳酸盐，或固定油。静脉内载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂，例如基于Ringer右旋糖的电解质补充剂等。还可包括防腐剂和其它添加剂，例如抗菌剂，抗氧化剂，鳌合剂，以及惰性气体等。
[0635] 更具体地，适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(溶于水时)或分散液以及用作可无菌注射溶液或分散液的临时制剂的无菌粉末。此时，该组合物应当无菌且具有足够的流动性以进行注射。它应在生产和贮存条件下保持稳定，并优选可耐受微生物(例如细菌和真菌)的污染。该载体可以是溶剂或分散介质，其包含，例如水，乙醇，多元醇(丙三醇，丙二醇，以及液体聚乙二醇等)，及其适当的混合物。适当的流动性可通过多种方式维持，例如，通过适用卵磷脂等包覆，对于分散剂通过保持所需的颗粒尺寸以及通过表面活性剂的使用。用于此处披露的治疗方法的合适制剂披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，16th ed.(1980)。
[0636] 微生物作用的预防可通过各种抗菌和抗真菌剂(例如，防腐剂，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞等)实现。在许多情况下该组合物中优选包含等张剂，例如，糖，多元醇(例如甘露醇，山梨糖醇)，或氯化钠。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物中包含一种延缓吸收的制剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
[0637] 在任意情况下，无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物(即，一种或多种治疗剂，例如结合分子，例如结合多肽，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段，其自身或与其它活性制剂的联合)与此处所列成份的一种或组合溶于适当的溶剂中，并根据要求过滤灭菌而制备得到。一般而言，分散剂可通过将活性化合物与包含了基础分散介质和所需其它上述成分的无菌载体结合得到。对于可用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，其优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，通过制备得到的粉末包含活性成分和从其无菌过滤溶液得到的任何附加所需成分。该注射制剂经处理后将根据本领域已知方法填充入容器(例如安瓶，袋，瓶，注射器或小瓶)，并在无菌条件下密封。此外，该制剂可经过包装以制剂盒的形式出售，如共同未决申请U.S.S.N.09/259,337(US-2002-0102208 A1)所述，其通过引用的方式全文并入本文中。该产品优选包含标签或说明书以指示该相关组合物可用于治疗患有或易患自体免疫或肿瘤性病症的受试者。
[0638] 用于治疗过度增殖紊乱的本发明组合物的有效剂量取决于多种因素，包括施用方法，靶标位点，患者的生理状态，该患者是人或动物，施用的其它药物，以及用于治疗还是预防。该患者通常为人，但也可治疗包括转基因动物在内的非人类哺乳动物。可采用本领域技术人员已知的常规方法对治疗剂量进行滴定测量以获得最佳的安全性和有效性。
[0639] 采用抗体或其片段对过度增殖紊乱进行治疗时，该剂量相对宿主体重可以为，例如，从约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5m g/kg(例如，0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg等)。例如该剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。上述范围的中间剂量在本发明的范围之内。
受试者给药可采取每天施用，隔日施用，每周施用或根据任何其它通过实证分析得到的进度施用。一种示例性治疗需要在较长的期限内(例如，至少六个月)进行多剂量施用。一种示例性治疗方案需要每两周或每月一次或是每3至6个月一次施用。示例性剂量给法包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg，隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中同时给用两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体或其它治疗剂，其中各抗体或治疗剂的施用剂量均在指示的范围之内。
[0640] 此处披露的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可在多种时间施用。单独剂量之间的间隔可以为数周，数月或数年。根据对患者体内靶多肽或靶分子血液水平的测量所示，该间隔也可是不规律的。在一些方法中可对剂量进行调整以使血浆多肽浓度在1-1000μg/ml，在一些方法中该浓度为25-300μg/ml。可选择地，结合分子可作为缓释制剂施用，此时可减少给药频率。剂量和频率的变化取决于抗体在患者体内的半衰期。结合分子还可通过与稳定多肽或部分(例如，白蛋白或PEG)相融合来延长半衰期。一般而言，人源化抗体显示了最长的半衰期，其次是嵌合抗体和非人源抗体。在一个实施方案中，本发明的结合分自可以未结合形式施用。在另一实施方案中，该结合分子(例如，如在本文中所述的方法中使用的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可以结合形式多次施用。在另一实施方案中，本发明的结合分子可先以不结合方式，再以结合方式施用，或以相反的顺序施用。
[0641] 剂量和施用频率可依据该治疗为预防性或治疗性而发生变化。在预防性应用中，包含抗体或其混合物的组合物被施用至未处于疾病状态或在疾病前状态的患者以增强该患者的抵抗力。该种数量被定义为“预防有效剂量”。对于该用途，其确切的数量在以依赖于患者的健康和总体免疫力状态，但通常在每个剂量约0.1至25mg的范围内，特别在每个剂量0.5至2.5mg的范围内。可以相对低的剂量在较长的一段时间内以相对较低的频率施用。部分患者将接受终生持续治疗。
[0642] 在治疗性应用中，有时需要以相对高的剂量(例如，从约1至400mg/kg的结合分子，例如，每个剂量的抗体，放射免疫结合物通常采用从5至25mg的剂量，细胞毒素药物结合的分子将采用更高的剂量)在相对短的间隔内施用直至疾病的进展被减缓或终止，并优选直至该患者显示部分或完全改善疾病症状。此后，该患者可以预防方案进行施用。
[0643] 在一个实施方案中，可采用包含编码IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段的核酸分子(例如，包含在载体中)的组合物治疗受试者。编码多肽的核酸的剂量范围为每个患者约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30-300μg DNA。传染性病毒载体的剂量在每剂10-100或更多病毒体。
[0644] 用于预防性和/或治疗性治疗的治疗剂可通过肠胃外，局部，静脉内，口服，皮下，动脉内，头颅内，腹膜内，鼻内或肌肉内的方式施用。在部分方法中，药剂被直接注射进入特定的IGF-1R-表达细胞被积聚的组织，例如头颅内注射。抗体施用优选采用肌肉注射或静脉输注。在部分方法中，特定的治疗性抗体被直接注射入颅内。在一些方法中，该抗体作为TM缓释组合物或仪器(例如Medipad 仪)进行给药。
[0645] 本发明的IGF-1R抗体或其片段可选择与其它对病症或症状的治疗(例如，预防或治疗)有效的制剂联合施用。
[0646] 90Y-标记的结合多肽的有效单独治疗剂量(即，治疗有效量)在约5和约75mCi131
的范围内，更优选在约10和约40mCi范围内。 I-标记的抗体的有效单独治疗非骨髓清除
131
性剂量在约5和约70mCi的范围内，更优选在约5和约40mCi范围内。 I-标记的抗体的有效单独治疗清除性剂量(即，可能需要自体骨髓移植)在约30和约600mCi的范围内，更优选在约50和约500mCi范围内。对于嵌合抗体，由于其相对鼠源抗体更长的循环半衰期，
131
I-标记的嵌合抗体的有效单独治疗非骨髓清除性剂量在约5和约40mCi的范围内，更优
131
选小于约30mCi。对于如 I的成像标准通常小于约5mCi。
[0647] 尽管对于131I和90Y已获得了大量的临床经验，其它放射性标记已为本领域所知并被用于类似的目的。还有其它放射性同位素被用于成像。例如，包含在本发明的范围内的其123 125 32 57 64 67 77 81 81 87 113 127
它放射性同位素包括但不限于 I、 I、P、Co、Cu、Cu、Br、Rb、Kr、Sr、In、 Cs、
129 132 197 203 206 177 186 212 212 105 109 153 188 199 225
Cs、 I、 Hg、 Pb、 Bi、 Lu、 Re、 Pb、 Bi、47Sc、 Rh、 Pd、 Sm、 Re、 Au、 Ac、
211 213
At和 Bi。就此而言，alpha、gamma和beta发射体均适用于本发明。此外，通过本披露可与认为本领域的技术人员能够在不进行额外实验的情况下容易地确定哪一种放射性核与
125 123 99 43 52
选定的治疗过程相匹配。为此，已用于临床诊断的其它放射性核包括 I、 I、Tc、K、Fe、
67 68 111
Ga、Ga和 In。抗体也可通过多种放射性核标记以潜在用于标靶型免疫疗法(Peirersz
188 186
et al.Immunol.Cell Biol.65：111-125(1987))。这些放射性核包括 Re和 Re以及较
199 67
少采用的 Au和 Cu。美国专利No.5,460,785提供有关该类放射性同位素的其它数据并通过引用的方式并入本文中。
[0648] 不管此处披露的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段为结合或未结合的形式，可以理解本发明的主要优点在于能够在骨髓抑制患者(特别是正经历，或曾经经历放射疗法或化学疗法等辅助疗法的患者)中使用抗-IGF-1R分子。也就是说，该分子有益的传递能力(即，相对短的血清停留时间，高结合亲和性和增强的定位)使其可特别用于治疗具有减少的红骨髓储备并对骨髓中毒性敏感的患者。就此而言，该分子独特的传递能力使其能非常有效的向骨髓抑制癌症患者施用放射性标记的结合物。因此，此处披露的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可以结合或未结合形式用于曾经经历外部辐射束或化疗等辅助疗法的患者。在其它优选的实施方案中，结合分子(例如，如IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)(处于结合或未结合形式)可用于联合化学治疗制剂的联合治疗方案。本领域的技术人员将能理解该治疗方案可包括顺序，同时，并行或同延施用所披露抗体或其它结合分子和一种或多种化学治疗剂。本发明该方面特别优选的实施方案包括施用放射标记的结合多肽。
[0649] 尽管IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可按上文所述进行施用，必须强调在其它的实施方案中，结合和未结合的结合分子可作为一线治疗剂施用给在其它方面健康的患者。在该种实施方案中，结合分子可施用给具有正常或平均红骨髓储存的患者和/或未曾，以及未在经历如外部辐射束或化疗等辅助疗法的患者。
[0650] 然而，如上文所讨论，本发明选定的实施方案中包括向骨髓抑制患者施用IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段，或者与一种或多种如放射疗法或化学疗法等辅助疗法联合或结合施用(即，联合治疗方案)。如此处所用，结合或联合辅助疗法施用IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段指顺序，同时，同延，并行，伴随或同期施用或采用疗法及此处披露的结合分子。本领域的技术人员将能理解联合治疗方案的各种成分的施用或应用可能需要定时以增强该治疗的整体疗效。例如，可在标准的，公知的治疗过程中施用化学治疗剂，并在随后的几周内施用此处所述的放射性免疫结合物。相反地，细胞毒素结合的结合分子可进行静脉施用，然后采用肿瘤定位外部辐射束。在另一实施方案中，结合分子可与一种或多种选定的化学治疗剂在单次诊疗中并行施用。技术人员(例如，有经验的肿瘤专家)能够根据所选的辅助疗法和本说明书的启示在不进行额外实验的基础上容易地辫别有效的联合治疗方案。
[0651] 就此而言，可以理解结合分子(带有或不带有细胞毒素)和化学治疗剂可在能向患者提供治疗性益处的任意顺序和任意时间段内联合施用。也就是说，化学治疗剂和IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可以任意顺序或并行施用。在选定的实施方案中，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段将被施用于曾经历化疗的患者。在另一实施方案中，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段将于化学疗法治疗疾病同时或并行充分施用。例如，该患者可在经历化疗的过程中接受结合分子。在优选的实施方案中，该结合分子将在接受任意化学治疗剂或治疗的1年内施用。在其它优选的实施方案中，该多肽将在接受任意化学治疗剂或治疗的10、8、6、4或2个月内施用。在其它优选的实施方案中，该结合分子将在接受任意化学治疗剂或治疗的4、3、2或1周内施用。在其它实施方案中，该结合分子将在接受任意化学治疗剂或治疗的5、4、3、2或1天内施用。可以进一步理解该两种药剂或治疗可在数小时或分钟内(即，基本同时)向患者施用。
[0652] 此外，如本发明所述的骨髓抑制患者应当指代任何显示出降低的血球计数的患者。本领域的技术人员将能理解有多种血球计数参数被常规用作骨髓抑制的临床指标，人们可以容易地测定患者体内骨髓抑制的程度。为本领域接受的骨髓抑制测量的范例为嗜中性细胞绝对计数(ANC)或血小板计数。该种骨髓抑制或部分骨髓抑制可能是各种生化紊乱或疾病的结果，或者更可能是先前的化疗或放疗的结果。就此而言，本领域的技术人员将能理解接受传统化疗的患者通常会显示降低的红骨髓储存。如上文讨论，该类受试者常常不能采用最优水平的细胞毒素(即，放射性核)进行治疗，因为这可能产生导致死亡率或发病率上升的贫血或免疫抑制等副作用。
[0653] 更具体地，本发明的结合或未结合的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可3 3
用于有效治疗ANC低于约2000/mm 或血小板计数低于约150,000/mm 的患者。更优选地，本发明的结合或未结合的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可用于治疗ANC低于约
3 3 3
1500/mm，低于约1000/mm，或更优选地低于约500/mm 的患者。类似地，本发明的结合或未结合的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可用于治疗血小板计数低于约75,000/
3 3 3
mm，低于约50,000/mm，或更优选地低于约10,000/mm 的患者。从更普遍意义上讲，本领域的技术人员将能够容易地采用政府实施的指南和程序确定患者何时被骨髓抑制。
[0654] 如上文指出，许多骨髓抑制患者曾经历包括化疗，移植放疗或外束放疗等治疗过程。对于后者，外部辐射源用于对恶性肿瘤进行局部照射。对于放疗移植法，放射活性试剂通过手术定位在恶性肿瘤内，从而选择性地照射疾病位点。在任意情况下，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段能够用于治疗显示了骨髓抑制(不论其原因)的患者体内的病症。
[0655] 就此而言，可以进一步理解本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可与消除，减少，抑制或控制体内肿瘤细胞生长的任意化学治疗剂或药剂结合或联合使用(例如提供联合治疗方案)。如同讨论，该种药剂常会导致红骨髓储存的减少。这种减少可被有利于该类患者体内肿瘤的积极治疗的本发明化合物减弱的骨髓中毒性所完全或部分抵消。在其它实施方案中，此处披露的放射性标记的免疫结合物可与提高肿瘤细胞对放射核易感性的放射敏化剂一起有效使用。例如，可在肿瘤标记的结合分子被从血流中大量清除但在肿瘤位点或肿瘤上仍保持治疗有效水平之后施用放射敏化化合物。
[0656] 对于本发明的这些方面，适用于本发明的示例性化学治疗剂包括烷基化剂，长春生物碱(例如，长春新碱和长春碱)，甲基苄肼，氨甲喋呤和强的松。四药物组合MOPP(mechlethamine(氮芥)、长春新碱(Oncovin)、甲基苄肼和强的松)在治疗多种类型的淋巴瘤中非常有效并构成了本发明的一个优选实施方案。在MOPP-耐性患者中，可采用组合ABVD(例如，阿霉素、博来霉素、长春碱和氮烯唑胺)，Ch1VPP(苯丁酸氮芥、长春碱、甲基苄肼和强的松)，CABS(罗莫司丁、阿霉素、博来霉素和链脲菌素)，MOPP加ABVD，MOPP加ABV(阿霉素、博来霉素和长春碱)或BCVPP(卡氮芥、环磷酰胺、长春碱、甲基苄肼和强的松)。Arnold S.Freedman and Lee M.Nadler，Malignant Lymphomas，in Harrison′s thPrinciples of Internal Medicine 1774-1788(Kurt J.Isselbacher et al.，eds.，13 ed.1994)and V.T.DeVita et al.，(1997)且该参考文献针对标准剂量和方案通过引用的方式并入本文中。这些疗法可不加改变地，或根据特定患者的需要进行改动后联合一种或多种本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段进行使用。
[0657] 其它在本发明的上下文中有用的方案包括使用单个烷基化剂例如环磷酰胺或苯丁酸氮芥，或组合例如CVP(环磷酰胺、长春新碱和强的松)，CHOP(CVP和阿霉素)，C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、强的松和甲基苄肼)，CAP-BOP(CHOP加甲基苄肼和博来霉素)，m-BACOD(CHOP加氨甲喋呤、博来霉素和亚叶酸)，ProMACE-MOPP(强的松、氨甲喋呤、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷和亚叶酸加标准的MOPP)，ProMACE-CytaBOM(强的松、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博来霉素、长春新碱、氨甲喋呤和亚叶酸)和MACOP-B(氨甲喋呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、固定剂量的强的松、博来霉素和亚叶酸)。本领域技术人员将能轻易地对该类方案中的每一种确定标准剂量和方案。CHOP还与博来霉素、氨甲喋呤、甲基苄肼、氮芥、阿糖胞苷和依托泊苷联用。其它适用的化疗剂包括但不限于2-氯脱氧腺苷(2-CDA)、2′-脱氧柯福霉素和氟达拉滨。
[0658] 对于患有中级和高级恶性肿瘤的患者，在无法实现缓解或者复发时，可使用挽救疗法。挽救疗法单独或组合使用如阿糖胞苷、顺氯氨铂、卡铂、依托泊苷和异环磷酰胺等药物。对于某些肿瘤性病症的复发或侵染形势常可采用如下的方案：IMVP-16(异环磷酰胺、氨甲喋呤和依托泊苷)，MIME(甲基-gag、异环磷酰胺、氨甲喋呤和依托泊苷)，DHAP(地塞米松、高剂量阿糖胞苷和顺氯氨铂)，ESHAP(依托泊苷、甲基泼尼松龙、HD阿糖胞苷、顺氯氨铂)，CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、甲基苄肼、强的松和博来霉素)和CAMP(罗莫司丁、米托蒽醌、阿糖胞苷和强的松)，分别采用其公知的给药速率和方案。
[0659] 与本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段联合使用的化疗剂的数量可随受试者变化，或可更加本领域已知的情况使用。例如参见Bruce A Chabner et al.，Antineoplastic Agents，in Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basis of thTherapeutics 1233-1287(Joel G.Hardman et al.，eds.，9 ed.(1996))。
[0660] 在另一实施方案中，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可与生物制品结合施用。可用于癌症治疗的生物制品已为本领域所知，且本发明的结合分子可与该种已知生物制品结合施用。
[0661] 例如，FDA批准了下列用于治疗乳腺癌的生物制品：HERCEPTIN (曲妥单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA；对HER2-阳性乳腺癌具有抗肿瘤活性的人源化单克隆抗体)；FASLODEX (氟维司群，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP，Wilmington，DE；用于治疗乳腺癌的雌激素受体拮抗剂)；ARIMIDEX (阿那曲唑，AstraZenecaPharmaceuticals，LP；阻断制造雌激素所需的芳香化酶的非甾体芳香化酶抑制剂)；
AROMASIN (依西美坦，Pfizer Inc.，New York，NY；用于治疗乳腺癌的不可逆、甾体类芳香化酶灭活剂)；FEMARA (来曲唑，NovartisPharmaceuticals，East Hanover，NJ；FDA批准的治疗乳腺癌的非甾体芳香化酶抑制剂)和NOLVADEX (他莫昔芬，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；FDA批准的治疗乳腺癌的非类固醇抗雌激素)。本发明的结合分子可联用的其它生物制品包括AVASTIN (贝伐单抗，Genentech Inc.；FDA批准的首个抑制血管生成的疗法)和ZEVALIN (替伊莫单抗，Biogen Idec，Cambridge，MA；目前被批准用于治疗B-细胞淋巴瘤的放射性标记单克隆抗体)。化合物，例如这些例子，可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖疾病和病症。
[0662] 另外，FDA批准了用于治疗结肠直肠癌的下列生物制品：AvastinTM；ErbituxTM(西妥昔单抗，ImClone Systems Inc.，New York，NY，and Bristol-Myers Squibb，New York，NY；针对表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体)；GLEEVEC (甲磺酸伊马替尼；蛋白激酶抑制剂)和ERGAMISOL (levamisole hydrochloride，Janssen Pharmaceutica Products，LP，Titusville，NJ；FDA于1990年批准的在患有Dukes C阶段结肠癌的患者手术切除后与5-氟尿嘧啶合用进行辅助治疗的免疫调节剂)。化合物，例如这些例子，可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖疾病和病症。
[0663] 在目前已被批准的用于治疗非Hodgkin淋巴瘤的疗法中使用的生物制品包括：131
BEXXAR (托西莫单抗和碘I- 托西莫单抗，GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，
131
NC；涉及连接了放射性标记(碘I- )的鼠单克隆抗体(托西莫单抗)的多步骤治疗)；
INTRON-A (干扰素α-2b，Schering Corporation，Kenilworth，NJ；一类批准结合含蒽环的联合化疗(例如，环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松[CHOP])治疗滤泡性非Hodgkin淋巴瘤的干扰素)；RITUXAN (利妥昔单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA，and Biogen Idec，Cambridge，MA；批准治疗非Hodgkin淋巴瘤的单克隆抗体)；ONTAK(地尼白介素2，Ligand Pharmaceuticals Inc.，San Diego，CA；白喉毒素片段遗传融合至白介素-2所得的融合蛋白)和ZEVALIN (替伊莫单抗，Biogen Idec；被FDA批准用于治疗B-细胞非Hodgkin淋巴瘤的放射性标记单克隆抗体)。化合物，例如这些例子，可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖疾病和病症。
[0664] 为了治疗白血病，可联合使用本发明包括的结合分子的示例性生物制品包括：GLEEVEC CAMPATH-1H (阿仑单抗，Berlex Laboratories，Richmond，CA；一类用
于治疗慢性淋巴细胞性白血病的单克隆抗体)。另外，Genasense(oblimersen，Genta Corporation，Berkley Heights，NJ；一种开发中的用于治疗白血病(例如，单独或联合一种或多种化学治疗药物，例如氟达拉滨和环磷酰胺)的BCL-2反义疗法)可与所要求的结合分子一起施用。化合物，例如这些例子，可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖疾病和病症。
[0665] 为了治疗肺癌，示例性生物制品包括：TarcevaTM(埃罗替尼HCL，OSIPharmaceuticals Inc.，Melville，NY；设计靶向人上皮生长因子受体1(HERI)途径的小分子)。化合物，例如这些例子，可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖疾病和病症。
[0666] 为了治疗多发性骨髓瘤，示例性生物制品包括：VELCADE (波替单抗，Millennium Pharmaceuticals，Cambridge MA；蛋白酶体抑制剂)。另外的生物制品包括THALIDOMID (沙利度胺，ClegeneCorporation，Warren，NJ；免疫调节剂，并表现为具有多种作用，包括抑制骨髓瘤细胞生长和存活以及抗血管生成的能力)。化合物，例如这些例子，可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖疾病和病症。
[0667] 其它示例性生物制品包括ImClone Systems，Inc.，New York，NY开发的MOAB IMC-C225和靶向或实现蛋白、配体和受体(例如但不限于蛋白，例如integrin)的生物活性的化学治疗剂(例如，TYSABRI (那他珠单抗))和CD分子(例如CD20(例如RITUXAN)、CD23、CD52和CD80)。化合物，例如这些例子，可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖疾病和病症。化合物，例如这些例子，可以作为另外的制剂和IGF-1R抗体(或其片段)联合使用以治疗过度增殖疾病和病症。
[0668] 如前文所述，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段，或其重组产物可通过药学有效量施用进行哺乳动物过度增殖病症的体内治疗。就此而言，可以理解所披露的抗体可进行制剂以便于施用并促进该活性药剂的稳定性。优选地，如本发明所述的药物组合物包含药学上可接受的，无毒的，无菌载体，例如生理盐水，无毒缓冲液，防腐剂等。为达到本申请的目的，结合或未结合治疗剂的本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段，或其重组产物的药学有效量应当指一种足以实现对靶标的有效结合并取得成效(例如，改善疾病或病症的症状或是检测物质或细胞)的数量。对于肿瘤细胞，该结合分子优选能够与肿瘤或免疫活性细胞，或在非肿瘤细胞(例如，与该肿瘤细胞相关的血管细胞)上的选定免疫活性抗原相互作用，并使这些细胞的死亡率上升。当然，本发明的药物组合物可作为单独或多重剂量施用以提供该结合分子的药学有效剂量。
[0669] 在当前披露的范围内，本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可通过上述治疗方法在足以产生治疗或预防效果的数量下施用于人或其它动物。本发明的IGF-1R-特异性抗体或其免疫特异性片段可以常规剂型施用于人或其它动物，该剂型可参照已知技术将本发明抗体结合常规药学上可接受载体或稀释液进行制备。本领域技术人员均可理解该药学上可接受的载体或稀释液的形式和特征由其结合的活性成分的量，给药途径和其它公知变量所决定。本领域技术人员将进一步理解包含一种或多种如本发明所述的结合分子的混合剂可能会特别有效。
[0670] 本发明的实施将采用(除非另行指出)细胞生物学，细胞培养，分子生物学，转基因生物学，微生物学，重组DNA以及免疫学的常规技术，其均在本领域的技术范围之内。该类技术在文献中得到了充分的解释。例如，参见Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，Sambrook et al.，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press：
(1989)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook et al.，ed.，Cold Springs Harbor Laboratory，New York (1992)，DNA Cloning，D.N.Glover ed.，Volumes I and II (1985)；Oligonucleotide Synthesis，M.J.Gait ed.，(1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)；
Transcription And Translation，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)；Culture Of Animal Cells，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，(1987)；Immobilized Cells And Enzymes，IRL Press，(1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；the treatise，Methods In Enzymology，Academic Press，Inc.，N.Y.；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells，J.H.Miller and M.P.Calos eds.，Cold Spring Harbor Laboratory(1987)；Methods In Enzymology，Vols.154and 155(Wu et al.eds.)；
Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology，Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London(1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV，D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，(1986)；Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1986)；and in Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland (1989)。
[0671] 抗 体 工 程 的 一 般 原 则 可 参 见 Antibody Engineering，2nd edition，C.A.K.Borrebaeck，Ed.，Oxford Univ.Press(1995)。蛋白工程的一般原则可参见Protein Engineering，A Practical Approach，Rickwood，D.，et al.，Eds.，IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.(1995)。抗体和抗体一半抗原结合的一般原则可参见Nisonoff，A.，Molecular Immunology，2nd ed.，Sinauer Associates，Sunderland，MA(1984)；and Steward，M.W.，Antiodies，Their Structure and Function，Chapman and Hall，New York，NY(1984)。此外，本领域已知且未具体描述的免疫学标准方法可参照Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York；Stites et al.(eds)，Basic and Clinical-Immunology(8th ed.)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)and Mishell and Shiigi(eds)，Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)。
[0672] 阐述了免疫学基本原理的标准参考著作包括Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons，New York；Klein，J.，Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination，John Wiley & Sons，New York (1982)；Kennett，R.，et al.，eds.，Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，New York (1980)；Campbell，A.，“Monoclonal Antibody Technology”in Burden，R.，et al.，eds.，Laboratory Techniques in Biochemistry and th
Molecular Biology，Vol.13，Elsevere，Amsterdam(1984)，Kuby Immunology 4 ed.Ed.Richard A.Goldsby，Thomas J.Kindt and Barbara A.Osborne，H.Freemand & Co.(2000)；
th
Roitt，I.，Brostoff，J.and Male D.，Immunology 6 ed.London：Mosby(2001)；Abbas A.，Abul，A.and Lichtman，A.，Cellular and Molecular Immunology Ed.5，Elsevier Health Sciences Division (2005)；Kontermann and Dubel，Antibody Engineering，Springer Verlan(2001)；Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Press (2001)；Lewin，Genes VIII，Prentice Hall(2003)；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press (1988)；
Dieffenbach and Dveksler，PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003)。
[0673] 前文及本文中引用的所有参考文献均以引用的方式全文并入本文中。
[0674] 本发明的一些实施方案(E#和F#)包括：
[0675] E1.由细胞系生产的抗体，所述细胞系选自由下列物质构成的组：a)以美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号PTA-7444保藏的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系；b)指定以ATCC保藏号PTA-7445保藏的CHO细胞系；c)以ATCC保藏号PTA-7855保藏的CHO细胞系；d)以ATCC保藏号PTA-7485保藏的杂交瘤细胞系；e)以ATCC保藏号PTA-7732保藏的杂交瘤细胞系；f)以ATCC保藏号PTA-7457保藏的杂交瘤细胞系；g)以ATCC保藏号PTA-7456保藏的杂交瘤细胞系；h)以ATCC保藏号PTA-7730保藏的杂交瘤细胞系；和i)以ATCC保藏号PTA-7731保藏的杂交瘤细胞系。
[0676] E2.由E1所述的细胞系生产的抗体，所述细胞系由ATCC保藏说明指定，所述ATCC保藏说明选自由下列保藏说明构成的组：a)中华仓鼠卵巢(CHO)：C06-40B5；CHO DG44Biogen Idec EA03.14.06；b)中华仓鼠卵巢(CHO)：C03-2 CHO DG44Biogen Idec DA03.14.06；c)中华仓鼠卵巢细胞系：G11 708e6细胞08.09.2006；d)杂交瘤8.P2A7.3D11；
e)杂交瘤细胞系：7.20C8.3B8；f)杂交瘤：5.P1A2.2B11；g)杂交瘤：7.20D8.24.B11；h)杂交瘤细胞系：9.P1E2.3B12；和i)杂交瘤细胞系：5P1G10.2B8。
[0677] E3.E1或E2所述的分离的细胞系。
[0678] E4.特异性结合多肽结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，所述多肽结构域由胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的纤连蛋白III型结构域-1(FNIII-1)构成。
[0679] E5.E4其中所述抗体抑制胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和胰岛素样生长因子-2(IGF-2)与IGF-1R结合。
[0680] E6.E5所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抑制是变构性的。
[0681] E7.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合的亲和性通过一个或多种IGF-1R残基的突变而降低，所述IGF-1R残基选自：a)Glu-459；b)Ser-460；c)Asp-461；d)Val-462；e)His-464；f)Thr-466；g)Ser-467；h)Thr-478；i)His-480；j)Tyr-482；k)Arg-483；l)Glu-533；m)Ile-564；n)Arg-565；o)Lys-568；p)Glu-570；和q)Ile-571。
[0682] E8.E7所述的抗体或抗原结合片段，其中所述突变是选自下列的替换突变：a)Glu-459至Ala；b)Ser-460至Ala；c)Asp-461至Ala；d)Val-462至Thr；e)His-464至Ala；f)His-464至Glu；g)Thr-466至Leu；h)Ser-467至Tyr；i)Thr-478至Arg；j)His-480至Glu；k)Tyr-482至Ala；l)Arg-483至Trp；m)Glu-533至His；n)Ile-564至Thr；o)Arg-565至Ala；p)Lys-568至Ala；q)Glu-570至Ala；和r)Ile-571至Thr。
[0683] E9.E7或E8所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合亲和性下降约2.5至约10倍。
[0684] E10.E7或E8所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合亲和性下降约10至约100倍。
[0685] E11.E7或E8所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合亲和性下降大于100倍。
[0686] E12.E7或E8所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合亲和性消除。
[0687] E13.E7-E12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段抑制IGF-1和IGF-2配体结合IGF-1R。
[0688] E14.E13所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抑制是变构性的。
[0689] E15.特异性结合多肽结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，所述多肽结构域由IGF-1R的富半胱氨酸区域(CRR)构成。
[0690] E16.E15所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体抑制IGF-1和IGF-2配体结合IGF-1R。
[0691] E17.E16所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抑制是竞争性的。
[0692] E18.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合的亲和性通过一个或多种IGF-1R残基的突变而降低，所述IGF-1R残基选自：a)Asp-248；b)Asp-250；c)Asn-254；d)Ser-257；e)Glu-259 f)Ser-260；g)Ser-263；h)Gly-265；和 i)Glu-303。
[0693] E19.E18所述的抗体或抗原结合片段，其中所述突变是选自下列的替换突变：a)Asp-248至Ala；b)Asp-250至Ser；c)Asn-254至Ala；d)Ser-257至Phe；e)Ser-257至Lys；f)Glu-259至Lys；g)Ser-260至Asn；h)Ser-263至Arg；i)Gly-265至Tyr；和j)Glu-303至Gly。
[0694] E20.E18或E19所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合亲和性下降约2.5至约10倍。
[0695] E21.E18或E19所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合亲和性下降约10至约100倍。
[0696] E22.E18或E19所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合亲和性下降大于100倍。
[0697] E23.E18或E19所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合亲和性消除。
[0698] E24.E18-E23中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段抑制IGF-1和IGF-2配体结合IGF-1R。
[0699] E25.E24所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抑制是竞争性的。
[0700] E26.特异性结合多肽结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，所述多肽结构域由IGF-1R的富半胱氨酸区域(CRR)和第二富亮氨酸重复结构域(L2)构成。
[0701] E27.E26所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体抑制IGF-1而不抑制IGF-2配体与IGF-1R的结合。
[0702] E28.E27所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抑制是变构性的。
[0703] E29.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合的亲和性通过一个或多种IGF-1R残基的突变而降低，所述IGF-1R残基选自：a)Asp-248；b)Asn-254；c)Ser-257；和d)Gly-265。
[0704] E30.E29所述的抗体或抗原结合片段，其中所述突变是选自下列的替换突变：a)Asp-248至Ala；b)Asn-254至Ala；c)Ser-257至Lys；和d)Gly-265至Tyr。
[0705] E31.E29或E30所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合亲和性下降约10至约100倍。
[0706] E32.E29或E30所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体结合亲和性消除。
[0707] E33.E29-E32中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体抑制IGF-1而不抑制IGF-2配体与IGF-1R的结合。
[0708] E34.E33所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抑制是变构性的。
[0709] E35.特异性结合和参考单克隆Fab抗体片段或由杂交瘤生产的参考单克隆抗体相同的胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)表位的分离的抗体或其抗原结合片段，所述参考单克隆Fab抗体片段选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组，所述杂交瘤选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组。
[0710] E36.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段竞争性地抑制参考单克隆Fab抗体片段或由杂交瘤生产的参考单克隆抗体与IGF-1R的结合，所述参考单克隆Fab抗体片段选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组，所述杂交瘤选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组。
[0711] E37.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含和单克隆Fab抗体片段或由杂交瘤生产的单克隆抗体的抗原结合域等同的抗原结合域，所述单克隆Fab抗体片段选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组，所述杂交瘤选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组。
[0712] E38.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的所述重链可变区(VH)包含与选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
[0713] E39.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的所述轻链可变区(VL)包含与选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
[0714] E40.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VH包含除了20个或更少保守氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[0715] E41.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段的VL包含除了20个或更少保守氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[0716] E42.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的氨基酸序列。
[0717] E43.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的氨基酸序列。
[0718] E44.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含与选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：
58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
[0719] E45.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含除了各有20个或更少保守氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：
38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；
SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和
118构成的组的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[0720] E46.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：
58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118构成的组的氨基酸序列。
[0721] E47.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了两个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64构成的组的参考VH-CDR1氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-1(VH-CDR1)氨基酸序列。
[0722] E48.E47所述抗体或其片段，其中所述VH-CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64构成的组。
[0723] E49.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65构成的组的参考VH-CDR2氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-2(VH-CDR2)氨基酸序列。
[0724] E50.E49所述的抗体或其片段，其中所述VH-CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65构成的组。
[0725] E51.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66构成的组的参考VH-CDR3氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-3(VH-CDR3)氨基酸序列。
[0726] E52.E51所述的抗体或其片段，其中所述VH-CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66构成的组。
[0727] E53.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119构成的组的参考VL-CDR1氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-1(VL-CDR1)氨基酸序列。
[0728] E54.E53所述的抗体或其片段，其中所述VL-CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119构成的组。
[0729] E55.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了两个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120构成的组的参考VL-CDR2氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-2(VL-CDR2)氨基酸序列。
[0730] E56.E55所述的抗体或其片段，其中所述VL-CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120构成的组。
[0731] E57.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121构成的组的参考VL-CDR3氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-3(VL-CDR3)氨基酸序列。
[0732] E58.E57所述的抗体或其片段，其中所述VL-CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121构成的组。
[0733] E59.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了在至少一个所述VH-CDR中一个、两个、三个或四个氨基酸替换外选自由SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；SEQ ID NO：27、28和29；SEQ ID NO：33、34和35；SEQ ID NO：39、40和41；.SEQ ID NO：44、45和
46；SEQ ID NO：49、50和51；SEQ ID NO：54、55和56；SEQ ID NO：59、60和61；以及SEQ ID NO：64、65和66构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。
[0734] E60.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含选自由SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；SEQ ID NO：27、28和29；SEQ ID NO：33、34和35；SEQ ID NO：39、40和41；.SEQ ID NO：44、45和46；SEQ ID NO：49、50和51；SEQ ID NO：54、55和56；SEQ ID NO：59、
60和61；以及SEQ ID NO：64、65和66构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。
[0735] E61.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了在至少一个所述VL-CDR中一个、两个、三个或四个氨基酸替换外选自由SEQ ID NO：69、70和71；SEQ ID NO：74、75和76；SEQ ID NO：79、80和81；SEQ ID NO：84、85和86；SEQ ID NO：89、90和91；SEQ ID NO：94、95和96；SEQ ID NO：99、100和101；SEQ ID NO：104、
105和106；SEQ ID NO：109、110和111；SEQ ID NO：114、115和116；以及SEQ ID NO：119、
120和121构成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。
[0736] E62.特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含选自由SEQ ID NO：69、70和71；SEQ ID NO：74、75和76；SEQ ID NO：79、80和81；SEQ ID NO：84、85和86；SEQ ID NO：89、90和91；SEQ ID NO：94、95和96；SEQ ID NO：99、100和101；SEQ ID NO：104、105和106；SEQ ID NO：109、110和111；SEQ ID NO：114、115和116；
以及SEQ ID NO：119、120和121构成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。
[0737] E63.E35至E62中任一项所述的抗体或其片段，其中所述VH框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[0738] E64.E35至E63中任一项所述的抗体或其片段，其中所述VL框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[0739] E65.E35至E64中任一项所述的抗体或其片段，其结合非线性构型表位。
[0740] E66.特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸残基缬氨酸-462。
[0741] E67.特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸残基组氨酸-464。
[0742] E68.特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸残基缬氨酸-462和组氨酸-464。
[0743] E69.特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其距离残基缬氨酸-462的溶剂可及表面半径为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14埃。
[0744] E70.特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其距离残基组氨酸-464的溶剂可及表面半径为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14埃。
[0745] E71.特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其距离残基缬氨酸-462和组氨酸-464的溶剂可及表面半径为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14埃。
[0746] E72.特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其距离人IGF-1R的残基缬氨酸-462和组氨酸-464的中心的溶剂可及表面半径为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14埃。
[0747] E73.E35至E64中任一项所述的抗体或其片段，其结合线性表位。
[0748] E74.E35至E73中任一项所述的抗体或其片段，其为多价体，并包含至少两条重链和至少两条轻链。
[0749] E75.E35至E73中任一项所述的抗体或其片段，其是多特异性的。
[0750] E76.E75所述的抗体或其片段，其是双特异性的。
[0751] E77.E35至E76中任一项所述的抗体或其片段，其是双特异性的。
[0752] E78.E35至E77中任一项所述的抗体或其片段，其中所述重链和轻链可变域是完全人源的。
[0753] E79.E78所述的抗体或其片段，其中所述重链和轻链可变域来自选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的单克隆Fab抗体片段。
[0754] E80.E35至E77中任一项所述的抗体或其片段，其中所述重链和轻链可变域是鼠源的。
[0755] E81.E80所述的抗体或其片段，其中所述重链和轻链可变域来自由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的单克隆抗体。
[0756] E82.E35至E77和E80-E81中任一项所述的抗体或其片段，其是人源化的。
[0757] E83.E35至E77和E80-E81中任一项所述的抗体或其片段，其是嵌合的。
[0758] E84.E35至E77和E80-E81中任一项所述的抗体或其片段，其是灵长源化的。
[0759] E85.E35至E79中任一项所述的抗体或其片段，其是完全人源的。
[0760] E86.E35至E85中任一项所述的抗体或其片段，其是Fab片段。
[0761] E87.E35至E85中任一项所述的抗体或其片段，其是Fab′片段。
[0762] E88.E35至E85中任一项所述的抗体或其片段，其是F(ab)2片段。
[0763] E89.E35至E85中任一项所述的抗体或其片段，其是Fv片段。
[0764] E90.E35至E85中任一项所述的抗体或其片段，其是单链抗体。
[0765] E91.E35至E88和E90中任一项所述的抗体或其片段，其包含选自由人kappa恒定区和人lambda恒定区构成的组的轻链恒定区。
[0766] E92.E35至E88和E90中任一项所述的抗体或其片段，其包含重链恒定区或其片段。
[0767] E93.E92所述的抗体或其片段，其中所述重链恒定区或其片段是人IgG4。
[0768] E94.E93所述的抗体或其片段，其中所述IgG4被突变以去除糖基化位点。
[0769] E95.E94所述的抗体或其片段，其中所述突变包含Kabat编号系统的S241P和T318A。
[0770] E96.E35至E95中任一项所述的抗体或其片段，其通过以解离常数(KD)低于对所述参考单克隆抗体的KD表征的亲和力特异性结合IGF-1R多肽或其片段或IGF-R1变体多肽。
[0771] E97.E35至E96中任一项所述的抗体或其片段，其通过以解离常数(KD)不大于-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -75x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-13 -14 -14 -15 -15
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M或10 M表征的亲和力特异性结合IGF-1R多肽或其片段或IGF-R1变体多肽。
[0772] E98.E35至E97中任一项所述的抗体或其片段，其中所述亲和力表征为解离常数-10 -9(KD)为约1x10 至约5x10 M。
[0773] E99.E35至E98中任一项所述的抗体或其片段，其中所述亲和力表征为解离常数-10 -10 -10 -9(KD)选自：(a)约1.1x10 M；(b)约1.3x10 M；(c)约3.6x10 M；(d)约1.3x10 M；(e)约-9 -9
4.0x10 M；和(f)约4.9x10 M。
[0774] E100.E35至E99中任一项所述的抗体或其片段，其中所述亲和力表征为解离常-10 -10 -10 -9 -9数(KD)选自：(a)1.1x10 M；(b)1.3x10 M；(c)3.6x10 M；(d)1.3x10 M；(e)4.0x10 M；和-9
(f)4.9x10 M。
[0775] E101.E35至E100中任一项所述的抗体或其片段，其相对于鼠IGF-1R多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-1R多肽或其片段优先结合人IGF-1R多肽或其片段。
[0776] E102.E35至E100中任一项所述的抗体或其片段，其结合人IGF-1多肽或其片段，并且还结合非-人灵长动物IGF-1R多肽或其片段。
[0777] E103.E35至E102中任一项所述的抗体或其片段，其结合在细胞表面上表达的IGF-1R。
[0778] E104.E103所述的抗体或其片段，其中所述细胞是恶性肿瘤细胞、肿瘤性细胞、肿瘤细胞或转移细胞。
[0779] E105.E35至E104中任一项所述的抗体或其片段，其阻断胰岛素生长因子与IGF-1R的结合。
[0780] E106.E105所述的抗体或其片段，其中所述胰岛素生长因子是胰岛素生长因子-1(IGF-1)。
[0781] E107.E105所述的抗体或其片段，其中所述胰岛素生长因子是胰岛素生长因子-2(IGF-2)。
[0782] E108.E105所述的抗体或其片段，其同时阻断IGF-1和IGF-2与IGF-1R的结合。
[0783] E109.E35至E108中任一项所述的抗体或其片段，其抑制IGF-1R-介导的细胞增殖。
[0784] E110.E35至E109中任一项所述的抗体或其片段，其抑制IGF-1或IGF-2-介导的IGF-1R磷酸化。
[0785] E111.E35至E110中任一项所述的抗体或其片段，其抑制肿瘤细胞生长。
[0786] E112.E35至E111中任一项所述的抗体或其片段，其抑制IGF-1R内在化。
[0787] E113.E35至E112中任一项所述的抗体或其片段，还包含与其融合的外源多肽。
[0788] E114.E35至E113中任一项所述的抗体或其片段，其中所述抗体结合至选自由细胞毒素剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、外源抗体或其片段、可检测的标记、聚乙二醇(PEG)、以及两种或多种任意所述制剂的组合构成的组的制剂。
[0789] E115.E114所述的抗体或其片段，其中所述细胞毒素剂选自由放射性核、生物毒素、酶活毒素、细胞抑制或细胞毒性治疗剂、前药、免疫活性配体、生物应答调节剂构成的组、或是两种或多种任意所述细胞毒素剂的组合。
[0790] E116.E114所述的抗体或其片段，其中所述可检测的标记选自由酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射活性标记构成的组、或是两种或多种任意所述可检测的标记的组合。
[0791] E117.一种组合物，包含E35至E116中任一项所述的抗体或其片段和载体。
[0792] E118.包含编码抗体VH多肽的核酸的分离的多聚核苷酸，其中VH多肽的氨基酸序列与选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性；并且包含该VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0793] E119.E118所述的多聚核苷酸，其中所述VH多肽的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：
38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组。
[0794] E120.E118或E119所述的多聚核苷酸，其中编码该VH多肽的核苷酸序列在不改变该VH多肽的氨基酸序列的情况下进行优化以提高表达。
[0795] E121.E120所述的多聚核苷酸，其中所述优化包括鉴别并去除剪接供体和剪接受体位点。
[0796] E122.E120或E121所述的多聚核苷酸，其中所述优化包括用于表达该多聚核苷酸的细胞的密码子的优化。
[0797] E123.E118至E122中任一项所述的多聚核苷酸，其中所述核酸包含选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：62构成的组的核苷酸序列。
[0798] E124.包含编码抗体VL多肽的核酸的分离的多聚核苷酸，其中该VL多肽的氨基酸序列与选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性；并且其中包含该VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0799] E125.E124所述的多聚核苷酸，其中该VL多肽的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组。
[0800] E126.E124或E125所述的多聚核苷酸，其中编码该VL多肽的核苷酸序列在不改变所述VL多肽的氨基酸序列的情况下进行优化以提高表达
[0801] E127.E126所述的多聚核苷酸，其中所述优化包括鉴别并去除剪接供体和剪接受体位点。
[0802] E128.E126或E127所述的多聚核苷酸，其中所述优化包括用于表达该多聚核苷酸的细胞的密码子的优化。
[0803] E129.E124至E128中任一项所述的多聚核苷酸，其中所述核酸包含选自由SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：117构成的组的核苷酸序列。
[0804] E130.包含编码抗体VH多肽的核酸的分离的多聚核苷酸，其中该VH多肽的氨基酸序列除了20个或更少的保守氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的参考氨基酸序列一致；并且其中包含所述VH多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0805] E131.包含编码抗体VL多肽的核酸的分离的多聚核苷酸，其中该VL多肽的氨基酸序列除了20个或更少的保守氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的参考氨基酸序列一致；并且其中包含所述VL多肽的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0806] E132.分离的多聚核苷酸，其包含除了两个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64构成的组的参考VH-CDR1氨基酸序列一致的VH-CDR1氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VH-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0807] E133.E132所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述VH-CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64构成的组。
[0808] E134.分离的多聚核苷酸，其包含除了四个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：6构成的组的参考VH-CDR2氨基酸序列一致的VH-CDR2氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VH-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0809] E135.E134所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述VH-CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65构成的组。
[0810] E136.分离的多聚核苷酸，其包含除了四个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66构成的组的参考VH-CDR3氨基酸序列一致的VH-CDR3氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VH-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0811] E137.E136所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述VH-CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66构成的组。
[0812] E138.分离的多聚核苷酸，其包含除了四个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119构成的组的参考VL-CDR1氨基酸序列一致的VL-CDR1氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VL-CDR1的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0813] E139.E138所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述VL-CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119构成的组。
[0814] E140.分离的多聚核苷酸，其包含除了两个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120构成的组的参考VL-CDR2氨基酸序列一致的VL-CDR2氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VL-CDR2的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0815] E141.E140所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述VL-CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120构成的组。
[0816] E142.分离的多聚核苷酸，其包含除了四个或更少的氨基酸替换之外与选自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121构成的组的参考VL-CDR3氨基酸序列一致的VL-CDR3氨基酸序列的编码核酸；并且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0817] E143.E142所述的多聚核苷酸或其片段，其中所述VL-CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121构成的组。
[0818] E144.分离的多聚核苷酸，其包含编码抗体VH多肽的核酸，其中所述VH多肽包含选自由SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；SEQ ID NO：27、28和29；SEQ ID NO：33、34和35；SEQ ID NO：39、40和41；SEQ ID NO：44、45和46；SEQ ID NO：49、50和51；SEQ ID NO：54、55和56；SEQ ID NO：59、60和
61；以及SEQ ID NO：64、65和66构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列；并且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0819] E145.包含编码抗体VL多肽的核酸的分离的多聚核苷酸，其中所述VL多肽包含选自由SEQ ID NO：69、70和71；SEQ ID NO：74、75和76；SEQ ID NO：79、80和81；SEQ ID NO：84、85和86；SEQ ID NO：89、90和91；SEQ ID NO：94、95和96；SEQ ID NO：99、100和101；
SEQ ID NO：104、105和106；SEQ ID NO：109、110和111；SEQ ID NO：114、115和116；以及SEQ ID NO：119、120和121构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列；并且其中包含所述VL-CDR3的抗体或其抗原结合片段特异性结合IGF-1R。
[0820] E146.E118至E111中任一项所述的多聚核苷酸，还包含融合至所述抗体VH多肽的信号肽的编码核酸。
[0821] E147.E118至E146中任一项所述的多聚核苷酸，还包含融合至所述抗体VL多肽的信号肽的编码核酸。
[0822] E148.E118至E147中任一项所述的多聚核苷酸，还包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH1结构域的核酸。
[0823] E149.E118至E148中任一项所述的多聚核苷酸，还包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH2结构域的核酸。
[0824] E150.E118至E149中任一项所述的多聚核苷酸，还包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH3结构域的核酸。
[0825] E151.E118至E150中任一项所述的多聚核苷酸，还包含编码融合至所述VH多肽的重链铰链区的核酸。
[0826] E152.E118至E151中任一项所述的多聚核苷酸，其中所述重链恒定区是人IgG4。
[0827] E153.E152所述的多聚核苷酸，其中所述IgG4被突变以去除糖基化位点。
[0828] E154.E153所述的多聚核苷酸，其中所述突变包含使用Kabat编号系统的S241P和T318A。
[0829] E155.E118至E154中任一项所述的多聚核苷酸，还包含编码融合至所述VL多肽的轻链恒定区结构域的核酸。
[0830] E156.E155所述的多聚核苷酸，其中所述轻链恒定区是人kappa。
[0831] E157.E118至E156中任一项所述的多聚核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含由该核酸编码的、与选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的参考单克隆Fab抗体片段或与由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位的多肽。
[0832] E158.E118至E157中任一项所述的多聚核苷酸，其中抗体或其抗原结合片段包含由该核酸编码的、竞争性地抑制选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的参考单克隆Fab抗体片段或由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B 11、P1E2.3B 12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的参考单克隆抗体的多肽。
[0833] E159.E118至E158中任一项所述的多聚核苷酸，其中所述VH多肽的框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[0834] E160.E118至E159中任一项所述的多聚核苷酸，其中所述VL多肽的框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[0835] E161.E118至E160中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合线性表位。
[0836] E162.E118至E160中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合非线性构型表位。
[0837] E163.E118至E162中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段为多价体，且包含了至少两条重链和至少两条轻链。
[0838] E164.E118至E163中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是多特异性的。
[0839] E165.E118至E164中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是双特异性的。
[0840] E166.E118至E165中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含完全人源的重链和轻链可变域。
[0841] E167.E166所述的多聚核苷酸，其中所述重链和轻链可变域与选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的单克隆Fab抗体片段一致。
[0842] E168.E118至E165中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段包含鼠源的重链和轻链可变域。
[0843] E169.E168所述的多聚核苷酸，其中所述重链和轻链可变域与由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的单克隆抗体一致。
[0844] E170.E118至E165和E168至E169中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
[0845] E171.E118至E165和E168至E169中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。
[0846] E172.E118至E165和E168至E169中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是灵长源化的。
[0847] E173.E118至E167中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是完全人源的。
[0848] E174.E118至E 173中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是Fab片段。
[0849] E175.E118至E173中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是Fab′片段。
[0850] E176.E118至E173中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是F(ab)2片段。
[0851] E177.E118至E173中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是Fv片段。
[0852] E178.E118至E173中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段是单链抗体。
[0853] E179.E118至E178中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多-2 -2 -3 -3肽的抗体或其抗原结合片段通过以解离常数(KD)不大于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、或-15
10 M表征的亲和力特异性结合IGF-R1多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽。
[0854] E180.E118至E179中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段相对于鼠IGF-1R多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-1R多肽或其片段优先结合人IGF-1R多肽或其片段。
[0855] E181.E118至E179中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合人IGF-1R多肽或其片段，并且还结合非-人灵长动物IGF-1R多肽或其片段。
[0856] E182.E118至E181中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合在细胞表面上表达的IGF-1R。
[0857] E183.E182所述的多聚核苷酸，其中所述细胞是恶性肿瘤细胞、肿瘤性细胞、肿瘤细胞或转移细胞。
[0858] E184.E118至E183中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段阻断胰岛素生长因子与IGF-1R的结合。
[0859] E185.E184所述的多聚核苷酸，其中所述胰岛素生长因子是胰岛素生长因子-1(IGF-1)。
[0860] E186.E184所述的多聚核苷酸，其中所述胰岛素生长因子是胰岛素生长因子-2(IGF-2)。
[0861] E187.E184所述的多聚核苷酸，其同时阻断IGF-1和IGF-2与IGF-1R的结合。
[0862] E188.E118至E153中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制IGF-1R-介导的细胞增殖。
[0863] E189.E118至E188中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制IGF-1或IGF-2-介导的IGF-1R磷酸化。
[0864] E190.E118至E189中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制肿瘤细胞生长。
[0865] E191.E118至E190中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段抑制IGF-1R内在化。
[0866] E192.E118至E191中任一项所述的多聚核苷酸，还包含编码外源多肽的核酸。
[0867] E193.E118至E192中任一项所述的多聚核苷酸，其中包含由所述核酸编码的多肽的抗体或其抗原结合片段结合至选自由细胞毒素剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、外源抗体或其片段、可检测的标记、聚乙二醇(PEG)、以及两种或多种任意所述制剂的组合构成的组的制剂。
[0868] E194.E193所述的多聚核苷酸，其中所述细胞毒素剂选自由放射性核、生物毒素、酶活毒素、细胞抑制或细胞毒性治疗剂、前药、免疫活性配体、生物应答调节剂构成的组、或是两种或多种任意所述细胞毒素剂的组合。
[0869] E195.E193所述的多聚核苷酸，其中所述可检测的标记选自由酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射活性标记构成的组、或是两种或多种任意所述可检测的标记的组合。
[0870] E196.一种组合物，包含E118至E195中任一项所述的多聚核苷酸和载体。
[0871] E197.包含E118至E196中任一项所述的多聚核苷酸的载体。
[0872] E198.E197所述的载体，其中所述多聚核苷酸和启动子可操作地关联。
[0873] E199.包含E197或E198所述的载体的宿主细胞。
[0874] E200.一种制备特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的方法，包括培养E199所述的宿主细胞，和回收所述抗体或其片段。
[0875] E201.由E200所述的方法制备的分离的多肽。
[0876] E202.由E118至E161中任一项所述的多聚核苷酸编码的分离的多肽。
[0877] E203.E202所述的分离的多肽，其中包含所述多肽的抗体或其片段特异性结合IGF-1R。
[0878] E204.包含E168或E169所述的多肽的分离的抗体或其片段。
[0879] E205.包含分离的VH编码多聚核苷酸和分离的VL编码多聚核苷酸的组合物，其中所述VH编码多聚核苷酸和所述VL编码多聚核苷酸分别包含与选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；以及SEQ ID NO：63和118构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列的编码核酸；并且其中由该VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段特异性结合IGF-1R。
[0880] E206.E205所述的组合物，其中所述VH编码多聚核苷酸和所述VL编码多聚核苷酸分别包含选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：
58和SEQ ID NO：113；以及SEQ ID NO：63和118构成的组的氨基酸序列的编码核酸。
[0881] E207.包含分离的VH编码多聚核苷酸和分离的VL编码多聚核苷酸的组合物，其中所述VH编码多聚核苷酸和所述VL编码多聚核苷酸分别包含除了少于20个保守氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：
103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；以及SEQ ID NO：63和118构成的组的参考氨基酸序列一致性的氨基酸序列的编码核酸；并且其中由该VH和VL编码多聚核苷酸所编码的抗体或其片段特异性结合IGF-1R。
[0882] E208.包含分离的VH编码多聚核苷酸和分离的VL编码多聚核苷酸的组合物，其中所述VH编码多聚核苷酸编码包含选自由SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；SEQ ID NO：27、28和29；SEQ ID NO：33、34和35；SEQ ID NO：39、40和41；SEQ ID NO：44、45和46；SEQ ID NO：49、50和51；SEQ ID NO：
54、55和56；SEQ ID NO：59、60和61；以及SEQ ID NO：64、65和66构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列的VH多肽；其中该VL编码多聚核苷酸编码包含选自由SEQ ID NO：69、70和71；SEQ ID NO：74、75和76；SEQ ID NO：79、80和81；SEQ ID NO：84、85和
86；SEQ ID NO：89、90和91；SEQ ID NO：94、95和96；SEQ ID NO：99、100和101；SEQ ID NO：104、105和106；SEQ ID NO：109、110和111；SEQ ID NO：114、115和116；以及SEQ ID NO：119、120和121构成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列的VL多肽；并且其中由该VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段特异性结合IGF-1R。
[0883] E209.E205至E208中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多聚核苷酸还包含融合至抗体VH多肽的信号肽的编码核酸。
[0884] E210.E205至E208中任一项所述的组合物，其中所述VL编码多聚核苷酸还包含融合至抗体VL多肽的信号肽的编码核酸。
[0885] E211.E205至E210中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多聚核苷酸还包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH1结构域的核酸。
[0886] E212.E205至E211中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多聚核苷酸还包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH2结构域的核酸。
[0887] E213.E205至E212中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多聚核苷酸还包含编码融合至该VH多肽的重链恒定区CH3结构域的核酸。
[0888] E214.E205至E213中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多聚核苷酸还包含编码融合至所述VH多肽的重链铰链区的核酸。
[0889] E215.E205至E214中任一项所述的组合物，其中所述重链恒定区是人IgG4。
[0890] E216.E215所述的组合物，其中所述IgG4被突变以去除糖基化位点。
[0891] E217.E216所述的组合物，其中所述突变包含使用Kabat编号系统的S241P和T318A。
[0892] E218.E205至E217中任一项所述的组合物，其中所述VL编码多聚核苷酸还包含编码融合至所述VL多肽的轻链恒定区结构域的核酸。
[0893] E219.E174所述的组合物，其中所述轻链恒定区是人kappa。
[0894] E220.E205至E219中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段与选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的参考单克隆Fab抗体片段或与由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的参考单克隆抗体特异性结合相同IGF-R1表位。
[0895] E221.E205至E220中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段竞争性地抑制选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的参考单克隆Fab抗体片段或由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的参考单克隆抗体与IGF-1R的结合。
[0896] E222.E205至E221中任一项所述的组合物，其中所述VH和VL多肽的框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[0897] E223.E205至E222中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段结合线性表位。
[0898] E224.E205至E222中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段结合非线性构型表位。
[0899] E225.E205至E222中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段为多价体，且包含了至少两条重链和至少两条轻链。
[0900] E226.E205至E225中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是多特异性的。
[0901] E227.E205至E226中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是双特异性的。
[0902] E228.E205至E227中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段包含完全人源的重链和轻链可变域。
[0903] E229.E228所述的组合物，其中所述重链和轻链可变域与选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的单克隆Fab抗体片段一致。
[0904] E230.E205至E227中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段包含鼠源的重链和轻链可变域。
[0905] E231.E230所述的组合物，其中所述重链和轻链可变域与由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的单克隆抗体一致。
[0906] E232.E205至E227和E230至E231中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是人源化的。
[0907] E233.E205至E227和E230至E231中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是嵌合的。
[0908] E234.E205至E227和E230至E231中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是灵长源化的。
[0909] E235.E205至E229中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是完全人源的。
[0910] E236.E205至E235中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是Fab片段。
[0911] E237.E205至E235中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是Fab′片段。
[0912] E238.E205至E235中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是F(ab)2片段。
[0913] E239.E205至E235中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是Fv片段。
[0914] E240.E205至E235中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段是单链抗体。
[0915] E241.E205至E240中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷-2 -2 -3 -3 -4酸编码的抗体或其片段通过以解离常数(KD)不大于5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9 -10
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-10 -11 -11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15 -15
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、或10 M表征的亲和力特异性结合IGF-R1多肽或其片段，或IGF-1R变体多肽。
[0916] E242.E205至E241中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段相对于鼠IGF-1R多肽或其片段或者非人灵长动物IGF-1R多肽或其片段优先结合人IGF-1R多肽或其片段。
[0917] E243.E205至E241中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段结合人IGF-1R多肽或其片段，并且还结合非-人灵长动物IGF-1R多肽或其片段。
[0918] E244.E205至E243中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段结合在细胞表面上表达的IGF-1R。
[0919] E245.E224所述的组合物，其中所述细胞是恶性肿瘤细胞、肿瘤性细胞、肿瘤细胞或转移细胞。
[0920] L246.E205至E245中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段阻断胰岛素生长因子与IGF-1R的结合。
[0921] E247.E246所述的组合物，其中所述胰岛素生长因子是胰岛素生长因子-1(IGF-1)。
[0922] E248.E246所述的组合物，其中所述胰岛素生长因子是胰岛素生长因子-2(IGF-2)。
[0923] E249.E246所述的组合物，其同时阻断IGF-1和IGF-2与IGF-1R的结合。
[0924] E250.E205至E249中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段抑制IGF-1R-介导的细胞增殖。
[0925] E251.E205至E250中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段抑制IGF-1或IGF-2-介导的IGF-1R磷酸化。
[0926] E252.E205至E251中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段抑制肿瘤细胞生长。
[0927] E253.E205至E252中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段抑制IGF-1R内在化。
[0928] E254.E205至E253中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多聚核苷酸、所述VL编码多聚核苷酸或所述VH和所述VL编码多聚核苷酸还包含编码外源多肽的核酸。
[0929] E255.E205至E254中任一项所述的组合物，其中由所述VH和VL编码多聚核苷酸编码的抗体或其片段结合至选自由细胞毒素剂、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、外源抗体或其片段、可检测的标记、聚乙二醇(PEG)、以及两种或多种任意所述制剂的组合构成的组的制剂。
[0930] E256.E255所述的组合物，其中所述细胞毒素剂选自由放射性核、生物毒素、酶活毒素、细胞抑制或细胞毒性治疗剂、前药、免疫活性配体、生物应答调节剂构成的组、或是两种或多种任意所述细胞毒素剂的组合。
[0931] E257.E255所述的组合物，其中所述可检测的标记选自由酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射活性标记构成的组、或是两种或多种任意所述可检测的标记的组合。
[0932] E258.E205至E257中任一项所述的组合物，其中该VH编码多聚核苷酸包含于第一载体，而该VL编码多聚核苷酸包含于第二载体。
[0933] E259.E258所述的组合物，其中该VH编码多聚核苷酸和第一启动子可操作地关联而该VL编码多聚核苷酸和第二启动子可操作地关联。
[0934] E260.E259所述的组合物，其中该第一和第二启动子为同一启动子的拷贝。
[0935] E261.E259所述的组合物，其中该第一和第二启动子不一致。
[0936] E262.E258至E261中任一项所述的组合物，其中该第一和第二载体包含于单个宿主细胞。
[0937] E263.E258至E261中任一项所述的组合物，其中该第一和第二载体包含于独立的宿主细胞。
[0938] E264.一种制备特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的方法，包括培养E262所述的宿主细胞，和回收所述抗体或其片段。
[0939] E265.一种制备特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的方法，包括共培养E263所述的独立的宿主细胞，和回收所述抗体或其片段。
[0940] E266.一种制备特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的方法，包括单独培养单独的E263所述的宿主细胞，合并该VH和VL编码多肽，以及回收所述抗体或其片段。
[0941] E267.由E264至E266中任一项所述的方法制备的特异性结合IGF-1R的抗体或其片段。
[0942] E268.E205至E267中任一项所述的组合物，其中所述VH编码多聚核苷酸和所述VL编码多聚核苷酸在相同载体上。
[0943] E269.E268所述的载体。
[0944] E270.E269所述的载体，其中所述VH编码多聚核苷酸和所述VL编码多聚核苷酸均和启动子可操作地关联。
[0945] E271.E269所述的载体，其中所述VH编码多聚核苷酸和所述VL编码多聚核苷酸进行框内融合，从与之可操作地关联的单个启动子进行共同转录，并共同翻译成单链抗体或其抗原结合片段。
[0946] E272.E269所述的载体，其中所述VH编码多聚核苷酸和所述VL编码多聚核苷酸从与之可操作地关联的单个启动子进行共同转录，但单独翻译。
[0947] E273.E272所述的载体，还包含位于该VH编码多聚核苷酸和该VL编码多聚核苷酸之间的IRES序列。
[0948] E274.E269所述的载体，其中该编码VH的多聚核苷酸和该编码VL的多聚核苷酸分别可操作地关联单独启动子并单独转录。
[0949] E275.E274所述的载体，其中所述独立的启动子为同一启动子的拷贝。
[0950] E276.E274所述的载体，其中所述独立的启动子不一致。
[0951] E277.包含E269至E276中任一项所述的载体的宿主细胞。
[0952] E278.一种制备特异性结合IGF-1R的抗体或其片段的方法，包括培养E277所述的宿主细胞，和回收所述抗体或其片段。
[0953] E279.由E244所述的方法制备的特异性结合IGF-1R的抗体或其片段。
[0954] E280.一种在动物中治疗过度增殖病症的方法，包括向需要治疗的动物施用包含以下成分的组合物：a)E1至E82、E170、E233和E245中任一项所述的分离的抗体或其片段；以及b)药学上可接受的载体。
[0955] E281.E280所述的方法，其中所述过度增殖疾病或病症选自由癌症、赘生物、肿瘤、恶性肿瘤或其转移性病灶构成的组。
[0956] E282.E281所述的方法，其中所述抗体或其片段特异性结合在恶性肿瘤细胞的表面上表达的IGF-1R。
[0957] E283.E282所述的方法，其中所述抗体或其片段结合恶性肿瘤细胞导致恶性肿瘤细胞的生长抑制。
[0958] E284.E280至E283中任一项所述的方法，其中所述抗体或其片段抑制IGF和所述恶性肿瘤细胞的结合。
[0959] E285.E284所述的方法，其中所述IGF是IGF-1。
[0960] E286.E284所述的方法，其中所述IGF是IGF-2。
[0961] E287.E284所述的方法，其中所述IGF是IGF-1和IGF-2。
[0962] E288.E287所述的方法，其中所述抗体或其片段抑制IGF-1结合所述恶性肿瘤细胞，但不抑制IGF-2。
[0963] E289.E287所述的方法，其中所述抗体或其片段抑制IGF-2结合所述恶性肿瘤细胞，但不抑制IGF-1。
[0964] E290.E280至E283中任一项所述的方法，其中所述辅助抗体或其片段促进IGF-1R内在化进入所述恶性肿瘤细胞。
[0965] E291.E280至E283中任一项所述的方法，其中所述辅助抗体或其片段抑制IGF-1R磷酸化。
[0966] E292.E280至E283中任一项所述的方法，其中所述辅助抗体或其片段抑制肿瘤细胞增殖。
[0967] E293.E292所述的方法，其中肿瘤细胞增殖通过预防或延缓转移生长而受到抑制。
[0968] E294.E280至E283中任一项所述的方法，其中所述辅助抗体或其片段抑制肿瘤细胞转移。
[0969] E295.E292所述的方法，其中肿瘤细胞增殖通过预防或延缓肿瘤扩散至邻近组织而受到抑制。
[0970] E296.E281所述的方法，其中所述过度增殖疾病或病症是位于下列部位的赘生物：前列腺、结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝脏、胰脏、腹膜、肾上腺、甲状旁腺、垂体腺、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺、眼、头、颈、中枢神经系统、周围神经系统、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部或泌尿生殖道。
[0971] E297.E281所述的方法，其中所述过度增殖疾病是癌症，所述癌症选自由下列疾病构成的组：上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、白血病、骨髓瘤、胃癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌和头颈癌。
[0972] E298.E297所述的方法，其中所述癌症选自由下列疾病构成的组：胃癌、肾癌、脑癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
[0973] E299.E280至E298中任一项所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。
[0974] E300.E299所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
[0975] E301.一种在动物中治疗过度增殖病症的方法，包括施用两种或多种抗体或其片段的组合，其中所述抗体或其片段特异性结合至少两个不同的IGF-1R表位。
[0976] E302.E301所述的方法，其中所述两种或多种抗体或其片段抑制IGF-1和/或IGF-2配体结合。
[0977] E303 E301所述的方法，其中所述两种或多种抗体或其片段抑制IGF-1R信号转导。
[0978] E304.E301-E303中任一项所述的方法，其中所述两种或多种抗体或其片段抑制配体竞争性地和变构性地结合。
[0979] E305.E301-E304中任一项所述的方法，其中所述两种或多种抗体或其片段联合比所述抗体或其片段单独中的任一种更有效地抑制肿瘤细胞增殖或IGF-1R信号转导，其中在约相同的最终总摩尔浓度的条件下比较抗体或其片段联合的情况和所述抗体或其片段单独的情况。
[0980] E306.E301-E304中任一项所述的方法，其中所述两种或多种抗体或其片段对于肿瘤细胞增殖或IGF-1R信号转导的抑制具有协同效应。
[0981] E307.E301-E304中任一项所述的方法，其中所述两种或多种抗体或其片段联合比所述抗体或其片段单独中的任一种更有效地抑制IGF-1和/或IGF-2与IGF-1R的结合，其中在约相同的最终总摩尔浓度的条件下比较抗体或其片段联合的情况和所述抗体或其片段单独的情况。
[0982] E308.E301-E304中任一项所述的方法，其中所述两种或多种抗体或其片段对于IGF-1和/或IGF-2与IGF-1R的结合的抑制具有协同效应。
[0983] E309.E301-E308中任一项所述的方法，其中所述动物是人。
[0984] E310.E301-E309中任一项所述的方法，其中所述过度增殖病症是癌症。
[0985] E311.E301-E310中任一项所述的方法，其中所述过度增殖病症是肿瘤。
[0986] E312.一种分离的多肽，其包含或由人IGF-1R的III型纤连蛋白结构域1(FNIII-1)构成。
[0987] E313.一种分离的多肽，其包含或由人IGF-1R的富半胱氨酸重复结构域(CRR)和富亮氨酸重复结构域2(L2)构成。
[0988] E314.一种分离的多肽，其包含或由人IGF-1R的富半胱氨酸重复结构域(CRR)构成。
[0989] E315.一种分离的多肽，其长度具有300或更少的氨基酸残基并且包含序列，其中所述序列选自：a)Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr Ser Thr；b)Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr；c)Trp His Arg Tyr Arg Pro Pro Asp Tyr Arg；d)Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys；e)Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr；f)Asp Gly Gln Asp Ala Cys Gly Ser Asn Ser；g)Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro；h)Asn Lys Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu；i)His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala；j)Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met；k)Val Glu Asn Asp His Ile Arg Gly Ala Lys；和l)Asp His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile。
[0990] E316.E315所述的多肽，其中所述多肽长度具有200或更少的氨基酸。
[0991] E317.E315所述的多肽，其中所述多肽长度具有250或更少的氨基酸。
[0992] E318.E315所述的多肽，其中所述多肽长度具有150或更少的氨基酸。
[0993] E319.E315所述的多肽，其中所述多肽长度具有100或更少的氨基酸。
[0994] E320.E315所述的多肽，其中所述多肽长度具有50或更少的氨基酸。
[0995] E321.E315所述的多肽，其中所述多肽长度具有40或更少的氨基酸。
[0996] E322.E315所述的多肽，其中所述多肽长度具有30或更少的氨基酸。
[0997] E323.E315所述的多肽，其中所述多肽长度具有20或更少的氨基酸。
[0998] E324.E315所述的多肽，其中所述多肽长度具有10的氨基酸。
[0999] E325.E315至E324中任一项所述的多肽，其中所述多肽特异性结合选自由a)Fab M13-C06；b)Fab M14-C03；c)M13.C06.G4.P.agly；和d)M14.C03.G4.P.agly构成的组的抗体。
[1000] E326.一种人IGF-1R的表位，包含选自下列氨基酸中的一种或多种氨基酸：a)Glu-459；b)Ser-460；c)Asp-461；d)Val-462；e)His-464；f)Thr-466；g)Ser-467；h)Thr-478；i)His-480；j)Tyr-482；k)Arg-483；l)Glu-533；m)Ile-564；n)Arg-565；o)Lys-568；p)Glu-570；和q)Ile-571，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1001] E327.一种分离的多肽，其长度具有300或更少的氨基酸残基并且包含序列，其中所述序列选自：a)Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser；b)Ala Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val；c)Ile His Asp Gly Glu Cys Met Gln Glu Cys；d)Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln；e)Ser Met Tyr Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro；和f)Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu。
[1002] E328.E327所述的多肽，其中所述多肽长度具有200或更少的氨基酸。
[1003] E329.E327所述的多肽，其中所述多肽长度具有250或更少的氨基酸。
[1004] E330.E327所述的多肽，其中所述多肽长度具有150或更少的氨基酸。
[1005] E331.E327所述的多肽，其中所述多肽长度具有100或更少的氨基酸。
[1006] E332.E327所述的多肽，其中所述多肽长度具有50或更少的氨基酸。
[1007] E333.E327所述的多肽，其中所述多肽长度具有40或更少的氨基酸。
[1008] E334.E327所述的多肽，其中所述多肽长度具有30或更少的氨基酸。
[1009] E335.E327所述的多肽，其中所述多肽长度具有20或更少的氨基酸。
[1010] E336.E327所述的多肽，其中所述多肽长度具有10的氨基酸。
[1011] E337.E327至E336中任一项所述的多肽，其中所述多肽特异性结合选自由a)Fab M14-G11；和b)M14-G11.G4.P.agly.构成的组的抗体。
[1012] E338.一种人IGF-1R的表位，包含选自下列氨基酸中的一种或多种氨基酸：a)Asp-248；b)Asp-250；c)Asn-254；d)Ser-257；e)Glu-259 f)Ser-260；g)Ser-263；h)Gly-265；和i)Glu-303，其中所述氨基酸其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1013] E339.一种分离的多肽，其长度具有300或更少的氨基酸残基并且包含序列，其中所述序列选自：a)Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser；和b)Leu Ser Ala Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly。
[1014] E340.E339所述的多肽，其中所述多肽长度具有200或更少的氨基酸。
[1015] E341.E339所述的多肽，其中所述多肽长度具有250或更少的氨基酸。
[1016] E342.E339所述的多肽，其中所述多肽长度具有150或更少的氨基酸。
[1017] E343.E339所述的多肽，其中所述多肽长度具有100或更少的氨基酸。
[1018] E344.E339所述的多肽，其中所述多肽长度具有50或更少的氨基酸。
[1019] E345.E339所述的多肽，其中所述多肽长度具有40或更少的氨基酸。
[1020] E346.E339所述的多肽，其中所述多肽长度具有30或更少的氨基酸。
[1021] E347.E339所述的多肽，其中所述多肽长度具有20或更少的氨基酸。
[1022] E348.E339所述的多肽，其中所述多肽长度具有10的氨基酸。
[1023] E349.E339至E348中任一项所述的多肽，其中所述多肽特异性结合选自由杂交瘤细胞系P1E2.3B12表达的a)嵌合抗体P1E2；和b)抗体构成的组的抗体。
[1024] E350.一种人IGF-1R的表位，包含选自下列氨基酸中的一种或多种氨基酸：a)Asp-248；b)Asn-254；c)Ser-257；和d)Gly-265，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1025] E351.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Glu-459至His-464，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1026] E352.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Ser-460至Thr-466，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1027] E353.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Asp-461至Thr-466，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1028] E354.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基AVal-462至Ser-467，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1029] E355.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基His-464至Thr-478，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1030] E356.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Thr-466至Thr-478，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1031] E357.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Ser-467至Thr-478，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1032] E358.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Thr-478至Tyr-482，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1033] E359.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基His-480至Glu-533，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1034] E360.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Tyr-482至Glu-533，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1035] E361.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Arg-483至Glu-533，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1036] E362.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Glu-533至Ile-564，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1037] E363.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Ile-564至Glu-570，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1038] E364.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Arg-565至Glu-570，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1039] E365.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Arg-565至Ile-571，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1040] E366.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Glu-459至Arg-483，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1041] E367.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Arg-483至Glu-533，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1042] E368.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Glu-533至Ile-571，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1043] E369.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Glu-459至Ile-571，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1044] E370.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Asp-248至Asn-254，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1045] E371.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Asp-250至Ser-257，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1046] E372.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Asn-254至Glu-259，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1047] E373.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Ser-257至Ser-263，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1048] E374.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Glu-259至Gly-265，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1049] E375.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Ser-260至Gly-265，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1050] E376.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Ser-263至Glu-303，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1051] E377.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Ser-265至Glu-303，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1052] E378.一种分离的多肽，包含人IGF-1R的氨基酸残基Ser-254至Gly-265，其中所述氨基酸对应于人IGF-1R的序列，而没有表20中指出的信号肽序列的前30个氨基酸。
[1053] F1.一种治疗动物中的过度增殖病症的方法，该方法包括向需要治疗的动物施用一种或多种组合物，所述组合物包含：a)第一制剂，其中所述制剂是分离的IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)抗体或其片段，其中所述抗体其片段抑制IGF-1R介导的信号转导；以及b)第二制剂，其中所述第二制剂是治疗上用于治疗过度增殖病症的。
[1054] F2.F1所述的方法，其中所述第二制剂抑制一种或多种生物进程，所述生物进程选自由下列生物进程构成的组：a)细胞生长；b)细胞增殖；和c)细胞存活。
[1055] F3.F1所述的方法，其中所述第二制剂抑制调节一种或多种生物进程的一种或多种信号转导途径，所述生物进程选自由下列生物进程构成的组：a)细胞生长；b)细胞增殖；和c)细胞存活。
[1056] F4.F1至F3中任一项所述的方法，其中所述第二制剂抑制由一种或多种分子介导的信号转导，所述分子选自：a)丝氨酸/苏氨酸激酶；b)酪氨酸激酶；c)a G-蛋白(鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白)；d)GPCR(G-蛋白偶联受体)；e)腺苷酸环化酶；f)cAMP(环AMP)；g)IGF-1(胰岛素样生长因子-1)；h)IGF-2(胰岛素样生长因子-2)；i)IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)；j)VEGF(血管内皮生长因子)；k)IRS-1(胰岛素受体底物-1)；l)AKT(蛋白激酶B)；m)MAPK(分裂素激活的蛋白激酶)；n)mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶)；o)PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)；p)S6激酶；q)p42/p44；r)ERK激酶；s)MEK；t)Ras；u)EGFR；v)HER2；和w)组蛋白去乙酰化酶。
[1057] F5.F1至F4中任一项所述的方法，其中所述第二制剂是小分子。
[1058] F6.F1至F4中任一项所述的方法，其中所述第二制剂是选自a)蛋白；b)多聚核苷酸；c)脂质；和d)碳水化合物中的大分子。
[1059] F7.F1至F4中任一项所述的方法，其中所述第二制剂是第二分离的抗体或其片段。
[1060] F8.F7所述的方法，其中所述第二分离的抗体或其片段选自：a)EGFR(表皮生长因子受体)抗体或其片段；b)ERBITUX (西妥昔单抗)或其片段；c)VECTIBIX (帕木单抗)或其片段；d)VOLOCIXIMAB (M200)或其片段；e)TYSABRI (那他珠单抗)或其片
段；f)Herceptin (曲妥单抗)或其片段；和g)Avastin (贝伐单抗)或其片段。
[1061] F9.F5所述的方法，其中所述小分子选自：a)埃罗替尼(TARCEVA )；b)埃罗替尼(TARCEVA )的变体、类似物或衍生物；c)雷帕霉素；d)雷帕霉素的变体、类似物或衍生物；e)坦西莫司；f)坦西莫司的变体、类似物或衍生物；g)PD0325901；h)PD0325901的变体、类似物或衍生物；i)PI-103；j)PI-103的变体、类似物或衍生物；k)吉非替尼(易瑞沙)；l)吉非替尼(易瑞沙 )的变体、类似物或衍生物；m)GLEEVEC (甲磺酸伊马替尼)；n)GLEEVEC (甲磺酸伊马替尼)的变体、类似物或衍生物；o)SUTENT (舒尼替尼苹果酸盐)；p)SUTENT (舒尼替尼苹果酸盐)的变体、类似物或衍生物；q)NEXAVAR (索拉非尼甲苯磺酸盐/BAY 43-9006)；r)(索拉非尼甲苯磺酸盐/BAY43-9006)的变体、类似物或衍生物；s)伏立诺他盐酸盐(SAHA)；t)伏立诺他盐酸盐(SAHA)的变体、类似物或衍生物；u)吉西他滨；v)吉西他滨的变体、类似物或衍生物；w)Tykerb (拉帕替尼)；x)Tykerb (拉帕替尼)的变体、类似物或衍生物；y)AZD6244(ARRY-142886)；z)AZD6244(ARRY-142886)的变体、类似物或衍生物；aa)Deforolimus(AP23573)；和ab)Deforolimus(AP23573)的变体、类似物或衍生物。
[1062] F10.F1至F9中任一项所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。
[1063] F11.F10所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
[1064] F12.F1至F11中任一项所述的方法，其中所述过度增殖病症选自由癌症、赘生物、肿瘤、恶性肿瘤或其转移性病灶构成的组。
[1065] F13.F12所述的方法，其中所述过度增殖病症是位于下列部位的赘生物：前列腺、结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝脏、胰脏、腹膜、肾上腺、甲状旁腺、垂体腺、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺、眼、头、颈、中枢神经系统、周围神经系统、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部或泌尿生殖道。
[1066] F14.F13所述的方法，其中所述过度增殖病症是癌症，所述癌症选自由下列疾病构成的组：上皮鳞状细胞癌、黑素瘤、白血病、骨髓瘤、胃癌、脑癌、骨癌、肺癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌、肉瘤和骨肉瘤。
[1067] F15.F14所述的方法，其中所述第一制剂是M13-C06.G4.P.agly抗体或其片段。
[1068] F16.F14所述的方法，其中所述第一制剂是选自下列物质的分离的抗体或其片段：a)M13-C06.G4.P；b)M14-G11.G4.P；c)M14-C03.G4.P；d)M14-B01.G4.P；e)M12-E01.G4.P；
f)M12-G04.G4.P.b)M14-G11.G4.P.agly；c)M14-C03.G4.P.agly；d)M14-B01.G4.P.agly；
e)M12-E01.G4.P.agly；和f)M12-G04.G4.P.agly。
[1069] F17.F14所述的方法，其中所述第一制剂是选自下列物质的分离的Fab抗体：a)M13-C06；b)M14-G11；c)M14-C03；d)M14-B01；e)M12-E01；和f)M12-G04。
[1070] F18.F14所述的方法，其中所述第一制剂是由选自下列物质的杂交瘤细胞系生产的分离的抗体：a)P2A7.3E11；b)20C8.3B8；c)P1A2.2B11；d)20D8.24B11；e)P1E2.3B12；和f)P1G10.2B8。
[1071] F19.F14所述的方法，其中所述第一制剂是由选自下列物质的细胞系生产的分离的抗体：a)以美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号PTA-7444保藏的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系；b)指定以ATCC保藏号PTA-7445保藏的CHO细胞系；c)以ATCC保藏号
PTA-7855保藏的CHO细胞系；d)以ATCC保藏号PTA-7485保藏的杂交瘤细胞系；e)以ATCC保藏号PTA-7732保藏的杂交瘤细胞系；f)以ATCC保藏号PTA-7457保藏的杂交瘤细胞系；
g)以ATCC保藏号PTA-7456保藏的杂交瘤细胞系；h)以ATCC保藏号PTA-7730保藏的杂交瘤细胞系；和i)以ATCC保藏号PTA-7731保藏的杂交瘤细胞系。
[1072] F20.F14所述的方法，其中所述第一制剂是由F 19所述的细胞系生产的分离的抗体，其中所述细胞系由ATCC保藏说明指定，所述ATCC保藏说明选自由下列保藏说明构成的组：a)中华仓鼠卵巢(CHO)：C06-40B5；CHO DG44Biogen Idec EA03.14.06；b)中华仓鼠卵巢(CHO)：C03-2CHO DG44Biogen Idec DA 03.14.06；c)中华仓鼠卵巢细胞系：G11 708e6细胞08.09.2006；d)杂交瘤8.P2A7.3D11；e)杂交瘤细胞系：7.20C8.3B8；f)杂交瘤：
5.P1A2.2B11；g)杂交瘤：7.20D8.24.B11；h)杂交瘤细胞系：9.P1E2.3B12；和i)杂交瘤细胞系：5P1G10.2B8。
[1073] F21.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合多肽结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，所述多肽结构域由胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的纤连蛋白III型结构域-1(FNIII-1)构成。
[1074] F22.F14所述的方法，其中所述第一制剂是抑制胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和胰岛素样生长因子-2(IGF-2)与IGF-1R结合的分离的抗体或抗原结合片段。
[1075] F23.F22所述的方法，其中所述抑制是变构性的.
[1076] F24.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述结合的亲和性通过一个或多种IGF-1R残基的突变而降低，所述IGF-1R残基选自：a)Glu-459；b)Ser-460；c)Asp-461；d)Val-462；e)His-464；f)Thr-466；g)Ser-467；h)Thr-478；i)His-480；j)Tyr-482；k)Arg-483；l)Glu-533；m)Ile-564；n)Arg-565；o)Lys-568；p)Glu-570；和q)Ile-571。
[1077] F25.F24所述的方法，其中所述突变是选自下列的替换突变：a)Glu-459至Ala；b)Ser-460至Ala；c)Asp-461至Ala；d)Val-462至Thr；e)His-464至Ala；f)His-464至Glu；g)Thr-466至Leu；h)Ser-467至Tyr；i)Thr-478至Arg；j)His-480至Glu；k)Tyr-482至Ala；l)Arg-483至Trp；m)Glu-533至His；n)Ile-564至Thr；o)Arg-565至Ala；p)Lys-568至Ala；q)Glu-570至Ala；和r)Ile-571至Thr。
[1078] F26.F24或F25所述的方法，其中所述抗体结合亲和性下降约2.5至约10倍。
[1079] F27.F24或F25所述的方法，其中所述抗体结合亲和性下降约10至约100倍。
[1080] F28.F24或F25所述的方法，其中所述抗体结合亲和性下降大于100倍。
[1081] F29.F24或F25所述的方法，其中所述抗体结合亲和性消除。
[1082] F30.F24至F29中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段抑制IGF-1和IGF-2配体结合IGF-1R。
[1083] F31.F30所述的方法，其中所述抑制是变构性的。
[1084] F32.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合多肽结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，所述多肽结构域由IGF-1R的富半胱氨酸区域(CRR)构成。
[1085] F33.F32所述的方法，其中所述抗体抑制IGF-1和IGF-2配体结合IGF-1R。
[1086] F34.F33所述的方法，其中所述抑制是竞争性的。
[1087] F35.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合的亲和性通过一个或多种IGF-1R残基的突变而降低，所述IGF-1R残基选自：a)Asp-248；b)Asp-250；c)Asn-254；d)Ser-257；e)Glu-259；f)Ser-260；g)Ser-263；h)Gly-265；和i)Glu-303。
[1088] F36.F35所述的方法，其中所述突变是选自下列的替换突变：a)Asp-248至Ala；b)Asp-250至Ser；c)Asn-254至Ala；d)Ser-257至Phe；e)Ser-257至Lys；f)Glu-259至Lys；g)Ser-260至Asn；h)Ser-263至Arg；i)Gly-265至Tyr；和j)Glu-303至Gly。
[1089] F37.F35或F36所述的方法，其中所述抗体结合亲和性下降约2.5至约10倍。
[1090] F38.F35或F36所述的方法，其中所述抗体结合亲和性下降约10至约100倍。
[1091] F39.F35或F36所述的方法，其中所述抗体结合亲和性下降大于100倍。
[1092] F40.F35或F36所述的方法，其中所述抗体结合亲和性消除。
[1093] F41.F35至F40中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段抑制IGF-1和IGF-2配体结合IGF-1R。
[1094] F42.F41所述的方法，其中所述抑制是竞争性的。
[1095] F43.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合多肽结构域的分离的抗体或其抗原结合片段，所述多肽结构域由富半胱氨酸区域(CRR)和第二富亮氨酸重复结构域(L2)构成。
[1096] F44.F43所述的方法，其中所述抗体抑制IGF-1而不抑制IGF-2配体与IGF-1R的结合。
[1097] F45.F44所述的方法，其中所述抑制是变构性的。
[1098] F46.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合的亲和性通过一个或多种IGF-1R残基的突变而降低，所述IGF-1R残基选自：a)Asp-248；b)Asn-254；c)Ser-257；和d)Gly-265。
[1099] F47.F46所述的方法，其中所述突变是选自下列的替换突变：a)Asp-248至Ala；b)Asn-254至Ala；c)Ser-257至Lys；和d)Gly-265至Tyr。
[1100] F48.F46或F47所述的方法，其中所述抗体结合亲和性下降约10至约100倍。
[1101] F49.F46或F47所述的方法，其中所述抗体结合亲和性消除。
[1102] F50.F46至F49中任一项所述的方法，其中所述抗体抑制IGF-1而不抑制IGF-2配体与IGF-1R的结合。
[1103] F51.F50所述的方法，其中所述抑制是变构性的。
[1104] F52.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合和参考单克隆Fab抗体片段或由杂交瘤生产的参考单克隆抗体相同的胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)表位的分离的抗体或其抗原结合片段，所述参考单克隆Fab抗体片段选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组，所述杂交瘤选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组。
[1105] F53.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段竞争性地抑制参考单克隆Fab抗体片段或由杂交瘤生产的参考单克隆抗体与IGF-1R的结合，所述参考单克隆Fab抗体片段选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组，所述杂交瘤选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组。
[1106] F54.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含和单克隆Fab抗体片段或由杂交瘤生产的单克隆抗体的抗原结合域等同的抗原结合域，所述单克隆Fab抗体片段选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组，所述杂交瘤选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组。
[1107] F55.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的重链可变区(VH)包含与选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
[1108] F56.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的轻链可变区(VL)包含与选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
[1109] F57.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了20个或更少保守氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[1110] F58.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了20个或更少保守氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[1111] F59.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：63构成的组的氨基酸序列。
[1112] F60.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含选自由SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：118构成的组的氨基酸序列。
[1113] F61.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含与选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118构成的组的参考氨基酸序列至少具有90％一致性的氨基酸序列。
[1114] F62.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含除了各有20个或更少保守氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118构成的组的参考氨基酸序列一致的氨基酸序列。
[1115] F63.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH和VL分别包含选自由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：73；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：78；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：
53和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：113；和SEQ ID NO：63和118构成的组的氨基酸序列。
[1116] F64.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了两个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64构成的组的参考VH-CDR1氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-1(VH-CDR1)氨基酸序列。
[1117] F65.F64所述的方法，其中所述VH-CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：64构成的组。
[1118] F66.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65构成的组的参考VH-CDR2氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-2(VH-CDR2)氨基酸序列。
[1119] F67.F66所述的方法，其中所述VH-CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：65构成的组。
[1120] F68.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66构成的组的参考VH-CDR3氨基酸序列一致的Kabat重链决定簇互补区-3(VH-CDR3)氨基酸序列。
[1121] F69.F68所述的方法，其中所述VH-CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：66构成的组。
[1122] F70.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119构成的组的参考VL-CDR1氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-1(VL-CDR1)氨基酸序列。
[1123] F71.F70所述的方法，其中所述VL-CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：119构成的组。
[1124] F72.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了两个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120构成的组的参考VL-CDR2氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-2(VL-CDR2)氨基酸序列。
[1125] F73.F72所述的方法，其中所述VL-CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：120构成的组。
[1126] F74.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了四个或更少氨基酸替换外与选自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121构成的组的参考VL-CDR3氨基酸序列一致的Kabat轻链决定簇互补区-3(VL-CDR3)氨基酸序列。
[1127] F75.F74所述的方法，其中所述VL-CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：121构成的组。
[1128] F76.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含除了在至少一个所述VH-CDR中一个、两个、三个或四个氨基酸替换外选自由SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；SEQ ID NO：27、28和29；SEQ ID NO：33、34和35；SEQ ID NO：
39、40和41；.SEQ ID NO：44、45和46；SEQ ID NO：49、50和51；SEQ ID NO：54、55和56；SEQ ID NO：59、60和61；以及SEQ ID NO：64、65和66构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。
[1129] F77.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VH包含选自由SEQ ID NO：5、6和7；SEQ ID NO：10、11和12；SEQ ID NO：15、16和17；SEQ ID NO：21、22和23；SEQ ID NO：27、28和29；SEQ ID NO：
33、34和35；SEQ ID NO：39、40和41；.SEQ ID NO：44、45和46；SEQ ID NO：49、50和51；
SEQ ID NO：54、55和56；SEQ ID NO：59、60和61；以及SEQ ID NO：64、65和66构成的组的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。
[1130] F78.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含除了在至少一个所述VL-CDR中一个、两个、三个或四个氨基酸替换外选自由SEQ ID NO：69、70和71；SEQ ID NO：74、75和76；SEQ ID NO：79、80和81；SEQ ID NO：84、85和86；SEQ ID NO：89、90和91；SEQ ID NO：94、95和96；SEQ ID NO：99、100和101；SEQ ID NO：104、105和106；SEQ ID NO：109、110和111；SEQ ID NO：
114、115和116；以及SEQ ID NO：119、120和121构成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。
[1131] F79.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段的VL包含选自由SEQ ID NO：69、70和71；SEQ ID NO：74、75和76；SEQ ID NO：79、80和81；SEQ ID NO：84、85和86；SEQ ID NO：89、90和91；SEQ ID NO：
94、95和96；SEQ ID NO：99、100和101；SEQ ID NO：104、105和106；SEQ ID NO：109、110和111；SEQ ID NO：114、115和116；以及SEQ ID NO：119、120和121构成的组的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。
[1132] F80.F52至F79中任一项所述的方法，其中所述抗体VH框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[1133] F81.F52至F80中任一项所述的方法，其中所述抗体VL框架区除了五个或更少的氨基酸替换外为人源。
[1134] F82.F52至F81中任一项所述的方法，其中所述抗体结合非线性构型表位。
[1135] F83.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸残基缬氨酸-462。
[1136] F84.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸残基组氨酸-464。
[1137] F85.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸残基缬氨酸-462和组氨酸-464。
[1138] F86.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其距离残基缬氨酸-462的溶剂可及表面半径为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14埃。
[1139] F87.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其距离残基组氨酸-464的溶剂可及表面半径为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14埃。
[1140] F88.F 14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其距离残基缬氨酸-462和组氨酸-464的溶剂可及表面半径为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14埃。
[1141] F89.F14所述的方法，其中所述第一制剂是特异性结合IGF-1R表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其距离人IGF-1R的残基缬氨酸-462和组氨酸-464的中心的溶剂可及表面半径为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14埃。
[1142] F90.F52至F89中任一项所述的方法，其中所述抗体结合线性表位。
[1143] F91.F52至F90中任一项所述的方法，其中所述抗体为多价体，并包含至少两条重链和至少两条轻链。
[1144] F92.F52至F91中任一项所述的方法，其中所述抗体是多特异性的。
[1145] F93.F52至F92中任一项所述的方法，其中所述抗体重链和轻链可变域是完全人源的。
[1146] F94.F93所述的方法，其中所述抗体重链和轻链可变域来自选自由M13-C06、M14-G11、M14-C03、M14-B01、M12-E01和M12-G04构成的组的单克隆Fab抗体片段。
[1147] F95.F52至F94中任一项所述的方法，其中所述抗体重链和轻链可变域是鼠源的。
[1148] F96.F95所述的方法，其中所述抗体重链和轻链可变域来自由选自由P2A7.3E11、20C8.3B8、P1A2.2B 11、20D8.24B11、P1E2.3B12和P1G10.2B8构成的组的杂交瘤生产的单克隆抗体。
[1149] F97.F52至F92和F95至F96中任一项所述的方法，其中所述抗体是人源化的。
[1150] F98.F52至F92和F95至F96中任一项所述的方法，其中所述抗体是嵌合的。
[1151] F99.F52至F92和F95至F96中任一项所述的方法，其中所述抗体是灵长源化的。
[1152] F100.F52至F94中任一项所述的方法，其中所述抗体是完全人源的。
[1153] F101.F52至F100中任一项所述的方法，其中所述抗体是Fab片段。
[1154] F102.F52至F100中任一项所述的方法，其中所述抗体是Fab′片段。
[1155] F103.F52至F100中任一项所述的方法，其中所述抗体是F(ab)2片段。
[1156] F104.F52至F100中任一项所述的方法，其中所述抗体是Fv片段。
[1157] F105.F52至F100中任一项所述的方法，其中所述抗体是单链抗体。
[1158] F106.F52至F103和F105中任一项所述的方法，其中所述抗体包含选自由人kappa恒定区和人lambda恒定区构成的组的轻链恒定区。
[1159] F107.F52至F103和F105中任一项所述的方法，其中所述抗体包含重链恒定区或其片段。
[1160] F108.F107所述的方法，其中所述重链恒定区或其片段是人IgG4。
[1161] F109.F108所述的方法，其中所述IgG4被突变以去除糖基化位点。
[1162] F110.F109所述的方法，其中所述突变包含Kabat编号系统的S241P和T318A。
[1163] F111.F52至F110中任一项所述的方法，其中所述抗体通过以解离常数(KD)低于对所述参考单克隆抗体的KD表征的亲和力特异性结合IGF-1R多肽或其片段或IGF-R1变体多肽。
[1164] F112.F52至F111中任一项所述的方法，其中所述抗体通过以解离常数(KD)不大-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7于 5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-13 -14 -14 -15 -15
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M或10 M表征的亲和力特异性结合IGF-1R多肽或其片段或IGF-R1变体多肽。
[1165] F113.F52至F112中任一项所述的方法，其中所述抗体亲和力表征为解离常数-10 -9(KD)为约1x10 至约5x10 M。
[1166] F114.F52至F113中任一项所述的方法，其中所述抗体亲和力表征为解离常数-10 -10 -10 -9(KD)选自：(a)约1.1x10 M；(b)约1.3x10 M；(c)约3.6x10 M；(d)约1.3x10 M；(e)约-9 -9
4.0x10 M；和(f)约4.9x10 M。
[1167] F115.F52至F114中任一项所述的方法，其中所述抗体亲和力表征为解离常数-10 -10 -10 -9 -9(KD) 选 自：(a)1.1x10 M；(b)1.3x10 M；(c)3.6x10 M；(d)1.3x10 M；(e)4.0x10 M；和-9
(f)4.9x10 M。
[1168] F116.F1至F115中任一项所述的方法，其中所述一种或多种组合物除了所述第一和第二制剂外包含多种制剂，其中所述多种另外的制剂是治疗上用于治疗过度增殖病症的。
[1169] F117.F116所述的方法，其中所述多种另外的制剂包括任何数量制剂，所述制剂选自：a)第三制剂；b)第四制剂；c)第五制剂；d)第六制剂；e)第七制剂；f)第八制剂；g)第九制剂；h)第十制剂；i)10至20之间任何数量的另外的制剂；j)20至100之间任何数量的另外的制剂；k)100至1000之间任何数量的另外的制剂；l)1000至1,000,000之间任何数量的另外的制剂；和m)大于1,000,000另外的制剂。实施例
[1170] 实施例1
[1171] IGF-1R特异性Fab从噬菌体库的选择
[1172] 重组人IGF-1R胞外区结构域被用于筛选包含3.5x1010个独特克隆的人原态噬菌粒Fab库(Hoet，R.M.，et al.Nat Biotechnol.23(3)：344-8(2005)，(″Hoet et al.″)通过引用的方式全文并入本文中)。在两个不同的淘选臂之后使用生物素化的IGF1R-his和IGF1R-Fc蛋白。以链霉亲和素包覆的磁珠捕获蛋白，然后与噬菌体孵育。对于IGF1R-Fc，生物素化的抗-Fc抗体被捕获在磁珠上，然后捕获Fc融合蛋白。参照Hoet et al.的描述进行选择。3轮淘选之后，通过MluI消化去除479bp基因III残余部分，且该载体被重新连接以在TG1细胞中进行可溶性Fab表达。对生物素化IGF1R-His臂的920个克隆的ELISA分析获得了593个阳性克隆，其中包含33个独特的序列。对IGF 1R-Fc臂的920个克隆的ELISA分析获得了163个阳性克隆，其中包含12个独特的序列。对所有克隆的序列分子确定在淘选策略的两个臂中分离得到12个克隆。纯化独特的克隆，并通过ELISA和以全长人IGF-1R稳定转染的3T3细胞再次确认与重组人IGF-1R胞外区结构域的结合(图1A和1B)。根据结合数据，从两条臂中分离得到的12个独特克隆中的6个被选定用于进一步分析。
[1173] 实施例2
[1174] Fab对肿瘤细胞上表达的IGF-1R的结合活性
[1175] Fab结合野生型IGF-1R的能力可通过采用MCF-7肿瘤细胞系的流式细胞术进行测定。
[1176] 在建立测定前24小时分裂MCF-7细胞(来自NCI的人乳腺癌细胞)以获得70％汇合的单层。MCF-7细胞系被常规维持在20代以内。以细胞解离缓冲液(Gibco目录编
6
号13151-014)解离细胞，计数，洗涤并调整至1x10 细胞/ml，然后向每个管(12x75mm管Falcon目录编号352054)中添加1ml的细胞。在1200rpm下离心5分钟聚集细胞并去除
上清液，然后向细胞团添加100μl稀释抗体。测试的纯化Fab的起始浓度可以是210或
60μg/ml以1∶3稀释于FRCS缓冲液，直至0.001μg/ml。在整个测定中使用的FACS缓冲液为含1％BSA(Sigma目录编号A-7906)和0.1％叠氮化钠(Sigma目录编号S2002)的
PB S(无Ca++/Mg++)。鼠源抗体IR3(Ab-1；Calbiochem #GR1 IL)被用作阳性对照。在冰上孵育样品1小时15分钟，然后以2ml FACS缓冲液洗涤，并在4℃ 1200rpm离心5分钟。
吸出上清液，并向每个相应的管中添加含于FACS缓冲液的100μl二级检测抗体。在暗处和冰上孵育样品30分钟。按如上洗涤细胞，然后以每管/样品250μl FACS缓冲液重悬浮。
[1177] 使用FITC-结合的亲和性纯化的F(ab′)2片段特异性山羊抗-人-IgG(Jackson ImmunoResearch Lab catalog #109-096-006；在5μg/ml下使用)检测结合Fab的细胞，而阳性鼠对照抗体采用F(ab′)2FITC结合的山羊抗-小鼠IgG(H+L)(Jackson
ImmunoResearch，catalog# 115-096-062；在5μg/ml下使用)进行检测。对细胞染色，以采用碘化吡啶溶液进行活细胞测定(以PI进行死亡细胞排除；BD Pharmingen catalog #51-66211E或556463；最终以1∶500含于FACS缓冲液)。在FACSCalibur仪器(Becton Dickinson)上以每个样品10000生活事件运行样品。使用GraphPad Prism version 4.0软件(www.graphpad.com)(GraphPad Software，Inc.，11452 E1 Camino Real，#215，San Diego，CA 92130 USA)分析数据。
[1178] 一旦样品被运行并测得几何平均数，可通过GraphpadPrism(Prism Graph)制图程序绘制抗体浓度(X轴)相对几何平均值(Y轴)的log 10的图。然后将数据组转化((X值数据组＝抗体浓度)为X＝Log(X)，并通过S型剂量响应(Sigmoidal dose-response)
2
非线性回归曲线拟合绘图。通过Prism Graph软件生成EC50值和R 值。
[1179] 所有6个Fab显示出对肿瘤细胞上表达的野生型IGF-1R的良好的结合活性(图2)。结合的EC50在9至42nM范围内(表3)。
[1180] 实施例3
[1181] Fab对配体结合IGF-1R的抑制
[1182] Fab阻断IGF-1和IGF-2配体与IGF-1R结合的能力可通过放射性免疫测(RIA)定进行检测。
[1183] 配体阻断测定(RIA)。重组人IGF-1(Cat# 291-G1)，IGF-2(Cat# 292-G2)，胰岛素(Cat# Custom02)人胰岛素受体(Cat#1544-1R)购自R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN。胰岛素(Arg-胰岛素，Cat#01-207)购自Upstate Cell Signaling Solutions(Lake125
Placid，NY( 现 为 Millipore，Concord，MA(USA) 的 一 部 分 )。 I-rhIGF-1(Cat#
125 125
IM 172)， I-rhIGF-2(Cat# IM238) 和 I-rhInsulin(Cat# IM166) 购 自 Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)。AffiPure山羊抗-人IgG，Fcγ片段特异性抗体(Cat #
109-005-098，Jackson IrnmunoResearch，WestGrove，PA)被用于捕获IGF-1R-Fc。山羊抗-小鼠IgG HRP(Cat# 1030-05，Southern Biotech Birmingham，AL)被用作检测抗体。
[1184] IR3(Ab-1，Cat.#GRIILSPS，Calbiochem，La Jolla，CA)和1H7(特异性针对IGF-1R α-链sc-461的小鼠单克隆，IgG1，SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)分别被用作IGF-1和IGF-2阻断的阳性对照。人胰岛素受体α-亚基特异性抗克隆83-14，(Cat#AHR0221，Biosource International，Inc.，Camarillo，CA)和47-9(Cat# E55502M，Biodesign International，Saco，ME)被用作胰岛素-胰岛素受体结合实验中的阳性对照阻断。重组IGF-1R-Fc融合蛋白由Biogen Idec(Cambridge，MA)生产。
[1185] 2B8(鼠α-CD20.IgG1)和2B8 mkm.G2a(鼠 α-CD20 MAb，IgG2a，Biogen Idec，Lot #NB3304-87，San Diego，CA)被用作同型匹配小鼠阴性对照抗体。Fab的阴性对照为Christilyn Graff(Biogen Idec，Cambridge，MA)提供的8001-1B。在缓冲液中使用的PBS来自于Bio Whittaker(Cat.#17-513F，Walkersville，MD)。
[1186] 重组人IGF-1R(组氨酸标记型)或IGF-1R-Fc包覆在IMMULON2HB(高结合)Removawell条带上(Dynex Technologies，Inc.，cat.#6302)并以pH 9.5的碳酸盐包覆缓冲液稀释至浓度为250ng/孔。在4℃孵育过夜后，以洗涤缓冲液(0.05％Tween 20/PBS)洗涤三次，然后以阻断缓冲液(3％BSA/PBS)在室温下阻断一小时。去除阻断缓冲液，继续洗涤孔三次。以稀释缓冲液(1％BSA/0.05％Tween 20/PBS)将抗体，Fab或配体制备物稀释至目标浓度，并以每孔50μl双份包覆。室温下45分钟后，向每个孔添加含于50μl稀释缓冲液的100,000cpm[125I]rhIGF-1或[125I]rhIGF-2。再在室温下孵育1小时。再次洗涤孔三次，并在最后一次洗涤后不留下液体。使用Isodata伽马计数器对空气干燥的孔计数。
[1187] 可选择地，可通过改良的捕获测定评估Fab，其中采用固定化至平板的抗-人IgG捕获IGF-1R-Fc。可通过在碳酸盐包覆缓冲液中将山羊抗-人片IgG，Fcγ片段特异性抗体(200ng/孔)孵育过夜进行固定化。洗涤孔，阻断并向每个孔添加250ng IGF-1R-Fc。
[1188] 表3中显示了6种不同Fab阻断IGF-1或IGF-2或两种配体的结合的能力。具有不同阻断活性的上面6个Fab被选择进行进一步分析。
[1189] 实施例4
[1190] Fab抑制IGF-1和IGF-2介导的IGF-1R磷酸化
[1191] 细胞系：表达人乳腺癌细胞系MCF-7(NCI)的IGF1R被维持于37℃和5％CO2下含10％FBS，1X非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠以及1000U/ml青霉素和链霉素的MEM eagle(ATCC)中。细胞被每周两次传代培养以进行维持和测定，所用的细胞最大为
12代。
[1192] 将含于2ml生长培养基的MCF-7细胞以2X105至4.0X105细胞/孔包覆于包覆了聚-D-赖氨酸的12孔板(BD Biosciences，#35-6470)上并在37℃，5％CO2下培养。48小时后，去除培养基并使细胞在37℃，5％CO2下血清饥饿过夜。去除无血清培养基，添加含于350μl新鲜无血清培养基的指定浓度的对照或测试抗体，并在室温下或37℃孵育1小时。
Fab在200nM、20nM和2nM的浓度系测试，而mAb在67、6.7和0.67nM的浓度下测试。所用的商业抗-IGF-1R对照抗体为αIR3(EMD biosciences，Oncogene Research products，#D27249)。向孔中添加含于35μl无血清培养基的13nM人重组IGF-1或27nM的IGF-2(R&D Systems，#291-G1，#292-G2)并在37℃孵育15分钟。配体在室温下孵育并用于37℃抗体实验。在具有1mM PMSF的1X细胞溶解缓冲液(Cell Signal technologies，#9803)中于室温下溶解细胞1小时。
[1193] 向预包覆了IGF-1Rβ抗体(克隆1-2，BiosourceInternational，#AHR0361)的ELISA平板添加细胞溶解产物并孵育2小时。随后洗涤平板，并以生物素标记的抗-磷酸酪氨酸抗体4G10(Catalog#16-103，Upstate Cell Signaling Solutions(Lake Placid，NY(现为Millipore，Concord，MA(USA)的一部分)和链霉素-HRP(BD Pharmingen，#554066)检测结合磷酸化受体的平板。通过添加TMB底物(Kierkegaard&Perry，#50-76-00)开始测定并通过添加4N H2SO4-4(LabChem，Cat#LC25830-1)终止显色。使用Molecular Devices平板读取器在450nm下读取光密度，并计算每个抗体-配体样品相对配体对照的抑制百分比。
[1194] 表3总结了Fab对MCF-7细胞中IGF-1和IGF-2介导的IGF-1R磷酸化的抑制。通过ELISA共筛选了16个IGF-1R Fab对受体磷酸化的抑制。九个抗体在200nM浓度下对IGF-1、IGF-2或两者显示了阳性响应“+’，或更好的响应。这些抗体被选择进行数量放大，并进行剂量依赖型抑制响应的测试。基于抑制配体结合和受体磷酸化的能力，四种Fab被选为全长抗体阳转的主要候选物(参见，实施例6)。
[1195] 图3(A和B)显示了顶部6个IGF-1R Fab的放大物质对IGF-1R磷酸化的抑制。
[1196] 实施例5
[1197] 抗体相对INSR对IGF-1R的结合特异性和亲和性
[1198] I部分：通过酶联免疫吸附分析(ELISA)对抗体相对可溶性INSR与可溶性IGF-1R的结合的分析。
[1199] 通过ELISA测定检测Fab片段抗体相对于胰岛素受体对可溶性IGF-1R的特异性结合。以10ug/ml的rh-IGF-1R(R&D Systems，#305-GR)或rh-INSR(R&D Systems，#
1544-IR)包覆平板过夜并以5％牛奶阻断。针对Fab添加浓度在2μM-0.2nM范围内的
1∶10稀释抗体或针对鼠Mab添加浓度在667-0.067nM范围内的1∶10稀释抗体并在室
温下孵育1小时。以针对Fab的HRPO标记的山羊α-人kappa(Southern Biotechnology Associates，#2060-0S)和针对鼠Mab的山羊α-小鼠IgG Fcγ(Jackson Immunoresearch，#115-035-164)检测结合抗体。通过添加4N H2SO4终止显色，使用Molecular Devices平板读取器在450nm下读取光密度并生成结合曲线。
[1200] IGF-1R在任何浓度下均未对可溶性胰岛素受体显示出特异性结合(表3)，然而与预期相同，它们很好地结合IGF-1R-Fc。
[1201] 图4(A和B)显示了由Fabs M14-B01，M14-C03和M12-G04得到的代表性的结合曲线。对M13-C06，M14-G11和M12-E01观察到了类似的结合模式(数据未显示)。
[1202] II部分：通过表面等离子共振(SPR)和时间分辨荧光共振能量转移((tr-FRET)分析抗体相对于可溶性INSR与可溶性IGF-1R的结合
[1203] 通过通过表面等离子共振(Biacore)和时间分辫荧光共振能量转移(tr-FRET)对M13-C06、M14-C03和M14-G11抗体与可溶性人IGF-1R和胰岛素受体胞外区结构域的结合亲和性进行比较；进一步证实M13-C06抗体未显示与胰岛素受体，鼠IGF-1R，或平头型人IGF-1R(即，hIGF-1R氨基酸残基1-462仅包含第一和第二亮氨酸富集重复区以及半胱氨酸富集重复区，但缺失IGF-1R在结构域中的三个纤维连接蛋白类型)具有明显的交叉反应性。
[1204] 表面等离子体共振(SPR)分析
[1205] SPR分析通过Biacore3000进行。该仪器被设置为25℃，并使用购自Biacore(Biacore，Cat.No.BR-1001-88)的运行缓冲液HBS-EP pH 7.2进行测定。参照Biacore提供的方法使用标准的NHS/EDC-胺反应化学品将全人源抗体M13-C06、M14-C03和M14-G11以～10,000RU固定化至Biacore CMS研究级SensorChip表面。该抗体在10mM醋酸盐pH 4.0缓冲液中被稀释至40g/mL以进行固定化。为了考察人IGF-1R(1-902)-His
10(hIGF-1R-His10(R&D systems))和人INSR(28-956)-His10(INSR(R&D systems))的全长胞外区结构域对各个人抗体的结合和解离的相对动力学，向传感器芯片表面注射上升浓度的hIGF-1R-His10或INSR。hIGF-1R-His10浓度介于1.0nM至250nM，而INSR浓度介于1.0nM至2μM。所有的抗体表面均以pH 2.0的100mM甘氨酸进行可靠地再生。重复再生不会导致任意抗体表面的活性损失。流速为20l/min。(“His10”指在构建体C-末端的10-残基组氨酸标记)。
[1206] 时间分辨荧光共振能量转移(tr-FRET)测定
[1207] 参照染料生产商的方法使用标准NHS化学品将hIGF-1R-His10和M13-C06分别共价结合至Cy5和铕鳌合物。将从6.25g(50l 125g/ml的储备溶液)开始的系列稀释的多种未标记可溶性胞外区结构域受体竞争剂(1)hIGF-1R-His10，(2)人IGF-1R(1-903)-FlagHis10(hIGF-1R-FlagHis10，Biogen Idec)，(3) 人 IGF-1R(1-903)-Fc(hIGF-1R-Fc，Biogen Idec)，(4) 人 IGF-1R(1-462)-Fc(hIGF-1R(1-462)-Fc，Biogen Idec)，(5) 鼠IGF-1R(1-903)-Fc(mIGF-1R-Fc，Biogen Idec)or(6)INSR，起始6.25g(50l，125g/ml储备溶液)，与0.1g hIGF1R-His10-Cy5(25l，4g/ml储备溶液)和0.075μg Eu-C06(25μl，3g/ml储备溶液)混合于96孔微量滴定板(黑色，来自于Costar)。通过检测各个染料相对蛋白浓度的吸收可以看到hIGF-1R-His10-Cy5的结合水平为6.8∶1(Cy5∶IGF-1R-His10)，而Eu-C06的结合水平为10.3∶1(Eu∶C06)。每个样品的总体积为100l。将平板在平板振荡器上室温孵育1小时。采用激发波长为340nm，发射波长为665nm的LANCE方案以Wallac
2
Victor 荧光平板读取器(Perkin Elmer)进行荧光检测。所有的构建体至少采用两个重复样品。
[1208] 所有来自Biogen Idec的可溶性IGF-1R受体胞外区结构域构建体被通过所述的方法亚克隆进入Biogen Idec PV-90载体以进行CHO表达(Brezinsky等人，2003)。参照前述采用单独蛋白ASEPHAROSE FFTM(GE Heathcare)步骤亲和纯化每个包含C-末端2+
IgG-F。标记的受体。参照前述(Demarest等人.，2006)采用Ni -琼脂糖(Qiagen)纯化hIGF-1R-FlagHis10。
[1209] 结果：
[1210] 采用表面等离子共振(SPR)评估全人源抗-IGF-1R抗体、M13-C06、M14-C03和M14-G11对可溶性IGF-1R和INSR胞外区结构域构建体的竞争性结合活性。采用相同的方案将hIGF-1R-His10和INSR注射至固定化抗体表面。经证实hIGF-1R-His10即使在最低浓度0.5nM下仍可结合所有三种抗-IGF-1R抗体(数据未显示，浓度范围从1至250nM，且该受体注射期400-2200秒，然后为缓冲液解离期，并以甘氨酸进行后续再生，pH 2.0。)hIGF-1R-His10对M13-C06相反地，经证实INSR即使在浓度高达2μM(高于对IGF-1R结合时1000倍以上)受体时对M13-C06表面仍仅有极小的活性(数据未显示：浓度范围从1.0nM至22μM，受体注射期500-1000秒，然后为缓冲液解离期)。同样证实M14-C03和M14-G11表面对INSR的结合活性很小。
[1211] 然后，采用基于竞争的tr-FRET测定检测各种重组IGF-1R和INSR构建体对M13-C06的亲和性。测定了所有重组受体构建体(如下文描述)的最佳拟合结合曲线(数据未显示)。所有的数据均拟合至单位点结合模型，并由此测得相应的IC50值。三种全长人IGF-1R胞外区结构域构建体(hIGF-1R-Fc、hIGF-1R-His10和hIGF-1R-FlagHis10)均以浓度依赖方式竞争，其IC50值分别为2.9、2.0、5.2μg/ml。平头人IGF-1R(1-462)-Fc构建体，全长小鼠IGF-1R-Fc构建体，以及全长人INSR-His10构建体在重组全场人IGF-1R构建体的IC50以上100倍的浓度下不抑制Cy5-标记的hIGF-1R-His10，提示前者构建体与后者全长人IGF-1R而言对M13-C06不显示明显的结合活性。
[1212] III部分：M13-C06抗体相对于鼠IGF-1R对可溶性人IGF-1R的相对结合亲和性[1213] 此处比较了M13-C06对于鼠和人IGF-1R的相对结合亲和性。使用表面等离子共振(SPR)测定M13-C06对鼠IGF-1R Fc和人IGF-1R Fc的亲和性。将Biacore 3000设置为25℃，并以HBS-EP(Biacore，Cat.No.BR-1001-88)为运行缓冲液进行实验。通过注射将HBS-EP缓冲液中的500nM抗-人IgG-Fc抗体(2C11来自于Biogenesis，
Cat.No.5218-9850)在Biacore CMS芯片(Cat.No.BR-1000-14)表面上固定化至饱和。
mIGF-1R-Fc或hIGF-1R-Fc通过以3μL/min注射40μL 20nM受体被捕获至芯片表面。在受体捕获后，以3μL/min注射40μL M13-C06 Fab。在～27分钟检测Fab的解离。将Fab由
25至0.4nM系列稀释以获得浓度依赖型动力学结合曲线。通过在60μL/min下的3x10μL注射pH 2.0的100mM甘氨酸在各注射系列间进行表面芯片再生。通过(1)没有抗-IgG抗体2C11的CMS芯片表面获得的数据以及(2)初次注射受体后再注射HBS-EP缓冲液所得的数据对各条曲线进行双重参考。M13-C06 Fab针对各个受体的浓度系列被拟合至生产商的BiaEvaluation软件中所提供的1∶1结合模型。为了获得M13-C06对mIGF-1R-Fc结合
的kd，以25nM的M13-C06 Fab和20nM的mIGF-IR-Fc重复实验，其中原始方法中唯一的变化是将解离期延伸至三小时。
[1214] 结果：
[1215] 将M13-C06Fab应用于含hIGF-IR-Fc或mIGF-1R-Fc的Biacore表面以测定该抗体对两类受体的相对亲和性。C-末端IgG1-Fc的存在导致IGF-1R-Fc受体构建体的额外多聚化(数据未显示)；因此，该结合模型拟合提供了M13-C06对各个受体的相对或表观亲和性的测量。M13-C06 Fab对人和鼠IGF-1R Fc的亲和性分别为0.978nM和89.1nM。在比较显示了结合和解离曲线，动力学速率常数和平衡解离常数的图25A和B时，对鼠IGF-1R的结合的100倍下降显而易见。图25A显示了M13-C06 Fab对人IGF-1R的浓度依赖型结-1 -1 -1合特征(ka(1/Ms)＝8.52e5M s ；kd(1/s)＝8.33e-4s ；和KD＝9.78e-10M)。图27B显-1 -1
示了M13-C06对mIGF-1R-Fc的慢连接和解离结合特征(ka(1/Ms)＝471M s ；kd(1/s)＝-1
4.20e-5s ；KD＝8.91e-8M)。由于M13-C06Fab从mIGF-1R-Fc极慢的解离，无法通过初始数据组测定动力学解离速率常数ka。采用3小时解离期进行第二次实验以获得解离速率常-1
数kd(4.20e-5s )，其被用于从原始数据组获得平衡解离常数KD(如上所述)。C-末端IgG
1-Fc的存在导致IGF-1R-Fc受体构建体的额外多聚化(数据未显示)；因此，该结合模型拟合提供了M13-C06对各个受体的相对或表观亲和性的测量。
[1216] IV部分：M 13-C 06全长抗体特异性结合哺乳动物细胞中表达的IGF-1R而不结合INSR
[1217] 重组IGF-1R和胰岛素受体(IR)在哺乳动物细胞(3T3或CHO)中独立表达。以1％Triton X-100溶解细胞，并以偶合至阴性对照抗体(IDEC-151)，M13.C06.G4.P.agly抗体(C06)，M14-G11.G4.P.agly抗体(G11)或INSR抗体(α-IR)的蛋白-A/G珠免疫沉淀受体。通过酸处理从珠中释放抗体/抗原复合物，加载至Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶并印至硝化纤维膜。使用小鼠抗-人IR(图24A)或小鼠抗-人IGF-1R(图24B)和山羊α-小鼠
IgG进行检测。结果：M13.C06.G4.P.agly抗体结合哺乳动物细胞中表达的IGF-1R但不结合INSR。
[1218] 实施例6
[1219] 全长抗-IGF-1R IgG构建体
[1220] 四种Fab被转化为IgG4.P.agly型并在CHO细胞中表达。通过重组人IGF-1R胞外区结构域-Fc融合蛋白从人抗体噬菌体库(Dyax Corp)生物淘选编码四种不同的
抗-IGF-1R Fab-M13-C06(SEQ ID No.13，14，77，78)，M14-C03(SEQ ID No.25，26，87，88)，M14-G11(SEQ ID No.31，32，92，93)，和M14-B01(SEQ ID No.19，20，82，83)的DNA序列。四种抗-IGF-1R Fab均包含VH3-23人重链胚系框架且为kappa轻链。Fab基因序列被用于通过pV90AS表达载体系统构建编码全长抗-IGF-R1抗体的表达质粒，从而在哺乳动物细胞中生产抗体。pV90AS是改良的pV90表达载体，其经设计可通过初级转录体的替代剪接从单个启动子生成转录体(参考文献：美国专利申请WO2005/089285)。天然CMV剪接供体可被剪接为部分受损剪接受体以生成抗体轻链-编码转录物，或剪接为CMV剪接受体以生成抗体重链-编码转录物。该部分受损剪接受体经工程改造以得到类似数量的重和轻链转录物。各个抗-IGF-1R Fab(M13-C06；M14-C03；M14-G11和M14-B01)的轻链可变(VL)和恒定(CL)区(SEQ ID NO：153和154)通过PCR扩增。(表7)。5’轻链PCR引物IGF1R-FK包括Sfi I限制性核酸内切位点，随后为根据Nakamura T，et al.，Int J Immunopharmacol.22：
131-41(2000)(通过引用的方式全文并入本文中)所述的方法与对应VL区氨基-末端的序列同框的编码免疫球蛋白轻链信号肽MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：157)的序列。所有四个成熟的IGF1R轻链序列具有一致的氨基末端。该3′轻链PCR引物IGF1R-RK包括对应CL区拨基末端和Asc I位点的序列。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，通过QIAquickGelExtration制剂盒法(QIAGEN CA)萃取，以限制性核酸内切酶Sfi I和Asc I消化，并与Sfi I/Asc I消化的pHLP025载体(Holly Prentice)连接。该pHLP025载体除了天然CMV剪接供体位点序列，部分损伤的剪接受体位点序列以及poly A信号序列外包含用于接受作为Sfi I/Asc I消化的PCR片段的抗体轻链(信号肽-VL-CL)的Sfi I/Asc I限制性核酸内切酶位点(参考文献：美国专利申请WO2005/089285)。
[1221] 各 抗 -IGF-1R Fab(M13-C06、M14-C03、M14-G11和 M14-B01) 的 重 链 可 变(VH)区通过PCR扩增。5’重链VH PCR引物IGF1R-FH包含Nco I限制性核酸内切酶位点，其后带有与如上所述的对应VH区氨基末端的序列同框的编码合成重链信号肽
MGWSLILLFLVAVATRVLS(SEQ ID NO：122)的序列。该3’重链VH PCR引物IGF1R-RH包括对应VH区羧基末端和Sfi I位点的序列。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化，通过QIAquick GelExtration制剂盒法(QIAGEN CA)萃取，以限制性核酸内切酶Nco I和Sfi I消化，并与Nco I/Sfi I消化的pHLP029载体(Holly Prentice)连接。该pHLP029载体除了上游poly A信号序列，天然CMV剪接受体位点序列以及下游poly A信号序列外包含用于接受作为Nco I/Sfi I消化的PCR片段的抗体信号肽-VH序列的Nco I/Sfi I位点(参考文献：
美国专利申请WO2005/089285)。
[1222] 采用如上所述的5’轻链IGF1R-FK和3’重链VH IGF1R-RHPCR引物通过在两个载体中的公共重叠序列经PCR扩增组装将pHLP025中编码(Sfi I位点-轻链信号肽-抗-IGF-1R VL和CL)和pHLP029中编码(重链信号肽-抗-IGF-1R VH-Sfi I位点)的基因序列进入单个DNA片段。以琼脂糖凝胶电泳纯化所得的PCR产物，并采用QIAquick GelExtration制剂盒法(QIAGEN，CA)进行萃取，并与Dra III消化的pXWU007载体连接。简单而言，首先通过将在IgG4铰链区包含S228P突变和在CH2区包含T299A突变(EU编号系统(Kabat，E，Wu，TT，Perry，HM，Gottesman，KS，Foeller，C：Sequencesof Proteins of Immunological Interest.B ethesda，US Department ofHealth and Human Services，NIH，1991)(SEQ ID NO：155和156)的Age I/BamHI人IgG4恒定区片段从质粒pEAG1808(由Ellen Garber提供)亚克隆进入Age I/BamHI消化的pHLP028载体构建pXWU007。pHLP028为经修饰包含用于接受如上所述的单独Sfi I-消化PCR产物的Dra III位点的pV90 IgG4载体(参考
文献：美国专利申请WO2005/08928)。
[1223] 所得的质粒生成双效前体转录物，后者可在替代剪接时形成化学计量相当的翻译活性抗体重和轻链mRNA。表8显示了用于生产全长糖苷化人抗-IGF-1R IgG4.P抗体的中间体和表达载体。正确的序列通过DNA序列分析进行确认。来自质粒pXWU020、pXWU022、pXWU024和pXWU025的全长抗体在哺乳动物细胞中的表达可导致稳定，糖苷化人IgG4.P抗体的生产。
[1224] 表7用于人抗体结构域PCR扩增的寡聚核苷酸
[1225] 正向5’轻链PCR引物包含Sfi I限制性核酸内切酶位点(下划线)和编码轻链信号肽的序列；
[1226] 反向3’轻链PCR引物包含Asc I位点(下划线)。
[1227] 正向5’重链可变PCR引物包含Nco I限制性核酸内切酶位点(下划线)和编码重链信号肽的序列。
[1228] 反向3’重链可变PCR引物包含Sfi I位点(下划线)。
[1229]
[1230]
[1231] 表8 编码抗-IGF-1R抗体的中间体和表达质粒
[1232]
[1233] 实施例7
[1234] 构建全长抗-IGF-1R IgG以提高在哺乳动物细胞中的表达
[1235] 为了提高抗体表达产率和产物质量，对来自抗-IGF-1RFab M13-C06、M14-C03、M14-G11和M14-B01的原始VH基因序列进行了修饰。首先，通过公共序列识别程序(www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html(The Institute forGenomic Research，9712 Medical Center Drive，Rockville，MD 20850)，vvww.fruitfly.org/seq-tools/splice.html)(Martin G.Reese和Frank H.Eeckman，Lawrence Berkeley National Laboratory，GenomeInformatics Group，1 Cyclotron Road，Berkeley，CA，94720；还可参见Reese MG，Eeckman，FH，Kulp，D，Haussler，D，1997.″ImprovedSplice Site Detection in Genie″.J Comp Biol 4(3)，311-23.)。在抗-IGF-1R VH序列中分析包含公认剪接位点的序列。其次，以来自曾在CHO细胞中成功表达的抗体中相同Kabat位置的密码子替换抗-IGF-1R Fab重链可变区中的密码子，且不引发抗原始抗-IGF-1R VH多肽序列中的任何改变。第二步主要去除了公认剪接位点，但在同类密码子替换后进行附加剪接位点分析以减少公认剪接位点存在的可能性。
[1236] 编码与 抗-IGF-1R Fab-M13-C06(SEQ ID NO：18)，M14-C03(SEQ ID NO：30)，M14-G11(SEQ ID NO：36)以及M14-B01(SEQ ID NO：24)的序列优化VH序列同框的合成重链前导的DNA片段可作为化学合成双链DNA序列从供应商(Blue Heron Biotechnology，Inc.Bothell WA)处获得。该合成片段包含了在5’和3’的Nco I和Sfi I限制性核酸内切酶位点。将前导和抗-IGF1R序列优化VH区片段克隆进入如上文实施例6所述的Nco I/Sfi I消化的pHLP029载体中。参照上文实施例6所述与pHLP025内适当对应的轻链重组并将单独片段亚克隆进入pXWU007。表9显示了用于生产序列优化全长糖苷化人抗-IGF-1R IgG4.P抗体的表达构建体。正确的序列通过DNA序列分析进行确认。来自质粒系列pXWU029-pXWU032的全长抗体在哺乳动物细胞中的表达可导致稳定，糖苷化人IgG4.P抗体的生产。
[1237] 表9 编码抗-IGF-1R抗体的序列优化表达质粒。优化重链序列前带有“m”
[1238]
[1239] 实施例8
[1240] IGF-1R抗体的瞬时表达和表征
[1241] 使用质粒DNA转化CHO DG44以瞬时生产抗体蛋白。在0.4mL的1X PBS中合并的20μg质粒DNA和4x106细胞。将混合物添加至0.4cm玻璃管(BioRad)并置于冰上15分
钟。以GenePulser电穿孔仪(BioRad)在600uF和350伏特下对细胞进行电穿孔。将细
胞放入含有CHO-SSFM II培养基以及100μM次黄嘌呤和16μM胸苷的T-25烧瓶中，并在
37℃孵育4天。收集上清液，通过Western印迹生化表征，并以ELISA测试抗原结合。
[1242] 可选择地，同样将选定的Fab转化为全长人IgG4.P型，并以如下所述的方法通过不同的载体系统表达。将编码五个不同的抗-IGF1R Fab抗体M12-E01、M12-G04、M13-C06、M14-C03和M14-G11的DNA序列转移进入载体，以表达全长人IgG4.P。所有五个抗体使用VH3-23人重链胚系片段。通过限制性酶MfeI和BstEII的消化从可溶性Fab表达载体去除可变重链。所得的片段通过QIAquick凝胶萃取制剂盒(Qiagen，CA)以琼脂糖凝胶电泳纯化，并结合进入MefI/BstEII消化的pRR253载体(Rachel Rennard)。所得的质粒包含重链信号肽(MGWSCIILFLV AT ATGAHS，SEQ ID NO：127)，以及随后的人IgG4.P抗-IGFIR VH和恒定区。
[1243] 五个抗体中有四个(M12-G04、M13-C06、M14-C03和M14-G11)包含轻链。可变轻链通过PCR扩增，所用引物可向可变区导入EcoRV位点5’和BsgI 3′。所得的PCR片段通过QIAquick凝胶萃取制剂盒(Qiagen，CA)以琼脂糖凝胶电泳纯化，并结合进入TOPO2.1 TA载体(Invitrogen，CA)。以限制性酶EcoRV和BsgI消化从TOPO载体去除可变kappa轻链并纯化。将片段连接进入EcoRV/BsgI消化的pRR237载体，该载体包含免疫球蛋白轻链信号肽(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC，SEQ ID NO：128)和恒定kappa区。以BamHI和NotI消化所得的载体，纯化完整的表达盒(信号序列，可变和恒定kappa区)，并连接进入BamHI/NotI消化的pRR223。
[1244] M12-E01抗体包含lambda轻链。可变轻链通过PCR扩增，所用引物可导入可变区的AgeI位点5′。所得的PCR片段通过QIAquick凝胶萃取制剂盒((Qiagen，CA)以琼脂糖凝胶电泳纯化，并结合进入TOPO2.1 TA载体(Invitrogen，CA)。以限制性酶AgeI和AvrII消化从TOPO载体去除可变lambda轻链并纯化。将片段连接进入AgeI/AvrII消化的pRR237载体(Xin Wang)，该载体包含免疫球蛋白轻链信号肽(METDTLLLWVLLLWVPGSTG，SEQ ID NO：129)和恒定lambda区。以NotI消化所得的载体，纯化完整的表达盒(信号序列，可变和恒定lambda区)，并连接进入NotI消化的pRR223。
[1245] 使用质粒DNA转染293E细胞以瞬时表达抗体蛋白。通过Qiagen的Effectene转6
染法(Qiagen，CA)将1.2μg各种(重和轻)质粒DNA转染进入2x10 细胞。将细胞在37℃孵育3天。收集上清液并同时通过Western印迹和ELISA法确认全长抗体。通过ELISA确认全.IgG4.P结合IGF-1R的能力。
[1246] 实施例9
[1247] 生产抗-IGF-1R抗体的CHO细胞系的开发
[1248] 本实施例给出了抗-IGF-1R抗体(包含作为全长铰链连接的修饰agly gamma 4、kappa(在此成为“agly.IgG4.P”或“G4.P.agly”)抗体的Fab M13-C06结合区)表达的详细描述。此处所述的其它Fab(即，表3列举的Fab)以类似的方式表达。M13-C06的可变和恒定来自人源序列。完整轻链和重链可变区来自通过DYAX噬菌体展示技术针对人IGF-1R生成的Fab。将可变和轻链恒定区亚克隆进入替代剪接表达载体。替代剪接构型通过使用具有两个剪接受体的单个剪接供体连接轻和重链，其中各个剪接受体生成编码两条链其中一条的转录物。将编码免疫球蛋白基因的表达载体DNA电穿孔进入非胰岛素依赖型中国仓鼠卵巢细胞(CHODG44i)。根据生产目的选自CHO转染瘤(细胞系40B5)。
[1249] “空”表达载体pXWU007包含用于在哺乳动物细胞中进行基因表达的人gamma 4恒定区(重链)以及单独启动器-增强子和多聚腺苷酸化区。在表达和翻译后，该重链多肽包含两个氨基酸替换(S228P和T299A)，分别用于减少“半抗体”形成和消除N-连接的糖基化。
[1250] 将来自相应M13-C06轻链基因的可变(VL)和恒定(CL)区和的M13-C06重链可变(VH)区的互补DNA克隆进入表达载体pXWU007。该pXWU007载体包含用于在紧邻人重链恒定区上游插入完整轻链和可变中cDNA的克隆位点。除了Ig基因，该表达载体包含可用于在哺乳动物细胞中选择的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。
[1251] 然后将所得的表达载体转染进入CHO细胞以形成分泌抗-IGF-1R的CHO细胞系(40B5)。
[1252] 将PXWU022电穿孔进入CHO细胞。可使用免疫球蛋白轻链特异性PCR引物对Fab轻链cDNA进行PCR扩增。该5’特异性低聚序列包含来自Biogen Idec抗-CD23分子轻链的原态信号肽。该5’和3’低聚体分别包含Sfi I和Asc I限制性核酸内切酶识别序列以亚克隆进入中间载体(pHLP025)。VH cDNA采用包含合成重链信号肽的5’低聚物进行PCR扩增。该5’和3’低聚体分别包含NcoI和S fi I限制性核酸内切酶识别序列以亚克隆进入中间载体(pHLP029)。
[1253] 以轻链5’和VH 3’低聚物以及pHLP025和pHLP029作为模板进行重叠PCR，从而将轻链和VH区合并为cDNA片段。将所得产物亚克隆进入pXWU007的Dry III位点，从而建立最终的替代剪接表达载体pXWU022。该替代剪接构型通过初级转录物的替代剪接从单个启动子生成两个转录物。天然CMV剪接供体可被剪接为次优剪接受体以生成轻链-编码转录物，或剪接为CMV剪接受体以生成重链-编码转录物。该次优剪接受体经设计可生成类似数量的两种转录物。
[1254] 在HEBS缓冲液中以～700ng/μL的浓度制备该DNA载体(pXWU022)，然后电穿孔进入CHO细胞。使用不同浓度的DNA(15、20、30、40和45μg)进行五次电穿孔。各电穿孔6
分别在具有含4x10 对数期CHO细胞的0.7ml无菌HEBS缓冲液和含DNA的0.1mLHEBS(总
体积0.8mL)的一次性0.4cm玻璃管(Invitrogen)中进行。使用设置为290伏特，950μF的Bio-Rad基因脉冲仪XCELL进行电击。然后将电击细胞在室温下保持10分钟，然后与
10mL室温无胰岛素CHOM 16培养基混合，离心(3′@1000rpm)，并吸取。将细胞重悬浮于
12mL(室温)无胰岛素CHOM 16培养基并转移至T-75组织培养瓶。
[1255] 细胞和培养基：在电穿孔前将CHO细胞培养于添加了1X核苷的无血清培养基(CHOM24)。CHOM24是一种不含任何动物成分的化学成分明确的内部培养基配方。氨甲喋呤选择在无核苷CHOM 16和CHOM24化学成分明确的培养基中进行。
[1256] 电穿孔后，将4x106CHO细胞汇集进入T-75瓶。在细胞被接种进入无核苷培养基后立即进行DHFR表达选择。最终将细胞扩增至125mL摇瓶中的CHOM24(～3周)。为了分离克隆细胞系，将转染的稳定汇集物稀释并以1细胞/孔(含于200μL CHOM 16)包覆于四块96孔板。将平板维持在36℃，直至进行抗体滴度筛选。
[1257] 以特异性针对人kappa链的ELISA测定细胞悬浮液中免疫球蛋白生产以筛选CHO克隆(包覆后21至28日)。在ELISA中所用的捕获抗体为多克隆山羊
抗-人IgG(SouthernBiotech)而检测抗体为结合了过氧化酶的多克隆山羊抗-人
kappa(SouthernBiotech)。扩增分泌免疫球蛋白数量最高的克隆。
[1258] 接种1920孔中总计381个接近汇合孔并测定。在381个孔中，扩增60个以供进一步研究，并扩增该60个中的4个克隆(15A7、40B3、40B5、40F6)。
[1259] 实施例10
[1260] 全人源抗-IGF-1R IgG4.P.agly抗体的纯化和表征
[1261] 通过如下所述的方法纯化并表征CHO细胞生产的抗体。
[1262] 蛋白A捕获：使用3倍柱体积的1X PBS(平衡缓冲液)以100-150cm/hr预平衡蛋白A柱。以150cm/hr，每毫升树脂最大10mg αIGF-1R加载上清液。加载后，以5倍柱体积的平衡缓冲液洗柱。然后，以100mM pH3.0的甘氨酸以上流方向逐步洗脱。采集目标组分并以2M Tris碱滴定至中性pH。用IX PBS透析采集的组分并浓缩物质以准备进行尺寸排阻步骤。
[1263] SUPERDEXTM 200(尺寸排阻)聚集体去除步骤包括用1.5柱体积的1X PBS以36cm/TMhr的流速平衡SUPERDEX 200然后加载蛋白，并采集目标组分。
[1264] 鉴定测试按如下进行
[1265] 1).通过质谱进行完整质量分析，其中在分子量测定在电喷雾质谱分光计(ESI-MSD)上进行。在分析前，还原样品以去除二硫键。退卷积质谱代表了重和轻链的质量。
[1266] 2).以配备了在线PTH分析仪的ABI蛋白测序仪通过Edman降解进行N-末端序列分析。鉴定得到轻链和重链的初始氨基酸序列。
[1267] 3).以质谱分析进行肽定位：通过分析各个肽生成的LC/MS数据进行胰蛋白酶或/和EndoLysC肽定位以获得完整的序列包覆。此外，测定了位点，并对氧化和脱氨基的数量进行了检测。
[1268] 通过如下手段进行纯度测试：1)SDS-Page或CE-SDS：还原或非还原样品，该技术用于测量抗体碎裂，聚集和杂质，2)以配合LS和RI的SEC-HPLC技术检测聚集和碎裂，以光散射测定样品成分的摩尔质量。3)以SDS凝胶或毛细管IEF法测定可由C-或N-末端不均匀性和/或脱氨基形成的带电亚型的等电聚焦模式和PI分布。
[1269] 最后，通过鲎基质显色(LAL)动力学浊度法测定内毒素浓度。
[1270] 图5显示了对G4.P.agly型全人源M13-C06和M 14-C03抗体的非还原型和还原型SDS PAGE分析。生产得到G4.P和G4.P.agly型的抗体M13-C06，M14-C03、M14-B01和M14-G11。所生产的M12-E01和M12-G04为G4.P型。
[1271] 实施例11
[1272] 全人源抗-IGF-1R抗体的结合活性
[1273] 以ELISA测定G4.P.agly和G4.P型的可溶性IGF-1R的结合活性。将含于pH 9.6，0.025M碳酸盐缓冲液的2.5μg/ml可溶性IGF-1受体融合蛋白(Biogen Idec)以50μl/孔包覆于96孔板(IMMULON2HB，Dynex Technologies，Inc.，Cat.#3455并在4℃孵育过夜。
用添加了0.025％Tween 20的磷酸盐缓冲盐(PBS，IrvineScientific，Cat#9240)在Skan Washer 300(Skatron Instruments)中洗涤平板，在含有1％脱脂牛奶，含于PBS的0.05％Tween 20的pH 7.4缓冲液中阻断，然后在室温下孵育1小时。孵育后以PBS加0.025％Tween 20在Skan Washer 300中洗涤平板。为进行测定，在可溶性IGF-1受体包覆的平板上孵育以1％脱脂牛奶，含于PBS的0.05％Tween 20稀释的50μl/孔的对照和测试抗体。
室温下孵育一小时后，以PBS和0.025％Tween 20在Skan Washer 300中洗涤平板。添加
50μl/孔的在1％脱脂牛奶，含于PBS的0.05％Tween 20中2000倍稀释的山羊抗-人
Kappa-HRP(Southern Biotech Cat#2060-05)以检侧结合抗体。将平板在室温下孵育1小时，并以PBS和0.025％Tween 20在Skan Washer 300中洗涤。以100μl/孔添加TMB溶液(KIRKEGAARD & PERRY LABS，INC.cat：50-76-00)，并在两分钟后以50μl/孔4N H2SO4终止反应。在450nm，背景540nm下以Molecular Devices平板读取器测定TMB的吸收。以
4.3LS版的SOFTMAX PRO软件包(Molecular Devices Corp.)分析数据。
[1274] 图6(A)显示了G4型M13-C06、M14-C03、M14-G11、M12-E01和M12-G04的浓度依赖型结合，其中该对照抗体IDEC-151(G4.P)依然未显示对IGF-1R.Fc的任何结合。
[1275] 图6(B)显示了以ELISA测定的G4.P.agly型M13-C06、M14-C03和M14-B01对可溶性IGF-1R.Fc的浓度依赖型结合。作为阴性对照的不相关特异性的G4.P抗体(IDEC-151)未显示对IGF-1R.Fc的任何结合。
[1276] 以流式细胞仪测定人源抗体对肿瘤细胞上表达的野生型IGF-1R的结合活性。在添加了10％胎牛血清(FBS)(Irvine Scientific，Cat#3000A)和50μg/ml庆大霉素(Gibco Invitrogen，Cat# 15750-060)的最小必需培养基Eagle(ATCC，Cat#30-2003)中培养肿瘤细胞系MCF-7和Calu-6。在添加了10％FBS和50μg/ml庆大霉素的RPMI-1640(ATCC，Cat#30-2001)中培养Panc-1、Colo-205、NCI-H23和ZR-75。使用胰蛋白酶-EDTA(Sigma，Cat#T4049；Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis，MO，USA))溶液从培养容器中去除吸附细胞。
[1277] 以pH 7.4的磷酸缓冲盐(PBS)(Irvine Scientific，Cat#9240)洗涤细胞两次，胰蛋白酶化并在PBS和10％FBS中洗涤一次。将细胞在FACS缓冲液(0.05％叠氮化钠，2％7
FBS，10％普通山羊血清和含于PBS的100μg/ml普通山羊IgG)中调整至细胞10/ml，并置于冰上至少15分钟。将对照和测试抗体等分至Corning 3790平板。将50μl/孔的细胞添加至Corning 3799平板。将来自Coming 3790平板的一抗以50μl/孔添加至Corning
6
3799平板的对应孔。然后，将细胞(0.5x10 细胞/样品)在冰上孵育45分钟。孵育后将平板1500rpm离心4分钟，然后吸取上清液。将细胞重悬浮于150μl FACS缓冲液。将平板1SOOrpm离心4分钟并吸取上清液。以100μl/孔添加在FACS缓冲液中750倍稀释的
6
山羊抗-人IgG-RPE(Southern Biotech Cat#2040-09)。然后，将细胞(0.5x10 细胞/二抗)在冰上孵育45分钟。以50μl/孔添加在FACS缓冲液中500倍稀释的7AAD(Molecular Probes，Cat#A1310)，并在冰上孵育5分钟。孵育后将平板1500rpm旋转4分钟，然后吸取上清液。将细胞重悬浮于150μl FACS缓冲液。将平板1500rpm离心4分钟并吸取上清液。
将细胞重悬浮于100μl/孔FACS缓冲液。将细胞转移至具有200μlFACS缓冲液的12x75mm FACS管。最后，在FACSCalibur上使用CellQuest软件(均来自Becton Dickinson)检测细胞的荧光强度。
[1278] 图7显示了M13-C06.G4.P.agly、M14-C03.G4.P.agly和M14-G11.G4.P与MCF-7细胞上表达的IGF-1R的浓度依赖型结合(图7(A))。通过测试与IGF-1R/3T3转染体和3T3亲代细胞的结合确认抗体的细胞表面结合特异性。所有的先导抗体显示了对表达IGF-1R的3T3细胞而非对3T3细胞的特异性反应性(图7(B))。
[1279] 实施例12
[1280] 全人源抗体对配体结合IGF-1R的抑制
[1281] 测定了G4.P.agly和G4.P型人源抗体阻断IGF-1和IGF-2结合可溶性IGF-1R-Fc的能力。IgG4型M13-C06、M14-G11、M14-B01、M12-E01和M12-G04阻断IGF-1和IGF-2两者结合IGF-1R，而M14-C03仅阻断IGF-2(图8(A)和(B))。
[1282] 抗-IGF-1R抗体的配体阻断能力可通过实施例3所述的固相RIA捕获法进行测125
定。简单而言，将不同浓度(100nM-0.01nM)的抗体与100,000cpm的‘ I标记的IGF-1或
125
I-1GF-2共培养于96孔IMMULON2平板，其中人IGF-1R-Fc已被固定化(200ng/孔)。室
温孵育一小时后，洗涤孔并通过伽马计数器对结合放射活性计数。IDEC-151(人G4)被用作同型匹配阴性抗体对照。抑制百分比(％)计算为＝[1-(带抗体的平均CPM)/(带缓冲液的平均CPM)]x100％。
[1283] 该结果证实全人源抗体M13-C06.G4.P、M13-C06.G4.P.agly、M14-G11.G4.P、M14-G11.G4.P.agly、M14-B01.G4.P.agly、M12-E01.G4.P和M12-G04.G4.P同时阻断IGF-1和IGF-2与IGF-1R的结合，而抗体M 14-C03.G4.P和M14-C03.G4.P.agly仅阻断IGF-2与IGF-IR的结合。参见，图8(A)-(B)。
[1284] 实施例13
[1285] 全人源抗-IGF-1R抗体对肿瘤细胞生长的抑制
[1286] 抗体阻断IGF-1和IGF-2驱动的肿瘤细胞生长的能力可通过细胞活性测定进行测验。
[1287] NCI-H23、Calu-6、Colo-205、Panc-1、BxPC-3(ATCC)肿瘤系购自ATCC。细胞系生长于含有RPMI-1640(ATCC)、10％胎牛血清(Irvine Scientific Inc.)和50μg/ml庆大霉素(Gibco，Invitrogen)的完全生长培养基。使用胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma)从培养容器中去除吸附细胞。pH7.2的磷酸缓冲盐来自于MediaTech Inc。用于发光测定的96孔底部洁净平板来自于Wallac Inc。
[1288] 将生长至80％单层的细胞胰蛋白酶化，洗涤，重悬浮于200μl2％生长培养基，3
将NCI-H23和Colo-205细胞以8x10 细胞/孔包覆于96孔平板；并将Calu-6、Panc-1和
3
BxPC-3细胞以5x10 细胞/孔包覆与96孔平板。24小时后，以100μl无血清培养基(SFM)置换培养基，并添加4X浓度的系列稀释抗体。在37℃继续孵育1小时后，添加50μl 4X浓度的IGF-1或IGF-2，并在37℃孵育至48小时以测定细胞生长。所有的处理均一式三份。
TM
使用CELL TITER-GLO 发光细胞活性测定(Promega，Madison，WI)检测细胞生长。试剂和SFM的1∶1混合以200μl/孔添加。在Wallac(Boston，MA)平板读取器上检测发光。
[1289] 各种人源IgG4型抗-IGF-1R抗体显示出对H-23(IGF-1和IGF-2)、Calu-6(IGF-2)细胞中IGF-1和IGF-2驱动的细胞增殖的抑制(图9(A)-(C))。其它细胞系显示出类似的趋势(例如，参见，实施例20)。
[1290] 实施例14
[1291] 通过全人源抗-IGF-1R抗体对IGF-1R的内在化
[1292] 染色步骤前48小时将MCF-7细胞以50,000细胞/孔接种进入8孔室玻片(Becton TMDickinson 1型胶原质包覆的培养玻片，BD BioCoat #354630)。将细胞常规维持在20代以内。染色当天，将各孔的培养基除去，并以500μl冷孵育缓冲液(MEM Eagle ATCC #30-2003+1％BSA)替换。以该种缓冲液洗涤细胞两次，每次3分钟。然后将250μl各种待测的单抗或人源G4.P.agly抗体添加以10μg/ml的浓度添加至适当的孔，在孵育培养基中稀释，并在冰上孵育1小时。以鼠源抗-人-IGF-1R抗体(Lab Vision/NeoMarkers，clone 24-31 cat# MS-641)作为阳性对照抗体以比较内在化程度。在冰上孵育一小时后，以500μl冷洗涤缓冲液洗(PBS+1％BSA+2％山羊血清)涤零时间(t＝0′)的玻片三次，每次洗涤3分钟(玻片始终在冰上！)。然后以500μl 4％多聚甲醛(从16％母液中以
PBS稀释；EMS #15710)在室温下固定t＝0玻片15分钟。然后以冷洗涤缓冲液洗涤t＝
0玻片3次，每次洗涤3分钟，然后置于冰上。同时，将剩余的玻片在其指定的时间点(15和60分钟)置于37℃孵育器中。在其孵育时间的末期，各玻片遵循如上相同的步骤-洗涤并固定，并置于冰上。然后在冰上以200μl冷渗透缓冲液(洗涤缓冲液+0.5Triton-X)渗透所有的玻片10分钟。然后以500μl冷洗涤缓冲液洗涤所有玻片3次，每次洗涤3分钟。首次在4℃1000rpm离心储存瓶10分钟后，在洗涤缓冲液中以1∶1000稀释制备二抗(AlexaFluor488山羊-抗-小鼠IgG(H+L)，针对单抗和AlexaFluor 488山羊-抗-人
IgG(H+L)的分钟探针#A1 1029，针对G4抗体的分子探针#A1 1013。再次以500μl冷洗涤缓冲液洗涤3次。最后一次洗涤时，除去缓冲液并使所有的孔空置。然后使用所提供的分拆工具从玻片上分拆室，并以含DAPI的Vectashield封固培养基(载体#H-1500，Hard TM
Set )封固盖玻片。将玻片在4℃暗处保存过夜，并使得封固培养基干燥。
[1293] 使用LaserSharp 2000程序(BioRad v5.2)以共焦显微镜拍摄玻片的照片，并表示为来自Kalman 10平均的蓝色和绿色分量的合并。
[1294] M13-C06.G4.P.agly抗体显示了IGF-1R在0、15和60分钟内的快速内在化。抗-鼠IGF-1R抗体克隆24-31是阳性对照。鼠7F2抗体和人G4.P抗体IDEC-151.G4.P是同型匹配的阴性对照。观察到M13-C06.G4.P.agly在60min内显示出IGF-1R的快速内在化(数据未显示)。M14-C03.G4.P.agly和M14-G11.4.P均显示出与M13-C06.G4.P.agly抗体类似的内在化性能(数据未显示)。作为预期的阳性对照，克隆24-31同样内在化受体，而同型匹配阴性对照(鼠7F2和人G4，IDEC-152.GP(灵长源化抗体))未结合或内在化(数据未显示)。
[1295] 此外，通过基于FACS的方法测定受体内在化速率以对鼠单克隆抗体进行确认。以细胞解离缓冲液(Gibco目录编号13151-014)使生长至70％汇合单层的MCF-7细胞脱离。6
将细胞重悬浮于培养基，并将5x10 细胞添加至12x75mm管(Falcon目录编号352054)，其中各管代表了待测试的不同单抗。向对应的管中添加10μg/ml含于无叠氮化物的0.5ml FACS缓冲液(PBS+1％BSA)的单抗，并向对照管添加无抗体缓冲液以测定试验内在化误差。
将试管在冰上孵育1小时15分钟，然后复原于1ml FACS缓冲液中。将100μl各种样品移入96孔U型底平板((NUNC #163320)，置于冰上以防止内在化，并定义为零时间(t＝0)。
这可用作100％抗体结合对照。然后将试管转移至37℃水浴，在时间(t)＝5、10、20、40和
60分钟(随后变为5、10、15、30和60分钟)取出100μl样品并置于在冰上的96孔U型底平板的单独孔中。采集所有样品后，在4℃离心机中1200rpm离心平板以聚集细胞。添加检测受体内在化的抗体或者是用于检测细胞表面残留受体的抗-CD221-PE(BD Pharmingen cat# 555999-抗-IGF-1R；10μl/100μl样品)，或者是用于检测在细胞表面残留抗体的山羊-抗-小鼠-PE(Jackson ImmunoResearch Lab cat#115-116-146；5μg/ml)。在含有1％叠氮化钠的FACS缓冲液中孵育样品1小时，洗涤一次，并在含叠氮化物的FACS缓冲液中保持终体积为200μl。然后使用FACSArray(BD)运行样品和采集，并测定几何平均值。同样运行PE-标记的Quantibrite珠(BD#340495)以对结合至细胞表面的PE分子定量，其中该Quantibrite珠的运行采用和样品相同的FL2设置。PE分子结合该珠子的数量在其包装上给出，从而可通过样品和珠子的几何平均值对结合至细胞表面的PE分子定量。FACS测定显示所测试的鼠单克隆抗体促进IGF-1R的内在化(数据未显示)。
[1296] 实施例15
[1297] 全人源抗体对IGF-1R介导的信号转导的抑制
[1298] I部分：MCF-7细胞中信号转导的抑制
[1299] 人抗-IGF-1R抗体对IGF-1R信号转导的作用可通过MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)进行评估。抗体阻断IGF-1和IGF-2介导的IGF-1R受体磷酸化的能力可参照实施例4所述进行测定。所有的IgG4型全人源抗体显示了对IGF-1R磷酸化的良好抑制(EC50＜1nM)(图10(A和B))。
[1300] 为了检侧对下游信号转导的作用，参照实施例4所述生成细胞溶解物。为进行信号转导实验，在血清饥俄后添加含于350μl新鲜无血清培养基的100nM、15nM、5nM和1nM的对照和测试抗体，并在37℃孵育1小时。向孔添加含于35μl无血清培养基的13nM人重组IGF-1和27nM IGF-II(R&D Systems，#291-G 1和#292-G2)，并在室温下孵育15分钟。溶解细胞，使用4-12％Bis-Tris凝胶分离回收的样品，并固定化至硝化纤维(Invitrogen Corp.)。以磷酸-Akt在位点Thr308(Cell signaling Technologies，#4056)，以磷
酸-p44/42MAPK在位点Thr202/Tyr204(Cell signaling Technologies，#9101)以及抗-兔IgG-HRP(Cell Signaling Technologies，#7071)检测IGF-1R信号转到途径。以ECL发光氨试剂(Amersham Biosciences，#RPN2109)显示条带并进行自动射线摄影。从各个印迹剥去抗体并分别重新探测总Akt(Cell signaling Technologies，#9272)或总p44/42MAPK(Cell signaling Technologies，#9102)和抗-兔IgG-HRP。以ECL发光氨试剂显示条带并进行自动射线摄影。
[1301] 测定抗体对Akt和MAPK磷酸化等下游信号转导事件的作用。使用多克隆IGF-1Rp抗体-琼脂糖结合物(Santa CruzBiotechnology，#SC-713)免疫沉淀来自自身磷酸化的细胞溶解物。使用4-12％双-甘氨酸凝胶分离回收的受体蛋白，并固定化至硝化纤维(Invitrogen Corp.)。通过抗-磷酸-IGF-1R位点Tyr1131(CellSignalingTechnologies，#3021)或抗-IGF-1Rβ(Santa CruzBiotechnology，#SC-9038)和抗-兔IgG-HRP(Cell SignalingTechnologies，#7071)检测受体。以ECL发光氨试剂(AmershamBiosciences，#RPN2109)显示条带并进行自动射线摄影。(图11A和11B)。
[1302] 图11A和B显示M13.C06.G4.P.agly以剂量依赖方式抑制IGF-1和IGF-2介导的Akt和p42/44 MAPK磷酸化。特别地，M13-C06.G4.P.agly IGF-1R抗体在所有的测试浓度(即，1-100nM)下抑制配体诱导的MCF7细胞中的Akt信号转导，该抑制可通过对氨基酸残基Ser473上IGF-1和IGF-2诱导的磷酸化的抑制得到证实(图17)。在100nM下测试对照抗体，而在100、15、5和1nM下测试M13-C06.G4.p.agly。抗体IDEC-152(人G4型不相关特异性抗体)被用作阴性对照。抗体IR3(针对IGF-1R的鼠单克隆抗体)被用作阳性对照。此外，M14-C03.G4.P.agly和M14.G11.G4.P全长抗体还抑制IGF-1和IGF-2驱动的Akt和p42/44MAPK激活信号转导(数据未显示)。
[1303] II部分：A549、Calu-6和H1299细胞中信号转导的抑制
[1304] M13-C06.G4.P.agly破坏胰岛素号受体底物(IRS-1)与肌醇磷脂3-激酶(PI3K)调节亚基p85结合的能力可通过共免疫沉淀测定在肿瘤细胞系中检测。特别地，在对M13-C06.G4.P.agly抗体敏感的NSCLC细胞系中，IRS-1以IGF-1R-依赖性方式结合P13K亚基p85。因此，在M13.C06.G4.P.agly或对照抗体(IDEC-151)存在下将两种非小细胞肺癌细胞系(NSCLC)A549和H1299(对M13-C06.G4.P.agly响应)和一种NSCLC细胞系Calu-6(对M13-C06.G4.P.agly响应较少)生长24小时。以抗-p85抗体免疫沉淀细胞溶解物，并通过抗-IRS-1(顶部印迹)和抗-p85(底部印迹)抗体进行western印迹分析(图23)。
[1305] 为进行该测定，从ATCC购买人肺肿瘤细胞系A549、Calu-6和NCI-1299细胞并维6
持于含10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基1640中。将细胞以3x10 细胞/皿接种于100mm皿中，培养24小时，然后在5％FBS存在下以100nM M13-C06.G4.P.agly或BDEC-151(人G4.p同型匹配阴性对照抗体)处理24小时。在来自Cell Signaling Technology，Inc.(Danvers，MA USA)的1％TritonX-100溶解缓冲液中制备细胞溶解物。为进行免疫沉淀，将抗-p85抗体(Cat #06-649，Upstate Cell Signaling Solutions(现在是Millipore，Concord，MA(USA)的一部分))添加至溶解物(每1-2mg溶解物4μg抗体)并在4℃孵育
过夜。然后通过与蛋白-G琼脂糖珠在4℃混合两小时捕获免疫复合物。以冰冷溶解缓冲液洗涤免疫沉淀物并在以NUPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝胶电泳(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA(USA))分离前在2x LDS(Lithium Dodecyl Sulfate)样品缓冲液中煮沸，然后转移至硝化纤维膜。IRS-1(Cat # 06-248，Upstate)和p85(Cat # 06-649，Upstate)抗体购自Millipore，参照生产商的方案进行免疫印迹。
[1306] 结果：
[1307] M13-C06.G4.P.agly在A549和H1299细胞系但不在Calu-6中抑制血清存在下的IRS-1与PI3K调节亚基p85的结合(图23)。
[1308] 实施例16
[1309] 抗体与非人源灵长动物IGF-1R的交叉反应性
[1310] 测试了抗-人IGF-1R抗体识别来自非人灵长动物的IGF-1R的能力。首先克隆恒河猴和食蟹猴IGF-1R，并在CHO细胞中表达。通过流式细胞术测定所有抗体的结合，并通过共焦显微镜确认。M13.C06.G4.P.agly、M14.C03.G4.P.agly和M14.G11.G4.P均显示出对恒河和食蟹IGF-1R的特异性结合活性(数据未显示)。进一步的物种交叉反应性研究显示M14.G11.G4.P和M14.C03.G4.P.agly结合表达IGF-1R的CHO细胞(数据未显示)。
[1311] 除了在CHO细胞上表达的食蟹猴IGF-1R外，抗体还与在粒细胞上表达的食蟹猴IGF-IR以及来自该物种的单核细胞进行交叉反应。(结合的特异性可通过可溶性重组人IGF-1R阻断M13.C06.G4.P.agly抗体结合的能力得到证实(数据未显示))。类似地，M13.C06.G4.P.agly抗体还结合已建立的食蟹猴成纤维细胞系。(参见，实施例25，图21)。这些结果显示食蟹猴是进行毒性测试的理想非啮齿物种。
[1312] 与IGF-1R受体在灵长动物中的结果相反，经FACS分析评估，M13.C06.G4.P.agly未显示与免疫细胞(粒细胞，单核细胞，淋巴细胞)上表达的大鼠或小鼠IGF-1R的交叉反应性。
[1313] 实施例17
[1314] IGF-1R特异性鼠单抗的生成
[1315] 特异性针对人IGF-1R的鼠单克隆抗体可通过标准杂交瘤技术生成。以表达IGF-1R的NIH-3T3成纤维细胞免疫来自Balb/c小鼠的脾细胞，并将IGF-1R.Ig融合蛋白用于PEG诱导的体细胞融合。表4总结了抗-IGF-1R鼠单克隆抗体的性能。
[1316] 选定鼠抗体抑制多种人肿瘤系(肺、H-23、Calu-6、胰腺、BxPc-3、Panc-1、MiaPaCa以及结肠Colo205)的IGF/IGF-1R依赖型体内生长的能力可通过如实施例13所述的增殖进行测定。图12(A)-(F)显示了八种鼠源抗体对100ng/ml的IGF-1存在下肿瘤细胞生长的抗体浓度依赖型抑制作用。
[1317] 抗体阻断IGF-1和IGF-2驱动的肿瘤细胞生长的能力可与NCI-H23肺部肿瘤细胞系进行比较。图13给出了三种鼠MAbs′(P2A7-3E11、20C8-3E8、P1A2-2B11)和一种全人源抗体M13-C06.G4.P.agly的生长抑制作用的例子。所有这些抗体显示抑制IGF-1和IGF-2驱动的肿瘤生长。可商业购得的抗-IGF-1R抗体IR3被用作阳性对照。不相关特异性小鼠IgG抗-IDectin，IgGI)和人gamma4型IDEC-152抗体被用作本实验的同型匹配对照。
[1318] 实施例18
[1319] 鼠抗-人IGF-1R单抗的克隆
[1320] 抗-IGF-1R鼠杂交瘤P2A7.3E11免疫球蛋白可变区的克隆
[1321] 来自鼠杂交瘤细胞的总细胞RNA可通过QiagenRNeasy微型制剂盒参照生产商推荐方案进行制备。编码重和轻链可变区的cDNA可采用Pharmacia Biotech First Strand cDNA合成制剂盒参照生产商推荐方案采用随机六聚体引物法以RT-PCR从总细胞RNA中克隆得到。
[1322] P2A7.3E11可变区的克隆和嵌合将作为实施例详细描述(其它单抗可变区通过类似的方法克隆和嵌合，但由于采用了抗体工程领域技术人员熟悉的标准分子生物学技术，为求简洁未作具体描述)。为了对具有完整信号序列的鼠免疫球蛋白可变区进行PCR扩增，可采用杂交至多重鼠免疫球蛋白基因家族信号序列的简并前向引物以及特异性针对如Current Protocols in Immunology(Whey和Sons，1999)所述的鼠恒定区5’端的单个后向引物的混合物。使用Clontech的Advantage Taq聚合酶的PCR条件为：在94°下初始变性2分钟，然后在94°下进行30个周期的1分钟变性，在45°下退火1分钟，并在72°下延长1分钟。P2A7重链可变区通过如下引物扩增：5′GGG GAT ATC CAC CAT GGR ATG SAG CTGKGT MAT SCT CTT 3’(M＝A/C，K＝G/T，R＝A/G和S＝C/G)(SEQ IDNO：130)和
5′AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRCCAG TGG ATA GAC 3′(R＝A/G和Y＝C/T)(SEQ ID NO：131)。具有其信号序列的P2A7轻链可变区通过如下引物扩增：5′GGG GATATC CAC CAT GGA TTT TCA GGT GCA GAT TTT CAG 3′(SEQID NO：132)和5′GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAG ATGGA 3′(SEQ ID NO：133)。PCR产物可采用Qiagen Qiaquick凝胶萃取制剂盒参照生产商的推荐方案进行凝胶纯化。纯化的PCR产物通过Invitrogen的TOPO克隆制剂盒参照生产商推荐方案亚克隆进入其pCR2.1TOPO载体。对来自多个独立亚克隆的插入物进行测序以避免PCR错误。
[1323] 通过对可变区序列的Blast分析确认其免疫球蛋白一致性。P2A7重链可变区为鼠亚组II(A)的成员。以下显示了P2A7成熟重链可变区的序列，其中CDR(基于Kabat名称的CDR(决定簇互补区))以下划线表示：
[1324] 1 QVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGNTFT DYVINWVKQR TGQGLEWIGE[1325] 51 IYPGNENTYY NEKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSED SAVYFCARGI
[1326] 101 YYYGSRTRTM DYWGQGTSVT VSS(SEQ ID NO：38)
[1327] P2A7轻链可变区为鼠kappa亚组W的成员。以下显示了P2A7成熟轻链可变区的序列，其CDR以下划线表示：
[1328] 1 EVVLTQSPTA MAASPGEKIT ITCSASSTLS SNYLHWYQQK PGFSPKLLIY
[1329] 51 RTSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYCQQGSSIPLTFG
[1330] 101 AGTKLELK(SEQ ID NO：98)
[1331] chP2A7的构建和表达
[1332] 使用编码重和轻链鼠P2A7可变区的cDNA来构建用于表达鼠-人嵌合体(chP2A7)的构建载体，其中muP2A7可变区被连接至人IgG4和kappa恒定区。为了构建重链嵌合体，将来自P2A7重链亚克隆pCN363的0.47kb NotI-BsmBI片段，来自pEAG1995(包含遗传去除了IgG4C-末端赖氨酸残基的序列确认的糖苷化S228P/T299A(Kabat EU命名)可变huIgG4重链恒定区cDNA的质粒)的1.0kb BsmBI-NotI片段亚克隆进入pV90(序列确认的基于pUC的Biogen Idec的专有表达载体，其包含SV40早期启动子驱动的可选择标记，其中外源基因表达受CMV-IE启动子和人生长激素多聚腺苷酸化信号控制)的磷酸化6.1kb NotI-线性化载体骨架。所得质粒pEAG2045中的重链cDNA序列通过DNA测序进行确认。嵌合P2A7重链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TGA)如下显示为SEQ ID NO：134：
[1333] 1 ATGGAATGGA GCTGTGTCAT GCTCTTCATC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT[1334] 51 CCACTCCCAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTA GTGAAGCCTG[1335] 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGAAACAC ATTCACTGAC[1336] 151 TATGTTATAA ACTGGGTGAA GCAGAGAACT GGACAGGGCC TTGAGTGGAT[1337] 201 TGGAGAGATT TATCCTGGAA ATGAAAATAC TTATTACAAT GAGAAGTTCA[1338] 251 AGGGCAAGGC CACACTGACT GCAGACAAAT CCTCCAACAC AGCCTACATG[1339] 301 CAGCTCAGTA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT TCTGTGCAAG[1340] 351 AGGGATTTAT TACTACGGTA GTAGGACGAG GACTATGGAC TACTGGGGTC[1341] 401 AAGGAACCTC AGTCACCGTC TCCTCAGCCT CCACCAAGGG CCCATCCGTC[1342] 451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGATCTACC TCCGAGAGCA CAGCCGCCCT[1343] 501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA[1344] 551 ACTCAGGCGC CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG[1345] 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG[1346] 651 CTTGGGCACG AAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA[1347] 701 CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGTCCAAAT ATGGTCCCCC ATGCCCACCG[1348] 751 TGCCCAGCAC CTGAGTTCCT GGGGGGACCA TCAGTCTTCC TGTTCCCCCC[1349] 801 AAAACCCAAG GACACTCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG[1350] 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC[1351] 901 GTGGATGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA[1352] 951 GTTCAACAGC GCGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG[1353] 1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC[1354] 1051 CCGTCCTCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA[1355] 1101 GCCACAAGTG TACACCCTGC CCCCATCCCA GGAGGAGATG ACCAAGAACC[1356] 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC[1357] 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC[1358] 1251 TCCCGTCCTC GATTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AGGCTAACCG[1359] 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG GAGGGGAATG TCTTCTCATG CTCCGTGATG[1360] 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCT[1361] 1401 GGGTTGA
[1362] 预测的成熟chP2A7重链蛋白序列如下显示为SEQ IDNO：135：
[1363] 1 QVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGNTFT DYVINWVKQR TGQGLEWIGE[1364] 51 IYPGNENTYY NEKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSED SAVYFCARGI[1365] 101 YYYGSRTRTM DYWGQGTSVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC[1366] 151 LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG[1367] 201 TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP PCPAPEFLGG PSVFLFPPKP[1368] 251 KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN[1369] 301 SAYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ[1370] 351 VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV[1371] 401 LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLG[1372] 鼠可变区为残基1-122，人IgG4重链恒定区为残基123-4590Kabat EU-定义的S228P铰链替换(为了校正IgG4的倾向以形成半抗体)为上述残基231，而在CH2中遗传去除N-连接的糖基化的T299A替换为上述序列中的残基302。
[1373] 为了构建轻链嵌合物，使用STRATAGENE Quick-Change突变制剂盒参照生产商的推荐方案，以突变引物5′CGC CAG TGT GCG GCC GCT GGA ATT CGC CCT TG 3′(SEQ IDNO：136)及其反向补体(在重链信号序列5’导入独特的NotI位点)，以及5′GGA CCA AGC TGG AGC TGA AGC GTA CGG ATG CTGCAC CAA CTG TAT CC 3′(SEQ ID NO：137)及其反向补体(在轻链可变/kappa恒定区结合部下游紧邻导入独特的BsiWI位点)对PCR扩增的P2A7轻链进行定点突变。通过导入的NotI和BsiWI位点变化筛选鉴定突变的质粒。通过DNA测序确认轻链序列。将如上制备的0.42kb NotI-BsiWI轻链可变区片段，以及从含有序列确认的人源化抗-LTbR kappa轻链恒定区cDNA的质粒pEAG 1572的0.34kb BsiWI-NotI片段亚克隆进入表达载体pEAG1256(序列确认的基于pUC的表达载体，其包含磷酸甘油激酶启动子驱动的neo可选择标记，其中外源基因的表达受到CMV-IE启动子和人生长激素多聚腺苷酸化信号的控制)的NotI位点。所得质粒中的轻链cDNA序列通过DNA测序进行确认。嵌合P2A7轻链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TAG)如下显示为SEQ ID NO：138：
[1374] 1 ATGGATTTTC AGGTGCAGAT TTTCAGCTTG CTGCTAATCA GTGTCACAGT[1375] 51 CATAGTGTCT AATGGAGAAG TTGTGCTCAC CCAGTCTCCA ACCGCCATGG[1376] 101 CTGCATCTCC CGGGGAGAAG ATCACTATCA CCTGCAGTGC CAGCTCAACT[1377] 151 TTAAGTTCCA ATTACTTGCA TTGGTATCAG CAGAAGCCAG GATTCTCCCC[1378] 201 TAAACTCTTG ATTTATAGGA CATCCAATCT GGCCTCTGGA GTCCCAGGTC[1379] 251 GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATTGGCACC[1380] 301 ATGGAGGCTG AAGATGTTGC CACTTACTAC TGCCAGCAGG GTAGTAGTAT[1381] 351 ACCGCTCACG TTCGGTGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAAG CGTACGGTGG[1382] 401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT[1383] 451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC[1384] 501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG[1385] 551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC[1386] 601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG[1387] 651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA[1388] 701 GGGGAGAGTG TTAG
[1389] 预测的成熟chP2A7轻链蛋白序列如下显示为SEQ IDNO：139：
[1390] 1 EVVLTQSPTA MAASPGEKIT ITCSASSTLS SNYLHWYQQK PGFSPKLLIY[1391] 51 RTSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYCQ QGSSIPLTFG[1392] 101 AGTKLELKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK[1393] 151 VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ[1394] 201 GLSSPVTKSF NRGEC
[1395] 鼠可变区为如上的残基1-108，而人kappa恒定区为上述序列的残基109-215。
[1396] 将chP2A7重链表达载体和chP2A7轻链表达载体共转染进入细胞293-EBNA，并测试转染细胞的抗体分泌和特异性。将空载体和hu5c8-S228P/T299A IgG4(分子克隆的CD40L-特异性单抗)-转染的细胞作为对照。对条件培养基的Western印迹分析(以抗-人重和轻链抗体展开)显示chP2A7-转染的细胞合成并有效分泌重和轻链。对条件培养基染色的表达IGF-1R-的MCF7人哺乳动物腺癌细胞的FACS分析显示chP2A7抗体结合并生成与muP2A7类似的染色模式，而来自于mock-和hu5c8-转染细胞的调节培养基未能对MCF7细胞染色(通过PE-结合的抗-人重和轻链抗体检测)。稀释滴定显示通过含有chP2A7单抗的条件培养基进行的特异性染色证实了剂量响应。以chP2A7重链表达载体和chP2A7轻链表达载体共转染CHO细胞以生成表达嵌合P2A7-糖苷化huIgG4，kappa单抗的稳定系。
[1397] 抗-IGF-1R鼠杂交瘤20C8.3B8免疫球蛋白可变区的克隆
[1398] 其它抗-IGF-1R单抗的可变区可通过与P2A7单抗类似的标准重组DNA技术进行克隆和嵌合。
[1399] 20C8.3B8单抗重链可变区(属于鼠亚组1(A))预测成熟序列如下显示，其CDR带有下划线：
[1400] 1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG[1401] 51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG[1402] 101 YGYRSAYYFD YWGQGTTVTV SS(SEQ ID NO：43)
[1403] 20C8轻链可变区(属于鼠kappa亚组III)的预测成熟序列如下显示：
[1404] 1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSAYSYMHWY QQKPGQPPKL[1405] 51 LIYLASNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELPY[1406] 101 TFGGGTKLEI K(SEQ ID NO：103)
[1407] 嵌合20C8重和轻链cDNA的表达载体按上述方法构建。质粒插入物中的免疫球蛋白cDNA序列通过DNA测序进行确认。嵌合20C8重链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TGA)如下显示为SEQ ID NO：140：
[1408] 1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC[1409] 51 CCACTCCGAC GTCCAACTGC AGGAGTCTGG ACCTGACCTG GTGAAACCTT[1410] 101 CTCAGTCACT TTCACTCACC TGCACTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT[1411] 151 GGTTATAGCT GGCACTGGAT CCGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG[1412] 201 GATGGGCTAC ATACACTACA GTGGTGGCAC TAACTACAAC CCATCTCTCA[1413] 251 AAAGTCGAAT CTCTATCACT CGAGACACAT CCAAGAACCA GTTCTTCCTC[1414] 301 CAGTTGAATT CTGTGACTAC TGAGGACACA GCCACATATT ACTGTGCAAG[1415] 351 ATCGGGGTAC GGCTACAGGA GTGCGTACTA TTTTGACTAC TGGGGCCAAG[1416] 401 GGACCACGGT CACCGTCTCC TCAGCTTCCA CCAAGGGCCC ATCCGTCTTC[1417] 451 CCCCTGGCGC CCTGCTCCAG ATCTACCTCC GAGAGCACAG CCGCCCTGGG[1418] 501 CTGCCTGGTC AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT[1419] 551 CAGGCGCCCT GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCGGCTGT CCTACAGTCC[1420] 601 TCAGGACTCT ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAGCTT[1421] 651 GGGCACGAAG ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA[1422] 701 AGGTGGACAA GAGAGTTGAG TCCAAATATG GTCCCCCATG CCCACCGTGC[1423] 751 CCAGCACCTG AGTTCCTGGG GGGACCATCA GTCTTCCTGT TCCCCCCAAA[1424] 801 ACCCAAGGAC ACTCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG[1425] 851 TGGTGGACGT GAGCCAGGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG[1426] 901 GATGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTT[1427] 951 CAACAGCGCG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT[1428] 1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCG[1429] 1051 TCCTCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAGCC[1430] 1101 ACAAGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCAGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG[1431] 1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG[1432] 1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC[1433] 1251 CGTCCTCGAT TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAGG CTAACCGTGG[1434] 1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGGAG GGGAATGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT[1435] 1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACACAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCTGGG[1436] 1401 TTGA
[1437] 预测的成熟ch20C8重链蛋白序列如下显示为SEQ IDNO：141：
[1438] 1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG[1439] 51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG[1440] 101 YGYRSAYYFD YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL[1441] 151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT[1442] 201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK[1443] 251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS[1444] 301 AYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV[1445] 351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL[1446] 401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLG[1447] 鼠可变区为残基1-122，人IgG4重链恒定区为残基123-459。
[1448] 嵌合20C8轻链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TAG)如下显示为SEQ ID NO：142：
[1449] 1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GTTATGGGTA CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG[1450] 51 TTCCACTGGT GACATTGTGC TGACACAGTC TCCTGCTTCC TTAGCTGTAT[1451] 101 CTCTGGGGCA GAGGGCCACC ATCTCATGCA GGGCCAGCAA AAGTGTCAGT[1452] 151 ACATCTGCCT ATAGTTATAT GCACTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC[1453] 201 ACCCAAACTC CTCATCTATC TTGCATCCAA CCTAGAATCT GGGGTCCCTG[1454] 251 CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT[1455] 301 CCTGTGGAGG AGGAGGATGC TGCAACCTAT TACTGTCAGC ACAGTAGGGA[1456] 351 GCTTCCGTAT ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATC AAACGTACGG[1457] 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA[1458] 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA[1459] 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC[1460] 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC[1461] 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC[1462] 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA[1463] 701 ACAGGGGAGA GTGTTAG
[1464] 预测的成熟ch20C8轻链蛋白序列如下显示为SEQ IDNO：143：
[1465] 1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSAYSYMHWY QQKPGQPPKL[1466] 51 LIYLASNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELPY[1467] 101 TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV[1468] 151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV[1469] 201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
[1470] 鼠可变区为如上的残基1-111，而人kappa恒定区为上述序列的残基112-218。
[1471] 将ch20C8重链表达载体和ch20C8轻链表达载体共转染进入细胞293-EBNA，并测试转染细胞的抗体分泌和特异性。将空载体和hu5c8-S228P/T299A IgG4(分子克隆的CD40L-特异性单抗)-转染的细胞作为对照。对条件培养基的Western印迹分析(以抗-人重和轻链抗体展开)显示ch20C8-转染的细胞合成并有效分泌重和轻链。对来自转染细胞的条件培养基染色的表达IGF-1R-的MCF7人哺乳动物腺癌细胞的FACS分析显示ch20C8抗体以可滴定剂量响应结合，而来自于mock-和hu5c8-转染细胞的调节培养基未能对MCF7细胞染色(通过PE-结合的抗-人重和轻链抗体检测)。以ch20C8重链表达载体和ch20C8轻链表达载体共转染CHO细胞以生成表达嵌合20C8-糖苷化huIgG4，kappa单抗的稳定系。
[1472] 抗-IGF-1R单抗20D8.24B 11免疫球蛋白可变区的克隆
[1473] 单抗20D8.24B11表现为20C8.3B8的姐妹克隆(均来自于融合7)：具有相同的轻链，且其重链与20C8重链的区别为单个残基FR4。20D8.24B11单抗重链可变区(属于鼠亚组I(A))的预测成熟序列如下显示，其CDR带有下划线：
[1474] 1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG
[1475] 51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG
[1476] 101 YGYRSAYYFD YWGQGTTLTV SS(SEQ ID NO：53)
[1477] 如下显示了20D8(上方)和20C8(下方)重链可变区的比对，突出了对应FR4Kabat残基109(以下的残基118)单个保守变化：
[1478]
[1479]
[1480] 构建20D8重链cDNA的表达载体，并通过DNA测序确认质粒pCN380中的重链cDNA插入物。嵌合20D8重链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TGA)如下显示为SEQID NO：144：
[1481] 1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC[1482] 51 CCACTCCGAC GTCCAACTGC AGGAGTCTGG ACCTGACCTG GTGAAACCTT[1483] 101 CTCAGTCACT TTCACTCACC TGCACTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT[1484] 151 GGTTATAGCT GGCACTGGAT CCGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG[1485] 201 GATGGGCTAC ATACACTACA GTGGTGGCAC TAACTACAAC CCATCTCTCA[1486] 251 AAAGTCGAAT CTCTATCACT CGAGACACAT CCAAGAACCA GTTCTTCCTC[1487] 301 CAGTTGAATT CTGTGACTAC TGAGGACACA GCCACATATT ACTGTGCAAG[1488] 351 ATCGGGGTAC GGCTACAGGA GTGCGTACTA TTTTGACTAC TGGGGCCAAG[1489] 401 GGACCACGTT GACAGTCTCC TCAGCTTCCA CCAAGGGCCC ATCCGTCTTC[1490] 451 CCCCTGGCGC CCTGCTCCAG ATCTACCTCC GAGAGCACAG CCGCCCTGGG[1491] 501 CTGCCTGGTC AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT[1492] 551 CAGGCGCCCT GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCGGCTGT CCTACAGTCC[1493] 601 TCAGGACTCT ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAGCTT[1494] 651 GGGCACGAAG ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA[1495] 701 AGGTGGACAA GAGAGTTGAG TCCAAATATG GTCCCCCATG CCCACCGTGC[1496] 751 CCAGCACCTG AGTTCCTGGG GGGACCATCA GTCTTCCTGT TCCCCCCAAA[1497] 801 ACCCAAGGAC ACTCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG[1498] 851 TGGTGGACGT GAGCCAGGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG[1499] 901 GATGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTT[1500] 951 CAACAGCGCG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT[1501] 1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCG[1502] 1051 TCCTCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAGCC[1503] 1101 ACAAGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCAGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG[1504] 1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG[1505] 1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC[1506] 1251 CGTCCTCGAT TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAGG CTAACCGTGG[1507] 1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGGAG GGGAATGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT[1508] 1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACACAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCTGGG[1509] 1401 TTGA
[1510] 由上述序列编码的预测的成熟ch20D8重链蛋白序列如下显示为SEQ ID NO：145：
[1511] 1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG[1512] 51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG[1513] 101 YGYRSAYYFD YWGQGTTLTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL[1514] 151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPS S SLGT
[1515] 201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK[1516] 251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS[1517] 301 AYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV[1518] 351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL[1519] 401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLG[1520] 鼠可变区为残基1-122，人S228P/T299A IgG4重链恒定区为残基123-458。
[1521] 20D8与20C8的轻链可变序列一致：请参见前述有关20C8的信息。
[1522] 抗-IGF-1R单抗P1G10.2B8免疫球蛋白可变区的克隆
[1523] 预测的成熟P1G10重链可变区的序列如下显示为SEQID NO：58，其CDR带有下划线：
[1524] 1 QIQLVQSGPD LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKDLKWMGW[1525] 51 INTNTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCASPL[1526] 101 YYRNGRYFDV WGAGTTVTVS S
[1527] P1G10表现为属于鼠重链可变区亚组II(A)，但对重链II(A)共有序列仅有55％的一致性。
[1528] 构建嵌合P1G10重链cDNA的表达载体，并测序确认其cDNA插入物。嵌合P1G10重链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TGA)如下显示为SEQ ID NO：146：
[1529] 1 ATGGGTTGGA TCTGTATCTT TCTATTCTTG GTGGCAGCTG CCCAAAGTGC[1530] 51 CCAAGCACAG ATCCAGTTGG TGCAGTCTGG ACCTGACCTG AAGAAGCCTG[1531] 101 GAGAGACAGT CAAGATCTCC TGCAAGGCTT CTGGGTATAC CTTCACAAAC[1532] 151 CATGGAATGA ACTGGGTGAA GCAGGCTCCA GGAAAGGATT TAAAGTGGAT[1533] 201 GGGCTGGATA AACACCAACA CTGGAGAGCC AACATATGCT GATGACTTCA[1534] 251 AGGGACGGTT TGCCTTCTCT TTGGAAACCT CTGCCAGCAC TGCCTATTTG[1535] 301 CAGATCAACA ACCTCAAAAA TGAGGACACG GCTACATATT TCTGTGCAAG[1536] 351 TCCCCTCTAC TATAGGAACG GGCGATACTT CGATGTCTGG GGCGCAGGGA[1537] 401 CCACGGTCAC CGTCTCCTCA GCTTCCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC[1538] 451 CTGGCGCCCT GCTCCAGATC TACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG[1539] 501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG[1540] 551 GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA[1541] 601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG[1542] 651 CACGAAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG[1543] 701 TGGACAAGAG AGTTGAGTCC AAATATGGTC CCCCATGCCC ACCGTGCCCA[1544] 751 GCACCTGAGT TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAAACC[1545] 801 CAAGGACACT CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG[1546] 851 TGGACGTGAG CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT[1547] 901 GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA[1548] 951 CAGCGCGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC[1549] 1001 TGAACGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC[1550] 1051 TCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAGCCACA[1551] 1101 AGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCAGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA[1552] 1151 GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG[1553] 1201 TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT[1554] 1251 CCTCGATTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAGGCTA ACCGTGGACA[1555] 1301 AGAGCAGGTG GCAGGAGGGG AATGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG[1556] 1351 GCTCTGCACA ACCACTACAC ACAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCTGGGTTG[1557] 1401 A
[1558] 由上述序列编码的预测的成熟chP1G10重链蛋白序列如下显示为SEQ ID NO：147：
[1559] 1 QIQLVQSGPD LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKDLKWMGW[1560] 51 INTNTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCASPL[1561] 101 YYRNGRYFDV WGAGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV[1562] 151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK[1563] 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD[1564] 251 TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNSA[1565] 301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY[1566] 351 TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD[1567] 401 SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLG
[1568] 鼠可变区为残基1-121，人S228P/T299A IgG4重链恒定区为残基122-457。
[1569] 预测的成熟P1G10重链可变区(属于鼠kappa亚组V)的序列如显示为SEQID NO：113，其CDR带有下划线：
[1570] 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGSVKLLIYY[1571] 51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GKTLPWTFGG[1572] 101 GTKLEIK
[1573] 构建嵌合P1G10轻链cDNA的表达载体，并测序确认其cDNA插入物。嵌合P1G10轻链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TAG)如下显示为SEQ ID NO：148：：
[1574] 1 ATGAGGTCCC CTGCTCAGTT TCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG[1575] 51 TGCCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT[1576] 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGT[1577] 151 AATTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGATCTG TTAAACTCCT[1578] 201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG[1579] 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAA[1580] 301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAAAGACGC TTCCGTGGAC[1581] 351 GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT[1582] 401 CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC[1583] 451 TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA[1584] 501 GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA[1585] 551 CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG[1586] 601 CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC[1587] 651 CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT[1588] 701 GTTAG
[1589] 由上述序列编码的预测的成熟chP1G10轻链蛋白序列如下显示为SEQ ID NO：149：
[1590] 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGSVKLLIYY[1591] 51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GKTLPWTFGG[1592] 101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV[1593] 151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG[1594] 201 LSSPVTKSFN RGEC
[1595] 鼠可变区为如上的残基1-107，而人kappa恒定区为上述序列的残基108-214。
[1596] 将chP1G10重链表达载体和chP1G10轻链表达载体共转染进入293-EBNA细胞，并测试转染细胞的抗体分泌和特异性(将空载体和hu5c8-S228P/T299A IgG4(分子克隆的CD40L-特异性单抗)-转染的细胞作为对照)。对条件培养基的Western印迹分析(以抗-人重和轻链抗体展开)显示chP1G10-转染的细胞合成并有效分泌重和轻链。对来自转染细胞的条件培养基染色的表达IGF-1R-的MCF7人哺乳动物腺癌细胞的FACS分析显示ch P1G10抗体以可滴定剂量响应结合，而来自于mock-和hu5c8-转染细胞的调节培养基未能对MCF7细胞染色(通过PE-结合的抗-人重和轻链抗体检测)。以ch P1G10重链表达载体和ch P1G10轻链表达载体共转染CHO细胞以生成表达嵌合P1G10-糖苷化huIgG4，kappa单抗的稳定系。
[1597] 抗-IGF-1R单抗P1A2.2B11免疫球蛋白可变区的克隆
[1598] 成熟P1A2重链可变区(属于鼠亚组II(A))的预测序列如下显示为SEQ ID NO：48：
[1599] 1 QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKGLKWMGW[1600] 51 NTSTGEPTYA DDFKGRFAFS LETSASTAFL QINNLKNEDT ASYFCASPLY[1601] 101 YMYGRYIDVW GAGTAVTVSS
[1602] 该P1A2与P1G10(均来自于融合5)的重链具有92.6％的一致性，并带有一个FR1，一个FR2，两个CDR2，两个FR3两个CDR3，以及1个FR4的差异。如下显示了P1A2(上部行)和P1G10(下部行)重链可变区的比对：
[1603]
[1604]
[1605] 嵌合P1A2重链的表达载体可参照上述方法构建。由该质粒(SEQ ID NO：150)编码的chP1A2重链的预测序列为：
[1606] 1 QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKOA PGKGLKWMGW[1607] 51 NTSTGEPTYA DDFKGRFAFS LETSASTAFL OINNLKNEDT ASYFCASPLY[1608] 101 YMYGRYIDVW GAGTAVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK[1609] 151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLOSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT[1610] 201 YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT[1611] 251 LMISRTPEVT CVVVDVSOED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEOFNSAY[1612] 301 RVVSVLTVLH ODWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT[1613] 351 LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGOPENN YKTTPPVLDS[1614] 401 DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
[1615] 鼠可变区为残基1-120，人S228P/T299A IgG4重链恒定区为残基121-456。
[1616] 预测的成熟P1A2重链可变区(属于鼠kappa亚组V)的序列如下显示为SEQID NO：108，其CDR带有下划线：
[1617] 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTIKLLIYY
[1618] 51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDFATYFCQQ GKTLPWTFGG 101 GTKLEIK
[1619] 该P1A2与P1G10(均来自于融合5)的轻链具有97.2％的一致性，带有两个FR2和一个FR3的差异，但具有一致的CDR。如下显示了P1A2(上部行)和P1G10(下部行)轻链可变区的比对：
[1620]
[1621]
[1622] 构建嵌合P1A2轻链cDNA的表达载体，并测序确认其cDNA插入物。嵌合P1A2轻链cDNA插入物(由信号序列的起始子ATG至终止子TAG)如下显示为SEQ ID NO：151：
[1623] 1 ATGAGGTCCC CTGCTCAGTT TCTTGGAGAC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG[1624] 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTATCTGCCT[1625] 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC[1626] 151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTA TTAAACTCCT[1627] 201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG[1628] 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAA[1629] 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTAAAACGC TTCCGTGGAC[1630] 351 GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT[1631] 401 CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC[1632] 451 TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA[1633] 501 GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA[1634] 551 CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG[1635] 601 CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC[1636] 651 CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT[1637] 701 GTTAG
[1638] 由pCN379编码的预测的成熟chP1 A2轻链蛋白序列如下显示为SEQ ID NO：152：
[1639] 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTIKLLIYY[1640] 51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDFATYFCQQ GKTLPWTFGG[1641] 101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV[1642] 151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG[1643] 201 LSSPVTKSFN RGEC
[1644] 鼠可变区为如上的残基1-107，而人kappa恒定区为上述序列的残基108-214。
[1645] 抗-IGF-1R单抗P1E2.3B12免疫球蛋白可变区的克隆
[1646] P1E2可变区的克隆参照上述方法进行。因此，抗体“P1E2”开发为嵌合抗体，该嵌合抗体含有衍生自由P1E2.3B12杂交瘤细胞系(参见表4)表达的抗体的鼠VH和VL，并融合至人IgG4Pagly/kappa恒定域。
[1647] 实施例19
[1648] IGF-1R Fab抗体以高亲和性结合可溶性IGF-1
[1649] 方法：M13-C06、M14-C03和M14-G11与可溶性IGF-1R的结合活性通过表面等离子共振测定。将生物素化PENTA-His抗体(Qiagen，Inc.)固定化至包覆了链霉素的传感芯片。可溶性/嵌合IGF-1R-His胞外区结构域(R&D systems，Inc.)通过PENTA-His抗体在表面捕获。进行M13-C06、M14-C03或M14-G11 Fab(0.5nM-1000nM)的第二次注射。三次短注射pH4.0的醋酸盐以再生表面。
[1650] 结果：M13-C06 Fa以KD＝1.3nM的高亲和性结合重组IGF-1R，而M14-G11 Fab以KD＝4.0nM的亲和性结合，M14-C03Fab以KD＝4.9nM的亲和性结合(数据未显示)。
[1651] 实施例20
[1652] 全人源IGF-1R抗体对IGF-1和IGF-2刺激的肿瘤细胞生长的抑制
[1653] 方法：抗体对体内肿瘤生长的作用通过CELLTITER-GLOTM(Promega Corporation，2800 Woods Hollow Rd.，Madison，WI 53711 USA)测定进行检测。将含10％FBS的RPMI培养基中的BxPC3细胞培养于Wallac96孔底部洁净TC-处理平板上(8000细胞/孔)。24小时后，将培养基替换为无血清条件，并添加不同浓度(100nM、10nM、1nM和0.1nM)的抗体。
30分钟孵育后，添加100ng/ml的IGF-1或IGF-2。继续孵育细胞48小时，溶解并通过CELL TM
TITER-GLO 试剂测定ATP存在的数量。抑制计算为[1-(Ab-SFM)/(IGF-SFM)]x100％。同型匹配抗体IDEC-151(人G4)抗体被用作阴性对照。
[1654] 结果：全人源抗体M13-C06.G4.P.agly、M14-G11.G4.P和M14-C03.G4.P.agly抑制重组人源IGF-1和IGF-2驱动的BxPC3(人胰腺癌)细胞增殖(图14)。在人肺癌细胞系NCI-H23(图15；M13-C06.G4.P.agly抗体)和人肺癌细胞系A549(图16；M13-C06.G4.P.agly抗体)中可得到这些抗体对重组人源IGF-1和IGF-2驱动细胞增殖的类似的生长抑制结果。在所有这些细胞系中M14-G11.G4.P，agly显示了与M14.G11.G4.P型类似的结果(数据未显示)。
[1655] 实施例21
[1656] 全人源IGF-1R抗体对体外肿瘤细胞生长的细胞周期阻滞
[1657] 方法：全人源IGF-1R抗体阻滞细胞周期进展的能力可通过FACS分析进行评估；5
检测培养的BxPC3细胞中碘化吡啶的结合。将BxPC3细胞(4x10 细胞/孔)包覆于6孔
板。24小时后，将细胞转换至无血清培养基(SFM)继续维持24小时。然后向培养基中添加终浓度133.3nM(20微克/ml)的IGF-1R抗体和终浓度200ng/ml的IGF-1。24小时后，将细胞胰蛋白酶化，并以乙醇固定。在FACS分析前以碘化吡啶(PI)对DNA成分染色。同型匹配抗体IDEC-151(人G4)被用作阴性对照。
[1658] 结果：全人源抗体M13-C06.G4.P.agly(表11)、M14-G11.G4.P.agly和M14-C03.G4.P.agly在细胞周期的G0/G1期阻滞了BxPC3肿瘤细胞。
[1659] 表11：
[1660]
[1661] 实施例22
[1662] 胰腺癌模型中的体内肿瘤生长抑制
[1663] 方法：在采用BxPC3(胰腺癌)细胞的异种移植胰腺癌模型系统中评估M13.C06.G4.P.agly抗体的单种药剂体内效力。以2x106细胞接种CB17 SCID小鼠并监测肿瘤生长。治疗开始时的平均肿瘤体积为～200mm3。腹腔(i.p.)施用60、30和15mg/kg的M13.C06.G4.P.agly抗体，每周一次，施用5周。同型匹配抗体IDEC-151(人G4)作为阴性对照以
60mg/kg施用，每周一次，施用5周。在接种后的指定间隔取出肿瘤(图18)并测量总体肿瘤体积。
[1664] 结果：全人源M13.C06.G4.P.agly抗体以剂量依赖方式抑制肿瘤生长(图18)。以60、30和15mg/kg每周施用持续5周的施用证实了该抗体具有统计学显著性的单种药剂效力。此外，该抗体在低达每周一次15mg/kg的剂量下仍有效力(图18)。
[1665] 实施例23
[1666] 肺癌模型中的体内肿瘤生长抑制
[1667] 方法：在采用A549(肺癌)细胞的异种移植肺癌模型系统中评估M13.C06.G4.P.agly抗体的单种制剂体内效力。以3-5x106细胞接种CB17 SCID小鼠并监测肿瘤生长。治疗开始时的平均肿瘤体积为～150mm3。腹腔(i.p.)施用30和15mg/kg的M13.C06.G4.P.agly抗体，每周两次，施用4周。同型匹配抗体IDEC-151(人G4)作为阴性对照以
30mg/kg施用。在接种后的指定间隔取出肿瘤(图19)并测量总体肿瘤体积。
[1668] 结果：全人源M13.C06.G4.P.agly抗体以剂量依赖方式抑制肿瘤生长(图19)。以30和15mg/kg剂量持续4周的施用证实了该抗体具有统计学显著性的单种制剂效力(图
19)。在该模型中进行的附加研究显示C06在低达每周注射7.5mg/kg的剂量下仍有效力(数据未显示)。
[1669] 实施例24
[1670] 采用联合疗法对肿瘤生长的体内抑制
[1671] 方法：在BxPC3异种移植模型中测试M13.C06.G4.P.agly抗体联合吉西他滨(一种常用于治疗非小细胞肺癌、胰腺、膀耽和乳腺癌的药物)在抑制肿瘤生长中的效力。联合参照当前护理标准(即，每3天80mg/kg，持续4周)施用的吉西他滨评估M13.C06.G4.P.agly抗体每周两次腹腔(i.p.)施用30mg/kg持续7周的效力(数据未显示)或每周一次施用60mg/kg持续5周的效力(图20)。单独的吉西他滨，单独的抗体，以及单独的传
3
递载体的了阮注射施用被用作阴性对照。治疗开始时的肿瘤体积为约200mm。
[1672] 结果：M13-C06.G4.P.agly抗体和吉西他滨作为单独的制剂(即，单独施用)显示了类似的效力。联用吉西他滨时，每周两次施用30mg/kg M13-C06.G4.P.agly抗体的方案(数据未显示)或每周一次的60mg/kg抗体的方案(图20)显示了与单独制剂治疗相比额外的效力。此外，以15mg/kg联用同样显示了额外的效力(数据未显示)。
[1673] 实施例25
[1674] 全人源IGF-1R抗体结合食蟹猴成纤维细胞系
[1675] 方法：M13.C06.G4.P.agly抗体结合至由食蟹猴建立的成纤维细胞系。该成纤维细胞系由皮肤切片中生成。抗体结合可通过以解离缓冲液使成纤维细胞脱离并在4℃生物素化的M13.C06.G4.P.agly中孵育45分钟进行评估。洗涤细胞后，添加链霉素-PE并在4℃暗处再度孵育30分钟。洗涤细胞，添加200μl冷PBS，然后以1％甲醛固定并轻柔涡旋。
通过FACS分析评估抗体结合。
[1676] 结果：M13-C06.G4.P.agly抗体以浓度依赖方式结合食蟹猴成纤维细胞系上表达的IGF-1R(图21)。
[1677] 实施例26
[1678] I部分：全人源M13.C06.G4.P.agly的生物特征的总结
[1679] 表11和12显示了评估的全人源M13.C06.G4.P.agly抗体的生物特征。这些特性通过此处的方法，实验和实施例确认并/或通过本领域普通技术人员已知或实施的方法和实验常规确定。
[1680] 表11：
[1681]
[1682] M13.C06.G4.P.agly抗体血清半衰期
[1683] 通过在SCID小鼠中施用3mg/kg M13.C06.G4.P.agly抗体(单剂量水平，腹腔注射)进行不带肿瘤小鼠体内的药代动力学(PK)研究。通过IgG特异性ELISA检测SCID小鼠血清中的M13.C06.G4.P.agly抗体。将山羊抗-人IgG(100ng/孔)固定化至immulon平板。以两倍系列稀释液从1∶25开始一式三份滴定血清。以山羊抗-人Kappa-HRP测定结合。该研究的结果显示该小鼠模型系统中的血清半衰期为～11.5天(数据未显示)。
[1684] M13.C06.G4.P.agly腹腔注射带MCF-7肿瘤动物(30μg/kg的抗体)和带BxPC3肿瘤动物(15μg/kg的抗体)后评估其血清浓度。以ELISA检测M13.C06.G4.P.agly抗体与固定化至96孔板(IMMULON2HB，Dynax Technologies，Inc.，Cat.#3455)的山羊抗-人IgG(100ng/孔)的结合。自10μg/ml开始以3倍系列稀释液滴定制作标准曲线。自1∶25稀释开始以2倍系列稀释液滴定血清。以山羊抗-人Kappa-HRP测定M13.C06.G4.P.agly抗体。通过4.3 LS版SOFTMAX PRO软件包(Molecular Devices Corp.)测定抗体浓度。
[1685] 所观察的平均血清浓度如下所示：
[1686]
[1687]
[1688] 同样在10mg/kg和25mg/kg剂量注射的食蟹猴中考察M13.C06.G4.P.agly抗体的药代动力学，其中观察得到的血清半衰期为～10至12天(数据未显示)。
[1689] 表12和13显示了在含有IGF-1或IGF-2(表12)或10％胎牛血清(FCS)或胎牛血清(FBS)(表13)的细胞培养基中添加M13-C06.G4.P.agly抗体时对各种肺，胰腺和结肠肿瘤细胞系的体外细胞生长所观察到的剂量依赖性抑制(抑制百分比)。
[1690] 表12：
[1691]
[1692] 表13：
[1693]
[1694] II部分：抗体亲和性检测
[1695] 目标：
[1696] 目标为检测IGF-1R抗体的结合亲和性。
[1697] 方法：
[1698] M13-C06、M14-C03和M14-G11 Fab的制备
[1699] M13-C06、M14-C03和M14-G11 Fab抗体可通过木瓜蛋白酶(Pierce Cat.No.20341)消化制备得到。以20mM pH7.0的磷酸钠；10mM EDTA；20mM半胱氨酸洗涤木瓜蛋白酶树脂。将抗体和木瓜蛋白酶树脂在pH7.0的500mM EDTA，100mM半胱氨酸中混合，在
37℃水浴中消化三小时，然后在反置振荡器上在室温下混合过夜。通过分析型尺寸排阻色谱(SEC)测定各消化的完成度。以烧结玻璃漏斗过滤器从消化蛋白中去除树脂，并以pH5.0TM
的20mM醋酸盐洗涤。采集流出物并以20mM pH5.0的醋酸盐稀释10倍。以S-SEPHAROSE阳离子交换色谱采用线性盐梯度纯化Fab片段。对洗脱组分进行分析SEC，汇集目标组分并透析进入PBS。然后将Fab烷基化以抑制可导致(Fab)：产生的铰链二硫化物的再次形成。
可通过将pH 8.5的1M Tris；200mM碘乙酸在Fab溶液中稀释10倍进行烷基化。将混合物在反置振荡器上于室温下孵育二十分钟，然后彻底透析进入1xPBS。使用制备型尺寸排阻色谱对各个Fab进行最终的纯化。
[1700] 表面等离子体共振(SPR)亲和性测定
[1701] 所有的表面等离子共振(SPR)实验在设置为25℃，并以HBS-EP(Biacore，Cat.No.BR-1001-88)为运行缓冲液的Biacore3000上进行。通过注射含于HBS-EP缓冲液的500nM生物素标记的抗-HisTag抗体(生物素-PENTA-His，Qiagen Cat.No.34440)将其在芯片(Cat.No.BR-1000-32)表面固定化至饱和。通过以2μL/分钟注射20μL 40nM蛋白在生物素-PENTA-His表面捕获重组人IGF-1R-His10(R&D Systems，Cat.No.305-GR-050)。
在IGF-1R注射后，将流速上升至20μL/分钟。再次注射130μL抗-IGF-1R抗体或Fab以考察与受体的相互作用。将各个抗体和Fab由64nM至0.5nM系列稀释以获得浓度依赖型动力学结合曲线。通过以20μL/min注射3x10μL pH4.0的10mM醋酸盐再生各个注射系列。各条曲线以(1)从无IGF-1R的链霉素表面获得的数据，以及(2)从先注射IGF-1R然后注射HBS-EP缓冲液得到的数据进行双重参考。各个抗体和Fab的浓度系列被拟合至生产商的BiaEvaluation软件中所提供的1∶1结合模型。
[1702] 结果
[1703] 重组抗-IGF-1R抗体M13-C06，M14-C03和M14-G11通过上述的表面等离子体共振测试了与IGF-1R的结合。所有三种抗体均证实与该受体强烈结合。实验中观察到了各个抗体(64nM系列稀释至0.5nM)与固定化重组人IGF-1R的浓度依赖性结合(数据未显示)。采用不同浓度时抗体在IGF-1R包覆表面积累的速率以及在采用纯缓冲液时它们解离的速率通过将数据拟合至1∶1结合模型进行考察。计算得到近似的动力学速率常数和平衡解离常数(表14)。
[1704] 表14
[1705]-1 -1 -1
抗体/Fab KD(M) kd(s ) ka(M s )
M13-C06_Ab 1.3e-10 2.5e-4 1.8e6
M14-C03_Ab 3.6e-10 2.0e-4 5.7e5
M14-G11_Ab 1.1e-10 1.1e-4 1.0e6
[1706] 表15
[1707]-1 -1 -1
抗体/Fab KD(M) kd(s ) ka(M s )
M13-C06_Fab 1.3e-9 1.2e-3 8.8e5
M14-C03_Fab 4.9e-9 9.4e-4 1.9e5
M14-G11_Fab 4.0e-9 1.2e-3 3.0e5
[1708] 为了获得分离的亲和性，按如上所述通过木瓜蛋白酶消化生成各个抗体的Fab片段。由于单个抗原结合位点的存在，Fab在与全长抗体所述相同的方式应用于IGF-1R受体时显示出一致的单相结合和解离曲线(数据未显示)。表15提供了各Fab对IGF-1R的亲和性。
[1709] 实施例27
[1710] I部分：M13.C06.G4.P.agly抗体与其它IGF-1R抗体相比具有独特的表位结合特征
[1711] 通过交叉竞争抗体结合研究比较M13.C06.G4.P.agly与其它IGF-1R抗体的IGF-1R抗体结合表位。参见图22。对未标记的竞争抗体与五种不同标记的抗体交又竞争结合可溶性IGF-1R的能力进行了分析。所用的五种标记的抗体为生物素标记的M13.C06.G4.P.agly(“生物素-C06”)，生物素标记的M14-G11(“生物素-G11”)，zenon标记的P1B10-1A10(“Zenon-O”)，zenon标记的20C8-3B4(“Zenon-M”)，或是zenon标记的IR3抗体(“Zenon-IR3”)。参见图22。
[1712] 抗体通过来自Pierce Chemical的生物素化制剂盒(#21335)进行生物素标记。
[1713] 通过来自Molecular Probes的小鼠IgG标记制剂盒(Z25000)进行Zenon标记。
[1714] +++++＝抗体相对其自身的结合竞争(90-100％)
[1715] ++++＝70-90％竞争
[1716] +++＝50-70％竞争
[1717] ++＝30-50％竞争
[1718] +＝10-30％竞争
[1719] +/-＝0-10％竞争
[1720] N/A＝无结果
[1721] 该分析的结果显示M13.C06.G4.P.agly和M14.C03.G4.P.agly抗体结合IGF-1R的相同或相似区域，这一点不同于所有其它测试的抗体。特别地，仅生物素标记的M13.C06.G4.P.agly抗体能与未标记的M13.C06.G4.P.agly或未标记的M14.C03.G4.P.agly有效竞争与IGF-1R的结合。还应当注意M13.C06.G4.P.agly不与受到充分研究的IR3抗体交叉竞争。因此，这两个抗体特别地结合不同IGF-1R表位。
[1722] II部分：M13-C06通过结合至FnIII-1区N-末端区的抗体变构性降低IGF-1对IGF-1R的结合亲和性
[1723] 目标：
[1724] 该目标为阐明M13-C06抗体在IGF-1R上的结合表位，以及对IGF-1/IGF-2结合IGF-1R的抑制背后的机制。
[1725] 背景：
[1726] IGF-1R由6个结构域组成(图27A)。据报导在IGF1-R的前三个结构域，即L1(亮氨酸富集重复区1)，CR(半胱氨酸富集重复区)，和L2，以及在结构域5的肽环区(FnIII-2，纤维连接蛋白型在结构域2中)中的突变对IGF-1和IGF-2结合有负面影响(Whittaker2001；Sorensen 2004)。此处，我们证实了M13-C06抗体并未通过与生长因子结合位点竞争性相互作用阻断IGF-1和IGF-2的结合，而是结合FnIII-I并变构性抑制IGF-1/IGF-2信号转导。FnIII-I被认为可以促进IGF-1R和INSR的受体同源二聚化(McKern 2006)，且在结合配体时，通过四级结构变化将激活信号通过跨膜区传递至C-末端酪氛酸激酶区。由该实施例所得的数据提示M13-C06抗体可抑制由IGF-1/IGF-2诱导的可导致下游受体信号转导的构型变化。
[1727] 方法：
[1728] M13-C06抗体存在和缺失时的IGF-1/IGF-1R结合实验
[1729] 多种构建体被用于考察抗体/IGF-1与IGF-1R受体或胰岛素受体的结合：：人IGF-1R(1-902)-His10(称为hIGF-1R-His10，来自R&D systems)，人INSR(28-956)-His10(称为1NSR，来 自R&D systems)，人IGF-1R(1-903)-Fc(称 为 hIGF-1R-Fc，来 自 Biogen Idec)，人IGF-1R(1-462)-Fc(称为hIGF-1R(1-462)-Fc，来自Biogen Idec)，以及小鼠IGF-1R(1-903)-Fc(称为mIGF-1R-Fc，来自Biogen Idec)。“His10”指在构建体C-末端的10-残基组氨酸标记。″Fc”指C末端人IgGl-Fc标记。
[1730] 人IGF-1购自Millipore。IGF-1对hIGF-1R-His10的亲和性采用表面等离子体共振(SPR)进行测定。通过注射含于HBS-EP缓冲液的500nM生物素标记的抗-HisTag抗体(生物素-PENTA-His，Qiagen Cat.No.34440)将其在芯片(Cat.No.BR-1000-32)表面固定化至饱和。对于各个感应图，可通过以2L/分钟注射20L 40nM蛋白在生物素-PENTA-His表面捕获hIGF-1R-His10(描述于实施例5(II部分))。在hIGF-1R-His10注射后，将流速上升至20L/min。再次注射130L含IGF-1溶液以考察生长激素与受体的相互作用。将IGF-1由64nM至0.125nM系列稀释以获得浓度依赖型动力学结合曲线。通过以20L/min注射3x10L pH4.0的10mM醋酸盐再生各个注射系列。各条曲线以(1)从无PENTA-His抗体的链霉素表面获得的数据，以及(2)从先注射hIGF-1R-His10然后注射HBS-EP缓冲液得到的数据进行双重参考。IGF-1的浓度系列被拟合至生产商的BiaEvaluation软件中所提供的1∶1结合模型。在运行缓冲液，hIGF-1R-His10注射缓冲液和IGF-1注射缓冲液中存在和缺失
400nMM13-C06的情况下各得到一组数据，共获得两组数据。
[1731] IGF-1/IGF-1R/M13-C06抗体三元复合物的Pull-down和Western印迹分析
[1732] 以1xPBS洗涤重悬浮的蛋白A/G珠(300l，Pierce Cat.No.20422)，并在旋转振荡器上与1.0mg M13-C06在1.5ml Eppendorf管中室温混合两小时。在单独的管中将12g hIGF-1R-His10(R&D systems)和460ng人IGF-1(ChemiconInternational Cat.No.GF006)室温下混合(1∶1 蛋白∶蛋白比例)一小时。以PBS洗涤结合M13-C06的蛋白A/G，并与hIGF-1R-His10/IGF-1混合物在室温下孵育30分钟。以PBS洗涤结合蛋白的蛋白A/
G然后以300L pH3.0的100mM甘氨酸洗脱结合蛋白。对于阴性对照，忽略添加12g人
IGF-1R(1-902)-His10。以抗-人IGF-1抗体(兔抗-人IGF-1生物素，USBiological Cat.No.I7661-O1B)和抗-人IGF-1R抗体(IGF-1Ra 1H7，Santa Cruz Biotechnology Cat.No.sc-461)作为一抗，然后以HRP-标记的链霉素(Southern Biotech Cat.No.7100-05)和HRP-标记的山羊抗-小鼠IgG(USBiological Cat.No.11904-40J)作为二抗通过Western印迹检测洗脱的蛋白。为了证明IGF-1/IGF-1R/M13-C06形成三元复合物的能力，该实验中所用的IGF-1和IGF-1R的浓度均超过了(＞15倍以上)这些蛋白的正常生理水平(特
别是血清中的IGF-1)以及IGF-1R/IGF-1的测得平衡解离常数。例如，参见，Hankinson等人.，1997。
[1733] IGF-1R(1-462)-Fc的构建以及相对全长受体胞外区结构域的比较抗体结合研究[1734] 人IGF-1R的IGF-1/IGF-2结合区，L1-CR-L2(残基1-462)的构建已有报导(McKern 1997)。利用该信息，我们将人IGF-1R残基1-462沿着N-末端信号序列)亚克隆进入同样用于生产全长人胞外区结构域(残基1-903，hIGF-1R-Fc)的内部PV90载体。通过已有描述的方法(Brezinsky 2003)促进在CHO中的表达。如针对其它Fc-融合蛋白的已有描述(Demarest 2006)，可通过将CHO上清液通过蛋白A亲和柱来纯化蛋白。该蛋白构建体被称为hIGF-1R(1-462)-Fc。
[1735] M 13-C06、M14-C03和M14-G11抗体结合hIGF-1R(1-462)-Fc和全长胞外区结构域构建体hIGF-1R-Fc的能力可通过采用Biacore3000的SPR进行测定。该仪器被设置为25℃，且运行缓冲液为pH 7.2的HBS-EP(Biacore，Cat.No.BR-1001-88)。参照Biacore提供的方法使用标准的NHS/EDC-胺反应化学品将全人源抗体M13-C06、M14-C03和M14-G11以～10,000RU固定化至Biacore CMS研究级SensorChip(Cat.No.BR-1000-14)表面。该抗体在10mM醋酸盐pH 4.0缓冲液中被稀释至40μg/mL以进行固定化。为了考察hIGF-1R-Fc和hIGF-1R(1-462)-Fc对各个人源抗体的结合和解离的相对动力学，可向传感芯片表面注射提高浓度的各种受体构建体。hIGF-1R-Fc浓度介于1.0nM至100nM，而hIGF-1R(1-462)-Fc浓度系列介于1.0nM至2μM。所有的抗体表面均以pH 2.0的100mM甘氨酸进行可靠地再生。重复再生不会导致任意抗体表面的活性损失。流速为20μl/min。
[1736] 表位的定位突变
[1737] 用于探测IGF-1R上M13-C06抗体的表位的突变体选择基于如下发现：在Biacore和FRET结合实验中M13-C06对小鼠IGF-1R的结合亲和性明显减少或不可测得(实施例5(III部分)。小鼠和人IGF-1R具有95％的基本氨基酸序列一致性。人IGF-1R和人INSR具有57％的一致性(73％相似性)。我们鉴定了胞外区结构域中小鼠和人IGF-1R之间不同的33个残基(表16)。这些残基中有二十个为突变的靶标，因为根据最近的INSR晶体结构(pdbcode 2DTG，McKern 2006)，INSR胞外区结构域中的同源位置被暴露至溶剂。可接近表面面积可通过StrucTools(http://molbio.info.nih.gov/structbio/basic.html)以1.4入的探测半径进行计算。四个不在INSR表面的附加残基也可选择进行突变，因为它们位于经证明对IGF-1/IGF-2结合非常重要的FnIII-2结构域的非结构化环区内(Whittaker
2001；Sorensen 2004)。表17显示了选择用于表位定位研究的24个突变。
[1738] 表16：人和小鼠IGF-1R之间的氨基酸差异。各个残基位置的溶剂可及性基于同源INSR胞外区结构域的公开有效结构进行测定。以粗体/斜体显示的残基上大于30％的表面面积暴露至溶剂，并可通过突变来筛选M13-C06的IGF-1R表位。
[1739]
[1740] 24个突变体表位定位库可采用Stratagene定点突变制剂盒参照生产商的方案诱变野生型hIGF-1R-Fc PV-90质粒构建得到。各个突变体(或对于SD004，SDO11，SD014，SD016和SD019库成员为双突变体)在PV-90载体中的整合可通过我们的内部DNA测序装置进行确认。质粒可分别通过Qiagen小量制备制剂盒和Qiagen无内毒素大量制备制剂盒进行小量制备和大量制备。将200μg各种突变质粒通过PolyFect转染制剂盒(Qiagen)6
以2x10 细胞/ml瞬时转染进入100mL HEK293T细胞，从而向培养基分泌可溶性蛋白。将细胞在DMEM(IvrineScientific)，10％FBS(低IgG牛血清，Invitrogen一通过流经20mL蛋白A柱进一步去除牛IgG)中CO2孵育器中37℃培养。7天后，通过1200rpm离心收集含各种IGF-1R-Fc突变体的上清液，并以0.2μm过滤器过滤。通过将上清液流经1XPBS预平衡的1.2mL蛋白A Sepharose FF柱对各个突变体进行亲和纯化。采用pH3.0的0.1M甘氨酸从柱上洗脱突变体，以pH8.5的1M Tris，0.1％Tween-80中和，并通过VivaSpin 6MWCO
30,000离心浓缩设备(Sartorius，Cat.No.VS0621)浓缩至～300μL。
[1741] IGF-1R突变体的Western印迹分析
[1742] 使用Xcell SureLock Mini Cell槽(Invitrogen Cat.No.EI0001)参照标准的生产商方案在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上运行hIGF-1R-Fc突变体样品。采用iBlot干印迹系统(Invitrogen Cat.No.IB1001)和转移架(Invitrogen Cat.No.IB3010-01或3010-02)参照标准生产商方案样品将样品转移至硝化纤维。在4℃25ml的PBST(含5mg/ml脱脂奶粉)中将膜封闭过夜。封闭后，以25ml PBST在室温下将膜洗涤5分钟。将膜与一级抗-IGF-1Rp抗体(Santa CruzBiotechnology Cat.No.sc-9038)以1∶100的比例在10ml PBST中室温孵育一小时。然后将膜在25ml的PBST中洗涤三次，每次5分钟。为进行检测，将膜与二级HRP-结合的山羊抗-兔-Fc抗体(USBiological Cat.No.I1904-40J)以1∶1000的比例在10ml PBST中室温孵育一小时。然后将膜在25ml的PBST中洗涤三次，每次5分钟，然后在25ml的PBST中一次洗涤20分钟。采用Amersham ECLWestern印迹分析系统(GE Healthcare Cat.No.RPN2108)根据标准的生产商方案进行蛋白条带检测。
[1743] IGF-1R-Fc突变体库的Biacore分析
[1744] 由于两个单独同源二聚体区(IGF-1R和IgGI-Fc)的结合引入的过度多价性质，mIGF-1R-Fc和hIGF-1R-Fc均以过度的表观亲和性结合上述的M13-C06、M14-C03和M14-G11表面。为了区分hIGF-1R-Fc和M13-C06的实际高亲和性结合与mIGF-1R-Fc和
M13-C06的低亲和性结合，可将受体-Fc融合物捕获于M13-C06传感芯片表面，然后进行附加的可溶性M13-C06 Fab结合。受体-Fc构建体可通过以1l/min的流速注射60L亲和纯化的浓缩物质被捕获至M13-C06芯片表面(参照前述方法制备)。在受体-Fc加载步骤完成后，将流速升高至5l/min。在加载各受体-Fc构建体后注射(50L)10nM、3nM和1nM浓度的M13-C06 Fab。在各个感应图的最后，流速被升高至30l/min，并通过2x10L注射pH 2的
0.1M甘氨酸使芯片表面再生。
[1745] 用于IGF-1R-Fc突变体筛选的时间分辫荧光共振能量转移(tr-FRET)测定
[1746] 在384孔微量滴定板(白色，来自Costar)中将0.25-0.5g开始系列稀释的突变受体(25l)与0.05g IGF1R-His10-Cy5(12.5l)和0.00375g Eu:C06(12.5l)混合。针对IGF1R-His10-Cy5的结合水平为6.8∶1 CyS∶IGFIR-His10，针对Eu-C06为10.3∶1 Eu∶C06。每个样品的总体积为50l。将平板在平板振荡器上室温孵育1小时。采用激发
2
波长为340nm，发射波长为665nm的LANCE方案以Wallac Victor 荧光平板读取器(Perkin Elmer)进行荧光检测。所有的数据均拟合至单位点结合模型，并由此测得相应的IC50值。
[1747] 结果
[1748] 在上文的实施例3中证实了M13-C06对IGF-1和/或IGF-2结合hIGF-1R-Fc的抑制。即使在饱和条件下，大部分抗体未能完全抑制IGF-1或IGF-2结合hIGF-1R-Fc。对于M13-C06，我们假设配体结合的抑制可能是非竞争性的或变构性的。为了侧试这种假设，我们测定了400nM M13-C06抗体(该抗体对hIGF-1R-His10的亲和性的～4000倍以上)存在或缺失的情况下IGF-1对hIGF-1R-His10的亲和性。采用SPR抗-Histag抗体将hIGF-1R-His10固定化至芯片表面，然后注射上升浓度的IGF-1(至64nM)。在400nM M13-C06抗体存在或缺失的情况下均证实IGF-1结合hIGF-1R-His10。(数据未显示：表面等离子体共振证实400nM M13-C06存在或缺失的情况下均证实hIGF-1结合hIGF-1R-His10。SPR结合期在1400-1800秒之间，而解离期在秒1800-3000之间。当M13-C06缺失时，IGF-1以KD-5
＝17nM(ka＝2.4x10 /M*s)结合hIGF-1R-His10。当400nMM13-C06存在时，IGF-1以KD＝-4
59nM(ka＝7.1x10 /M*s)结合hIGF-1R-His10)。当M13-C06存在时IGF-1结合hIGF-1R-His10的动力学结合速率常数减少了大约3倍，提示M13-C06变构性减少了配体对受体的亲和性。
[1749] 通过采用远超过IGF-1和M13-C06对hIGF-IR-His10的表观亲和性的M13-C06浓度进行hIGF-IR-His10和IGF-1的共免疫沉淀可得到M13-C06不直接与IGF-1竞争结合hIGF-IR-His10的支持证据。Western印迹证实与hIGF-1R-His10混合的IGF-1物质中～
70-100％被M13-C06降低，从而证明M 13-C06和IGF-1有可能共同结合hIGF-1R-His10以形成三元复合物(数据未显示)。这些结果显示了M13-C06对正常IGF-1血清浓度下的IGF-1结合的变构性，并提示M13-C06的结合位点与IGF-1R配体-结合口袋不重叠。
[1750] 接着，我们考察了M13-C06是否结合IGF-1R(L1-CR-L2)的假定配体结合区。我们生成了包含融合至IgGI-Fc的N-末端三个结构域(残基1-462)的平头型受体，并通过表面等离子体共振(SPR)将其结合M13-C06、M14-C03和M14-G11的能力与全长受体胞外区结构域构建体hIGF-1R-Fc的能力相比较。经证实M14-G11可同等结合平头型受体，但M13-C06和M 14-C03的结合被大幅减少。(数据未显示：测试了表面固定化M13-C06、M14-C03和M14-G11抗体与浓度为2μM、100nM、30nM、10nM、5nM和1nM的hIGF-1R(1-903)Fc和平头hIGF-1R(1-462)-Fc的结合。SPR结合期在480-960秒之间，而解离期在秒960-1170之间)。M13-C06和M14-C03的残基结合均显而易见；然而，该数据提示这些抗体至少有相当大一部分表位位于配体结合区外的IGF-1R区。
[1751] 我们利用鼠IGF-1R不结合M13-C06的事实设计了一个小鼠hIGF-1R-Fc内的突变库以评估IGF-1R上M13-C06结合位点的位置。表17显示了hIGF-1R测试中的各个突变体。Western印迹被用于确认各个hIGF-IR-Fc突变体的表达以及生成标准曲线以估计各个突变体蛋白的相对浓度，以纯化hIGF-1R-Fc作为阳性对照(数据未显示)。
[1752] 表17：突变对IGF-1R结合M13-C06的作用。SD015被粗体显示，因为它是唯一在两种测定形式中极少或不结合M13-C06的残基。ND＝未测定。
[1753]
[1754] SPR和tr-FRET被用于筛选抑制IGF-1R-Fc结合M13-C06的突变。除了SD015突变体，所有的突变体IGF-1R构建体均在SPR实验中证实有M13-C06结合活性，或M13-C06Fab结合活性。参见：图26；表17；以及数据未显示竞争性抑制分析被用于建立结合曲线以通过上升浓度的未标记hIGF1R-Fc(SDWT)，小鼠IGF1R-Fc(mIGF1R-Fc)以及突变hIGF1R-Fc构建体来替换Eu-M13-C06结合Cy5-标记的IGF1R。
[1755] 由于Western印迹的表达和定量的自然变异，在tr-FRET测定的IC50值和通过SPR侧定的相对结合强度之间存在着一些偏差；然而，SD015是唯一在两个测定中实际没有针对M13-C06的结合活性且平行于mIGF-IR-Fc对照测定的结果的突变体。His464位于平头型hIGF-1R-Fc构建体的C-末端的基本氨基酸序列(即，hIGF-1R(1-462)-Fc)中的2氨基酸C-末端。M13-C06与平头hIGF-1R(1-462)的残基结合活性提示M13-C06结合表位至少包含残基Va1462-His464。由于有证据显示M13-C06的表位具有构型依赖性，该抗体-表位结合相互作用中很可能涉及其它残基。然而，可以显而易见地预测残基Va1462和His464在FnIII-1结构域的外表面(图27)。
[1756] 在尝试表征M13-C06表位的范围(即，462-464外周的哪些残基对于抗体结合或活性具有重要性)时，我们采用了结构模型法。人IGF-1R和人INSR具有57％的一致性(73％相似性)和类似的三级结构。已进行的蛋白抗原：抗体结合表面的X射线晶体结构分析提示平均结合表面为 (平方埃)，从结合表位中心的半径约为 (Davies 1996)。通过INSR(pdb code 2DTG，(McKem 2006)的同源性胞外区结构域的X射线晶体结构，我们以IGF-1R残基V462至H646定位于INSR残基L472和K474计算了在FnIII-1结构域表面
由残基462-464的半径 内的残基在原子间距离在 以内采用距离取舍点，而平均
距离计算为L472和K474对表面块中的各个残基的C至C距离。对于C至C距离大于
但侧链在 取舍点内的残基所计算的平均距离列为 表18列举了可能对M13-C06结
合和活性具有重要性的残基。
[1757] 表18.在IGF-1R内预测对M13-C06结合和活性具有重要性的残基。残基462和464被斜体表示，因为它们代表了IGF-1R结合表位的预测中心，实验数据证实了这些残基在M13-C06结合中的重要性。
[1758] 表18
[1759]
[1760] 已发表的著作显示识别残基440-586的抗体可同时抑制和对抗IGF-1结合(Soos1992；Keyhanfar 2007)。440-586代表了具有多个对抗-IGF-1R抗体可及的潜在非重叠表面的所有L2和FnIII-1。我们的研究是使我们能够认识IGF-1R的抑制性表位中何处被定位至特定残基的首个研究。INSR最新结构与已知抑制胰岛素结合其受体的抗-INSR抗体共结晶(Soos 1986；McKern 2006)。对IGF-R的His464的同源残基(INSR的K474)是该抗体与INSR的结合表面的一部分。M13-C06可能与拮抗剂抗-INSR抗体在抑制IGF-1结合IGF-1R上具有类似的抑制机制。
[1761] 实施例28
[1762] M13.C06.G4.P.agly抗体在体内有效定位至肿瘤细胞，抑制Ki67表达，并下调在体内有效定位至肿瘤细胞的IGF-1RM13.C06.G4.P.agly抗体的表达
[1763] M13.C06.G4.P.agly抗体在体内有效定位至肿瘤细胞
[1764] 方法：在雌激素存在下向SCID Beige鼠注射2x106 MCF-7细胞(含于matrigel)3
(0.36mg球，90天释放(InnovativeResearch of America))。将肿瘤生长至300-500mm，然后向小鼠腹腔注射30mg/kg的M13.C06.G4.P.agly抗体。在注射后2、6、12、24和48小时处死小鼠并取出肿瘤，在OCT中冰冻，并进行6μm切片以供免疫组化分析(IHC)。未注射抗体的肿瘤作为对照切除。在OCT中冰冻，并进行6μm切片以供IHC。底物为载体VIP，一种紫斑病。使用山羊抗-人IgG H+L(人Elite ABC制剂盒，Vector Labs)在M13.C06.G4.P.agly或IDEC151(阴性对照抗体)处理的肿瘤上检测结合抗体。使用α-IGF-1R Mab(克隆24-31，NeoMarkerslLab Vision)在M13.C06.G4.P.agly或IDEC151处理的肿瘤上检测IGF-1R表达。在BxPC3胰腺癌异种移植模型中进行类似的研究。
[1765] 结论(数据未显示)：使用小鼠MCF-7乳腺或BxPC3胰腺肿瘤异种移植模型进行的体内效力实验显示腹腔注射30和15mg/kg的M13.C06.G4.P.agly能有效抑制肿瘤细胞生长。通过时间曲线实验研究在MCF-7或BX-Pc3荷瘤小鼠中采用单独30mg/kg或15mg/kg的M13.C06.G4.P.agly剂量时各自的药效学。由免疫组化分析(IHC)测定，M 13.C06.G4.P.agly早在处理后6小时便定位至肿瘤，并在48小时出现最大的定位。通过Western和IHC分析测定的IGF-1R的表达显示M13.C06.G4.P.agly处理的肿瘤在处理后6小时IGF-1R明显下降，并在24小时几乎完全失去IGF-1R。在同型匹配对照抗体处理的肿瘤中未观察到变化。对肿瘤溶解产物的信号转导分析显示磷酸化Erk和Akt在2-12小时内的瞬时减少。
[1766] M13.C06.G4.P.agly抗体抑制Ki67表达
[1767] 对M13.C06.G4.P.agly处理的肿瘤的Ki67染色还显示了与对照抗体处理的肿瘤相比增值细胞数量的减少(数据未显示)。这些数据揭示M13.C06.G4.P.agly在体内有效定位于肿瘤，并能通过下调IGF-1R抑制肿瘤生长以及抑制IGF-1R介导的信号转导。
[1768] M13.C06.G4.P.agly在肿瘤中下调并降解IGF-IR
[1769] 从通过人胰腺细胞(BxPC3；图28(A))和乳腺癌细胞(MCF-7；图28(B))生成的SCID-小鼠肿瘤溶解产物中对IGF-1R进行免疫印迹。在以M13.C06.G4.P.agly或IDEC-151阴性对照抗体处理后的指定时间点切除肿瘤。将肿瘤快速冷冻，粉碎并溶解。将肿瘤细胞溶解产物中的蛋白浓度归一化并在4-12％NuPAGE 凝胶(Invitrogen Inc.，SD，CA)上分离。将该凝胶印迹至硝化纤维过滤器，以多克隆抗-IGF-1R探测，并通过抗-兔-辣根过氧化酶抗体进行的酶反应进行检测。结果显示与阴性对照抗体相比M13.C06.G4.P.agly可导致IGF-1R的下调和降解。
[1770] 实施例29
[1771] M13.C06.G4.P.agly抗体在多种肿瘤模型系统中显示了体内抗肿瘤活性
[1772] 除了前述实施例中证实的M13.C06.G4.P.agly在肺和胰腺模型系统中对肿瘤生长的体内抑制，以下实验进一步证实了M13.C06.G4.P.agly显示活性的多种肿瘤细胞模型。
[1773] M13.C06.G4.P.agly对通过MiaPaCa2胰腺癌细胞生成的肿瘤的抗肿瘤活性
[1774] 以含于50％Matrigel(BD Biosciences)/PB S的2x106 MiaPaCa2胰腺癌细胞在右3
侧接种雌性SCID小鼠。当肿瘤达到150mm(LxW2/2)的体积时，分选小鼠，并腹腔给用单独的制剂(单用抗体)或联合治疗剂(M13.C06.G4.P.agly抗体和吉西他滨)。单用吉西他滨(20mg/kg，Q4Dx3)和联合M13.C06.G4.P.agly(30mg/kg)以及单用M13.C06.G4.P.agly(采用15mg/kg和30mg/kg两种剂量；1x周x6)抑制肿瘤生长。
[1775] 除了吉西他滨外，也可测试许多其它的联合疗法并与本发明的抗体联合使用。例如，采用以下类别(仅列举了少量示范性样例)中的化合物的联合疗法，可与本发明的抗体联合使用。
[1776] EGFR酪氨酸激酶抑制剂，例如：
[1777] Tarceva(埃罗替尼)
[1778] 易瑞沙(吉非替尼)
[1779] EGFR抗体，例如：
[1780] ERBITUX (西妥昔单抗)
[1781] VECTIBIX (帕木单抗)
[1782] mTOR抑制剂，例如：
[1783] 坦西莫司
[1784] 雷帕霉素
[1785] 和其它抗癌化合物，例如：
[1786] GLEEVEC (甲磺酸伊马替尼)
[1787] Sutent (舒尼替尼苹果酸盐)
[1788] NEXAVAR (索拉非尼甲苯磺酸盐BAY 43-9006)
[1789] SAHA(伏立诺他盐酸盐；组蛋白去乙酰化酶抑制剂)
[1790] VolociximabTM(M200)。
[1791] M13.C06.G4.P.agly对来自原发性人结肠癌细胞生成的肿瘤的抗肿瘤活性
[1792] 以1mm3的结肠肿瘤片段在雌性SCID小鼠的右侧接种。该肿瘤片段来自患有结肠癌的患者手术切除的肿瘤中获取的结肠肿瘤组织的系列传代(5x)。使肿瘤生长至
3
150mm(LxW2/2)的体积，分选小鼠，并给用所示的治疗剂(n＝6)(图29)。15mg/kg或30mg/kg的抗体每周一次通过腹腔给药。
[1793] M13.C06.G4.P.agly有效抑制SCID小鼠中原代结肠肿瘤(CT3)生长(图29)。
[1794] M13.C06.G4.P.agly对MCF-7乳房癌细胞生成的肿瘤的抗肿瘤活性
[1795] 以含于50％Matrigel/PBS的2x106 MCF-7细胞(雌激素依赖型)在右侧接种雌性SCID Beige小鼠。在细胞接种前24小时在左侧移植雌二醇丸(0.36mg丸型雌二醇，903
天释放(InnovativeResearch of America))。使肿瘤生长至150mm(LxW2/2)的体积，分选小鼠，并给用所示的治疗剂(n＝10)(图30)。抗体每周一次腹腔给用，而在每个方案中含于花生油的枸橼酸他莫昔芬(Sigma Inc.)一周皮下给用5次。通过成对学生t检验进行统计分析。
[1796] 结果：M13.C06.G4.P.agly有效抑制MCF-7乳腺癌肿瘤的生长(图30)。
[1797] 当然，本发明的抗体的肿瘤抑制效力也可在多种其它肿瘤细胞类型(例如，肺癌细胞系H-1299、H-460、H-23；结肠癌细胞系Colo205和HT-29；胰腺癌细胞系如Panc-1；以及前列腺癌细胞系如PC-3，此处仅列举少量示例性样例)中简单地测得。
[1798] 实施例30
[1799] M13.C06.G4.P.agly抗体不显示体外ADCC活性
[1800] 方法：
[1801] 通过标准Ficoll-paque分离从肝素化全血中纯化得到人外周血单核细胞。将细TM胞重悬浮与含10％FBS和200U/ml人IL-2的GIBCO RPMI1640培养基中，并在37℃孵育
7
过夜。在下一日采集细胞并在培养基中洗涤一次，然后以1X10 细胞/ml重悬浮。
[1802] 将靶细胞(MCF-7，乳腺癌细胞)与100μCi51Cr在37℃孵育1小时。对靶细胞洗51 4
涤一次以去除未结合的 Cr，并以1x10 细胞/孔的体积进行包覆。将靶细胞与50μl效应细胞和50μl抗体进行孵育。在整个实验中采用1∶50的靶∶效应比例。对照分别在抗体存在或缺失的情况下进行孵育，该抗体包括M13.C06.G4.P.agly，Herceptin(阳性对照)以及IDEC-151(阴性对照-特异性针对CD4的食蟹猴/人嵌合IgGI单克隆抗体)。37℃孵育4小时后，收集上清液，并以伽马计数器((Isodata伽马计数器，Packard Instruments)计数。溶解％通过如下计算式进行确定：
[1803] 溶解％＝[样品释放(CPM)-自发释放(CPM)]÷[最大释放(CPM)-自发释放(CPM)]x100％
[1804] 结果：与Herceptin抗体阳性对照相反，M13-C06或IDEC-151均未显示ADCC活性，从而揭示后述抗体缺乏效应功能(图31)。
[1805] 实施例31
[1806] 采用抗-IGF-1R抗体治疗人癌症
[1807] 本实施例描述了采用针对IGF-1R的抗体来靶向恶性细胞(例如，检测到IGF-IR表达的过度增殖细胞)，从而治疗癌症的方法。
[1808] 在特定的实施方案中，M13.C06.G4.P.agly抗体(或本发明的其它抗体)被纯化并与适当的药学载体制成注射制剂。向患有过度增殖紊乱的人类患者每两周或每月一次静脉输注约1mg/kg体重至约100mg/kg体重的多重剂量的M13.C06.G4.P.agly抗体(或本发明的其它抗体)，并施用至少六个月。可测定患者的预断指数，并据此采用不规则的间隔。
[1809] 可在此处所述的标准放射治疗方案之前，同时或之后施用抗体。对患者进行监测以确定治疗是否得到抗肿瘤响应，例如，基于肿瘤消退，新肿瘤发生率的减少，更低的肿瘤抗原表达，或是其它评估疾病预后的方法进行判断。
[1810] 实施例32
[1811] IGF-1R的变构性和竞争性抗体抑制剂的残基特异性表位定位
[1812] 目的
[1813] 目的是阐述抑制性抗-IGF-1R抗体的结合表位和在IGF-1/IGF-2封闭后面的机理。
[1814] 背景
[1815] IGF-1R(1型胰岛素样生长因子受体)是在多种正常细胞类型上表达的受体酪氨酸激酶(Pollak 2004)。IGF-1R也参与肿瘤生长和存活，因此已经成为用于治疗干预的抗体和小分子基方案的靶。抑制性抗体已经被靶向至受体的细胞外配体-结合结构域。IGF-1R细胞外区域包括6个蛋白结构域；称为L1的N-末端富亮氨酸重复结构域，富半胱氨酸区域(CRR)，第二富亮氨酸重复结构域(L2)和三个C-末端III型纤连蛋白结构域(称为FnIII-1、FnIII-2和FnIII-3)(图35)。此处，我们证实在IGF-1R胞外结构域的表面上的两个单独表位可以导致受体的抑制。我们基于46个个体或双IGF-1R突变的数据库形成有关这两个表位的新的残基特异性表位定位信息。第一表位位于FnIII-1，并且导致IGF-1和IGF-2结合的变构性封闭。第二表位在CRR结构域中并且邻近推定的IGF-1/IGF-2结合位点。我们发现在该区域中抗体表位的微妙差别使得变构性地阻断单独配体IGF-1的能力和竞争性地阻断IGF-1和IGF-2的能力产生差别。必须靶向以获得配体竞争性封闭的特定残基此处首次鉴定。
[1816] 材料
[1817] 按照上述方式纯化抗-IGF-1R抗体M13-C06、M14-C03和P1E2(例如参见实施例 10)。市 售 抑制 性IGF-1R抗 (αIR3，(Jacobs 1986))购自 Calbiochem(Cat.No.GR11LSP5)。具有N-末端8组氨酸标记的人IGF-1在Pichia中重组生产，并且使用
2+
Ni -NTA琼脂糖纯化。含有C-末端10-组氨酸标记的重组可溶性人IGF-1R胞外结构域
构建体，称为hIGF-1R(1-902)-His10，购自R&D systems(Cat.No.305-GR-050)。人和鼠IGF-1R(1-903)-IgG1-Fc融合蛋白被构建并使用标准蛋白A柱层析法进行纯化。
[1818] 方法
[1819] 抗体交叉-阻断研究
[1820] 使用生物素化型抗体和hIGF-1R-Fc测定各种抗体阻断M13-C06或M14-G11的能力。简言之，在室温下(RT，不振荡)将在1XPBS中50L 2g/mL hIGF-1R-Fc被包覆在透明MaxiSorp板(Nunc)的96孔的每个孔中2小时。在室温下将板用生物素化M13-C06或
生物素化M14-G11(80ng/mL)和抑制剂抗体的100L混合物洗涤和孵育1小时。将抑制剂抗体从40μg/mL至3ng/mL系列稀释(5倍稀释)。根据生产商提供的方案(Pierce Cat.No.21335)，使用EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素使M13-C06和M14-G11生物素化。对照使用生物素化M13-C06或生物素化M14-G11通过非-IGF-1R特异性IgG4同型对照抗体的系列稀释来进行。将板在室温下用100μL/孔抗生蛋白链菌素-HRP(1∶4000稀释到阻断缓冲液中，Southern Biotech Cat.No.7100-05)洗涤并振荡1小时。将板洗涤并向孔中加入
100μL/孔SureBlue Reserve TMB Microwell过氧化物酶底(KPL，Cat.No.53-00-01)。通过使用Wallac 1420-041 Multilabel计数板读取器每隔5分钟在650nm处读取吸光度来进行检测生物素化M13-C06或M14-G11的存在。
[1821] 各种抗体阻断鼠αIR3的能力“Zenon-Fab-HRP”标记的αIR3和hIGF-1R-Fc来测定。αIR(IgG1)被生产商(Invitrogen Cat.No.Z25054)称为ZENON -Fab-HRP。简言之，简言之，在室温下(RT，不振荡)将在1XPBS中50μL 2μg/mL hIGF-1R-Fc被包覆在透明MaxiSorp板(Nunc)的96孔的每个孔中2小时。将板用1XPBS洗涤并用PBS/1％BSA溶液在2-8℃下阻断过夜。在室温下将板用Zenon-标记的αIR3(40ng/mL)和抑制剂抗体的
100μL混合物洗涤和孵育1小时。将抑制剂抗体从40μg/mL至3ng/mL系列稀释(5倍稀释)。使用Zenon-标记的αIR3通过非-IGF-1R特异性IgG4同型对照抗体的系列稀释来进行对照抑制。将板洗涤并向孔中加入100μL/孔SureBlue Reserve TMB Microwell过氧化物酶底物(KPL，Cat.No.53-00-01)。通过使用Wallac 1420-041 Multilabel计数板读取器每隔5分钟在650nm处读取吸光度来进行检测Zenon-标记的αIR3的存在。
[1822] IGF-1和IGF-2阻断
[1823] 根据生产商提供的方案(Pierce Cat.No.21335)，使用EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素使hIGF-1R-Fc生物素化。将5μg/ml的生物素化人IGF-1R-Fc以100μL/孔加入SigmaScreen抗生蛋白链菌素-包覆的96孔板的孔(Sigma，Cat.No.M5432-5EA；
Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis，MO，USA))中，在2-8℃下孵育过夜。然后使用200μL/孔PBST将板洗涤四次。在PBST，1.0mg/ml BSA中的320nM制备人IGF-1 His。抗-IGF-1R抗体M13-C06、M14-C03、M14-G11、P1E2和αIR3(Calbiochem，Cat.No.GR11LSP5)的系列稀释在320nM IGF-1 His溶液中进行。对于M13-C06和M14-C03从1.3μM稀释至10pM，对于M14-G11从5.2μM稀释至10pM，对于P1E2和αIR3从2.6μM稀释至10pM。在PBST，
1.0mg/ml BSA的320nM下制备人IGF-2His。使用320nM IGF-2His溶液将抗体系列稀释(对于M13-C06和M14-C03从1.3μM至5pM，对于M14-G11和αIR3从5.2μM至5pM，对于P1E2从5.2μM至20pM)。以100μL/孔重复将稀释液加入板中，将板在室温下孵育1小时。
然后将板用200μL/孔PBST洗涤四次。将HRP-偶联的抗-Histag抗体(Penta-His HRP Conjugate，QIAGEN，Cat.No.1014992)以1∶1000在PBST中稀释，并以100μL/孔加入板中，将板在室温下孵育1小时。然后用200μL/孔PBST将板洗涤四次。一旦观察到期望的反应，以100μL/孔向板中加入SureBlue Reserve TMB Microwell过氧化物酶底物(KPL，Cat.No.53-00-01)，然后以100μL/孔加入1％磷酸。在450nm处测定各孔的吸光度，将结果归一化并针对抗体浓度的log值制图。
[1824] 表位定位突变
[1825] 根据生产商的方案使用Stratagene定点突变制剂盒通过使野生型hIGF-1R-Fc PV-90质粒突变来构建46突变表位定位库。通过DNA测序来证实在PV-90载体内引入各突变(或双突变)。对于DNA制备，将质粒转移到DH5α(Invitrogen，Cat.No.18258-012)，在37℃下培养过夜，并分别使用Qiagen Miniprep制剂盒或Qiagen Endotoxin-Free6
MaxiPrep制剂盒来小量制备或大量制备。使用PolyFect转染制剂盒(Qiagen)以2x10 细胞/mL将200μg的各突变质粒瞬时转染到100mL HEK293T细胞以可溶性蛋白分泌到培养基中。将细胞在DMEM(IvrineScientific)，10％FBS(低IgG牛血清，Invitrogen-通过经过20mL蛋白A柱而进一步缺失牛IgG)中在37℃下在CO2孵育器中培养。在7天后，含有各IGF-1R-Fc突变的上清通过在1200rpm离心而收集并通过0.2μm的过滤器过滤。各突变体通过使其上清流过1.2mL蛋白A琼脂糖凝胶FF柱(用1XPBS预平衡)来亲和纯化。使用
0.1M甘氨酸，pH 3.0将突变体从柱上洗脱，用1M Tris，pH 8.5，0.1％Tween-80中和，并使用VivaSpin 6 MWCO 30,000离心浓缩装置(Sartorius，Cat.No.VS0621)浓缩至～300μL。
[1826] IGF-1R突变体的Western印迹分析
[1827] 根据标准生产商的方案，使用Xcell SureLock Mini Cell(Invitrogen，Cat.No.EI0001)将hIGF-1R-Fc突变体样品在4-20％Tris-甘氨 酸凝胶(InvitrogenCat.No.EC6028)上运 行。根 据标 准生 产商 的方 案，使 用iBlot Dry Blotting System(Invitrogen，Cat.No.IB1001)和Transfer Stacks(Invitrogen，Cat.No.IB3010-01或3010-02)将样品转移至硝化纤维。在4℃下在25ml PBST；5mg/mL脱脂奶粉中将膜阻断过夜。在阻断后，在室温下使用25ml PBST将膜洗涤一次5分钟。使用一抗抗-IGF-1Rβ抗体(Santa Cruz Biotechnology Cat.No.sc-9038)以1∶100在10mL PBST在室温下将膜孵育1小时。随后将膜在25ml PBST洗涤三次5分钟。为了检测，将膜用第二HRP-偶联的山羊抗-兔IgG-Fc抗体(US Biological Cat.No.I1904-40J)以1∶1000稀释在室温
下在10mL PBST中孵育1小时。将膜在25mL PBST中洗涤三次5分钟，然后在25mL PBST中洗涤一次20min。根据标准生产商方案使用Amersham ECL Western印迹分析系统(GE Healthcare，Cat.No.RPN2108)来检测蛋白带。
[1828] IGF-1R-Fc突变库的表面等离子体共振
[1829] 在设定至25℃的Biacore 3000设备上进行表面等离子体共振(SPR)实验。mIGF-1R-Fc和hIGF-1R-Fc都以高的表观亲和性结合研究等级CM5传感芯片表面(含有固定的M13-C06、M14-C03和M14-G11)。抗体传感芯片表面通过下列方式制备：根据生产商的标准方案，注射各抗体(稀释的100μg/mL在10mM醋酸盐，pH 4.0)在EDC/NHS-激活的传感芯片表面上。mIGF-1R-Fc结合抗体表面的能力是由于蛋白的高表观亲和力。hIGF-1R-Fc和mIGF-1R-Fc蛋白寡聚体引入两个单独的均聚体区域(IGF-1R和IgG1-Fc)。为了区别实际高亲和性抗体结合hIGF-1R-Fc和低亲和性抗体结合mIGF-1R-Fc，将受体-Fc融合捕获在M13-C06和M14-G11传感芯片表面上，然后另外注射抗体(αIR3和P1E2)或抗体Fab(M13-C06、M14-C03和M14-G11)。通过在传感芯片表面上以1μl/min注射60μL亲和纯化的浓缩材料而使受体-Fc构建体捕获在抗体表面上。在完成受体-Fc上载步骤后，将流速增至5μl/min。在上载各受体-Fc构建体后，随后注射溶液(50μL)，其含有M13-C06Fab或αIR3抗体，10nM、3nM或1nM，或M14-C03Fab、M14-G11Fab或P 1E2抗体，30nM、10nM或
3nM。在完成抗体注射后测量7分钟的解离。最后，将流速增至30μL/min，并且芯片表面通过2X10μL注射0.1M甘氨酸，pH 2来重生。
[1830] 结果：
[1831] 抗-IGF-1R抗体的IGF-1和IGF-2阻断性能
[1832] 测试五个抗体(M13-C06、M14-C03、M14-G11、P1E2和αIR3)在ELISA-基竞争测定中阻断IGF-1和IGF-2结合IGF-1R的能力。M13-C06和M14-C03都阻断IGF-1和IGF-2结合IGF-1R(图32和33)。部分IGF-1或IGF-2结合可以通过增加测定中配体的浓度而
增加，即使在存在饱和水平的M13-C06或M14-C03时也是如此。另外，M13-C06和M14-C03的抑制曲线的中点(IC50)在测定中不依赖于IGF-1或IGF-2的浓度。两个结果都暗示配体封闭的变构性机理。在测定中在存在和不存在饱和水平的M13-C06时滴定人IGF-1His允许我们测量配体对于hIGF-1R-Fc的表观亲和性损失。数据显示存在M13-C06抗体导致人IGF-1His对于hIGF-1R-Fc的亲和性约50倍损失(图34)。P1E2和αIR3还阻断IGF-1
变构性，但对于IGF-2结合IGF-1R具有较小作用(图32和33)。αIR3的这些结果和出版的结果一致(Jacobs 1986)。M14-G11显示出以竞争性的方式阻断IGF-1和IGF-2(图32和33)。M14-G11的IC50依赖于测定中使用的IGF-1浓度。在比变构性的阻断剂的IC50的M14-G11浓度更高处饱和水平的M14-G11阻断100％的配体。
[1833] 抗-IGF-1R抗体的交叉阻断性能
[1834] 测试了所有抗体在IGF-1R ELISA结合测定中交叉阻断另一者的能力(表19)。在测定中M13-C06和M14-C03交叉阻断另一者，但在测定中对于P1E2、αIR3或M14-G11没有交叉阻断活性。P1E2和αIR3在测定中能够完全交叉阻断标记的αIR3和M14-G11。
M14-G11证实对于αIR3具有中度交叉阻断活性，这表明M14-G11的表位可重叠，但不同于αIR3和P1E2的表位。
[1835] 初步表位定位-表位位置的测定
[1836] 构建初级组的19个突变体以确定抑制性抗-IGF-1R抗体表位的位置。基于观察M13-C06、M14-C03和M14-G11证实对于鼠IGF-1R具有较小的活性，我们鉴定有限的突变在人IGF-1R内，所述人IGF-1R应该能够使我们定位抑制性抗-IGF-1R抗体的表位(例如参见实施例27)。鼠和人IGF-1R共享95％的初级氨基酸序列一致性。三十三个(33)残基在鼠和人IGF-1R的胞外结构域中是不同的。这些残基中有二十个(20)为突变的靶标，因为它们在同源INSR胞外结构域结构内的暴露于溶剂(pdb code 2DTG，(McKern 2006))。可接近表面面积可通过StrucTools(http://molbio.info.nih.gov/structbio/basic.html)以1.4入的探测半径进行计算。这些突变中的四对被鉴定，其中目标突变在初始序列中彼此相邻。在这些情况下，每对都在单独构建体中双突变。因此，20个残基位置导致16个初始突变构建体。四个另外的突变被构建，因为鼠/人IGF-1R氨基酸在已知对于IGF-1/IGF-2结合重要的FnIII-2结构域中未结构化的环区域不同(Whittaker 2001；Sorensen 2004)。这些位置中的两个在初始序列中接近，并且可在单独突变构建体内联合。19个初步突变的最终列表(SD001-SD019)提供于表20中。表20中示出的残基编号表示30-残基IGF-1R
信号序列已经被割除。每种构建体都通过瞬时转染到100mL HEK293细胞中1星期来表达，使用蛋白A柱层析法来纯化。纯化的突变IGF-1R构建体浓缩和测定用于通过Western印迹分析来表达/折叠。对于所有突变构建体表达10-30μg。
[1837] 使用表面等离子体共振(Biacore)测定M13-C06、M14-C03、M14-G11、P1E2和αIR3它们和各突变IGF-1R-Fc融合构建体相互作用的能力。为了除去在测定中作为变量的不确定浓度的IGF-1R-Fc融合构建体，将各突变构建体捕获在研究等级CM5芯片(含有～10,000RU固定的M13-C03、M14-C03和M14-G11抗体)上。为了增强我们能够肉眼看到抗体结合捕获突变IGF-1R构建体的衰减，我们使用酶衍生的M13-C06、M14-C03和M14-G11抗原结合片段(Fab)。
[1838] 在我们初步19个突变构建体中，只有SD015(E464H)影响M13-C06和M14-C03Fab结合IGF-1R的能力。残基464至组氨酸的突变导致Fab的结合反应的完全切除。所有其它突变IGF-1R构建体结合比较平衡解离常数(对于M13-C06和M14-C03Fab，KD分别等于1nM和5nM)。这些实验固定M13-C06和M14-C03抗体的表位至FnIII-1结构域的表面。两个抗体的VH CDR区过度类似(38个残基中26个一致)，而VL结构域的CDR区是不关联
的，这表明针对抗原识别的强的VH偏见。不吃惊地，两个抗体彼此有效交叉阻断。Soos和coworkers示出使用IR/IGF-1R嵌合体(在第二富亮氨酸重复结构域(L2)和第一III型纤连蛋白结构域(FnIII-1)内的一个或多个表位)可导致受体抑制(Soos 1992)。这跨越了残基333-609；总共276残基。我们首次将该抑制性表位直接固定在FnIII-1结构域内的单独残基E464。
[1839] 在19个突变体中，只有SD008(S257F)和SD012(E303G)，分别在富半胱氨酸重复(CRR)和L2结构域中的突变削弱了M14-G11Fab识别人IGF-1R的能力(表20)。在两者情况下，突变导致基于测定的KD的亲和力的约3倍损失。所有其它突变IGF-1R构建体(包括SD015)都证实针对结合M14-G11 Fab(野生型亲和力(KD～4-6nM))的M13-C06和M14-C03没有反应性。
[1840] 也筛选IR3和P1E2针对初步突变库。这些抗体中的两个表现出相对于野生型人IGF-1R-Fc，它们和SD012的亲和性类似地降低；然而，只有P1E2表现出和SD008降低的结合(表20)。
[1841] 详细的表位定位：M13-C06和M14-C03抗体表位的残基特异性定义
[1842] 基于固定M13-C06和M14-C03表位至IGF-1R的FnIII-1结构域的初级IGF-1R突变库的结果，第二组突变被设计以探测围绕初始突变的IGF-1R的表面E464H，这导致抗体结合的切除。基于它们的和E464的3D接近性(包括除了初始组氨酸突变外在残基464处不同的突变)，总共21个残基被选择用于突变。胰岛素受体的3D结构被用于评价围绕464的残基的接近性。7对残基是突变一致的，其都邻近初始序列。这些残基对同时突变以产生双突变。因此，第二组突变包括总共14个构建体，表20中列为SD101-SD114。
[1843] 如第一组初级突变(SD001-SD019)中所述，进行14个突变构建体的表达、扩增和质量控制。所有14构建体除了SD114都表达良好，并且基于Western印迹分析都表现折叠的。该构建体表达较差，并且在我们的Biacore实验中不和M13-C06、M14-C03或M14-G11(它们识别完全不同的表位)反应。因此，丢弃用于该突变构建体的数据。其它
13个构建体允许M13-C06和M14-C03表位的精确、残基特异性定义。残基特异性结果列于表20中。简言之，M13-C06和M14-C03的表位几乎相同并且完全包含在FnIII-1结构域中。最关键(可能中间)的残基是461和462。含有残基461和462处的突变的SD103证
实不对M13-C06和M14-C03Fab具有反应性，和不对M13-C06和M14-C03表面具有反应性。
SD103和M14-G11表面的结合和任何其它FnIII-2突变构建体并无不同，这表明该完全切除是表位特异性的。导致IGF-1R的抗体亲和性切除或更大降低(亲和性＞100倍降低)的其它突变被发现在IGF-1R残基459、460、464、480、482、483、570和571。导致和野生型人IGF-1R相比抗体亲和性较小降低(2.5≥KD≥10nM)的突变被发现在残基466、467、564、
565。这些残基的位置被定位至同源IR结构的表面(图35，McKern et al.，2006)。对于突变IGF-1R和M13-C06与M14-C03的结合仅观察到两处差异影响。在残基533处的突变强烈地影响M14-C03结合，但对于M13-C06结合仅有较弱影响。在残基568处的突变较弱地消弱M14-C03结合，但对于M13-C06结合没有影响。
[1844] 基于表位的位置和表面积覆盖率，不吃惊的是，M13-C06和M14-C03都表现出变构性抑制IGF-1和IGF-2结合IGF-1R。表位在和已知配体结合表面(Whittaker 2001；Sorensen 2004)相对的受体面上。出版的作品已经证实识别残基440-586的抗体可以对于IGF-1结合是抑制性和拮抗性的(Soos 1992；Keynanfar 2007)。在IGF-1R内，氨基酸残基
440-586表示具有多个潜在不重叠表面(可接近抗-IGF-1R抗体)的所有L2和FnIII-1。
我们的研究是首次研究，我们认识到以残疾特异性方案固定抑制性表位至受体上的特定区域。胰岛素受体(IR)的近期结构和已知抑制胰岛素结合其受体(McKern 2006)的抗-IR抗体共结晶。IGF-1R的His464的同源残基(IR的K474)是具有IR的该抗体的结合表面
的一部分。可能的是，M13-C06分享和拮抗性抗-IR抗体类似的作为拮抗剂用于抑制IGF-1结合IGF-1R的抑制性机理。基于Biacore的结果(例如参见实施例27)，M13-C06表现出通过降低动力学缔合速率来抑制IGF-1(可能还有IGF-2)。抗体表现出捕获构型中的受体胞外结构域，这使得难以使IGF-1和IGF-2接近受体-结合位点。
[1845] 详细表位定位-M14-G11、P1E2和αIR3抗体表位的残基特异性定义
[1846] 基于初始IGF-1R突变库的结果，即将M14-G11、P1E2和αIR3表位定位至IGF-1R的CRR和L2结构域，设计第3组突变S257F和E303G，其位于初始突变周围的IGF-1R表面，可以导致对受体的抗体亲和性降低。基于残基的3D与S257和E303的接近程度，选择总共15个残基(包括残基257处与原始苯丙氨酸突变不同的突变)进行诱变。利用胰岛素受体的3D结构评估S257和E303周围之残基的接近程度。鉴定出用于突变的2(2)对残基，其在一级序列中相邻。对这些残基对同时进行突变，以产生双突变体。因此，第2组突变由总共13个质粒组成，其以SD201-SD213列于表20中。
[1847] 利用用于第1组初始突变(SD001-SD019)所描述的方法进行这13个突变质粒的表达、纯化和质量对照。基于Western印迹分析，除了SD213之外，所有这些质粒均较好地表达并且显示出折叠状态。由于受体折叠状态的周围模糊不清，SD213的数据被忽略。另外12个突变质粒产生了准确的M14-G11、P1E2和αIR3表位之残基特异性定义。残基特异性结果列于表20。M14-G11、P1E2和αIR3之间的表位不同。这并不出乎意料，因为M14-G11是IGF-1和IGF-2的竞争性抑制剂，而P1E2和αIR3仅变构性地抑制IGF-1。M14-G11的表位在表面上位于CRR结构域的中心附近，所述表面直接与已知影响受体结合的残基(Whittaker2001；Sorensen 2004)相接触。发现抑制M14-G11结合的突变位于248和250位。残基
254处的突变导致对受体的抗体亲和性中度降低(超过野生型IGF-1R10≥KD≥100倍)。
许多其他突变(主要在CRR中)使M14-G11对受体的亲和性稍微降低(超过超过野生型
IGF-1R 2.5≥KD≥10倍)，包括残基257、259、260、263、265和303。这些残基的位点定位于IGF-1R前三个胞外结构域之已公开结构的表面(图36，(Garrett 1998))。
[1848] P1E2和αIR3的表位彼此相似，仅有少许差异。其表位主要在CRR结构域中与M14-G11的表位残基相互重叠，但是位于轻微旋转而远离IGF-1/IGF-2结构窝的受体面。另外，发现CRR结构域C-末端以及L2结构域中的残基(除影响M14-G11结合的残基以外)仅使αIR3的亲和性稍微降低(表20)。P1E2与IGF-1R的结合由于残基254和265处的
突变而受到抑制；由于残基257处的突变而中度降低(超过野生型IGF-1R 10≥KD≥100倍)；由于残基248和303处的突变而稍微降低(超过超过野生型IGF-1R 2.5≥KD≥10
倍)。αIR3与IGF-1R的结合由于残基248和265处的突变而受到抑制；由于残基254处的突变而中度降低(超过野生型IGF-1R 10≥KD≥100倍)；由于残基263、301、303、308、
327和379处的突变而稍微降低(超过超过野生型IGF-1R 2.5≥KD≥10倍)。影响P1E2
和αIR3与IGF-1R结合(对2个抗体的平均影响)的残基位点定位于IGF-1R前三个胞外
结构域之已公开结构的表面(图37，(Garrett 1998))。αIR3和P1E2似乎具有相同的仅阻断变构性的/IGF-1的特性，如最近文献中所描述(Keyhanfar 2007)。已知残基241、242、
251和266影响这些抗体结合受体的能力。我们的数据与该报道一致，并且表明残基257和
265的额外重要性。
[1849] M14-G11(竞争性的IGF-1和IGF-2阻断物)与P1E2/αIR3表位之间的主要差异是与IGF-1结合位点相邻的区域。能够同时识别残基248、250和254的能力可能是限定性因素，其使得M14-G11可以竞争性地阻断与IGF-1和IGF-2的结合。P1E2和αIR3均完全未受到D250S突变的影响，所述突变完全抑制M14-G11与受体的结合。M14-G11与IGF-1R的结合还由于IGF-1结合位点附近CRR结构域之内部裂缝处的突变(残基259和260，图36和37)而减弱，这或许可以解释该抗体如何在空间上完全阻断配体与受体的结合。这些位点的突变对于P1E2或者αIR3的结合没有任何影响。P1E2和αIR3亲和性由于IGF-1结合沟外部表面上的突变而减弱(图36和37)。因此，似乎被M14-G11特异性识别从而可能导致竞争性的配体阻断的残基是D250、E259和S260。
[1850] 使αIR3和M14-G11与IGF-1R的结合减弱的残基突变从CRR结构域扩展至L2结构域中。基于描述平均抗体表位区域的已公开结果(Davies 1996)，所有这些残基同时参与与抗体的直接相互作用是不太可能的。最近的数据显示，重复蛋白的稳定性和折叠与大部分球状结构域不同(Kajander 2005)。重复结构域倾向于是延伸结构，其非协同性折叠/去折叠反应与单个α螺旋的螺旋-卷曲转换相似。从最简单的角度看，球状结构域一般协同地折叠并且以单一的天然折叠状态或者变性状态存在。球状结构域的结构不会由于单个突变而打乱，假设该突变不会导致结构域的整体去折叠。相比而言，突变时，折叠的重复结构域可以逐渐恢复至去折叠状态。因此，沿IGF-1R CRR或者L2结构域表面的突变可能通过修饰这些结构域的整体结构(或者顺序)而影响抗体结合。该机制还可以解释CRR或者L2结构域特定构型的抗体稳定性如何影响CRR结构域与配体的动力结合反应。可以预期这将在变构性的形式中发生(如P1E2和αIR3中所观察到的)，假设抗体也不会变构性地阻断配体与其结合(如M14-G11中所观察到的)。
[1851] 表19.抗体交叉阻断实验的结果概述
[1852]
[1853] +++++＝抗体相对其自身的结合竞争(90-100％)
[1854] ++++＝70-90％竞争
[1855] +++＝50-70％竞争
[1856] ++＝30-50％竞争
[1857] +＝10-30％竞争
[1858] +/-＝0-10％竞争
[1859] N/A＝无结果
[1860] 表20.IGF-1R突变体和它们对于抗体结合影响的完全列表。
[1861]
[1862]
[1863]
[1864]a
[1865] 无效果(NE)：测定的KD在WT hIGF-1R-Fc的2.5倍内；弱(W)：测定的KD比WT高2.5-10倍；中(M)：测定的KD比WT高10-100倍；强(S)：和抗体的结合由于突变而消除；和nd：未测定。
*
[1866] “折叠影响”是指受体表达消弱，并且蛋白以异常方式发挥作用，据推测因为受体的“折叠”受到“影响”。
[1867] 实施例33
[1868] 不同IGF-1R表位与配体-阻断抗体的组合靶定导致对肿瘤细胞增长的抑制作用增强
[1869] 目的：在基于细胞的肿瘤生长测定中研究使与非重叠表位相结合之抑制性抗-IGF-1R抗体组合的功能性影响。
[1870] 背景：本文所描述的生化研究表明，与非重叠表位相结合之抑制性抗-IGF-1R抗体的组合物在阻断IGF-1和IGF2配体与受体结合方面可以相互促进。这种组合可以导致完全的配体阻断并且效力更强(即在较低抗体浓度下)。
[1871] 材料和方法：细胞生长抑制测定
[1872] 利用细胞活力测定对抗体阻断IGF-1和IGF-2所驱动之肿瘤细胞生长的能力进行检测。BxPC3(人胰腺癌)和H322M(人非小细胞肺肿瘤)(ATCC)肿瘤系购自ATCC。细胞系在含有RPMI-1640(ATCC)和10％胎牛血清(Irvine Scientific Inc.(Santa Ana，CA，USA))的完全生长培养基中生长。胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis，MO，USA))用于从组织血管中去除粘连的细胞。磷酸盐缓冲液(pH 7.2)购自MediaTech Inc.(Herndon，VA，USA)。用于发光测定的96孔透明底板购自Wallac Inc.。生长至80％融合3
单层的细胞经胰蛋白酶消化、清洗、重悬并且对于BxPC3和H322M细胞均以8×10 细胞/每孔的200μl 0.5％生长培养基包覆至96孔板中。24小时后，培养基用50μl或者100μl的无血清培养基(SFM)替换，并加入50μl经系列稀释的抗体(如图38-40所示的4倍浓度)。于37℃额外孵育30分钟后，加入50μl 4倍浓度的IGF-1和IGF-2。所有处理均一式三份进行。细胞额外孵育72小时，随后裂解，利用CELL TITER-GLOTM发光细胞活力测定仪((Promega Corporation，2800 Woods Hollow Rd.，Madison，WI 53711 USA)确定ATP的存在量。以200μl/孔加入试剂和SFM的1∶1混合物。在Wallac(Boston，MA)读板仪上以相对发光单位Relative Luminscence Units(RLU)对发光进行检测和定量。抑制作用以[1-(Ab-SFM RLU)/(IGF-SFM RLU)]×100％计算。一种同型配对抗体，IDEC-151用作阴性对照(图38至40中的“ctr”或者“ctrl”)。
[1873] 结果：通过以细胞ATP作为测定代谢活性的相对比较，对M13.C06.G4.P.agly(C06)和M14.G11.G4.P.agly(G11)抗-IGF1-R抗体在体外抑制细胞生长的能力进行了间接测定。在无血清条件下，C06和G11均以剂量依赖性方式抑制了IGF-1和IGF-2所诱导之BxPC3胰腺癌细胞系的生长(图38)。重要的是，对于暴露于含有等摩尔量C06和G11抗体之组合物的细胞，在10和1nM浓度时对生长的抑制作用与单独使用1种抗体时相比显著增强(图38)。这些结果在实验中被进一步证实，其中在宽范围的抗体浓度下(1mM至0.15nm)对C06和G11的组合物进行检测。图39显示，在500nM和5nM之间，含有等摩尔量C06和G11抗体的组合物与在相同的相应抗体浓度下单独使用1种抗体相比，其导致对细胞生长的抑制作用显著增强。
[1874] 为了表明在胰腺癌肿瘤细胞系(BxPC3)中所观察到的抑制作用也适用于其他肿瘤类型中，还在非小细胞肺癌来源的H322M细胞系中对C06和G11进行了评估。图40示出在标准细胞培养条件下和存在10％胎牛血清时生长的H322M中所观察到的影响的示例，其中与单独使用1种抗体相比，C06/G11抗体组合物导致对细胞生长的抑制作用明显较强。
[1875] 实施例34
[1876] M13-C06(人IgG4Pagly抗-IGF-1R抗体)增强了埃罗替尼在NSCLC、胰腺癌和结肠癌细胞系中的抗肿瘤生长活性
[1877] 小分子EGFR抑制剂TARCEVA (Genentech Inc.，SanFrancisco，CA & OSIPharmaceuticals Inc.，Melville，NY)(a.k.a.，埃罗替尼)被批准用于治疗具有非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌的癌症患者。
[1878] 埃罗替尼：
[1879] 化学名：N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺；化学式：C22H23N3O4
[1880] 化学结构：
[1881]
[1882] M13-C06(人IgG4Pagly抗-IGF-1R抗体)目前处于针对多种实体瘤的临床开发。我们评价了抗-IGF-1R M13-C06与埃罗替尼(American Custom Chemicals Corp.，目录号
183319-69-9(San Diego，CA))组合对一组NSCLC、胰腺癌和结肠癌细胞系的生长(增殖)的影响。细胞以每孔5000个细胞铺板在96孔组织培养板中的RPMI-1640(含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone目录号Sh30071.03))，然后用M13-C06或埃罗替尼作为单剂或组合治疗，M13-C06或埃罗替尼以1∶3系列稀释，起始浓度分别为200nM和20μM。五天后，通TM
过用Promega(目录号G7571(Madison，WI))的CELL TITER GLO 试剂根据生产商的方案测量ATP水平来测定细胞存活力(参见CELL TITER-GLOTM Luminescent Cell Viability测定)。结果表明，仅几种测试的细胞系对亚微摩尔浓度的单剂埃罗替尼诱导的细胞生长抑制敏感，而M13-C06以纳摩尔浓度抑制了几种肿瘤细胞系的生长，当组合使用时还增加了一些细胞系对埃罗替尼的敏感性。如图41A和41B所示，埃罗替尼作为单剂仅明显抑制了H322M和H1650细胞系(测试了7种NSCLC细胞系)的生长。相反，与埃罗替尼组合的
M13-C06增强了埃罗替尼在几种细胞系中的抑制作用，最显著的是A549，否则A549对作为单剂的埃罗替尼中度响应。M13-C06还增加了胰腺细胞系BxPC3和SU86.86对埃罗替尼的敏感性，但对MiaPaca2、Panc-1或Capan-2细胞没有太多作用(图42)。如图43所示，5种结肠癌细胞系都不显示响应于埃罗替尼的明显生长抑制，但M13-C06在Colo205、WiDr和HT-29细胞中表现出单剂活性。我们的数据表明，EGFR抑制剂TARCEVA 和抗-IGF-1R抗体M13-C06的组合可以提供在治疗NSCLC和胰腺肿瘤的一组患者中的治疗优势。
[1883] 实施例35
[1884] M13-C06和埃罗替尼的组合导致AKT存活和MAPK增殖信号传导途径的有效抑制[1885] 我们要确定组合埃罗替尼和M13-C06在NSCLC细胞系中观察到的提高的抗肿瘤作用的潜在分子机制。在用埃罗替尼和M13-C06单剂或组合治疗后评价了AKT和MAPK活化状态，因为AKT和MAPK是IGF-1R和EGFR的常见的下游信号传导靶。肿瘤细胞系以每孔6
1.2x10 铺板在6孔板上的RPMI+10％FBS培养基中，并被允许附着过夜。第二天，培养基被从孔去除并用与培养基(单剂对照)或培养基中10μM埃罗替尼组合的100nM M13-C06或IDEC151(人IgG4同型对照抗体)替换。测定板在37℃，5％CO2加湿孵育器中孵育3小时，并在细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology，目录号9803(Danvers，MA USA))中提取细胞蛋白。使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，目录号23227(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL))测量溶解产物中的蛋白浓度，等量蛋白在NUPAGE 4-12％Tris-Bis凝胶上运行并转移至硝化纤维膜(0.45μm孔)。通过用对二氧磷基-AKT、总AKT、二氧磷基-MAPK或总MAPK特异性的抗体(Cell Signaling Technology，目录号9271，9272，9101，
9102)处理、随后用抗-兔-IgG-HRP(Southern Biotech.目录号4050-05)处理来检测磷酸化。印迹用Supersignal Western Substrate Kit(Pierce，目录号34095)显色，并在BioRad Max2成像仪上捕获化学发光图像。如图44所示，埃罗替尼在H322M细胞中完全消除了可检测的MAPK磷酸化，在A549细胞中产生了对MAPK磷酸化的部分抑制，并且在H1299和NCI-H23细胞中产生很少作用。M13-C06在所有四种测试的细胞系中对AKT磷酸化具有强抑制作用，并且对MAPK磷酸化具有很少作用。当组合时，M13-C06和埃罗替尼显示对AKT和MAPK磷酸化累加的抑制作用。一般而言，M13-C06和埃罗替尼对下游信号传导分子AKT和MAPK的作用与其对细胞生长的作用相关，如图41所示。
[1886] 实施例36
[1887] M13-C06增强了埃罗替尼在弥散的A549肺异种移植模型中的抗肿瘤生长活性[1888] 我们开发了弥散的A549肺肿瘤模型以测试M13-C06作为单剂(图45A)或与TARCEVA ( 购自 Pharmaceutical Buyers International，NY.，NDC# 50242-063-01；
药物级埃罗替尼；OSI/Genentech Inc.生产)组合的抗肿瘤活性。静脉内孵育A549细
6
胞(1x10)后3天，SCID小鼠(n＝10)组用M13-C06或IDEC-151(同种型匹配的对照
抗体)或TARCEVA 或组合(M13-C06+TARCEVA )治疗。M13-C06(15或7.5mg/kg)和
IDEC-151(15mg/kg)每周一次I.P.注射，持续4周。TARCEVA 以每天50mg/kg给予22天。
在第30天收集肺并称重以评估肿瘤负荷。百分比(％)肿瘤负荷通过用平均正常肺重量减去治疗的肺的重量来计算并表示为肺肿瘤重量的％。如图45A & 46B所示，M13-C06作为单剂减少了肺肿瘤负荷。然而，M13-C06和TARCEVA 组合完全消除了肺肿瘤生长(图
45B)。
[1889] 实施例37
[1890] M13-C06增强了雷帕霉素在NSCLC、胰腺、结肠癌和肉瘤细胞系中的抗肿瘤生长活性
[1891] 雷帕霉素抑制mTOR(AKT存活途径中的一种关键信号传导分子)，从而抑制细胞生长。坦西莫司，一种雷帕霉素衍生物，已经被批准用于治疗肾癌患者，而几种其他药物正在临床试验用于多种肿瘤类型，包括肉瘤。我们已经检验了M13-C06对用雷帕霉素治疗的肿瘤细胞的细胞生长的作用。
[1892] 坦西莫司：
[1893] 化学名：
[1894] (3S，6R，7E，9R，10R，12R，14S，15E，17E，19E，21S，23S，26R，27R，34aS)-9，10，12，13，14，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十六氢-9，27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S，
3R，4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲3H-吡啶并[2，1-c][1，4]氧氮杂环三十一烷-1，5，11，28，29(4H，6H，31H)-异戊烯炔
4′-[2，2-二(羟基甲基)丙酸酯]；或雷帕霉素，42-[3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸酯]。
[1895] 化学式：C56H87NO16
[1896] 化学结构：
[1897]
[1898] 雷帕霉素：
[1899] 化学名：(16Z，24Z，26Z，28Z)-1，18-二羟基-12-[1-(4-羟基-3-甲氧基环己基)丙-2-基]-19-甲氧基-15，17，21，23，29，35-六甲基-30-(5-甲基噻吩-2-基)-11，36-二氧-4-氮杂三环[30.3.1.0^{4，9}]三十六烷-16，24，26，28-四烯-2，3，10，14，20-异戊烯炔。
[1900] 化学式：C51H79NO13
[1901] 化学结构：
[1902]
[1903] 为了细胞生长测定，细胞以每孔5000个细胞铺板于96孔组织培养板中含有10％胎牛血清的RPMI-1640(对于大多数细胞系)或McCoy′s 5A加15％FBS(对于肉瘤细胞系)中。细胞用M13-C06和雷帕霉素(American Custom Chemicals Corp.目录号
53123-88-9)作为单剂或组合治疗三天或五天，M13-C06和雷帕霉素以1∶3系列稀释，M13-C06的起始浓度是200nM，而雷帕霉素的起始浓度是100nM或1μM。通过用CELL TITER GLOTM试剂测量ATP水平来测定细胞存活力。图46A和46B示例说明M13-C06和雷帕霉
素组合对7种NSCLC细胞系的作用，结果表明M13-C06显著增强雷帕霉素对A549、H322M、H23和H1299细胞的抗肿瘤活性。M13-C06和雷帕霉素对胰腺癌细胞系的作用表现为累加的(图47)，BxPC3是最敏感的细胞系。图48显示大多数测试的结肠癌细胞系对雷帕霉素响应不良，而M13-C06似乎增强了雷帕霉素对WiDr和HT-29细胞的作用。在四种肉瘤细胞系的研究中，组合的M13-C06和雷帕霉素表现出比单独使用的任一单剂更高的抗肿瘤活性(图49)。有趣的是，SJSA-1细胞对单独的M13-C06或雷帕霉素不响应，但是生长被这两种药物的组合所抑制。
[1904] 实施例38
[1905] M13-C06抑制雷帕霉素诱导的AKT活化
[1906] 已经报道，mTOR的雷帕霉素抑制通过S6K(S6激酶)和IGF-1R/IRS-1(胰岛素受体底物-1)依赖性反馈回路诱导AKT活化(O’Reilly等，Cancer Research，66卷，p.1500-1508(2006))。因此，我们检验了M13-C06和雷帕霉素在选定的肉瘤和肺肿瘤细胞系中对AKT和S6K信号传导的作用，其中M13-C06增强了雷帕霉素的抗肿瘤活性。细胞以每孔6x105铺板于12孔板中的McCoy′s 5A培养基加15％FBS(对于肉瘤)和RPMI-1640
加10％FBS(对于NSCLC细胞系)，并被允许附着过夜。第二天，培养基被从孔去除并用与培养基(单剂对照)或培养基中100nM雷帕霉素组合的100nMM13-C06或IDEC151替换。测
定板在37℃，5％CO2加湿孵育器中孵育3小时，细胞在Cell Signaling裂解缓冲液(Cell Signal Technologies，#9803)中裂解，溶解产物通过蛋白浓度标准化并在NUPAGE 4-12％Tris-Bis凝胶上运行并转移至硝化纤维膜。通过用对二氧磷基-AKT、AKT二氧磷基-S6K或总S6K特异性的抗体(Cell Signaling Technology，目录号2215，2217)处理、随后用抗-兔-IgG-HRP(Cell Signaling Technology，目录号7071)处理来检测AKT和S6K的磷酸化状态。印迹用Supersignal Western Substrate Kit(Pierce，目录号34095)显色，并在BioRad Max2成像仪上捕获化学发光图像。如图50和51所示，雷帕霉素如所预期的抑制了S6K的磷酸化，同时其在所有测试的细胞系中诱导了AKT磷酸化。诱导的AKT磷酸化被M13-C06有效阻断，而不被同种型匹配的对照抗体IDEC151有效阻断。因此，M13-C06对雷帕霉素-诱导的AKT活化的抑制作用与使用M13-C06/雷帕霉素组合中观察到的增强的抗肿瘤活性良好相关。
[1907] 实施例39
[1908] M13-C06在SK-ES-1 Ewing’s肉瘤模型表现出抗肿瘤生长活性
[1909] SK-ES-1Ewing’s肉瘤(间变性骨肉瘤)模型用于测试M13-C06作为单剂的抗肿6 TM
瘤活性。裸小鼠(8-10周龄)在肋腹区被皮下接种5x10SK-ES-1细胞(保藏号：HTB-86 ；
美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA)。第21天，具有肿瘤的小鼠被分成组(n
3
＝10)。在治疗开始时组的平均肿瘤体积是150-200mm。小鼠被腹腔内注射M13-C06(15或30mg/kg)或对照抗体(15mg/kg)，一周一次，共3剂。M13-C06以剂量依赖性方式抑制SK-ES-1肉瘤模型中的肿瘤生长(图52)。雷帕霉素衍生物作为mTOR抑制剂的使用目前处在临床试验用于治疗肉瘤患者。因此，IGF-1R抗体，例如M13-C06与mTOR抑制剂组合使用应该在治疗过度增殖病症(例如肉瘤)中是治疗上有用的。
[1910] 实施例40
[1911] M13-C06增强了PD0325901在NSCLC、胰腺癌和结肠癌细胞系中的抗肿瘤生长活性[1912] PD0325901是IGF-1R下游的MAPK增殖途径中的信号传导分子MEK的小分子抑制剂。连同其他MEK抑制剂，PD0325901处于针对各种肿瘤类型的临床试验，并已经显示临床活性。我们合成并测试了PD0325901与M13-C06组合对各种肿瘤细胞系生长的作用。
[1913] PD0325901：
[1914] 化学名：(R)-N-(2，3-二羟基丙氧基)-3，4-二氟-2-(2-氟-4-碘代苯基氨基)苯酰胺.
[1915] 化学式：C16H14F3IN2O4
[1916] 化学结构：
[1917]
[1918] 细胞以5000细胞/孔铺板于96孔组织培养板中含有10％胎牛血清的RPMI-1640，然后用M13-C06和PD0325901作为单剂或组合治疗，M13-C06和PD0325901以1∶3系列稀释，M13-C06的起始浓度是200nM，而PD0325901的起始浓度是10μM。通过用Promega的CELL TITER GLOTM试剂测量ATP水平来测定细胞存活力。在测试的7种NSCLC细胞系中，其中五种细胞系对PD0325901抑制敏感，而在其中4种细胞系中M13-C06提高了PD0325901的效力(图53A和53B)。H460和H1650显示了较小的对PD325901的响应。然而，值得注意的是，M13-C06大大增强了PD0325901的效力以及H460细胞中最大生长抑制程度。
[1919] 图54示例说明了4种测试的胰腺细胞系的结果，BxPC3和Panc-1显示了对PD0325901的中度响应，而组合的M13-C06和PD0325901显示累加效应；相反，MiaPaCa2和Su86.86对作为单剂的PD0325901敏感，而添加M13-C06具有很小作用。
[1920] 测试了五种结肠癌细胞系，其中M13-C06仅在HT-29细胞中适度增强了PD0325901的生长抑制活性(图55)。我们目前正研究在所选细胞系中观察到的PD0325901和M13-C06组合的增强抗肿瘤活性的潜在分子机制。
[1921] 实施例41
[1922] M13-C06增强了NSCLC和胰腺癌细胞系中PI-103的抗肿瘤生长活性
[1923] IGF-1R活化诱导了PI3K/AKT存活途径。我们评估了M13-C06增强PI3K/AKT途径抑制剂的生长抑制作用的能力，使用具有针对PI-3K和mTOR的双重抑制活性的小分子PI-103。
[1924] PI-103：
[1925] 化学名：3-[4-(4-吗啉基)吡啶并[3′，2′：4，5]氟[3，2-d]嘧啶-2-基]-苯酚.
[1926] 化学式：C19H16N4O3
[1927] 化学结构：
[1928]
[1929] 细胞以5000细胞/孔铺板于96孔组织培养板中含有10％胎牛血清的细胞培养基中，然后用M13-C06或PI-103(American Custom Chemicals Corp.目录号371935-74-9)作为单剂或组合治疗，M13-C06或PI-103以1∶3系列稀释，起始浓度分别是200nM和10μM。通过用Promega的CELL TITER GLOTM试剂测量ATP水平来测定细胞存活力。如图56A和
56B所示，在大多数测试的细胞系(A549，H322M，H1299，H23和H460)中，M13-C06提高了PI-103的效力。在四种胰腺癌细胞系中，M13-C06增强了Panc-1和Su86.86对PI-103抑制的敏感性(图57)。没有一种结肠癌细胞系表现出对PI-103抑制敏感，尽管M13-C06对HT-29和WiDr表现出单剂活性的事实(图58)。
[1930] 实施例42
[1931] M13-C06增强了索拉非尼在HCC细胞中的抗肿瘤生长活性
[1932] 甲苯磺酸索拉非尼(″索拉非尼″)是多种激酶的小分子抑制剂，包括Raf、VEGFR和PDGFR。索拉非尼已经被批准用于治疗具有晚期肝细胞癌(HCC)的患者。IGF-1R信号传导已经参与HCC的发展并且是HCC的潜在治疗靶。我们评价了M13-C06抗体增强索拉非尼在两种HCC细胞系中生长抑制作用的能力。HepG2和Sk-Hep-1细胞以5000细胞/孔铺板于96孔组织培养板中含有10％胎牛血清的细胞培养基中，然后用M13-C06或甲苯磺酸索拉非尼(American Custom Chemicals Corp.目录号475207-59-1)作为单剂或组合治疗，M13-C06或甲苯磺酸索拉非尼以1∶3系列稀释，起始浓度分别是200nM和10μM。三天后，通过用Promega的CELL TITER GLO 试剂测量ATP水平来测定细胞存活力。如图59中所示，M13-C06抗体在HepG2细胞中显示单剂活性并增强了索拉非尼的效力，而在Sk-Hep-1细胞中没有。所观察到的与抗-IGF-1R抗体(例如M13-C06)组合的抗癌剂(例如索拉非尼)的增强作用提供了使用此类联合治疗增强体内抗肿瘤效力的预期。
[1933] 甲苯磺酸索拉非尼：
[1934] 化学名：4-(4-{3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]脲基}苯氧基)N2-甲基吡啶-2-甲酰胺4-甲基苯磺酸酯
[1935] 化学式：C21H16ClF3N4O3·C7H8SO3
[1936] 化学结构：
[1937]
[1938] 参考文献：
[1939] Brezinsky，S.C.G.，Chiang，G.G.，Szilvasi，A.，Mohan，S.，Shapiro，R.I.，MacLean，A.，Sisk，W.，and Thill，G.(2003). ″ A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specificproductivity.″J.Immunol.Methods 277：141-155.
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