首页 / 国际专利分类库 / 化学;冶金 / C07有机化学 / 甾族化合物 / 正系甾族化合物,不属于C07J1/00至C07J43/00组的具有未变型环戊烷并[a]氢化菲骨架的 / 固醇修饰的两亲脂质

固醇修饰的两亲脂质
申请号 CN200880125025.7 申请日 2008-11-10 公开(公告)号 CN101909581A 公开(公告)日 2010-12-08
申请人 加利福尼亚大学董事会; 发明人 F·C·小斯佐卡; 黄兆华;
摘要 公开了具有两个或更多个疏 水 性尾部的固醇修饰两亲脂质化合物，所述尾部中至少一个是固醇。还公开了合成这些化合物的方法、包含这种化合物的组合物和这种化合物在递送感兴趣 试剂 ，例如 治疗 剂、 显像剂 、用于超声应用的造影物质、 疫苗 、 生物 传感器 、营养添加剂和 皮肤 护理产品中的应用。
权利要求

1.一种包含固醇修饰的两亲脂质(SML)的化合物，所述固醇修饰的两亲脂质具有亲水性首基和两个或更多个疏水性尾基，其中所述疏水性尾基中的至少一个包含固醇。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述首基包含磷酸根。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述亲水性首基选自下组：磷酸根、磷酸胆碱、磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷酸肌醇和乙基磷酰胆碱。
4.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，所述磷酸乙醇胺首基选自下组：磷酸乙醇胺-N-[单甲氧基聚乙二醇]2000和磷酸乙醇胺-N-琥珀酰-N-三-次氨基乙酸。
5.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述固醇选自下组：动物固醇和植物固醇。
6.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述固醇选自下组：胆固醇、类固醇激素、油菜固醇、谷固醇、麦角固醇和豆固醇。
7.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述疏水性尾基中的至少一个包含非-固醇。
8.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，所述非-固醇疏水性尾部包含饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的脂族烃。
9.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述SML选自下组：单固醇修饰的两亲脂质和双固醇修饰的两亲脂质。
10.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述SML选自下组：固醇修饰的甘油磷脂、固醇修饰的神经鞘氨醇磷脂、固醇修饰的肉碱脂质和固醇修饰的氨基酸脂质。
11.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述亲水性首基选自下组：氨基酸、活化的官能团、三聚氰胺、葡糖胺、多胺、羧酸根(COO-)、硫酸根(SO4-)、磺酸根(SO3-)、分支聚乙二醇、聚甘油、三-次氨基乙酸和碳水化合物。
12.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述疏水性尾基之一是前药。
13.一种选自下组的固醇修饰的两亲脂质：SML1a、SML1b、SML1c、SML2a、SML2b、SML2c、SML2d、SML3a、SML3b、SML3c、SML3d、SML4a、SML4b、SML4c、SML4d、SML5a、SML5b、SML5c、SML5d、SML6a、SML6b、SML6c、SML6d、SML7a、SML7b、SML8a、SML8b、SML8c、SML8d、SML8e、SML8f、SML9a、SML9b、SML9c、SML10a、SML10b、SML10c、SML10d、SML10e、SML10f、SML11a、SML11b、SML11c、SML11d、SML11e、SML11f、SML12a、SML12b、SML12c、SML12d、SML12e、SML12f、SML13a、SML13b、SML13c、SML13d、SML13e、SML13f、SML13g、SML13h、SML13i、SML13j、SML13k、SML14a、SML14b、SML14c、SML14d、SML14e、SML14f、SML15a、SML15b、SML15c、SML15d、SML15e、SML15f、SML15g、SML15h、SML15i、SML15j、SML15k、SML16a、SML16b、SML16c、SML16d、SML16e、SML16f、SML16g、SML16h、SML16i、SML16j、SML16k、SML16l和SML16m以及它们的衍生物。
14.一种包含权利要求1所述固醇修饰的两亲脂质(SML)的组合物。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述SML是固醇修饰的两亲磷脂(SPL)。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含治疗剂、美容剂和可检测标记物中的至少一种。
17.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含非固醇两亲脂质，其中所述非固醇两亲脂质包含饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的脂族烃。
18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述SPL和非固醇两亲脂质包含长度大致相同的疏水性尾基。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述SPL是单固醇修饰的两亲磷脂，所述非固醇两亲脂质是二酰基磷脂，各自具有链长约6-24个碳的非固醇疏水性尾部。
20.一种合成固醇修饰的两亲脂质的方法，该方法包括：
将至少一个固醇尾基经分支核心偶联于亲水性首基，从而产生具有与两个或更多个疏水性尾基相连的亲水性首基的固醇修饰的两亲脂质，其中至少一个所述疏水性尾基包含所述固醇尾基。
21.一种产生包含固醇修饰的两亲脂质的组合物的方法，该方法包括：
将固醇修饰的两亲脂质与非固醇两亲脂质、治疗剂、美容剂、可检测标记物、缓冲剂、溶剂和赋形剂中的至少一种混合。
22.一种将包含固醇修饰的两亲脂质的组合物给予动物或细胞的方法，该方法包括使所述动物或细胞与权利要求14所述的组合物接触。
23.一种检测流体中某分析物存在与否的方法，该方法包括：
使该流体与权利要求14所述的组合物接触，和；
检测该脂质组合物或流体的可检测特性中的至少一种改变。
说明书全文

技术领域

本发明涉及两亲脂质化合物以及组合物和用法。

背景

真核生物膜具有双层结构，主要由磷脂、鞘脂和胆固醇构成。在这些化合物中，胆固醇或胆固醇样固醇是真核生物膜中最丰富的单一化学物质。因此，了解胆固醇在生物膜中的特性和功能以及胆固醇在某些疾病中的作用极其令人感兴趣。

可从磷脂鞘脂和其它两亲合成脂质制备人工囊泡。称为脂质体的这些人工囊泡已用于多种领域，例如双层膜的模型和药物递送载体。

游离胆固醇广泛用作脂质体组合物中的组分。当脂质混合物中游离胆固醇大于约30摩尔％时，其有助于脂质体双层稳定。这种含游离胆固醇的脂质体用于药物递送领域、显像剂和生物物理研究中。游离胆固醇和合成磷脂的混合物的特性是良好表征的。对于含有游离胆固醇和磷脂的双组分混合物，胆固醇的摩尔百分比加上磷脂的摩尔百分比等100摩尔百分比。发现可包含在这种脂质混合物中的胆固醇的最大摩尔百分比约为50摩尔百分比。在含有合成磷脂的组合物中包含高摩尔百分比的游离胆固醇(大于30摩尔％)会除去二酰基磷脂转移的可测热量并消除从合成磷脂形成脂质体时观察到的可检测相变。含有高摩尔百分比的游离胆固醇的脂质体相比于不含游离胆固醇的那些通常更稳定且不易渗漏，其广泛用于化疗药物制剂中。

然而，当游离胆固醇和磷脂构成的脂质体置于含有其它生物脂质和血清的生物流体中时，游离胆固醇从脂质体中快速移出进入生物脂质。脂质体的这种游离胆固醇丧失通常导致脂双层稳定性降低，随后脂质体中包封的内含物丧失。游离胆固醇从脂质体移出到过量的不含胆固醇的脂质的半存留期是约2小时。此外，由于血清脂蛋白对游离胆固醇有吸附作用，游离胆固醇从脂质体转移至蛋白质，因此血清的存在会显著增加脂质体的渗漏。游离胆固醇与其它两亲脂质组分物理混合的常规脂质体制剂未能满意地解决游离胆固醇从脂质体快速转移至生物膜相关的该渗漏问题。

因此，需要开发可用于在体外和体内形成稳定脂质体的脂质。所需分子不仅应能将足够量的固醇掺入制剂以提供稳定作用，还能在接触生物流体时将固醇维持在制剂中。

使用水溶性固醇衍生物已见诸描述。已将各种亲水性基团连接于固醇从而制备水溶性固醇衍生物，例如固醇-半琥珀酸酯、固醇-磷酸胆碱、固醇-聚乙二醇和固醇-磷酸酯。由于这些分子只有一个固醇作为疏水性部分并且亲水性首基相对较大，它们本身易形成胶束并从脂质体双层快速转移至生物流体。因此，这种水溶性固醇不是稳定脂质体制剂的合适组分。

疏水性固醇是另一类已知的固醇衍生物，其中脂肪酸酯或烷基醚连接于固醇。虽这些分子因脂族链而有助于将固醇维持在脂质体双层中，但只有少量摩尔百分比(低于15％)可掺入制剂。当游离胆固醇的百分比高于约15摩尔％时，胆固醇酯相分成不掺入双层的不同相。因此，这种疏水性固醇不能将足够摩尔百分比的固醇引入脂质组合物以消除相变并稳定脂质体双层。

本发明提供可解决这些问题的化合物，还提供具有所需物理特性的脂质体。

文献

固醇、脂质和递送制剂通常总结于：Fahy等，J.Lipid Research(2005)46：839-861；Felgner，1990，Advanced Drug Delivery Reviews，5：162-187；和Felgner 1993，J.Liposome Res.，3：3-16。

脂质化合物和含有胆固醇的组合物公开于以下文献，例如：Brockerhoff等，Biochim.Biophys.Acta 1982，691：227-232；Demel等，Biochim.Biophys.Acta 1984，771：142-150；Patel等，Biochim.Biophys.Acta 1984，797：20-26；Lai等，Biochemistry 1985，24：1646-1653；Epand等，Chem.Phys.Lipids 1990，55：49-53；Gotoh等，Chem.Biodivers.2006，3：198-209；Torchilin，V.P.，Nat.Rev.Drug Discov.2005，4：145-60；Phillips等，Biochim.Biophys.Acta 1987，906：223-76；Hamilton，J.A.，Curr.Opin.Lipidol.2003，14：263-271；Kan等，Biochemistry 1992，31：1866-74；Urata等，Eur.J.Lipid Sci.Tech.2001，103：29-39；Salunke等，Curr.Med.Chem.2006，13：813-47；Guo等，Acc.Chem.Res.2003，36：335-341；Bhattacharya等，Curr.Opin.Chem.Biol.2005，9：647-55；和Huang等，刊于Liposome technology(脂质体技术)第3版，Gregoriadis，G.编，Informa Healthcare：纽约，2007，第1卷，第165-196页。例如，Bhattacharya等(Curr.Opin.Chem.Biol.2005，9：647-55)总结了脂质设计和它们在各种生物化学、物理学和化学领域的应用。

由于递送核酸的脂质化合物和组合物公开于以下专利文件，例如：US4,493,832；US 4,897,355；US 5,651,981；US 5,661,018；US 5,686,620；US5,688,958；US 5,780,053；US 5,855,910；US 5,891,714；US 6,627,218；Lewis等，美国专利申请公布号20030125281；MacLachlan PCT公布号WO/2003/077829；MacLachlan，PCT公布号WO 05/007196；Vargeese等，PCT公布号WO2005007854；McSwiggen等，PCT公布号WO 05/019453、WO03/70918、WO 03/74654和美国专利申请公布号20050020525及20050032733；和Chen等，PCT公布号WO/2007/086883。例如，Chen等(PCT公布号WO/2007/086883)公开了阳离子脂质、微粒、纳米颗粒和转染或递送短干扰核酸(siNA)的转染试剂。

概述

本发明总体上涉及固醇修饰的两亲脂质化合物。还提供了合成这些化合物的方法、包含这种化合物的组合物和这种化合物在递送感兴趣药剂，例如治疗剂、疫苗、显像剂、超声领域的造影剂、生物传感器、营养添加剂、皮肤护理产品和化妆品中的应用。

本发明的固醇修饰两亲脂质化合物包含亲水性首基和两个或更多个疏水性尾基(tail group)，其中至少一个疏水性尾基包含固醇。

本发明的化合物和组合物可适用于各种药学、美容和医学领域以及可利用脂质系统的各种工业和商业领域。例如，本发明化合物可用于，例如稳定双层、单层、立方体相(cubic phase)、六角相(hexagonal phase)、油和水乳液(水包油或油包水乳液)、凝胶、泡沫、洗液和乳膏。

因此，本发明一方面提供包含固醇修饰的两亲脂质的化合物，所述脂质具有亲水性首基和两个或更多个疏水性尾基，其中至少一个疏水性尾基包含固醇。在一个实施方式中，固醇选自动物固醇和植物固醇。在相关实施方式中，固醇选自胆固醇、类固醇激素、油菜固醇、谷固醇、麦角固醇和豆固醇。

在还要进一步的实施方式中，亲水性首基选自待电荷的、极性的以及带电荷的和极性首基的组合。在相关实施方式中，亲水性首基选自磷酸根、磷酸胆碱、磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷酸肌醇、乙基磷酰胆碱(ethylphosphosphorylcholine)、聚乙二醇、聚甘油、三聚氰胺、葡糖胺、三甲胺、多胺、羟基(OH)、羧酸根(COO-)、硫酸根(SO4-)、磺酸根(SO3-)和碳水化合物。

在进一步的实施方式中，至少一个亲水性尾基包含非固醇。在相关的实施方式中，所述非固醇是饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的脂族烃。在进一步的相关实施方式中，所述非固醇部分是基于饱和脂族烃链，例如含烷基的饱和链的取代烃链。在进一步的相关实施方式中，亚烷基的1、2、3、4或更多个碳原子(通常不超过约10个碳原子)被选自氧、硅、硫或氮原子的杂原子取代，和/或亚烷基的1、2、3、4或更多个氢原子(通常不超过氢原子的总数)被氟取代。

在进一步的实施方式中，固醇修饰的两亲脂质选自单固醇修饰的两亲脂质和双固醇修饰的两亲脂质。在相关的实施方式中，所述双固醇修饰的两亲脂质包含相同的固醇疏水性尾部。在进一步的实施方式中，所述固醇修饰的两亲脂质选自甘油磷脂、神经鞘氨醇磷脂、肉碱脂质、和氨基酸脂质。

在还要进一步的实施方式中，亲水性首基和疏水性尾基通过1，2-二羟基，3-氨基丙烷相连。

在一个实施方式中，疏水性尾基之一是前药，例如视黄酸。

本发明在其它方面提供含有固醇修饰的两亲脂质的组合物，所述脂质具有亲水性首基和两个或更多个疏水性尾基，其中至少一个疏水性尾基包含固醇。在相关的实施方式中，固醇修饰的两亲脂质选自单固醇修饰的两亲脂质和双固醇修饰的两亲脂质。在进一步的实施方式中，固醇修饰的两亲脂质选自胆固醇、类固醇激素、油菜固醇、谷固醇、麦角固醇和豆固醇。

在相关实施方式中，组合物是乳液。在进一步相关的实施方式中，组合物是任选包含有效负载(payload)的脂质体。在脂质体包含有效负载的实施方式中，所述有效负载包含治疗剂、化妆品和可检测标记物中的至少一种。在进一步的实施方式中，所述脂质体包含非固醇两亲脂质。在相关的实施方式中，所述脂质体包含一种或多种赋形剂，可作为药物制品或化妆制品提供。

在进一步的实施方式中，固醇修饰的两亲脂质包含治疗剂，所述固醇修饰的两亲脂质可以在脂质体中提供。

在还要进一步的实施方式中，非固醇两亲脂质选自饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的脂族烃。在进一步的实施方式中，固醇修饰的两亲脂质和非固醇两亲脂质包含长度大致相同的疏水性尾基。在一些实施方式中，组合物中的固醇修饰的两亲脂质是单固醇修饰的两亲脂质。

在其它方面，本发明提供合成固醇修饰的两亲脂质的方法，该方法包括将至少一个固醇尾基经分支核心(branching core)偶联于亲水性首基，从而产生其中亲水性首基与两个或更多个疏水性尾基相连的固醇修饰的两亲脂质，其中至少一个所述疏水性尾基包含固醇尾基。

在其它方面，本发明提供产生包含固醇修饰的两亲脂质的组合物的方法，该方法包括将固醇修饰的两亲脂质与非固醇两亲脂质、治疗剂、化妆品、可检测标记物、缓冲剂、溶剂和赋形剂中的至少一种混合。在相关的实施方式中，所述方法还包括纯化该组合物。

在还有其它方面，本发明提供将包含固醇修饰的两亲脂质的组合物给予动物的方法，该方法包括使所述动物与本发明的固醇修饰脂质组合物接触。

在其它方面，本发明提供将包含固醇修饰的两亲脂质的组合物给予细胞的方法，该方法包括使所述细胞与本发明的固醇修饰脂质组合物接触。

在还有其它方面，本发明提供检测流体中某分析物存在与否的方法，包括使该流体与本发明的含固醇修饰脂质的组合物接触，并检测该脂质组合物或流体的可检测特性的至少一种改变。在相关实施方式中，所述流体是生物学流体。在进一步相关的实施方式中，通过评估脂质组合物的特性进行检测。

阅读本文内容后不难理解本发明的其它方面和实施方式。

附图简述

结合附图阅读以下详述可更好地理解本发明。附图包括以下：

图1是SChcPC和DSPC的混合物的示差扫描量热法(DSC)热分析图。

图2显示了含各种百分比的胆固醇的固醇修饰两亲脂质(“SML”)/二酰基脂质混合物的转换温度和焓。在图2所示结果中，SML与相同链长的二酰基脂质混合。

图3显示渗透应力诱导渗漏的分析结果。在不同渗透压力下检测脂质体中释放的钙黄绿素。计算维持在脂质体中的钙黄绿素的分数，并对渗透梯度作图。数据的误差在0.5％以内。

图4显示脂质体组合物在磷酸缓冲盐水配制的30体积％胎牛血清中的渗漏分析结果。通过检测不同温育时间下荧光强度自起始荧光强度的改变来监测37℃，30体积％胎牛血清中钙黄绿素从脂质体中的释放。计算维持在脂质体中的钙黄绿素的分数，并对温育时间作图。对照制剂中有40％的胆固醇(DSPC/胆固醇和DMPC/胆固醇)。

图5显示37℃，胆固醇交换的相对速率的分析结果。

图6显示所选固醇修饰的两亲脂质对C26结肠癌细胞的细胞毒性。

图7显示磷脂酶A2水解固醇修饰的两亲脂质的全反式视黄酸。

图8显示用阿霉素包封SPL脂质体的不同制剂治疗(15mg/kg，静脉内)皮下携带C-26肿瘤的BALB/c小鼠的肿瘤生长曲线，其中F1是SeChcPC/DSPE-PEG2000/α-生育酚，94.8/5.0/0.2；F2是SeChcPC/DSPE-PEG5000/α-生育酚，94.8/5.0/0.2；F3是DChcPC/DSPC/DSPE-PEG2000/α-生育酚，10.6/84.2/5.0/0.2；F4是PChcPC/DSPE-PEG2000/α-生育酚，94.8/5.0/0.2；F5是DCHEMSPC/DSPC/DSPE-PEG2000/α-生育酚，33/61.8/5.0/0.2；和F6是DCHEMSPC/DSPE-PEG2000/α-生育酚，94.8/5.0/0.2。

图9显示用阿霉素包封SPL脂质体的不同制剂治疗(15mg/kg，静脉内)皮下携带C-26肿瘤的BALB/c小鼠的肿瘤生长曲线，其中F1是SeChcPC/DSPE-PEG2000/α-生育酚，94.8/5.0/0.2；F2是SeChcPC/DSPE-PEG5000/α-生育酚，94.8/5.0/0.2；F3是DChcPC/DSPC/DSPE-PEG2000/α-生育酚，10.6/84.2/5.0/0.2；F4是PChcPC/DSPE-PEG2000/α-生育酚，94.8/5.0/0.2；F5是DCHEMSPC/DSPC/DSPE-PEG2000/α-生育酚，33/61.8/5.0/0.2；和F6是DCHEMSPC/DSPE-PEG2000/α-生育酚，94.8/5.0/0.2。

图10是DChcPC/DPPC混合物的示差扫描量热法(DSC)热分析图。

图11显示利用还原敏感性SML脂质顺序装配纳米脂颗粒。首先，通过透析方法将DNA包封入纳米大小的阳离子脂质体。然后，通过与还原剂HSR’的二硫键交换修饰颗粒表面。最后，通过胶束转移方法或二硫键交换将靶向配体掺入颗粒表面上。SML-SSR：在首基(R)中具有二硫键(SS)的阳离子固醇修饰脂质；SML-SSR’：首基交换的固醇修饰两亲脂质。

图12显示脂质体组合物在HEPES缓冲盐水配制的30体积％胎牛血清中的渗漏分析结果。通过检测不同温育时间下荧光强度自起始荧光强度的改变来监测37℃，30体积％胎牛血清中5-羧基荧光素(CF)从脂质体中的释放。计算28天时从脂质体中释放的CF百分比，并对脂质体制剂中烷基链长度作图。

图13显示37℃，CF从包含二酰基/SML6b的脂质体在HEPES缓冲盐水配制的30体积％胎牛血清中释放的特征。标记表示脂质体中所用二酰基脂质的链长度。

详述

在描述本发明的示范性实施方式之前，应该知道本发明不限于所述的具体实施方式，因为这些实施方式当然可以改变。还应该知道本文所用的术语只是出于描述特定实施方式的目的，不应理解成限制性的，因为本发明的范围只受随附权利要求的限制。

应该理解，给出数值范围时，除非文中另有明确说明，还专门公开了该范围上下限之间、以下限单位的十分之一为间隔的各间插数值。所述范围的任何所述值或间插值之间的各较小范围包括在本发明范围内。这些较小范围的上下限可独立地包括或排除在该范围中，上下限中任一、无一或均包括在这些较小范围中的各范围也属于本发明，还可在所述范围中专门排除任何限值。所述范围包含上下限的一个或两个时，排除那些所包括限值中任一个或两个的范围也包括在本发明范围内。

除非另有限定，本文所用的所有科技和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似或等效于本文所述的任何方法和材料可用于实施或检验本发明，但现在描述了一些可能的和示范性的方法和材料。本文所述的任何和所有出版物通过引用纳入本文以便连同所引用的出版物公开和描述方法和/或材料。应该知道如有冲突，以本文内容替换所纳入出版物的任何内容。

必须注意，本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一”、“一种”以及“该”包括复数含义，除非文中明确指定。因此，例如，提到“一种固醇修饰的两亲脂质”包括多种这样的固醇修饰的两亲脂质，提到“该脂质体”包括提及一个或多个脂质体，依此类推。

还应注意，权利要求书可以撰写成排除任何可选元素。因此，本声明旨在将诸如“单独”、“仅仅”等排除性术语与权利要求的引述联用，或采用“负”限制的前提基础。

提供本文所述出版物仅是因为它们在本申请的申请日之前公开。不应理解为承认由于在先发明而使本发明不具资格先于这种出版物。而且，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。

定义

“两亲脂质”指结构上与脂质最相似(疏水性)的分子，但其在一端具有急性、带电荷或急性和带电荷(亲水性)的组合的区域。亲水性区域称为首基，脂质部分称为尾基。两亲脂质的例子包括磷脂、糖脂和鞘脂。

“分析物”指在分析或定量检测过程中测定的物质或化学成分，例如滴定、免疫测定、层析、分光光度法、温度图表法等。分析物本身通常不能检测，但能检测可检测的特性。例如，所检测的典型特性是浓度、光吸收度、分子量、融点、结合特性、生物学活性等等。

“游离的固醇”指未共价结合另一化合物的固醇。因此，“游离胆固醇”指未共价结合于另一化合物的胆固醇。例如，将游离胆固醇加入脂质已用作常规技术来增强脂质体稳定性。因此，“游离胆固醇”尤其指未共价结合作为固醇修饰的两亲脂质化合物中部分的胆固醇。

“药物试剂”指可用于检验、开发或用作药物的试剂，包括营养剂。

“多囊泡脂质体”(MVL)指在各脂质体颗粒中含有多个非同心小室的脂质体，类似于“泡沫样”的基质。

“多层脂质体”(也称为多层囊泡或“MLV”)指在各脂质体颗粒中含有双层构成的多个同心小室的脂质体，类似于“洋葱的诸层”。

“单固醇修饰的两亲脂质”或“m-SML”指结构中只具有一个固醇的SML。

“双固醇修饰的两亲脂质”或“di-SML”指结构中有两个固醇的SML。

“三固醇修饰的两亲脂质”或“tri-SML”指结构中有三个固醇的SML。

“四固醇修饰的两亲脂质”或“tetra-SML”指结构中有四个固醇的SML。

“固醇”或类固醇指具有游离羟基的类固醇或其衍生物的亚组，例如胆固醇及其衍生物类别，以及植物固醇及其衍生物类别和真菌固醇及其衍生物所示例和包括的。固醇可以是天然的或合成的。

本文所用的“固醇修饰的两亲脂质”通常指具有亲水性首基和两个或更多个疏水性尾基的两亲脂质化合物，其中至少一个尾基是固醇。“固醇修饰的两亲磷脂”或“SPL”指包含含磷酸根部分，例如磷酸胆碱或磷酸甘油的固醇修饰两亲脂质。

“治疗剂”指可用于检验、开发或用作治疗试剂的药剂，包括药物试剂。

“显像剂”指可用于在动物中定位脂质颗粒的位置的试剂，包括：光学试剂、超声波造影剂、大质量X-射线造影剂(high mass X-ray contrast agent)、放射性显像剂或核磁显像剂。

“美容试剂”指可用于检验、开发或用作化妆品的试剂。

术语“治疗上可接受的”、“药学上可接受的”和“美容上可接受的”指不是在生物学上或其它方面不良的物质，即，该物质具有可接受的质量，还指组合物，该组合物可连同所选活性成分给予个体而不导致任何不良生物学效应或不会以有害方式与该组合物所含的其它组分相互作用。

术语“乳液”指两种不可互溶(不能掺混的)物质的混合物。

术语“双层”指排列成双分子层的两亲脂质分子(常是磷脂)构成的“夹心样”结构，其中疏水性尾部在内部，而极性首基在外表面上。

术语“单层”指由两亲分子的分子层限定的结构，其中富含的首基基本上排列在一侧，而富含的疏水性基团基本上在相对侧。

本文所用的术语“赋形剂”指为给定的最终应用，例如将感兴趣化合物施加于或给予对象而提供可接受载体的任何合适物质。赋形剂的例子包括称为稀释剂、添加剂、辅助剂和运载体的物质。例如，“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的运载体”和“药学上可接受的辅助剂”包括可用于制备药物组合物的赋形剂、稀释剂、运载体和辅助剂，这些物质通常是安全的、无毒的并且不是生物学或其它方面不良的，包括兽医学应用以及人药用可接受的赋形剂、稀释剂、运载体和辅助剂，可同时包括一种和多于一种的此类赋形剂、稀释剂、运载体和辅助剂。

术语“生理条件”表示包括与活细胞相容的那些条件，例如与活细胞相容的温度、pH、盐度等主要是水性的条件。

术语“治疗组合物”、“药物组合物”、“化妆品组合物”、“治疗制品”、“药物制品”或“美容制品”表示包括适合施加或给予对象，例如哺乳动物，特别是人的组合物。此类组合物总体上是安全的，通常是无菌的，优选不含能引发对象的不良反应的污染物(例如，组合物中的一种或多种化合物对于给定的最终应用是可接受级别的)。可将组合物设计成通过许多不同给药途径施加于或给予有此需要的对象或患者，所述给药途径包括局部、口服、口腔含化、直肠、胃肠外、皮下、静脉内、腹膜内、真皮内、气管内、鞘内、肺部等。在一些实施方式中，该组合物适于通过经皮途径施加或给予。在其它实施方式中，该组合物适于通过经皮给药以外的途径施加或给予。

术语，本发明化合物的“衍生物”包括其盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、缩醛、腙、缩酮、原酸酯、半缩醛、半缩醛、酸、碱、溶剂合物、水合物或前药。本领域技术人员采用已知的这种衍生方法不难制备这类衍生物。

术语，化合物的“盐”表示具有本发明化合物的所需活性的盐。这种盐包括：(1)酸加成盐，用无机酸或有机酸形成，所述无机酸例如有盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸等；所述有机酸例如有乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、1，2，3，4丁烷四羧酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基二-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸等；或(2)当亲代化合物中存在的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子、碱土金属离子或铵离子替代；或与有机碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺、三乙胺等配位而形成的盐。

术语，本发明化合物的“溶剂合物或水合物”表示具有亲代化合物的所需药理学活性的溶剂合物或水合物络合物，包括但不限于本发明化合物与一个或多个溶剂或水分子，或1-约100，或1-约10，或1-约2、3或4个溶剂或水分子的络合物。

术语“保护基团”表示通过化学修饰官能团而引入分子的化学基团以便保护或防护该官能团免受其正常化学反应活性的影响。保护基团以及它们的加入和除去是熟知的(T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)，W-I公司(Wiley-Interscience)，纽约，2005)。除去保护基团产生称为“未保护基团”的原始官能团。

术语“前药”表示但将此类前药给予哺乳动物对象时能在体内释放活性亲代药物的任何化合物。通过修饰化合物中存在的官能团来制备前药，这种方式可在体内切割这些修饰从而释放亲代化合物。前药包括的化合物中羟基、氨基、羧基或巯基分别结合于可在体内切割从而产生游离羟基、氨基、羧基或巯基的任何基团。前药的例子包括但不限于酯、氨基甲酸酯、腙、二硫化物等。

术语“对象”、“宿主”、“患者”和“个体”在本文可互换使用以指需要诊断或治疗的任何哺乳动物对象，特别是人。其它对象可包括牛、狗、猫、豚鼠、家兔、大鼠、小鼠、马、鱼等等。非人动物模型，特别是哺乳动物，例如灵长类、鼠、兔等可用于实验研究。

本文所用的术语“测定”、“检测”和“评估”及“检验”可互换使用，包括定量和定性测定。

在本文中，用于描述两亲脂质化合物的术语如下所示。首先，固醇化合物使用常规名称，例如胆固醇、豆固醇和谷固醇。为便于描述，按照甘油磷脂通用名的类似规则缩写具有甘油作为骨架的固醇修饰两亲脂质。例如，1-胆固醇基羰基-2-棕榈基-甘油-3-磷脂酰胆碱缩写为ChcPePC，其中：1)sn-1/sn-2位置的基团在它们取代位置的序列中以大写缩写表示(例如，“Ch”表示胆固醇，“CHEMS”表示胆固醇基半琥珀酰基(cholesteryl hemisuccinyl)，“P”表示棕榈酰基)；2)按照惯例，利用下标字母或小写字母表示连接类型，例如“c”表示碳酸酯，“e”表示醚，“a”表示氨基甲酸酯，空白(或无小写或下标字母)表示酯；3)按照惯例命名首基，例如“PC”表示磷酸胆碱，“PG”表示磷酸甘油。

引言

本发明提供具有两个或更多个疏水性尾部的两亲脂质化合物(本文称为“固醇修饰的两亲脂质”，缩写为“SML”)，疏水性尾部中至少一个是固醇。本发明还提供制备这种SML化合物的方法和含有它们的组合物。本发明还提供利用SML的方法以及包含一种或多种SML化合物和/或组合物的试剂盒。

本发明的化合物和组合物适用于发现可利用两亲脂质或从中获益的各种领域，例如，两亲脂质本身可用作治疗剂、化妆品和显像剂，从而有助于递送治疗剂、化妆品、可检测标记物和其它感兴趣的试剂以检测分析物、生物传感器等的存在与否。可将SML设计成稳定水包油或油包水乳液以便用于化妆品或营养产品中。还可将SML设计成用作药物或前药，例如下文更详细描述的。

本发明化合物在性质上是两亲的，其可单独或与溶液、乳液中的其它组分形成各种结构，或作为干粉，因此可用于多种应用。例如，SML化合物可形成凝聚物、片层、颗粒、乳液、有结构的相等，还可为这些目的作微调。因此，可将这些化合物制备成包含一种或多种所述结构的组合物，例如制成乳液或脂质体组合物，特别是制成治疗组合物、药物组合物、化妆品组合物和检测组合物。

所述SML化合物和组合物具有独特特性。一种这样的特性是与没有或用游离固醇作为稳定剂的相比，SML能提高各种脂质系统的稳定性。例如，SML在稳定脂质系统以及相应的游离固醇的同时，从脂质系统转移出的SML很少，进而提高了脂质系统在体外和体内的稳定性(例如，对通常会限制标准脂质系统应用的各种生理和其它条件下的解离、降解或渗漏的耐受性提高)。因此，与不用稳定剂或用游离固醇(例如，游离胆固醇)作为稳定剂的常规脂质系统相比，含有一种或多种SML化合物的脂质系统提供的应用更有效。下文进一步讨论了SML的其它优点。

一种优点是SML化合物可单独用作感兴趣的试剂，或者与其它组分联用，例如以递送感兴趣的试剂。例如，SML本身可包含治疗剂、美容或可检测试剂。作为治疗性或美容性SML，SML的亲水性首基和/或一个或多个疏水性尾基可包含治疗剂或美容剂，例如尾基包含固醇，包括类固醇激素或其衍生物，和/或首基包含亲水性试剂，例如肉碱。作为可检测SML，可用可检测标记物标记该化合物，或者如果SML本身形成适合于对比成像应用的微泡，其可用作造影剂。

其它优点包括与标准脂质系统相比，可从利用稳定的脂质系统获益的各种领域。例如，当与其它组分联用以便递送感兴趣试剂时，SML可作为稳定的脂质制品提供，例如稳定的乳液或脂质体制品。

特别感兴趣的脂质系统应用的例子包括利用SML和组合物作为毒性药物，例如阿霉素、表柔比星、喜树碱、紫杉醇、多西他奇、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、顺铂、他莫昔芬、伊马替尼、依立替康的稳定药物运载体以便胃肠外给予药物。其它例子包括利用SML和组合物作为同一运载体中的两种或更多种药物的稳定药物运载体。其它例子包括利用SML作为抗微生物化合物，例如妥布拉霉素的稳定药物运载体以便通过吸入递送入肺部，作为水溶性差的药物，例如两性霉素B或视黄酸的药物递送系统。其它例子包括利用SML作为稳定的囊泡、作为佐剂和/或疫苗运载体。其它例子包括利用SML作为显像剂，例如磁共振显像剂或放射性显像剂的稳定运载体。其它例子包括利用SML作为酶敏感性药物递送的脂质体前药，作为还原反应性药物递送的脂质体组合物，具有鞘氨醇的SML用于脂质筏(lipid raft)建模和递送膜蛋白，具有视黄酸的SML乳液作为皮肤护理产品，和利用SML作为供超声诊断中的微泡。还有其它例子包括利用SML和组合物作为递送生物学大分子，例如蛋白质、DNA、RNA、siRNA、寡核苷酸、修饰的核酸的纳米颗粒，或用作稳定蛋白质的纳米颗粒，将含有谷固醇或豆固醇的SML用在营养产品中以供治疗高胆固醇血症，以及利用SML和组合物作为生物传感器。

固醇修饰的两亲脂质

本发明化合物是具有两个或更多个疏水性尾部的两亲脂质化合物，疏水性尾部中至少一个是固醇。亲水性首基通常连接于两个或三个疏水性尾基，但可含有更多个，例如基于具有四个疏水性尾基的双磷脂酰甘油首基结构(例如心磷脂)的固醇修饰两亲脂质。

依据至少两个通用原则设计化合物：1)固醇共价连接于亲水性首基；和2)该化合物是具有两个或更多个疏水性尾部的两亲分子。因此，SML化合物的设计具有显著的灵活性并能为给定的最终应用微调各特性，例如：1)两个尾部的总疏水性和首基的亲水性之间的平衡；和2)特定固醇修饰两亲脂质的所需功能(例如，与作为前药或本身作为药物的功能相比，用于乳液或脂质体中以促进递送，等等)。

所述化合物不仅可有助于将充足的胆固醇掺入脂质系统以稳定固醇修饰的两亲脂质所存在的系统，还能抑制固醇从该结构转移，因为固醇与该系统共价相连并强烈结合。例如，脂质体中固醇修饰的两亲脂质可稳定脂质体并增强生理条件下(例如，37℃，有生物学流体存在下，例如血清存在下)脂质体内含物渗漏的耐受性。

对于SML化合物的固醇组分，固醇基团通常是基于或衍生自固醇化合物的天然或合成结构，所述固醇化合物携带(经修饰以携带)用于共价连接SML的亲水性首基的官能团。例如，通常发现生物来源的固醇是游离固醇、酰化(固醇酯)、烷化(固醇基烷基醚)、硫酸化(硫酸胆固醇)，或连接于本身可酰化(酰化的固醇糖苷)的糖苷部分(固醇基糖苷)(参见，例如通过引用全文纳入本文的Fahy等，J.Lipid Research(2005)46：839-861)。例子包括(1)可从动物来源获得的固醇，本文称为“动物固醇”，例如动物固醇胆固醇和某些类固醇激素；和(2)可从植物、真菌和海洋来源获得的固醇，本文称为“植物固醇”，例如植物固醇油菜固醇、谷固醇、豆固醇和麦角固醇。这些固醇通常携带至少一个游离羟基，一般在环A的3位，另一位置或它们的组合，或者可视需要经修饰掺入合适的羟基或其它官能团。因此，固醇组分可依据SML构建物、组成和/或给定的最终应用而在固醇结构的各种位置连接于SML化合物。

特别感兴趣的固醇是携带独特官能团以连接SML的首基的简单固醇。所述独特官能团是羟基的简单固醇尤其感兴趣，具体地说，是在环A的3位具有羟基的简单固醇(例如，胆固醇、β-谷固醇、豆固醇、油菜固醇和菜子固醇、麦角固醇等以及它们的衍生物)。

在一些实施方式中，SML包含至少一个简单固醇。在其它实施方式中，SML包含至少一个在固醇环A的3位连接于SML首基的简单固醇。在具体的实施方式中，SML包含至少一个在固醇环A的3位连接于SML首基的简单固醇，其中所述固醇是基于或衍生自环A的3位具有一个羟基的简单固醇(例如，胆固醇、β-谷固醇、豆固醇、油菜固醇和菜子固醇、麦角固醇等以及它们的衍生物)。

在某些实施方式中，SML的固醇组分不是胆酸或胆盐。在其它实施方式中，SML的固醇组分不是类固醇。在一些实施方式中，SML的固醇组分不是类固醇偶连物。在某些实施方式中，SML的固醇组分不是开环类固醇(secosteroid)。

在其它实施方式中，SML化合物可包括胆酸组分。例如，含有特别感兴趣的胆酸组分的一类SML化合物是其中胆酸的羧基连接于以下分子的胺的化合物：D-红-鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸、鞘氨醇磷酸胆碱(溶血鞘磷脂(lysosphingomyelin))、糖基化鞘氨醇、二氢鞘氨醇、二氢鞘氨醇-1-磷酸、二氢鞘氨醇磷酸胆碱等，其中疏水性链可变。含有感兴趣的胆酸组分的第二类SML化合物是其中胆酸连接于甘油磷酸胆碱的一个或两个羟基的那些化合物

在还有其它实施方式中，SML化合物可包含经合适的连接基团连接于以下分子，或者在其它实施方式中，连接于其它磷脂基团的类固醇组分、类固醇偶联物组分和/或开环类固醇组分：D-红-鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸、鞘氨醇磷酸胆碱(溶血鞘磷脂)、糖基化鞘氨醇、二氢鞘氨醇、二氢鞘氨醇-1-磷酸、二氢鞘氨醇磷酸胆碱等，其中疏水性链可变。

特别感兴趣的示范性SML如下所示：包含取代或未取代的胆固醇的SML；包含取代或未取代的β-谷固醇的SML；包含取代或未取代的豆固醇的SML；包含取代或未取代的油菜固醇的SML；包含取代或未取代的菜子固醇的SML；和包含取代或未取代的麦角固醇的SML。

特别感兴趣的是胆固醇。感兴趣的胆固醇类别(包括取代的胆固醇)的代表性固醇包括，例如以下固醇(参见表1)：(1)天然和合成的固醇，例如胆固醇(羊毛)、胆固醇(源自植物的)、2，4-去氢胆固醇、豆固醇、β-谷固醇、硫代胆固醇、丙烯酸3-胆固醇酯；(2)A-环取代的氧化固醇，例如胆甾烷醇和胆甾烯酮；(3)B-环取代的氧化固醇，例如7-酮胆固醇(7-ketocholesterol)、5α，6α-环氧胆甾烷醇、5β，6β-环氧胆甾烷醇和7-脱氢胆固醇；(4)D-环取代的氧化固醇，例如15-酮胆甾烯和15-酮胆甾烯；(5)侧链取代的氧化固醇，例如25-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇、24(R/S)-羟基胆固醇、24(R/S)，25-环氧胆固醇和24(S)，25-环氧胆固醇；(6)羊毛固醇，例如24-二氢羊毛固醇和羊毛固醇；(7)氟化固醇，例如F7-胆固醇、F7-5α，6α-环氧胆甾烷醇、F7-5β，6β-环氧胆甾烷醇和F7-7-酮胆固醇；(8)荧光胆固醇，例如25-NBD胆固醇、脱氢麦角固醇和胆固醇三烯。这些化合物还可包括氘化和未氘化的形式，这些化合物可市售购得，例如购自阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids，Inc)。

表1：代表性的胆固醇和衍生化合物

表1：代表性的胆固醇和衍生化合物

表1：代表性的胆固醇和衍生化合物

表1：代表性的胆固醇和衍生化合物

提供的SML化合物可以是外消旋或立体纯的化合物。在一些实施方式中，SML化合物是立体化学纯的。其它实施方式提供外消旋SML。例如，可合成包含溶血鞘磷脂和溶PC的SML以提供一种异构体(如果所连接的不是外消旋的)，而其它途径提供外消旋化合物。在具有氨基酸分支核心(branching core)作为首基部分的SML的情况中，可存在D或L形式，或外消旋化合物。因此，提供的SML可以是D或L异构体，或外消旋化合物(取决于用于合成的形式)。尤其可用作分支核心的氨基酸包括：赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙氨酸、二氨基丁酸、二氨基乙酸、氨基乙基甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、δ’，δ’-二氨基丙基鸟氨酸、炔丙基甘氨酸和3，5-氨基-苯甲酸。

对于含有至少一个非固醇疏水性尾部的SML化合物，该非固醇疏水性尾部包含饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的脂族链。特别感兴趣的是约2-约40个碳原子长的非固醇疏水性尾部，可以是饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的。例如，此例中SML的非固醇部分是饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的烃链，其具有2-40个碳原子，通常是4-30个碳原子，常见的是4-25个碳原子，更常见的是6-24个碳原子，更常见的是10-20个碳原子。

当非固醇部分是基于饱和脂族烃链的取代脂族烃链，例如含烷基的饱和链时，亚烷基的1、2、3、4或更多个碳原子(通常不超过约10个碳原子)可被选自氧、硅、硫或氮原子的杂原子取代，其中该亚烷基的1、2、3、4或更多个氢原子(通常不超过氢原子的总数)可被氟取代。

特别感兴趣的非固醇链是基于或衍生自各种脂质的那些，例如脂族酸、甘油酯、甘油磷脂、鞘脂、孕烯醇脂质(prenol lipid)和糖脂，例如Fahy等，J.Lipid Research(2005)46：839-861所述的脂质。

应该注意可根据所需的分子亲脂性选择SML化合物的疏水性尾部烃链中的碳数目。分子的亲脂性与所需链长直接相关。如果固醇修饰的两亲脂质用于脂质体中，10-24个碳的分子是尤其感兴趣的，因为这样能提供疏水性适合于形成稳定囊泡的分子。用杂原子，例如氧取代烃链中亚烷基的碳原子能对该分子的亲脂性施加所需影响。同样的原理适用于氟化烃链。因此，一个或多个疏水性尾部的理想烃链长度可根据杂原子的取代程度而有所不同。还应注意，取代的脂族烃链可包括用一个或多个芳基或杂芳基，例如芳族(如苯基或取代的苯基)或杂芳族(例如，吡啶或取代的吡啶)取代的那些。

SML化合物还包括可通过切割(例如，酶或化学切割)从亲代化合物释放疏水性尾基的那些。例如，SML中的一个或多个共价键能在预先选择的条件下，例如酯链接触酯酶或碱性pH条件下切割。在另一实例中，SML中存在的二硫键可在还原条件下切割。特别感兴趣的是其中至少一个疏水性尾部包含通过可切割键连接于SML的疏水性物质或药物的SML。

在某些实施方式中，SML的一个或多个疏水性尾基是可聚合的脂族酸，例如10，12-二十三碳二炔酸(10，12-tricosadiynoic acid)。在其它实施方式中，SML包含一个或多个疏水性尾基，所述尾基包含(i)具有6-30个碳原子的聚丙二醇短链；(ii)具有3-30个硅原子的含硅线形或分支链；和/或(iii)具有5-40个碳原子的孕烯醇脂质。

对于亲水性首基，SML化合物的该组分包含荷电基团、极性基团或荷电和极性基团的组合。荷电基团包括阴离子和阳离子部分。阴离子基团的例子(在该情况中，分子的疏水性尾基和分支核心部分以R表示)包括但不限于：硼酸(RBO2H2)、羧酸根(RCO2-)、硫酸根(RSO4-)、磺酸根(RSO3-)和磷酸根(RPO4H-)、膦酸根(RPO3H-)，它们代表了两亲脂质首基的常见荷电官能团。阳离子基团的例子包括但不限于：胺(RNH3+)、甲基化的胺、多胺，例如精胺等，以及含有酸性和碱性基团(因此是两性的)，作为两性离子或在某些pH下是阳离子(例如，组氨酸)存在的两性电解质，它们也代表了两亲脂质首基的荷电官能团。极性、不带电荷的基团的例子是醇类(-OH)，例如甘油、糖、极性氨基酸(包括两性离子氨基酸)和寡聚乙二醇。在某些实施方式中，亲水性首基包含其它两亲脂质首基的其它额外元素，例如胆碱、乙醇胺、甘油、核酸、糖、肌醇、叠氮化物、炔丙基和丝氨酸。

亲水性首基可以是天然或合成的首基，例如氨基酸或衍生物、肽、金属螯合剂、芳基或杂芳基衍生物、或连接尾基和携带荷电或极性特性的任何合适结构，只要整个首基是亲水性。亲水性首基还可以是基于或衍生自两亲脂质的结构，该两亲脂质携带(经修饰以携带)一个或多个用于共价连接SML的疏水性尾部的官能团。例如，亲水性首基可以基于或衍生自生物来源的两亲脂质，例如甘油脂、甘油磷脂、鞘脂和糖脂，如来自Fahy等，J.Lipid Research(2005)46：839-861所述的脂质。

感兴趣的亲水性首基的具体例子包括但不限于：包含选自以下的第一分子的首基：硼酸(RBO2H2)、羧酸根(RCO2-)、硫酸根(RSO4-)、磺酸根(RSO3-)和磷酸根(RPO4H-)、膦酸根(RPO3H-)、胺(RNH3+)、甘油、糖类，例如乳糖或衍生自透明质酸，极性氨基酸、聚氧化乙烯(也称为聚乙二醇)，例如单甲氧基聚乙二醇、分支聚乙二醇和寡聚乙二醇，任选偶联于选自胆碱、乙醇胺、甘油、核酸、糖、肌醇或丝氨酸的第二分子的残基。在此，首基依然可含有各种其它修饰，例如在寡聚乙二醇和聚氧化乙烯(PEG)首基的情况中，这种PEG链的末端可含有甲基或具有远端官能团以便进一步修饰。

特别感兴趣的亲水性首基的例子包括但不限于：磷酸根、磷酸胆碱、磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷酸肌醇、乙基磷酰胆碱、聚乙二醇、聚甘油、三-次氨基三乙酸、三聚氰胺、葡糖胺、三甲胺、精胺、亚精胺和偶联的羧酸根、硫酸根、硼酸、磺酸根、硫酸根和碳水化合物。首基仍然可含有各种修饰，例如用活化的官能团，例如叠氮化物、马来酰亚胺、溴乙酰基、2-吡啶基二硫醇(pyridyldithiol)、烯烃或炔丙基作末端功能化的聚乙二醇首基。亲水性首基还可包含和/或偶联于第二分子的残基，其中磷酸乙醇胺-N-[单甲氧基聚乙二醇]2000和磷酸乙醇胺-N-琥珀酰-N-三-次氨基乙酸代表了特别感兴趣的一些例子。

因此，在某些实施方式中，SML包含含有天然氨基酸的首基和/或分支核心。在其它实施方式中，SML包含合成氨基酸的首基和/或分支核心。“天然氨基酸”指可从生物来源获得的氨基酸，例如天然产生的遗传学编码氨基酸和其它核糖体装配的氨基酸。“合成氨基酸”指可从生物来源分离的氨基酸以外的氨基酸。如上所述，这种天然和合成氨基酸的例子包括：赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙氨酸、二氨基丁酸、二氨基乙酸、氨基乙基甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、δ’，δ’-二氨基丙基鸟氨酸、炔丙基甘氨酸和3，5-氨基-苯甲酸，其在SML中可作为D或L异构体，或作为外消旋化合物存在(取决于合成所用的形式)。

在进一步的实施方式中，SML包含具有配体结合部分，例如靶向配体的亲水性首基。经改造含有靶向配体的SML能与靶分子，例如选择性结合特异性表位的抗体或其片段选择性形成高亲和力结合配对。在一个实施方式中，靶向配体是金属螯合剂。金属螯合剂的例子包括但不限于：乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)、次氨基三乙酸(NTA)和它们的衍生物。例如，三-次氨基三乙酸(tri-NTA)及其各种衍生物描述于Huang等，Bioconj.Chem.2006，17：1592-1600。特征性SML包含首基，所述首基包含三-次氨基三乙酸及其衍生物，例如磷酸乙醇胺-N-琥珀酰-N-三-次氨基乙酸，该SML对于高亲和力结合组氨酸标记的分子特别有用。

特别感兴趣的SML如下式所示：

(R1)(R2)G-X，式I

式中R1和R2是疏水性尾基，G是分支核心，和X是亲水性首基，其中R1和R2中至少一个是固醇。

式I的X、G、R1和R2基团各自对式I所示化合物的一种或多种其它特征有贡献，只要该化合物包含至少一个首基和至少两个疏水性尾部，其中至少一个是固醇(例如，参见式III)。式I所示化合物还可包括具有一个或多个额外分支点、一个或多个额外尾部和/或一个或多个首基的化合物，前提依旧是该化合物包含至少一个亲水性首基和其中至少一个是固醇的至少两个疏水性尾部。例子包括式(R1)(R2)G-X-G(R3)(R4)所示的SML化合物，其中R3和R4各自可以存在或不存在，例如依据心磷脂首部/分支核心构建物的SML，其中存在R1、R2、R3和R4。特别感兴趣的SML是式I所示具有连接的一个首部/分支核心基团和两个疏水性尾部的单固醇和二固醇两亲脂质。

在一个实施方式中，如果式I所示化合物只含有一个固醇部分(即，位于R1或R2处的固醇)，非固醇部分包含长约2-约40个碳原子的脂族链，其可以是饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的。例如，非固醇部分(相应的R1或R2处)是具有2-40个碳原子、通常是4-30个碳原子、常见的是4-25个碳原子、更常见的是6-24个碳原子、更常见的是10-20个碳原子的饱和或不饱和、线形或分支的、取代或未取代的烃链，其中R1或R2的亚烷基的1、2、3、4或更多个碳原子(通常不超过约10个碳原子)可被选自氧、硅、硫或氮原子的杂原子取代，其中R1或R2的亚烷基的1、2、3、4或更多个氢原子(通常不超过氢原子的总数)可被氟取代。在此，仍然可依据分子的所需特性选择SML化合物的碳数目和非固醇疏水性尾部的取代类型及数量。

在一个实施方式中，单固醇两亲脂质如式I所示，其中R1或R2之一是包含动物固醇或支链固醇的固醇(例如，胆固醇、类固醇激素、油菜固醇、谷固醇、麦角固醇和豆固醇)，其中R1或R2之一是包含具有2-30个碳原子的饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的烃链的非固醇部分，G是将R1和R2连接于亲水性首基X的分支核心。

在另一实施方式中，式I的R1或R2之一是具有2-40个碳原子的饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的烃链。在某些实施方式中，式I的R1或R2之一是具有4-24个碳原子的饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的烃链。在其它实施方式中，式I的R1或R2之一是具有6-24个碳原子的饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的烃链。在还要其它实施方式中，式I的R1或R2之一是具有10-20个碳原子的饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的烃链。

总体上，当式I的R1或R2之一依据具有一个或多个亚烷基的不饱和、取代的脂族烃链时，额外的R1或R2基团包括其中亚烷基的1、2、3、4或更多个碳原子，但通常是不超过约10个碳原子可被选自氧、硅、硫或氮原子的杂原子取代的那些。此外，不饱和的R1或R2脂族烃链的亚烷基中1、2、3、4或更多个氢原子(通常不超过氢原子总数)可被氟取代。

特别感兴趣的非固醇链的例子是基于或可衍生自各种脂质的那些，例如脂族酸、甘油酯、甘油磷脂、鞘脂、孕烯醇脂质和糖脂，例如Fahy等，J.Lipid Research(2005)46：839-861所述的脂质。

在另一实施方式中，以上式I所示化合物的R1或R2是可通过酶切割从亲代化合物释放的疏水性药物。在另一实施方式中，以上式I所示化合物的R1、R2和X经共价键连接于G，所述共价键中至少一个能在预选择的条件下，例如二硫键接触还原条件或酯接触碱性条件下切割。在另一实施方式中，以上式I所示化合物的R1或R2是可聚合的脂族酸，例如10，12-二十三碳二炔酸。在另一实施方式中，以上式I所示化合物的R1或R2是具有6-30个碳原子的聚丙二醇短链。在另一实施方式中，以上式I所示化合物的R1或R2是具有3-30个硅原子的含硅线形或分支链。在另一实施方式中，以上式I所示化合物的R1或R2是具有5-40个碳原子的孕烯醇脂质。

在一个实施方式中，以上式I所示化合物的G是具有至少三个连接点的分支核心，其中一个连接点连接于亲水性首基X，两个连接点各自独立连接于亲水性尾基R1和R2。因此，在某些实施方式中，G是衍生自具有至少三个用于连接R1、R2和X的官能团的化合物的分支核心，例如选自以下结构的化合物：

式中n可以是0、1、2或3。在该实施方式中，R1和R2可以在任何位置，其余位置被X占据。因此，亲水性首基X连接于一个官能团(例如，羧基(-COOH)、胺(-NH2)或醇(-OH))，亲水性尾基R1和R2连接于其余的官能团(例如，羧基(-COOH)、胺(-NH2)或醇(-OH))。

式I中的X是亲水性基团，通常是亲水性首基。在具体的实施方式中，亲水性基团包含荷电基团、极性基团或荷电和极性基团的组合。因此，亲水性基团X(或G-X)可以是合成基团，例如氨基酸或衍生物，芳基或杂芳基衍生物，或连接尾基和携带荷电或极性特性的任何合适结构，只要SML的整个首基是亲水性的。特别感兴趣的芳基或杂芳基衍生物亲水性基团X的例子是色甘酸(chromolyn)和羟乙酸色甘酸(glycolate chromolyn)(G-X)。亲水性基团X(或G-X)还可以是基于或衍生自携带(或经修饰携带)一个或多个用于共价连接SML的疏水性尾部的官能团的两亲脂质结构。例如，亲水性基团X(或G-X)可以基于或衍生自生物来源的两亲脂质，例如甘油脂、甘油磷脂、鞘脂和糖脂，例如Fahy等，J.Lipid Research(2005)46：839-861所述的脂质。X和G-X的示范性基团包括但不一定限于：磷酸根、磷酸胆碱、磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷酸肌醇、乙基磷酰胆碱、聚乙二醇、聚甘油、三聚氰胺、葡糖胺、透明质酸和三甲胺。

在一些实施方式中，感兴趣的部分提供G-X。例如，如下文详述的，可由肉碱提供G-X，进而连接于式I所示的R1和R2。

在其它实施方式中，由双磷脂酰甘油(例如，心磷脂)提供G-X，进而连接于式I所示的R1和R2基团(至少两个，最多4个)。

特别感兴趣的示范性化合物是通式I所示的化合物，其中G是甘油，X是磷酸胆碱。

在另一实施方式中，以上式I所示化合物的R1-G选自鞘氨醇和鞘脂(sphingonine)。在还有另一实施方式中，以上式I所示化合物的G-X是肉碱。

特别感兴趣的是固醇甘油磷脂，其表示具有甘油核心的脂质，其中至少一个固醇取代脂肪酸尾基。固醇甘油磷脂的例子包括sn-甘油基-3-磷酸的任何衍生物，其含有至少一个与甘油部分相连的固醇残基和由，例如含氮碱基、甘油或肌醇单位构成的极性首基。对于单固醇甘油磷脂，固醇连接于甘油部分的一个残基，该甘油部分的另一残基是，例如O-酰基、O-烷基、O-烯-1′-基或O-氨基甲酸酯基。它们可以是相同或不同的固醇和脂肪酸亚单位。

在固醇甘油磷脂的具体示范性实施方式中，化合物如式I所示，其中G是甘油，X是磷酸胆碱。特别感兴趣的化合物如通式II所示或其药学上可接受的盐：

式II

式中R1和R2独立为疏水性部分，其中R1和R2中至少一个是固醇，当R1或R2中只有一个是固醇时，非固醇部分是具有2-40个碳原子、通常是4-25个碳原子、更常见的是6-24个碳原子、更常见的是10-20个碳原子的饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的烃链，其中R1(或R2)的亚烷基的1、2、3、4或更多个碳原子被选自氧、硫或氮原子的杂原子取代，其中R1(或R2)的亚烷基中1、2、3、4或更多个氢原子可被氟取代。R1(或R2)的非固醇部分可以是上述任何非固醇部分。

在具体的实施方式中，式II所示化合物具有下表2所示结构式：

表2：示范性的固醇-修饰磷脂(SPLs)a

a侧接通用结构的通式II；b，c，en＝18、16、14；d，fn＝17、15、13。

gCHEMS：胆固醇基半琥珀酸(cholesterylhemisuccinic acid)；hStigHS：豆固醇基半琥珀酸(stigmasterylhemisuccinic acid)；

iSitoHS：谷固醇基半琥珀酸。

在其它具体实施方式中，化合物如式III所示或其药学上可接受的盐，其中R1、G和X包含在鞘氨醇磷酸胆碱中(溶血鞘磷脂)和R2是固醇：

式III。

特别感兴趣的式III所示化合物的例子是其中R2是胆固醇半琥珀酸酯或其它固醇衍生物。

如上式I所反映的，本发明考虑其中R1或R2之一是固醇的化合物，以及R1和R2均是固醇的化合物。在这种实施方式中，R1和R2独立选择，从而它们可以是相同或不同的固醇。特别有用的类固醇组合的例子是胆固醇和麦角固醇、胆固醇和谷固醇、胆固醇和豆固醇以及豆固醇和谷固醇。

特别感兴趣的示范性SML包括基于或可衍生自两亲脂质的那些，所述脂质选自甘油磷脂、神经鞘氨醇磷脂、肉碱脂质和氨基酸脂质。例如，氨基酸磷脂是偶联于磷酸修饰的氨基酸亲水性首基的脂质。

例子包括但不限于：

(1)式II所示的固醇修饰的甘油磷脂是，例如选自以下的化合物：SML1a、SML1b、SML1c、SML2a、SML2b、SML2c、SML2d、SML3a、SML3b、SML3c、SML3d、SML4a、SML4b、SML4c、SML4d、SML5a、SML5b、SML5c、SML5d、SML6a、SML6b、SML6c、SML6d、SML7a、SML7b、SML9a、SML9b、SML9c、SML10a、SML10b、SML10c、SML10d、SML10e、SML10f、SML13a、SML13b、SML13c、SML13d、SML13e、SML13f、SML13g、SML13h、SML15a、SML15b、SML15c、SML15d、SML15e、SML15f、SML15g、SML15h、SML15i、SML15j、SML15k、SML16a、SML16b、SML16c、SML16d、SML16e、SML16f、SML16g、SML16h、SML16i、SML16j、SML16k、SML16l和SML16m以及它们的衍生物；

(2)式III所示的固醇修饰的神经鞘氨醇磷脂是，例如选自以下的化合物：SML8a、SML8b、SML8c、SML8d、SML8e和SML8f以及它们的衍生物；

(3)式I所示的固醇修饰的肉碱脂质是，例如选自以下的化合物：SML11a、SML11b、SML11c、SML11d、SML11e和SML11f以及它们的衍生物；

(4)式I所示的固醇修饰的氨基酸脂质，特别是亲水性首基包含氨基酸的那些是，例如选自以下的化合物：SML12a、SML12b、SML12c、SML12d、SML12e、SML12f、SML13i、SML13j和SML13k以及它们的衍生物；和

(5)式I所示，具有用活化的部分，例如叠氮化物、马来酰亚胺、溴乙酰基、2-吡啶基二硫醇、烯烃和炔丙基作末端功能化的活化亲水性首基的固醇修饰两亲脂质是，例如选自以下的化合物：SML14a、SML14b、SML14c、SML14d、SML14e和SML14f以及它们的衍生物。

因此，特征性实施方式包括选自以下的SML化合物：SML1a、SML1b、SML1c、SML2a、SML2b、SML2c、SML2d、SML3a、SML3b、SML3c、SML3d、SML4a、SML4b、SML4c、SML4d、SML5a、SML5b、SML5c、SML5d、SML6a、SML6b、SML6c、SML6d、SML7a、SML7b、SML8a、SML8b、SML8c、SML8d、SML8e、SNL8f、SML9a、SML9b、SML9c、SML10a、SML10b、SML10c、SML10d、SML10e、SML10f、SML11a、SML11b、SML11c、SML11d、SML11e、SML11f、SML12a、SML12b、SML12c、SML12d、SML12e、SML12f、SML13a、SML13b、SML13c、SML13d、SML13e、SML13f、SML13g、SML13h、SML13i、SML13j、SML13k、SML14a、SML14b、SML14c、SML14d、SML14e、SML14f、SML15a、SML15b、SML15c、SML15d、SML15e、SML15f、SML15g、SML15h、SML15i、SML15j、SML15k、SML16a、SML16b、SML16c、SML16d、SML16e、SML16f、SML16g、SML16h、SML16i、SML16j、SML16k、SML16l和SML16m，这些化合物如表3所述以及它们的衍生物。

表3

表3

表3

固醇修饰的两亲脂质的特性

可将本发明的固醇修饰两亲脂质设计成当存在于双层中，例如脂质体中时能显示各种物理特性。示范性的此类物理特性是相转变行为、焓和抵抗脂质体内含物的渗漏。例如，可通过一个或多个内含物渗漏试验评估含有本发明SML的脂质体在生理条件下渗漏(例如，37℃，有血清存在)，或接触渗应力时的稳定性。还可利用SML对合成的双酰基磷脂的转换温度和焓的影响来表征它们。

在一个实施方式中，固醇修饰的两亲脂质提供在体内生理条件(或模拟这种体内生理条件的体外条件)下耐受渗漏的稳定脂质体，从而在约7天期间检测到的脂质体内含物渗漏少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％或少于5％直至检测不到。在进一步的实施方式中，固醇修饰的两亲脂质可提供在生理条件下耐受渗漏的脂质体，从而在约14天期间检测到的脂质体内含物渗漏少于少于25％、少于20％、少于15％、少于10％或少于5％或少于1％直至检测不到。此外，固醇修饰的两亲脂质可提供在耐受渗漏的脂质体，从而在约7天期间，在生理条件下维持约80％、90％或更多的脂质体内含物；在约14天期间，在生理条件下维持约60％、70％、80％、90％或更多的脂质体内含物；在约21天期间，在生理条件下维持约40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的脂质体内含物；和/或在约28天期间，在生理条件下维持约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的脂质体内含物。

在具体的实施方式中，稳定的脂质体组合物包含的固醇修饰两亲脂质的摩尔含量通常是至少15％、至少20％、至少25％、至少30％，可以是15％-90％、15％-35％、30％-70％、35％-80％、35％-65％或40％-70％，还可以存在更高含量，例如90％-95％，或者更高的脂质体总脂质摩尔含量。在特定的实施方式中，固醇修饰两亲脂质的固醇(例如，胆固醇)存在于脂质体组合物中，从而能提供的固醇的摩尔含量为至少25％、至少30％、至少50％、至少60％、至少70％或更高。在具体的实施方式中，脂质体组合物包含摩尔含量为至少30％、至少35％、至少70％、至少85％或更高的单固醇修饰的两亲脂质。在另一特定实施方式中，脂质体组合物包含的双固醇-修饰两亲脂质的摩尔含量是约15％-35％，可以是至少30％或更高、至少40％、至少45％或更高。

作为前药、药物的固醇修饰两亲脂质和所需特性

可将本发明的固醇修饰两亲脂质设计成能提供所需特性，例如所需的物理特征(例如，亲脂性)和/或功能活性(例如，作为药物或前药的活性)。

例如，可将本发明的固醇修饰两亲脂质设计成能用作前药，即，可从活性较低的形式转化成活性较高形式的化合物。因此，在一些实施方式中，以上通式I所示化合物的R1或R2是可通过酶促切割从亲代化合物释放的疏水性药物。因此，例如通式I涵盖了其中R1是感兴趣药物，而R2是固醇的化合物。将固醇和药物掺入单固醇修饰的两亲脂质优于常规脂质体前药，因为可单独通过固醇修饰的两亲脂质前药或与最小互补组分联用获得稳定的脂质体，因而能简化前药配制。此外，共价相连的固醇可促进脂质体前药在生物流体中的稳定性，从而该脂质体可逐渐累积在靶向治疗部位，例如与身体的其它部位相比，前药切割增强的部位(例如，酶活性升高的部位，或pH较低或高于7.4，等等)。

如果通式I所示化合物是前药，则R1和R2中至少一个是固醇，其中R1和R2中至少一个是疏水性药物。示范性疏水性药物包括固醇(例如类固醇)、类胡萝卜素、维生素、脂肪酸、小分子疏水性药物、分化因子和麻醉剂。疏水性药物的例子包括但不一定限于：视黄酸(例如，全反式视黄酸；13-顺式视黄酸)、类固醇和衍生物(例如，C18类固醇(雌激素)和衍生物；C19类固醇(雄激素，例如睾酮和雄酮)和衍生物；C21类固醇(糖皮质激素/盐皮质激素、孕激素以及糖皮质激素和盐皮质激素及衍生物)和开环类固醇及衍生物(例如，维生素D2和衍生物；维生素D3和衍生物，它们的特征在于核心结构的B环开环，因此有“开环”这一前缀)。特别感兴趣的是式I所示前药化合物，其中R1是简单的固醇，R2是疏水性药物。在一具体实施方式中，R1是固醇，R2是视黄酸。当G-X是磷酸胆碱时，可由磷脂酶A2切割sn-2位的酯键，从而释放视黄酸。本领域技术人员应知道可在所需药物的SML脂质体前药的制备中作出许多改变和改进。

如果需要提供固醇修饰的两亲脂质作为前药，R1、R2和X通过共价键连接于式I的G，从而至少一根共价键易于在所需条件下切割。例如，固醇修饰的两亲脂质可以在还原条件下酶促切割，或在低pH下是可切割的。例如，R1、R2和X可以通过共价键连接于式I的G，共价键中至少一根在还原条件下可切割。例如，可将二硫键引入R2和X之间，从而可经由还原环境触发切割。本发明化合物可用于在具有特征性还原环境的，例如胞内环境，如胞质溶胶中，胞内囊泡中(例如，内含体、吞噬小泡)等所见的特定部位触发药物释放。

还可将固醇修饰的两亲脂质设计成具有阳离子首基，从而通过非共价电荷-电荷相互作用而促进带负电荷的治疗部分的递送。例如，式I的G-X可以是人体代谢过程必需的分子-肉碱。本发明化合物可提供有用工具以便将核酸，例如RNA、DNA、寡核苷酸或siRNA递送入培养的细胞和体内细胞。例如，带负电荷的核酸可通过为此目的而设计的SML的阳离子首基形成复合体，进而递送至靶部位。

还可设计固醇修饰的两亲脂质，从而R1和/或R2基团能影响化合物的组装，例如在脂质体中。例如，在一个实施方式中，固醇修饰的两亲脂质可包含可聚合的链。例如，以上式I所示化合物的R1或R2含有可聚合的脂族酸，例如10，12-二十三碳二炔酸。聚合固醇修饰的两亲脂质的至少一条链可赋予该分子诸多特性，例如可用于基础生物医学研究、传感器领域或药学领域的相行为。

还可选择R1或R2从而能提供具有所需亲脂性的固醇修饰两亲脂质。例如，以上式I所示化合物的R1或R2可以是亚烷基二醇短链，例如具有6-30个碳原子的聚丙二醇链。在固醇修饰的两亲脂质中引入聚丙二醇短链能影响该分子的疏水性并影响固醇修饰两亲脂质的组装。如果微调固醇修饰两亲脂质的结构，可以获得胆固醇液晶相。

还可设计固醇修饰的两亲脂质从而起到“脂质筏”的作用。例如，R2可以是固醇(例如，胆固醇)，式I的R1-G可选自鞘氨醇和和鞘脂。这种化合物可通过，例如鞘氨醇和胆固醇之间的相互作用形成人工脂质筏。人工脂质筏可用作研究蛋白质-脂质筏相互作用的工具，据信，该筏在膜蛋白信号转导和病原体进入中起重要作用。这些固醇-修饰的两亲脂质还可用于递送蛋白质或调节细胞膜结构域以防止病原体进入。

产生固醇修饰的两亲脂质的方法

在另一方面，本发明提供合成本发明化合物的各种方法。该方法通常包括将至少一个固醇尾基经分支核心偶联于亲水性首基，从而产生具有通过分支核心相连的亲水性首基和两个或更多个疏水性尾基的固醇修饰两亲脂质，其中至少一个疏水性尾基包含固醇尾基。

在具体的实施方式中，该方法包括：(i)将分支核心偶联于亲水性首基，其中所述分支核心包含至少一个固醇尾基；和(ii)形成具有通过分支核心相连的亲水性首基和两个或更多个疏水性尾基的固醇修饰两亲脂质，其中至少一个疏水性尾基包含固醇尾基。

在另一具体实施方式中，该方法包括：(i)将至少一个固醇尾基偶联于分支核心，其中所述分支核心连接于亲水性首基；和(ii)形成具有通过分支核心相连的亲水性首基和两个或更多个疏水性尾基的固醇修饰两亲脂质，其中至少一个疏水性尾基包含固醇尾基。

在以上方法中，当固醇修饰的两亲脂质包含至少一个非固醇尾基时，可在连接固醇尾基之前、同时或之后将该非固醇尾基连接于分支核心。

因此，这些方法包括各种不同的合成方案，从而为最终的所需产物提供多种不同的途径。例如，通常可通过以下步骤制备式I所示化合物：(i)提供组分(a)-(c)作为用于偶联的不同预形成组分，其中组分(a)是分支核心G，组分(b)是包含R1和R2的疏水性尾基，组分(c)是亲水性首基X；然后(ii)偶联组分(a)-(c)从而产生式I所示分子。或者，通常可通过以下步骤制备式I所示化合物：(i)提供用于偶联的中间组分(d)和(e)，其中组分(d)是包含疏水性尾基组分R1和R2的一部分或与其相连的分支核心G(即，(R1)(R2)-G’)，组分(e)是亲水性首基X；然后(ii)偶联组分(d)-(e)，从而产生式I所示分子。

可为此类目的采用标准的有机合成方法，例如采用化学选择性偶联方案、正交保护基团和除去，等等。

具体合成途径的长度通常取决于具体靶分子的复杂性和可得的起始材料。例如，可利用高于磷酸胆碱作为起始材料一步反应合成二固醇磷酸胆碱。然而，合成含醚连接键的脂质需要多步。

具体地说，甘油磷酸胆碱是制备式II所示固醇修饰两亲脂质的有用起始材料，但其在大多数反应溶剂中的溶解性差。因此，本发明总体上提供将甘油磷酸胆碱溶解在有机溶剂中的有效方法，该方法利用硼酸四苯酯作为胆碱的抗衡离子，具体地说是作为有效且高效合成含磷酸胆碱的两亲脂质的相转变催化剂。作为具体的实施方式中，提供合成含磷酸胆碱的两亲脂质的方法，该方法包括：(i)将含至少一个官能团的磷酸胆碱与硼酸四苯酯在有机溶剂中形成复合体，和(ii)将一个或多个脂质与该磷酸胆碱化合物的官能团偶联，其中所述脂质含有至少一个能与磷酸胆碱化合物的官能团反应并偶联的官能团。在本发明的该方面，出于与反应的相容性选择有机溶剂、功能化磷酸胆碱化合物和功能化脂质。用于偶联的溶剂和其它试剂是标准溶剂和试剂(例如，甲醇、吡啶、4，4-二较佳氨基吡啶，等等)。所述官能团可以是在反应中具有化学选择性的任何官能团，例如磷酸胆碱化合物官能团上的羟基和脂质的氯甲酸酯。功能化磷酸胆碱的例子包括但不限于：甘油磷酸胆碱、氨基酸功能化磷酸胆碱等。在某些实施方式中，单脂质连接方案以及不同脂质的正交连接可采用各种保护基团策略。所述方法还可包括步骤(iii)：纯化含磷酸胆碱的两亲脂质。

本发明还提供制备含有固醇修饰两亲脂质的组合物的方法。该方法包括将固醇修饰的两亲脂质与非固醇两亲脂质、治疗剂、美容剂、可检测标记物、缓冲剂、溶剂和赋形剂中的至少一种混合。该方法还可包括纯化该组合物。制备含脂质的组合物的方法通常是熟知的，因此，可用于制备本发明的SML组合物。该方法尤其可用于制备脂质体和乳液。

因此，在具体实施方式中，本发明提供形成包含本发明的固醇修饰两亲脂质化合物的脂质体的方法。该方法通常包括使得固醇修饰的两亲脂质接触脂质体形成条件，从而形成脂质体。脂质体形成条件通常是脂质体领域熟知的标准条件。该方法可任选包括将固醇修饰的两亲脂质与一种或多种其它两亲脂质、试剂、缓冲剂、溶剂和/或赋形剂混合，并使得该混合物接触脂质体形成条件。该方法还可包括通过熟知方法纯化脂质体的方法，例如通过层析、相分离、溶剂萃取、冻干、再水合等。

在某些实施方式中，本发明脂质体中固醇修饰的两亲脂质含量为至少1％到最高100％，特别包括其间以分数增加的范围，例如0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％增量，例如在固醇修饰两亲脂质含量选自5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％的情况中是5％增量。

在具体实施方式中，制备脂质体的方法包括在脂质体形成条件下混合(i)一种或多种两亲脂质与(ii)一种或多种固醇修饰的两亲脂质从而形成脂质体，其中所述固醇修饰的两亲脂质含有通过分支核心相连的首基和两个或更多个疏水性尾基，其中至少一个所述疏水性尾基包含固醇。

在具体实施方式中，两亲脂质和固醇修饰的两亲脂质混合的摩尔比应能提供固醇修饰两亲脂质的摩尔百分比是至少1％的脂质体组合物。因此，在某些实施方式中，两亲脂质和固醇修饰的两亲脂质混合的摩尔比应能提供固醇修饰两亲脂质的摩尔含量在至少1％到低于100％的脂质体组合物，特别包括其间以分数增加的范围，例如0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％增量，例如在固醇修饰两亲脂质含量选自5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的情况中是5％增量。

本发明的特征性方面是脂质体组合物包含的固醇修饰两亲脂质的摩尔含量通常是至少15％、至少20％、至少25％、至少30％，可以是15％-90％、15％-35％、30％-70％、35％-80％、35％-65％或40％-70％，还可以存在更高含量，例如90％-95％，或者更高的脂质体总脂质摩尔含量。在具体实施方式中，固醇修饰两亲脂质的固醇(例如，胆固醇)存在于脂质体组合物中，从而提供的固醇的摩尔含量为至少25％、至少30％、至少50％、至少60％、至少70％或更高。在具体的实施方式中，脂质体组合物包含摩尔含量为至少30％、至少35％、至少70％、至少85％或更高的单固醇修饰的两亲脂质。在另一特定实施方式中，脂质体组合物包含的双固醇-修饰两亲脂质的摩尔含量是约15％-35％，可以是至少30％或更高、至少40％、至少45％或更高。

在另一实施方式中，本发明提供形成包含本发明固醇修饰的两亲脂质化合物的乳液的方法。该方法通常包括使得固醇修饰的两亲脂质接触乳液形成条件，从而形成乳液。可采用该方法制备水包油型SML乳液，或油包水型SML乳液等。例如，可采用所述方法构建SML胶束(例如，水包油体系)以及反相或倒装SML胶束(例如，油包水体系)。

乳液形成条件通常是乳液领域熟知的标准条件。例如，乳液形成条件包括将SML分散在连续水相中，从而产生SML的油包水乳液。或者，乳液形成条件包括将水相分散在连续的SML相中，从而产生SML的水包油乳液。

乳液形成方法可任选包括混合固醇修饰的两亲脂质与一种或多种其它两亲脂质。试剂、缓冲剂、溶剂和/或赋形剂，并使得该混合物接触乳液形成条件。该方法还可包括通过各种熟知方法纯化该乳液的步骤。

可视需要通过振荡、搅拌、匀浆或喷雾方法促进乳化，从而形成乳液。SML可用作其它乳液中的表面活性剂或乳化剂，例如从而能稳定乳液以供储存，特别是用于制备含治疗剂。化妆品和药物的乳液(例如，制剂、乳膏和洗液)。

乳液是转换成油包水乳液还是水包油乳液取决于两相的体积分数和乳化剂的类型。通常适用斑克罗夫特规则(Bancroft rule)：乳化剂和乳化颗粒倾向于促进它们不能良好溶解于其中的相分散。

某些实施方式提供纳米乳液(nanoemulsion)，其中分散相中颗粒的大小小于1000纳米。

包含固醇修饰的两亲脂质的组合物

本发明包括各种含有本发明的固醇修饰两亲脂质的组合物。就固醇修饰两亲脂质化合物而言，这种组合物可以是均匀的，或者可包含本文公开的一种或多种不同的固醇修饰两亲脂质化合物。具有不同的固醇修饰两亲脂质，例如不同的固醇修饰两亲磷脂的混合物的组合物可微调组合物的物理特性，特别是组合物是脂质体的情况下。

例如，可改变两亲脂质和固醇修饰两亲脂质的相对量(例如，单固醇修饰两亲脂质(或“m-SML”)、双固醇修饰两亲脂质(或“d-SML”)或二者的组合)以提供所需的物理特性，例如相转变温度、脂质体生理条件下对渗漏的耐受性、在所需时期(例如，至少一周、至少一个月、至少一年，等等)的储存稳定性(例如，在约4℃)，等等。“稳定的脂质”通常是在限定时期内保留所包封内含物约90％的制剂。

因此，在某些实施方式中，含脂质组合物(例如，脂质体或乳液)的固醇修饰两亲脂质含量可以是至少1％到最低100％，特别包括其间以分数增加的范围，例如0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％增量，例如在固醇修饰两亲脂质含量选自5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％的情况中是5％增量。在示范性实施方式中，含脂质的组合物中含有的固醇修饰两亲脂质的摩尔含量通常是至少15％、至少20％、至少25％、至少30％，可以是15％-90％、15％-35％、30％-70％、35％-80％、35％-65％或40％-70％，还可以存在更高含量，例如90％-95％，或者更高的脂质体总脂质摩尔含量。在具体实施方式中，固醇修饰两亲脂质的固醇(例如，胆固醇)存在于脂质体组合物中，从而提供的固醇的摩尔含量为至少25％、至少30％、至少50％、至少60％、至少70％或更高。在具体的实施方式中，脂质体组合物包含摩尔含量为至少30％、至少35％、至少70％、至少85％或更高的单固醇修饰的两亲脂质。在另一特定实施方式中，脂质体组合物包含的双固醇-修饰两亲脂质的摩尔含量是约15％-35％，可以是至少30％或更高、至少40％、至少45％或更高。

考虑的含脂质组合物还包括具有一定摩尔比的非固醇修饰两亲脂质和固醇修饰两亲脂质的那些，从而提供的含脂质组合物具有至少1％的固醇修饰两亲脂质含量。因此在某些实施方式中，例如在脂质体中，含脂质组合物中非固醇修饰两亲脂质和固醇修饰两亲脂质以一定摩尔比混合存在，从而提供的脂质组合物的固醇修饰两亲脂质含量是至少1％到少于100％，特别包括其间以分数增加的范围，例如0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％增量，例如在固醇修饰两亲脂质含量选自5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的情况中是5％增量。

在含SML的组合物中，非固醇两亲脂质可以是任何合适的两亲脂质(包括任何各种常规脂质，包括市售可得的脂质)，例如具有饱和或不饱和的、线形或分支的和/或取代或未取代的脂族烃链的非固醇修饰两亲脂质。当SML是单固醇修饰两亲脂质时，在组合物中选择m-SML和非固醇两亲脂质可能是理想的，从而非固醇两亲脂质和m-SML的疏水性尾基在性质上相似，例如非固醇两亲脂质和m-SML的疏水性尾基长度大致相同、作类似取代，等等。

非固醇两亲脂质的脂族烃链可以是任何各种不同链长度，例如2-约40个碳原子的长度，可以是饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的烃链。例如，该情况中非固醇部分是饱和或不饱和的、线形或分支的、取代或未取代的烃链，其具有2-40个碳原子，通常是4-30个碳原子，常见的是4-25个碳原子，更常见的是6-24个碳原子，更常见的是10-20个碳原子。当非固醇部分是基于饱和脂族烃链的脂族烃链，例如含烯基的饱和链时，亚烷基的1、2、3、4或更多个碳原子(通常不超过约10个碳原子)可被选自氧、硫或氮原子的杂原子取代的那些，其中亚烷基中1、2、3、4或更多个氢原子(通常不超过氢原子总数)可被氟取代。

如果要将组合物给予对象，该组合物通常优选无菌，并且可储存在无菌容器(例如，无菌小瓶)中。可将组合物配制成用于各种不同给药途径，包括胃肠外、肠道、鼻部和肺部给药，并可包含一种或多种赋形剂。示范性制剂包括局部、可注射、气溶胶和口服制剂，可配制成药物制品、美容制品、营养制品，等等。可以将含有固醇修饰两亲脂质的组合物冻干，作为干粉储存，或者可以储存在溶液中。

包含固醇修饰的两亲脂质的脂质颗粒

本发明的含SML组合物可提供各种不同形式，本文通常称为脂质颗粒。本文所用的“脂质颗粒”表示包括结构确定或不定的含SML颗粒。由于两亲分子由亲水性和疏水性区段构成，在水性环境中时，SML首基面对水，而它们的疏水性尾基彼此相互作用而产生片状双层，以及少量的其它凝聚结构(取决于脂质组成和条件)。因此，SML化合物根据脂质和水含量及温度可形成各种不同形状，包括球形(囊泡)、棒状(管状)和片状(平板)。这些形状代表相互作用以形成两维和三维晶格基质结构的基本单位，所述结构分类为片状相(例如，双层平板、封闭球形)、六角形相(例如，棒状)或立方体相(例如，经溶剂通道相连的球形、棒状或片状)。

当分子分散在溶剂中时，组织诸区段最有利的方法是形成疏水性和亲水性部分分隔入不同结构域中的结构。这些结构域和有组织的结构域形成的结构称为溶剂诱导的液晶相。这些相的例子是：胶束、片状、六角形、立方体和海绵相。诸相可以是正常和颠倒的。在前一情况中，界面向油弯曲，在颠倒情况中，界面向水弯曲。相的类型取决于全局参数(global parameter)，例如混合物的水油比和两亲分子更多的特性。在六角形相中，两亲分子凝聚成长度不定的圆柱形结构，这些圆柱形凝聚物沉积在六角形晶格上，从而得到相远程定向等级(phase long-range orientational order)。还可存在双连续立方体相。药物递送的更重要的相是胶束、立方体和片状。本文所述的两亲分子宜是或构成这些相中的一种或多种。

示范性质粒颗粒包括脂质体(例如，多-囊泡、多-片层脂质体、少-片层脂质体、单-片层脂质体，等等)、乳液(包括油和水乳液，例如水包油乳液、油包水乳液，等等，其中所述油可以是，例如甘油三酯)、固体核心乳液、脂质凝聚物(例如，六角形、立方体相)、脂质单层(例如，可以存在于表面上)、脂质泡沫，等等。

特别感兴趣的是含固醇修饰两亲脂质的脂质体和乳液，其还可任选包含感兴趣的试剂作为有效负载。术语“脂质体”包括脂双层体系所包封的任何区室。“脂质体”也称为脂质囊泡，其表示包括各种形式的脂质体，例如多层脂质体(平均直径通常是0.5-10微米，由与水相层交替的两种到上百个同心脂双层构成)、单层囊泡(通常由单脂质层构成，平均直径大致约20-约400纳米(nm)、约50-约300nm、约300-约400nm、约100-约200nm)、和其它囊泡形式，例如少-片层囊泡或多囊泡脂质体。

制备具有固醇修饰两亲脂质的组合物的方法

本发明还提供制备包含固醇修饰两亲脂质的组合物的方法。此类方法通常包括混合固醇修饰的两亲脂质与至少一种非固醇两亲脂质，和任选的用有效负载加载该组合物，所述有效负载可以是，例如治疗剂(例如，药物试剂、营养剂)、美容试剂、可检测试剂(例如，显像剂)。可在有缓冲剂、溶剂和赋形剂中的一种或多种存在下混合组合物。该方法还包括筛分脂质体的步骤，该步骤可在用有效负载加载脂质体之前或之后进行。这些方法任选可包括通过各种熟知的方法纯化脂质体，例如通过层析、相分离、溶剂萃取、冻干、再水合等。可纯化这些方法制备的组合物，从而组合物至少60％不含、通常是至少75％不含、最常见是至少90％不含杂质。

这些方法包括产生两亲脂质和固醇修饰两亲脂质具有一定摩尔比的含脂质组合物，从而提供组合物中固醇修饰两亲脂质含量如上所述的含脂质组合物。

不难通过可用的技术形成含有一种或多种固醇修饰两亲脂质颗粒的组合物。例如，将包含固醇修饰两亲脂质的脂质置于水性溶液中，并搅拌该溶液数秒到数小时的时间不难形成这种组合物。该简单的过程自发形成直径约1-10微米的、大的多片层脂质体或囊泡。这些脂质体由与存在脂质的水相层交替的两个到上百个同心脂双层构成。制备脂质体的进一步示范性方法如下所示。

如果需要提供含有包封了有效负载(例如，包封试剂、治疗剂、显像剂等)的脂质体的组合物，这些试剂可与包封量的一种或多种固醇修饰两亲脂质，例如一种或多种固醇修饰两亲磷脂一起包含在水相内。或者，如果感兴趣试剂是疏水性的，因而不易溶于水的话，这些试剂可包含在脂双层内。术语“包封量”指包封感兴趣试剂和形成所需大小脂质体需要的脂质用量。平均脂质体大小通常是直径小于10,000nm，更常见的是小于5,000nm，还要更常见的是约20-600nm。包封量取决于特定化合物和所选的工艺条件，但通常是约2∶1到约1∶100的化合物∶脂质，通常是约1∶1到约1∶20。或者，可采用遥控加载方法将有效负载引入脂质体。与上述加载方法相比，远端加载包括首先产生脂质体，然后通过离子梯度将有效负载引入该脂质体。

有效负载的掺入

含有固醇修饰两亲脂质的组合物可包含有效负载以便随脂质颗粒转运(例如用脂质体)。“有效负载”指含有固醇修饰两亲脂质的组合物中随含SML的组合物转运并由其递送的组分。代表性有效负载包括包含在脂质颗粒结构中(例如，脂质体内)，存在于脂质颗粒双层或单层中，作为SML脂质本身的一部分(例如，SML前药)或连接于脂质颗粒表面(例如，通过共价或非共价键)的组分。因此，“有效负载”可包含脂质颗粒所包封的组分(例如，药剂、营养剂、美容试剂、显像剂(例如，气体，包括空气)、放射性药物、核磁共振造影剂等)。在某些实施方式中，包封的有效负载通常作为晶体、作为粉末或它们的组合而处于溶液中。在一些实施方式中，有效负载是固醇修饰两亲脂质的组分，其可通过切割该化合物中存在的可切割键而释放(例如，固醇修饰两亲脂质用作前药的情况中)。在一些实施方式中，有效负载可以是病毒(例如，灭活或减毒的病毒)或细菌(例如，灭活或减毒的细菌)或核酸。

制备含药物脂质体悬液的方法通常遵循常规脂质体制备方法。在一个示范性方法中，将固醇修饰两亲脂质溶解于合适的有机溶剂或溶剂体系中，真空或在惰性气氛中干燥成脂质薄膜。可将感兴趣的亲脂性物质包含在形成薄膜的脂质中。可以在脂质溶液中提供要包封在脂质颗粒中和/或脂质颗粒双层内的有效负载(例如，脂质体中摩尔过量的最终最高所需浓度的物质)，从而有助于尽可能增强包埋。或者，如果感兴趣的物质是水溶性的(例如，更具亲水性)，该物质可包含在水性介质中以和脂质形成水合物。或者，可首先产生脂质颗粒(例如，脂质体)，再通过远程加载方法，例如提供有助于感兴趣物质进入脂质体的离子梯度(例如，硫酸铵梯度)将有效负载引入这些颗粒。

可通过，例如共价连接于脂质颗粒的固醇修饰两亲脂质的远端官能团而将有效负载连接于脂质颗粒的表面(实施例14)。适用于或可经改造用于连接有效负载的各种方法描述于，例如Liposomes：2nd edition(脂质体：第二版)，牛津大学出版社，2003，V.Torchilin和V.Weissig.编。

筛分

可筛分脂质体悬液以获得具有所需尺寸分布的囊泡，尺寸范围小于约1微米，通常是约0.05-0.5微米，最常见是约0.05-0.2微米。利用筛分排除较大的脂质体并产生具有最佳药代动力学特性的确定尺寸。

可采用几种技术降低脂质体的尺寸和尺寸异质性。通过水浴或探针超声处理(probe sonication)来超声处理脂质体悬液使得尺寸逐渐降低至尺寸小于约0.05微米的小单层囊泡(SUV)。匀浆是依赖于剪切力使大脂质体破碎成较小脂质体的另一种方法。在典型的匀浆过程中，MLV通过标准乳液匀浆器再循环直至观察到所选的脂质体尺寸，通常是约0.1-0.5微米。有硬球形珠存在下，在置于双重不对称离心机中的小瓶中加工脂质分散体可将脂质体颗粒直径降低至0.04-0.3微米。在这三种方法中，可通过常规的激光束粒度区分监测粒度分布。

脂质体经小孔聚碳酸酯膜挤出是将脂质体尺寸降低至相对良好确定的尺寸分布的有效方法，根据膜的孔径，该尺寸的平均值是0.05-8微米。悬液通常通过该膜循环数次直至获得所需脂质体尺寸分布。脂质体可经连续较小孔膜挤出，从而逐渐降低脂质体的尺寸。

离心和分子筛层析是可用于产生粒度低于所选阈值，即小于1微米的脂质体悬液的其它方法。这两种方法均涉及除去较大的脂质体，而不是将大颗粒转化成较小的颗粒。脂质体产率相应降低。

除去游离的有效负载材料

可以除去未掺入的有效负载或“游离”有效负载，例如以增加组合物中脂质体包埋的有效负载的比例。可将所述除去设计成能将游离物质的最终浓度降低至小于组合物中存在的总有效负载(例如，总药物)的约20％，通常是小于约10％。

可采用几种方法除去脂质体悬液中的游离有效负载。可通过高速离心沉淀筛分的脂质体悬液，游离的有效负载和非常小的脂质体维持在上清液中。另一种方法包括通过超滤浓缩该悬液；然后将浓缩的脂质体重悬在无试剂的替代介质中。或者，可采用凝胶过滤分离较大的脂质体颗粒与溶质分子。

除去游离有效负载的一种示范性方法利用能结合游离而非脂质体结合形式的物质的离子交换树脂。可依据在，例如中性pH下游离物质的电荷选择阳离子交换或阴离子交换树脂。

含固醇修饰两亲脂质的组合物的有效负载

可利用含固醇修饰两亲脂质的组合物来促进递送与该组合物结合的有效负载。如上所示，有效负载指含固醇修饰两亲脂质的组合物中由该含固醇修饰两亲脂质的组合物转运的组分，因此，可包括，例如包含在脂质颗粒结构中(例如，脂质体内)，存在于脂质颗粒双层中，或连接于脂质颗粒表面(例如，通过共价或非共价键)的组分。

因此，有效负载可以是各种不同的物质，它们可适用于各种不同应用，包括但不限于：药学、营养学、美容学和诊断领域。示范性物质包括但不限于：二膦酸盐、碳铂、顺铂、奥沙利铂(oxaloplatin)、卡莫司汀、喜树碱、环丙沙星、氯甲烷、环磷酰胺、环杷明、阿糖胞苷、达卡巴嗪、视黄酸、去氧氟尿苷、氟代乳清酸(fluoroortic acid)、格尔德霉素、吉西他滨、棉酚、异磷酰胺、羟基他莫昔芬、伊立替康(inrinotecan)、植酸、蛋白激酶抑制剂、紫杉醇、白藜芦醇、紫杉烷、甲基硒代-半胱氨酸、氨甲蝶呤、6-硫鸟嘌呤、酪氨酸磷酸化抑制剂、汉黄芩(黄)素、依托泊苷、反义寡核苷酸、siRNA、化学修饰的RNA、柠檬酸盐、1、2、3、4丁烷四羧酸、八硫酸蔗糖(octasulfate sucrose)、多磷酸盐、环丙沙星(ciprofloxicin)、吗啡、羟吗啡酮、丁丙诺啡和美沙酮。这些试剂可以单独包封或与另一试剂包封在同一脂质体中(例如，一种或多种试剂。两种或更多种试剂)，从而提供协同作用。

特别感兴趣的有效负载包括但不限于：抗癌症化疗剂(例如，阿霉素、柔红霉素(danorubicin)、喜树碱、顺铂等)、抗生素(例如，抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂等)、镇痛剂、麻醉剂、抗痤疮剂、生物分子(例如，核酸(例如，RNA、DNA、siRNA等)、多肽(例如，肽，包括重组多肽和肽，包括天然或化学修饰的多肽和肽(例如，PEG化的多肽))、抗体等)、抗原性物质(例如，可以是疫苗的组分)、抗-血液凝结剂、治疗神经再生性疾病(neurogenerative disease)的化合物、麻醉剂，例如苯佐卡因、氯普鲁卡因、可卡因、普鲁卡因、丁卡因、布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、芬太尼和三甲卡因，镇痛剂，例如双氯芬酸和能将离子梯度加载入脂质体的分子，例如硫酸铵、硫酸三乙胺、八硫酸蔗糖的三乙胺盐、三乙胺多磷酸盐、植酸的铵盐、乙酸的钠、三乙胺或铵盐、草酸的钠、三乙胺或铵盐、丙酸的钠、三乙胺或铵盐、琥珀酸的钠、三乙胺或铵盐、1，2，3，4丁烷四羧酸的钠、三乙胺或铵盐、吡啶-2，3，5，6四羧酸的钠、三乙胺或铵盐、1，2，4，5-苯四羧酸的钠、三乙胺或铵盐、1，2，4，5-环己烷四羧酸的钠、三乙胺或铵盐、1，3，5-苯三羧酸的钠、三乙胺或铵盐、多胺，例如精胺、亚精胺、三氨基乙胺等的乙酸盐。

还可利用美容剂(例如，黄酮类化合物、抗氧化剂，例如γ-亚麻酸、β胡萝卜素、花青素、β-谷固醇)和饮食添加剂(例如，维生素)作为本发明脂质组合物中的有效负载。

可用作本发明组合物的有效负载的示范性美容剂可包括水合试剂(hydrating agent)、蛋白质(例如，胶原)、维生素、植物化学品、酶、抗氧化剂、精油、UV保护剂(例如，羟苯甲酮)、清洁剂、色素、芳香剂等(例如，可用于美容品、化妆品、芳香剂、香料、皮肤护理产品和美容助剂)。视黄酸特别有用，特别是用于皮肤护理产品的含视黄酸的固醇修饰两亲脂质的乳液。

诊断剂包括可检测标记物，其可以是放射性标记物、荧光团、发光团、核磁共振造影剂，例如钆、正电子发射断层摄影术标记物等。在一些实施方式中，脂质体本身可用作诊断剂，例如在超声诊断中用作微泡。

特别感兴趣的是可用作毒性药物(例如，各种癌症化疗剂，阿霉素、柔红霉素、喜树碱等)和/或水溶性差的药物(例如，两性霉素B、视黄酸等)的药物运载体的含固醇修饰两亲脂质的组合物。用作疫苗运载体的含固醇修饰两亲脂质的组合物也是特别感兴趣的，特别是显示储存稳定性的那些(例如，环境温度下和/或4℃)。

作为活性试剂或前药的固醇修饰的两亲脂质

在一些实施方式中，固醇修饰的两亲脂质或该化合物的组分用作有效负载。例如，固醇修饰的两亲脂质本身可以是药物或前药。例如，固醇修饰的两亲脂质的固醇可以是当存在于该固醇修饰的两亲脂质中和/或切割可切割接头后从该固醇修饰的两亲脂质释放时能提供有益作用的物质。在一示范性实施方式中，固醇修饰的两亲脂质的固醇是β-谷固醇，其可用于高胆固醇血症治疗。或者或此外，固醇修饰的两亲脂质的非固醇疏水性尾部可以是当存在于该固醇修饰的两亲脂质中和/或切割可切割接头后从该化合物释放时能提供有益作用的物质。例如，固醇修饰的两亲脂质的非固醇疏水性尾部可以是视黄酸。

其它组分

除有效负载外，含有固醇修饰的两亲脂质的组合物可包含其它活性或惰性物质。例如，脂质体组合物可包含降低要用该组合物递送的药物毒性和/或降低脂质体组分的毒性的药物保护性化合物。例如，这种额外的物质可包括亲脂性自由基捕捉剂，例如α-生育酚，或其药学上可接受的类似物或酯，例如α-生育酚琥珀酸酯。其它合适的自由基猝灭剂包括丁羟甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(奥古斯汀(Augustin))和它们在药理学上可接受的盐。还可使用对于人给药可接受的其它亲脂性自由基猝灭剂。可通过，例如包封或膜结合将此类额外试剂与感兴趣的试剂共同包埋。含固醇修饰的两亲脂质的组合物还可包含一种或多种显像剂，从而能在体内确定和/或追踪加载药物的脂质体的位置。

本发明脂质体的水性悬液优选包含增强该脂质体耐受性的物质从而减少脂质体脂质的氧化降解。水溶性离子特异性螯合剂，例如除铁灵(高铁氧胺)是该类物质的示例。

制剂

可将组合物配制成用于各种不同给药途径，包括胃肠外、肠道、鼻部和肺部给药，并可包含一种或多种赋形剂。示范性制剂包括局部、经皮、可注射(例如，静脉内、肌肉内、皮下)、气溶胶和口服制剂，可配制成药物制品、美容制品、营养制品，等等。可以将含有固醇修饰两亲脂质的组合物冻干，或可储存在溶液中。

因此，含有固醇修饰的两亲脂质的组合物包括含有固醇修饰的两亲脂质和可接受的运载体或载体的制剂。该制剂的可接受剂型包括但不限于：水性溶液、悬液、分散液、润肤露、洗液、乳膏、药膏、香膏和软膏。还可借助片剂或胶囊(例如，溶解于消化道中)以及栓剂给予固体形式的固醇修饰两亲脂质组合物。还可在器件，例如贴片、绷带等中提供组合物。

除了固醇修饰的两亲脂质和所需的有效负载外，局部制剂可包含适合施加于动物的皮肤或粘膜的药学上可接受的局部运载体。可用各种合适的剂型提供局部制剂，包括但不一定限于洗液、凝胶、药膏、乳膏、香膏、软膏等。这些组合物可以是水性溶液或乳液的形式，例如油和水乳液(例如，水包油乳液或油包水乳液)。如果需要，局部制剂可包含渗透增强剂或帮助经皮肤递送的其它试剂。

通常可利用生理上可接受的运载体、赋形剂、稳定剂等配制本文考虑的剂型，这些剂型可以是缓释或定时释放剂型。治疗应用的可接受的运载体、赋形剂和稀释剂是药学领域熟知的，描述于，例如Remington′s Pharmaceutical Science(雷明顿药物科学)(A.R.Gennaro编，马克出版公司(Mack Publishing Co.)，1985)。这些物质在所用剂量和浓度下对于接受者是无毒的，其包含缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸盐；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(低于约10个残基)肽，例如聚精氨酸；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸；单糖；二糖和其它碳水化合物，包括纤维素及其衍生物，葡萄糖、甘露糖和糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇和山梨醇；在局部制剂中包含阳离子型和非离子型表面活性剂，例如吐温、普朗尼克(PLURONICS)和PEG。

用于治疗给药的制剂必须无菌。经无菌膜过滤，或通过其它常规方法，例如辐射或用气体、加热或高压处理不难实现无菌。本发明制剂的pH通常是3-11，更优选5-9。可给予需要用本发明制剂治疗的对象(通常是哺乳动物)将提供最佳疗效的剂量。给药的剂量和方法可依对象而有所不同，取决于诸如所治疗宿主的类型等因素，以动物为例，包括其性别、体重、饮食、目前的治疗、总体临床情况、所用的特定疏水性化合物、这些化合物的具体用途和本领域技术人员知道的其它因素。本领域技术人员能测定有效剂量水平，即，获得所需结果的剂量水平。

可将制剂制备成能在适于保留任何有效负载的活性以及维持固醇修饰两亲脂质和可能存在的其它脂质的完整性的条件下储存。如实施例所示，含有固醇修饰两亲脂质的脂质体在4℃稳定1年或更长时间，因此4℃储存适于长期维持本文所述的固醇修饰的两亲脂质组合物。

固醇修饰的两亲脂质的使用方法

含固醇修饰的两亲脂质的组合物可用于各种不同的药学、美容、诊断和生物医学领域。示范性的应用如下所示。

例如，药学、营养学和美容应用通常包括将含有固醇修饰的两亲脂质的组合物给予动物对象。通常可经由任何合适的途径(例如，胃肠外、肠道、鼻部、肺部等)使得动物与组合物接触来实现给药。就这些应用而言，所述动物是需要治疗的对象，因为该对象需要治疗或可从这种治疗获益。就治疗方法而言，本文所用的“动物对象”通常指需要治疗的对象，和/或就诊断方法而言，指怀疑患有可通过该诊断方法检测的疾病的对象。对象包括动物，包括哺乳动物，例如人、牲畜、宠物等。

本文通常利用术语“治疗”等表示获得所需药理学和/或生理学作用。就完全或部分防止疾病或其症状而言，该作用可以是预防性的，和/或就部位或完全稳定或治愈某疾病和/或逆转该疾病所致不利作用而言，该作用可以是治疗性的。本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人中疾病的任何治疗，包括：(a)防止倾向于产生疾病或症状但尚未诊断到具有疾病或症状的对象中疾病或症状的发生；(b)抑制疾病症状，即，使其发展停滞；或(c)缓解疾病症状，即，导致疾病或症状消退。

可根据待治疗的对象和病症以及需要给药带来的益处来选择含有固醇修饰的两亲脂质的组合物及其有效负载。

含有固醇修饰的两亲脂质的组合物还可用于诊断方法。此类方法包括通过检测动物对象的生物学样品中的分析物来诊断病症。

本文所用的“诊断”通常包括测定对象对疾病或病症的敏感性，测定目前对象是否收疾病或病症影响，预后受疾病或病症影响的对象，和治疗剂的使用(例如，监测对象的情况以提供给予治疗作用或效力的信息)。术语“生物学样品”包括从生物体获得的各种样品类型，其可用于诊断或监测试验。该术语包括生物来源的血液和其它液体样品、实体组织样品，例如活检样本或组织培养物或源于其的细胞及其后代。该术语包括获得后以各种方式操作的样品，例如用试剂处理、溶解或富集某些组分。该术语包括临床样品，还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解液、血清、血浆、生物流体和组织样品。

利用含有固醇修饰两亲脂质的组合物的诊断方法通常包括检测流体中分析物存在与否，该方法包括使得该液体与含有固醇修饰两亲脂质的组合物接触，检测脂质组合物中的变化，其中脂质组合物中的变化表示分析物的存在与否。脂质组合物中的变化可以是，例如颜色改变(例如，由于所包封荧光团的发射波长改变)，由于含有固醇修饰两亲脂质的组合物中存在的可聚合固醇修饰两亲脂质的聚合程度增加或降低，含有固醇修饰两亲脂质的脂质体的尺寸或完整性变化，等等。因此，可通过评估脂质组合物的特性，例如光学特性(如，反射率)、相转变等来检测脂质组合物中的变化。

其它应用

含有固醇修饰两亲脂质的组合物在与治疗或诊断不直接相关的领域中也有各种应用。例如，利用含有固醇修饰的两亲脂质的组合物有助于将有效负载(例如，核酸、多肽)体外递送至细胞。在该方法中，培养的动物细胞(例如，培养的哺乳动物细胞，如人细胞)与含有感兴趣的有效负载的固醇修饰两亲脂质组合物接触，从而有助于将该有效负载递送至该细胞。可采用此类方法引入不易穿过动物细胞膜的核酸、多肽或其它化合物。

在另一实例中，具有鞘氨醇的固醇修饰两亲脂质可用于脂质筏建模以及递送膜蛋白。

固醇修饰的两亲脂质还可用作人工双层，因此可用于诸如生物传感器等设置中。涉及利用人工双层的生物传感器是本领域熟知的。它们尤其适用于脂质表面与血液、血浆、血清或含细胞、蛋白质或脂质的其它体液直接接触的情况。

试剂盒与系统

提供的试剂盒和系统可促进本文所述组合物的产生和/或利用。本文考虑的试剂盒可包含一种或多种固醇修饰的两亲脂质，要递送的感兴趣试剂，它们可以在不同容器中提供，或者通常在无菌容器中以单一组合物提供。

此外，试剂盒可装有利用试剂盒诸组分，特别是装在试剂盒中的本发明组合物的使用说明书。

实施例

列出以下实施例是为本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本发明，而非试图限制发明人所认为的发明范围，也不是想要表示以下实验是所进行的全部或唯一的实验。已努力确保所用数值(例如，含量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有表示，部分是重量部分，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，而压力是或接近大气压。

方法与材料

以下是以下实施例所用的通用材料和方法。

试剂：甘油硫酸胆碱购自加利福尼亚州托兰斯的巴开姆公司(BACHEM，Torrance，CA)。溶血磷脂购自阿拉巴马州阿拉巴斯特的阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)。其它试剂购自威斯康星州密尔沃基的阿尔德里奇公司(Aldrich，Milwaukee，WI)。溶剂可直接使用，或在使用前根据标准方法纯化或干燥。

技术.采用各种展开系统，利用0.25-mm硅胶F254平板进行TLC分析：(A)CHCl3/MeOH/NH4OH(65/25/4)；(B)CHCl3/MeOH/NH4OH(65/35/5)；(C)CHCl3/MeOH/H2O(65/25/4)；(D)己烷/EtOAc(2/1)；(E)己烷/EtOAc(10/1)；(F)己烷/EtOAc(5/1)；(G)甲苯/醚(9/1)；(H)甲苯/醚(1/1)。利用弗吉尼亚州夏洛茨维尔的拜尔泰格公司(Biotage，Charlottesville，VA)的配有预装填硅胶柱(40-63μm)的HorizonTM HPFCTM系统进行高效快速层析(HPFC)。除非另有注释，描述溶剂混合物的组成的比例表示相对体积。用Varian 400MHz仪器或Bruker 300mHz仪器获得1H NMR图谱。利用四甲基硅烷作为内标，化学位移表示为百万分之一。J值以赫兹计。在加利福尼亚州大学旧金山分校的质谱中心(Mass Spectrometry Facility，University of California San Francisco)获得MALDI-TOF质谱。

合成方法.合成所用的通用方法如下所述。

保护1-取代甘油的3-羟基：50℃，无水条件下，将1-取代甘油和三苯基氯(1.5当量)的混合物在无水吡啶中加热18小时。冷却至室温(r.t.，约23℃)后，将混合物倒入冰冷却的水中，用3份己烷萃取。过滤除去未溶解的三苯基甲醇用水洗涤滤液三遍，无水硫酸钠干燥。蒸发溶剂，将残留物溶解于最少量的己烷中。4℃静置过夜将额外的三苯基甲醇从溶液中沉淀下来。滤出固体，将滤液蒸发至干。高真空干燥残留物，直接用于下一反应步骤。通过TLC监测反应，产率通常为80-90％。

除去1，2-取代的-3-三苯甲基甘油的三苯甲基：0℃，用三氟化硼二乙基醚合物(boron trifluoride diethyl etherate)(4当量)处理1，2-取代的-3-三苯甲基甘油3小时。用水/氯仿/甲醇(2∶2∶1)洗涤溶液。有机层经硫酸钠干燥并蒸发。干燥残留物，直接用于下一反应步骤。通过TLC监测反应，产率高于90％。

磷酸化1，2-取代-甘油：0℃，将1，2-取代甘油和无水吡啶(2当量)的无水四氢呋喃基(THF)溶液滴加入THF配制的新鲜蒸馏磷酰氯(1.1当量)中，并搅拌。0℃，继续搅拌2-3小时。然后加入10％碳酸氢钠(约5当量)，0℃搅拌该混合物15分钟。然后将溶液倒入冰水，用HCl(pH约为2)酸化并用乙醚萃取。将丙酮加入水以沉淀水层中的产物。将沉淀物与醚萃取的产物合并，与甲苯共沸干燥，直接用于下一反应步骤。产率通常高于90％。

1，2-取代-甘油-硫酸胆碱：将1，2-取代-甘油磷酸、胆碱四苯基硼酸酯(2当量)和2，4，6-三异丙基(triisoproyl)苯磺酰氯(TPS)(2.5当量)溶解于无水吡啶中并简单加热，然后在70℃搅拌1小时，再于室温搅拌3小时。加入水后，通过旋转蒸发除去溶剂。用乙醚萃取残留物两次。合并萃取物并蒸发。通过HPLC纯化粗产物。该步骤的产率通常是80-90％。

实施例1：制备脂质SML1A、SMLB和SMLC

合成本文称为SML1a、SML1b和SML1c(统称为SML1a-SML1c)的脂质的合成方案如流程1所示。以下合成脂质SML1a-c的详述示例了该流程。

流程1.合成aSML1a-c

a试剂和条件.(A)三苯甲基氯(1.03当量)、ZnCl2(0.95当量)、DMF，4℃，10小时；(B)异氰酸烷基酯(1.0当量)、DMSO，100℃，24小时；(C)CHCl3配制的TFA(16.7％)，室温下，4小时；(D)氯甲酸胆固醇酯(5当量)、DIPEA(5.2当量)、CHCl3，室温，16小时。“Tr”表示三苯甲基。“Chol-OH”＝胆固醇。

1-O-三苯甲基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(6)：将氯化锌粉末(无水，25g，175mmol)加入甘油磷酸胆碱(50g，185mmol)的无水DMF(500mL)悬液中。室温下，将混合物搅拌30分钟，4℃，加入三苯甲基氯(53g，190mmol)。将反应体系维持于4℃，10小时。然后加入1L乙醚使粗产物沉淀。将油性产物溶解于1L氯仿/异丁醇(2∶1)，用300ml4％氨水洗涤，无水硫酸钠干燥。蒸发挥发物后，用甲苯共沸干燥粗产物。室温下，用乙腈研磨残留物5小时。然后收集白色沉淀物，高真空干燥。产量：45.2g(49重量％甘油磷酸胆碱)。TLC：Rf＝0.08(洗脱剂A)。1H NMR(MeOH-d4)，δ3.12(m，2H)；3.15(s，9H)；3.56(m，2H)；3.90(m，2H)；4.01(m，1H)；4.20(m，2H)；7.27(m，9H)；7.42(m，6H)。为C27H35NO6P+计算的MALDI-MS[M+H]+500.22，实测500.31。

1-O-三苯甲基-2-硬脂酰基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(7a)：向6(1g，2mmol)的二甲基亚砜(无水，10mL)溶液中加入异氰酸十八烷酯(0.6g，2mmol)。100℃，在N2下搅拌反应混合物24小时。蒸发溶剂后，用甲醇提取残留物。滤出白色固体，将滤液蒸发至干。粗产物经HPFC纯化(CHCl3/MeOH/H2O，35/13/2)。产量：450mg(28.3重量％6).TLC：Rf＝0.25(洗脱剂A)。1H NMR(CDCl3)，δ0.89(t，J＝6.4，3H)；1.25-1.31(m，30H)；1.47(m，2H)；3.01(m，2H)；3.20(s，9H)；3.27(m，2H)；3.72(m，2H)；4.03-4.12(m，3H)；4.24(m，2H)；5.07(br，1H)；7.20(m，9H)；7.41(m，6H)。为C46H72N2O7P+计算的MALDI-MS[M+H]+795.51，实测795.52。

1-O-三苯甲基-2-棕榈基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(7b)：按照7a相同的方法合成该化合物，直接用于下一反应步骤。

1-O-三苯甲基-2-肉豆蔻基氨甲酰基-sn-甘油式-3-磷酸胆碱(7c)：按照7a相同的方法合成该化合物，直接用于下一反应步骤。

1-羟基-2-硬脂酰基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(8a)：室温下，在氯仿(5mL)中用三氟乙酸(TFA，1mL)处理化合物7a(420mg，0.52mmol)，4小时。蒸发挥发物，残留物经HPFC纯化(CHCl3/MeOH/H2O，10/5/1)。产量：320mg(99重量％7a)。TLC：Rf＝0.05(洗脱剂B)。1H NMR(CDCl3)，δ0.88(t，J＝6.4，3H)；1.21-1.31(br，30H)；1.47(m，2H)；3.03(m，1H)；3.11(m，1H)；3.29(s，9H)；3.66(m，2H)；3.76(m，2H)；3.99(m，2H)；4.30(m，2H)；4.78(m，1H)；6.51(br，1H)。为C27H58N2O7P+计算的MALDI-MS[M+H]+553.40，实测553.38。

1-羟基-2-棕榈基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(8b)：按照8a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.05(洗脱剂B)。1H NMR(CDCl3)，δ0.89(t，J＝6.4，3H)；1.21-1.31(br，26H)；1.48(m，2H)；3.03(m，1H)；3.11(m，1H)；3.30(s，9H)；3.66-3.76(m，4H)；4.0(m，2H)；4.30(m，2H)；4.79(m，1H)；6.52(br，1H)。为C25H54N2O7P+计算的MALDI-MS[M+H]+525.37，实测525.28。

1-羟基-2-肉豆蔻基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(8c)：按照8a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.05(洗脱剂B)。1H NMR(CDCl3)，δ0.89(t，J＝6.4，3H)；1.21-1.31(m，22H)；1.47(m，2H)；3.03(m，1H)；3.11(m，1H)；3.29(s，9H)；3.66-3.76(m，4H)；3.99(m，2H)；4.30(m，2H)；4.78(m，1H)；6.52(br，1H)。为C23H50N2O7P+计算的MALDI-MS[M+H]+497.34，实测497.36。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-硬脂酰基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML1a，ChcSaPC)：室温下，向8a(0.3g，0.54mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA，0.5mL，2.8mmol)的干燥无乙醇氯仿(10mL)溶液中滴加无乙醇氯仿(5mL)配制的氯甲酸胆固醇酯(1.21g，2.7mmol)。室温下反应16小时后，蒸发挥发物，残留物经HPFC纯化(CHCl3/MeOH/H2O，40/18/3)。产量：438mg(84重量％8a)。TLC：Rf＝0.28(洗脱剂A)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，68H)；1.78-2.01(m，5H)；2.38(m，2H)；3.03(m，1H)；3.17(m，1H)；3.38(s，9H)；3.88(m，2H)；4.0(m，2H)；4.25(m，1H)；4.36(m，4H)；5.08(m，1H)；5.39(1H，d，J＝4.4)；6.02(br，1H)。为C55H102N2O9P+计算的MALDI-MS[M+H]+965.73，实测965.68。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-棕榈基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SNK1b，ChcPaPC)：按照SML1a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.23(洗脱剂A)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，64H)；1.78-2.01(m，5H)；2.37(m，2H)；3.0(m，1H)；3.16(m，1H)；3.37(s，9H)；3.88(m，2H)；3.98(m，2H)；4.24(m，1H)；4.36(m，4H)；5.07(m，1H)；5.39(1H，d，J＝4.4)；6.17(br，1H)。为C53H98N2O9P+计算的MALDI-MS[M+H]+937.70，实测937.69。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-肉豆蔻基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML1c，ChcMaPC)：按照SML1a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.25(洗脱剂A)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，60H)；1.78-2.06(m，5H)；2.38(m，2H)；3.03(m，1H)；3.17(m，1H)；3.38(s，9H)；3.88(m，2H)；4.0(m，2H)；4.25(m，1H)；4.36(m，4H)；5.08(m，1H)；5.40(1H，d，J＝4.4)；6.02(br，1H)。为C51H94N2O9P+计算的MALDI-MS[M+H]+ 909.67，实测909.70。

实施例2制备脂质SML2A、SML2B、SML2C和SML2D

合成脂质SML2a、SML2b、SML2c和SML2d(统称为SML2a-SML2d)的合成方案如流程2所示。以下合成脂质SML2a-c的详述示例了该流程。

流程2.合成aSML2a、SML2b、SML2c和SML2d

a试剂和条件.(A)1)NaH(1.2当量)、甲苯，室温下，30分钟；2)碘烷(1.25当量)，回流，过夜；(B)HCl(浓)，MeOH(10％)配制，回流，5小时；(C)氯甲酸胆固醇酯(1.05当量)、DIPEA(1.4当量)、DMAP(0.5当量)、CHCl3，0℃，0.5小时，然后在室温下，过夜；(D)POCl3(1.1当量)、吡啶(2当量)、THF，0℃，2-3小时；(E)胆碱四苯基硼酸酯(2当量)、TPS(2.5当量)、吡啶，70℃，1小时，然后在室温下，3小时。“Chol-OH”＝胆固醇。

1，3-苯亚甲基-2-硬脂酰基-甘油(9a)：室温下，将1，3-苯亚甲基甘油(7.2g，40mmol)的甲苯(100mL)溶液加入NaH(60％，矿物油配制，1.92g，48mmol，用己烷洗涤)的甲苯(30mL)悬液，并搅拌。然后将甲苯(40mL)配制的1-碘-十八烷(20g，50mmol)滴加入该反应混合物。加入后，将该混合物在氮气中回流过夜，冷却至室温。小心地将水加入该混合物以破坏过量的NaH。然后用水(100mL×2)洗涤反应混合物。收集有机层，硫酸钠干燥。蒸发溶剂，将残留物直接用于下一反应步骤。

1，3-苯亚甲基-2-棕榈基-甘油(9b)：按照9a相同的方法合成该化合物。

1，3-苯亚甲基-2-肉豆蔻基-甘油(9c)：按照9a相同的方法合成该化合物。

1，3-苯亚甲基-2-油基-甘油(9d)：按照9a相同的方法合成该化合物。

2-硬脂酰基-甘油(10a)：通过在HCl(浓，30mL)和甲醇(270mL)的混合溶液中回流5小时来水解粗产物9a。将反应混合物冷却至室温，减压蒸发。将残留物溶解于乙醚(300mL)，用氢氧化钠溶液(0.5M，100mL)和水(150mL×2)连续洗涤。然后干燥醚层并蒸发。粗产物经HPFC纯化(30-80％乙酸乙酯-己烷)。产量：11.3g(82重量％1，3-苯亚甲基甘油)。TLC：Rf＝0.17(洗脱剂D)。1H NMR(CDCl3)，δ0.86(t，J＝6.4，3H)；1.29(br，30H)；1.58(m，2H)；3.44-3.78(m，7H)。为C21H45O3+计算的MALDI-MS[M+H]+345.34，实测345.33。

2-棕榈基-甘油(10b)：按照10a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.16(洗脱剂D)。1H NMR(CDCl3)，δ0.86(t，J＝6.4，3H)；1.29(br，26H)；1.57(m，2H)；3.44-3.78(m，7H)。为C19H41O3+计算的MALDI-MS[M+H]+317.31，实测317.28。

2-肉豆蔻基-甘油(10c)：按照10a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.18(洗脱剂D)。1H NMR(CDCl3)，δ0.87(t，J＝6.4，3H)；1.29(br，22H)；1.58(m，2H)；3.44-3.78(m，7H)。为C17H37O3+计算的MALDI-MS[M+H]+289.28，实测289.26。

2-油基-甘油(10d)：按照10a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.17(洗脱剂D)。1H NMR(CDCl3)，δ0.87(t，J＝6.4，3H)；1.29(br，22H)；1.58(m，2H)；2.0(m，4H)；3.44-3.78(m，7H)；5.34(m，2H)。为C21H43O3+计算的MALDI-MS[M+H]+343.32，实测343.32。

1-胆固醇基羰基(cabonoyl)-2-硬脂酰基-甘油(11a)：0℃，向10a(0.7g，2mmol)、DIPEA(0.5mL，2.8mmol)和DMAP(0.12g，1mmol)的干燥无乙醇氯仿(10mL)溶液中滴加氯甲酸胆固醇酯(0.94g，2.1mmol)氯仿溶液(10mL)。0℃，搅拌该反应混合物0.5小时，然后在室温下过夜。蒸发挥发物，粗产物经HPFC纯化(5-15％乙酸乙酯-己烷)。TLC：Rf＝0.41(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，68H)；1.78-2.01(m，5H)；2.40(m，2H)；3.52(m，2H)；3.60(m，2H)；3.68(m，1H)；4.22(m，2H)；4.43(m，1H)；5.40(1H，d，J＝4.4)；为C49H89O5+计算的MALDI-MS[M+H]+757.67，实测757.68。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-棕榈基-甘油(11b)：按照11a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.39(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，64H)；1.79-2.01(m，5H)；2.39(m，2H)；2.80(m，1H)；3.51(m，2H)；3.61(m，2H)；3.72(m，1H)；4.21(m，2H)；5.39(1H，d，J＝4.4)；为C47H85O5+计算的MALDI-MS[M+H]+729.64，实测729.61。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-肉豆蔻基-甘油(11c)：按照11a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.40(洗脱剂E).1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，60H)；1.78-2.02(m，5H)；2.38(m，2H)；2.82(m，1H)；3.51(m，2H)；3.60(m，2H)；3.72(m，1H)；4.22(m，2H)；5.41(1H，d，J＝4.4)；为C45H81O5+计算的MALDI-MS[M+H]+711.69，实测711.68。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-油基-甘油(11d)：按照11a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.40(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，60H)；1.78-2.01(m，9H)；2.38(m，2H)；3.51(m，2H)；3.60(m，2H)；3.71(m，1H)；4.22(m，2H)；4.46(m，1H)；5.35(m，2H)；5.40(d，J＝4.4，1H)；为C49H87O5+计算的MALDI-MS[M+H]+755.66，实测755.62。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-硬脂酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(12a)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.05(洗脱剂A)。为C49H89NaO8P+计算的MALDI-MS[M+Na]+859.62，实测859.60。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-棕榈基-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(12b)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.05(洗脱剂A)。为C47H85NaO8P+计算的MALDI-MS[M+Na]+831.59，实测831.61。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-肉豆蔻基-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(12c)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.05(洗脱剂A)。为C45H81NaO8P+计算的MALDI-MS[M+Na]+803.56，实测803.55。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-油基-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(12d)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.05(洗脱剂A)。为C49H87NaO8P+计算的MALDI-MS[M+Na]+857.60，实测857.62。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-硬脂酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML2a，ChcSePC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.3(洗脱剂A)。δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，68H)；1.78-2.04(m，5H)；2.38(m，2H)；3.41(s，9H)；3.52(m，2H)；3.68(m，1H)；3.88(m，4H)；4.19(m，1H)；4.35(m，4H)；5.39(1H，d，J＝4.4)；为C54H101NO8P+计算的MALDI-MS[M+H]+922.73，实测922.74。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-棕榈基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML2b，ChcPePC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.3(洗脱剂A)。δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，64H)；1.78-2.04(m，5H)；2.38(m，2H)；3.41(s，9H)；3.52(m，2H)；3.68(m，1H)；3.88(m，4H)；4.19(m，1H)；4.35(m，4H)；5.39(1H，d，J＝4.4)；为C52H97NO8P+计算的MALDI-MS[M+H]+894.69，实测894.70。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-肉豆蔻基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML2c，ChcMePC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.3(洗脱剂A)。δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，60H)；1.78-2.04(m，5H)；2.38(m，2H)；3.41(s，9H)；3.52(m，2H)；3.68(m，1H)；3.88(m，4H)；4.19(m，1H)；4.35(m，4H)；5.39(1H，d，J＝4.4)；为C52H97NO8P+计算的MALDI-MS[M+H]+866.66，实测866.67。

1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-油基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML2d，ChcOePC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.3(洗脱剂A)。δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，60H)；1.78-2.04(m，9H)；2.39(m，2H)；3.40(s，9H)；3.54(m，2H)；3.70(m，1H)；3.84-3.97(m，4H)；4.20(m，1H)；4.35-4.44(m，4H)；5.35(m，2H)；5.39(1H，d，J＝4.4)；为C54H99NO8P+计算的MALDI-MS[M+H]+920.71，实测920.73。

实施例3制备脂质SML3A、SML3B、SML3C和SML3D

合成脂质SML3a、SML3b、SML3c和SML3d(统称为SML3a-SML3d)的合成方案如流程3所示。以下合成脂质SML3a-d的详述示例了该流程。

流程3.合成aSML3a-d

a试剂和条件.(A)甲苯磺酸胆固醇酯、甲苯，90℃，4小时；(B)TFA-HCl(浓)2∶1，THF，室温，4小时；(C)三苯甲基氯(1.5当量)、吡啶，50℃，18小时；(D)脂族酸(1.05当量)、DCC(1.05当量)、DMAP(0.3当量)、CHCl3，室温，过夜；(E)BF3.Et2O(4当量)，CHCl3，0℃，3小时；(F)POCl3(1.1当量)、吡啶(2当量)、THF，0℃，2-3小时；(G)胆碱四苯基硼酸酯(2当量)、TPS(2.5当量)、吡啶，70℃，1小时，然后在室温下，3小时。“Tr”值三苯甲基。“Chol-OH”＝胆固醇。

3-(2，3-异亚丙基-1-甘油基)胆固醇(13)：80-90℃，在氮气气氛中搅拌甲苯磺酸胆固醇酯(50g，90mmol)和丙酮缩甘油(solketal)(250mL，2mol)在甲苯(50mL)中的混合物4小时。冷却至室温后，将甲苯(300mL)加入该混合物。用盐水(300mL)洗涤混合物。分离后，再向有机层加入200mL甲苯。然后用盐水(300mL)洗涤有机层，干燥并蒸发至干。粗产物直接用于下一反应步骤。TLC：Rf＝0.55(洗脱剂G)。

1-甘油基胆固醇(14)：将粗产物13溶解于THF(130mL)-TFA(40mL)-HCl(浓，20mL)的混合溶剂中。将该混合物维持在室温下4小时。减压蒸发挥发物。将残留物溶解于CHCl3/MeOH(400mL/100mL)中，用水(100mL)洗涤。然后用硫酸钠干燥有机层，过滤并蒸发。粗产物经-20℃，乙醇重结晶纯化。TLC：Rf＝0.12(洗脱剂H)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，33H)；1.78-2.31(m，7H)；3.10(m，1H)；3.45-3.70(m，4H)；3.79(m，1H)；5.34(1H，d，J＝4.4)；为C30H53O3+计算的MALDI-MS[M+H]+461.40，实测461.44。

1-胆固醇基-3-三苯甲基甘油(15)：按照通用方法用三苯甲基保护14的3-羟基。产物经HPFC纯化(9％-25％乙酸乙酯-己烷)。TLC：Rf＝0.38(洗脱剂F)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，33H)；1.86(m，3H)；2.0(m，2H)；2.18(m，1H)；2.32(m，1H)；2.42(br，1H)；3.11-3.22(m，3H)；3.57(m，2H)；3.93(m，1H)；5.35(1H，d，J＝4.4)；7.28(m，9H)；7.43(m，6H)。为C49H67O3+计算的MALDI-MS[M+H]+703.51，实测703.53。

1-胆固醇基-2-硬脂酰基-3-三苯甲基甘油(16a)：0℃，向15(2.11g，3mmol)、硬脂酸(0.94g，3.15mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP，0.13g)的干燥无乙醇氯仿(20mL)溶液中加入DCC(0.65g，3.15mmol)。0℃，搅拌反应混合物30分钟，然后在室温下过夜。滤出白色沉淀物，滤液蒸发至干。粗产物经HPFC纯化(1％-10％乙酸乙酯-己烷)。TLC：Rf＝0.5(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，66H)；1.81(m，3H)；2.0(m，2H)；2.19(m，1H)；2.26(m，1H)；2.35(t，J＝7.2，2H)；3.12(m，1H)；3.25(m，2H)；3.67(m，2H)；5.17(m，1H)；5.32(d，J＝4.4，1H)；7.27(m，9H)；7.44(m，6H)。为C67H101O4+计算的MALDI-MS[M+H]+969.77，实测969.73。

1-胆固醇基-2-棕榈酰基-3-三苯甲基甘油(16b)：按照16a相同的方法合成该化合物。TLC：TLC：Rf＝0.5(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.68(s，3H)；0.85-1.65(m，62H)；1.80(m，3H)；1.99(m，2H)；2.10(m，1H)；2.27(m，1H)；2.35(t，J＝7.2，2H)；3.12(m，1H)；3.25(m，2H)；3.66(m，2H)；5.16(m，1H)；5.32(d，J＝4.4，1H)；7.26(m，9H)；7.42(m，6H)。为C65H97O4+计算的MALDI-MS[M+H]+941.74，实测941.72。

1-胆固醇基-2-肉豆蔻酰基-3-三苯甲基甘油)(16c)：按照16a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.5(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，58H)；1.81(m，3H)；2.0(m，2H)；2.19(m，1H)；2.26(m，1H)；2.35(t，J＝7.2，2H)；3.12(m，1H)；3.25(m，2H)；3.66(m，2H)；5.17(m，1H)；5.32(d，J＝4.4，1H)；7.27(m，9H)；7.44(m，6H)。为C63H93O4+计算的MALDI-MS[M+H]+913.71，实测913.71。

1-胆固醇基-2-油酰基-3-三苯甲基甘油(16d)：按照16a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.5(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，58H)；1.81(m，3H)；2.01(m，6H)；2.11(m，1H)；2.27(m，1H)；2.37(t，J＝7.2，2H)；3.13(m，1H)；3.24(m，2H)；3.66(m，2H)；5.17(m，1H)；5.35(m，3H)；7.28(m，9H)；7.45(m，6H)。为C67H99O4+计算的MALDI-MS[M+H]+967.75，实测967.74。

1-胆固醇基-2-硬脂酰基甘油(17a)：按照通用方法除去三苯甲基。该粗产物直接用于下一反应步骤。TLC：Rf＝0.08(洗脱剂E)。

1-胆固醇基-2-棕榈酰基甘油(17b)：按照通用方法除去三苯甲基。该粗产物直接用于下一反应步骤。TLC：Rf＝0.08(洗脱剂E)。

1-胆固醇基-2-肉豆蒄酰基甘油(17c)：按照通用方法除去三苯甲基。该粗产物直接用于下一反应步骤。TLC：Rf＝0.08己烷/EtOAc(10/1)。

1-胆固醇基-2-油酰基甘油(17d)：按照通用方法除去三苯甲基。该粗产物直接用于下一反应步骤。TLC：Rf＝0.08(洗脱剂E)。

1-胆固醇基-2-硬脂酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(18a)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.05(洗脱剂A)。

1-胆固醇基-2-棕榈酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(18b)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.05(洗脱剂A)。

1-胆固醇基-2-肉豆蔻酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(18c)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.05(洗脱剂A)。

1-胆固醇基-2-油酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(18d)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.05(洗脱剂A)。

1-胆固醇基-2-硬脂酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML3a，CheSPC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.31(洗脱剂A)。1HNMR(CDCl3)，δ0.68(s，3H)；0.85-1.65(m，66H)；1.84(m，3H)；2.0(m，2H)；2.12(m，1H)；2.30(m，3H)；3.15(m，1H)；3.39(s，9H)；3.63(m，2H)；3.81(m，2H)；4.25-4.45(m，5H)；5.33(d，J＝4.4，1H)。为C53H99NO7P+计算的MALDI-MS[M+H]+892.72，实测892.73。

1-胆固醇基-2-棕榈酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML3b，ChePPC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.31(洗脱剂A)。1HNMR(CDCl3)，δ0.68(s，3H)；0.85-1.65(m，62H)；1.83(m，3H)；1.99(m，2H)；2.11(m，1H)；2.29(m，3H)；3.14(m，1H)；3.38(s，9H)；3.64(m，2H)；3.82(m，2H)；4.24-4.44(m，5H)；5.32(d，J＝4.4，1H)。为C51H95NO7P+计算的MALDI-MS[M+H]+864.68，实测864.70。

1-胆固醇基-2-肉豆蔻酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML3c，CheMPC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.31(洗脱剂A)。1H NMR(CDCl3)，δ0.68(s，3H)；0.85-1.65(m，58H)；1.83(m，3H)；1.99(m，2H)；2.12(m，1H)；2.30(m，3H)；3.14(m，1H)；3.39(s，9H)；3.62(m，2H)；3.83(m，2H)；4.22-4.42(m，5H)；5.33(d，J＝4.4，1H)。为C49H91NO7P+计算的MALDI-MS[M+H]+836.65，实测836.65。

1-胆固醇基-2-油酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML3d，CheOPC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.30(洗脱剂A)。1HNMR(CDCl3)，δ0.68(s，3H)；0.85-1.65(m，58H)；1.83(m，3H)；2.0(m，6H)；2.12(m，1H)；2.29(m，3H)；3.13(m，1H)；3.36(s，9H)；3.60(m，2H)；3.82(m，2H)；4.25-4.45(m，5H)；5.32(m，3H)。为C53H97NO7P+计算的MALDI-MS[M+H]+890.70，实测890.67。

实施例4制备脂质SML4A-4D

合成脂质SML4a、SML4b、SML4c和SML4d(统称为SML4a-d)的合成方案如流程4所示。以下合成脂质SML4a-d的详述示例了该流程。

流程4.合成aSML4a-d

a试剂和条件.(A)NaH(1.7当量)、溴烷(0.9当量)、甲苯，120℃，过夜；(B)HCl，MeOH配制(2M)，回流，1.5小时；(C)三苯甲基氯(1.5当量)、吡啶，50℃，18小时；(D)氯甲酸胆固醇酯(1.2当量)、DMAP(1.2当量)、CHCl3，室温，过夜；(E)BF3.Et2O(4当量)、CHCl3，0℃，3小时；(F)POCl3(1.1当量)、吡啶(2当量)、THF，0℃，2-3小时；(G)胆碱四苯基硼酸酯(2当量)、TPS(2.5当量)、吡啶，70℃，1小时，然后在室温下，3小时。“Chol-OH”＝胆固醇。

1-棕榈基-2，3-异亚丙基甘油(19b)：向NaH(9g，0.225mol)的50mL无水甲苯悬液中滴加丙酮缩甘油(19.8g，0.15mol)。加入后，于120℃搅拌反应混合物15分钟。然后向该混合物中加入1-溴十四烷(40mL，0.134mol)，将反应维持在120℃过夜。将反应混合物冷却至室温后，小心加入水(400mL)以破坏过量的NaH，然后加入己烷(400mL)。随后用水(200mL×2)洗涤有机层，硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残留物直接用于下一反应步骤。

1-肉豆蔻基-2，3-异亚丙基甘油(19c)：按照19b相同的方法合成该化合物。

1-油基-2，3-异亚丙基甘油(19d)：按照19b相同的方法合成该化合物。

1-棕榈基甘油(20b)：将粗产物19b溶解于200mL甲醇和40mL浓HCl中并回流1.5小时。然后将该混合物冷却至室温，并置于4℃过夜。收集晶体，进行甲醇重结晶。TLC：Rf＝0.1(洗脱剂D)。1H NMR(CDCl3)，δ0.87(t，J＝7.2，3H)；1.27(br，26H)；1.53(m，2H)；2.52(br，2H)；3.30-3.90(m，7H)。为C19H41O3+计算的MALDI-MS[M+H]+317.31，实测317.30。

1-肉豆蔻基甘油(20c)：按照20b相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.1(洗脱剂D)。1H NMR(CDCl3)，δ0.87(t，J＝7.2，3H)；1.27(br，22H)；1.52(m，2H)；2.50(br，2H)；3.31-3.90(m，7H)。为C17H37O3+计算的MALDI-MS[M+H]+289.28，实测289.25。

1-油基甘油(20d)：按照20b相同的方法合成该化合物，但通过HPFC纯化(30-70％乙酸乙酯-己烷)。TLC：Rf＝0.1(洗脱剂D)。1H NMR(CDCl3)，δ0.87(t，J＝7.2，3H)；1.27(br，22H)；1.57(m，2H)；2.0(m，4H)；2.62(br，2H)；3.36-3.54(m，4H)；3.68(m，2H)；3.85(m，1H)；5.34(m，2H)。为C21H43O3+计算的MALDI-MS[M+H]+343.32，实测343.36。

1-硬脂酰基-3-三苯甲基甘油(21a)：按照通用方法引入3-三苯甲基。TLC：Rf＝0.11(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.87(t，J＝7.2，3H)；1.27(br，30H)；1.55(m，2H)；2.40(br，1H)；3.18(m，2H)；3.32-3.53(m，4H).3.94(m，1H)；7.23(m，9H)；7.43(m，6H)。为C40H59O3+计算的MALDI-MS[M+H]+587.45，实测587.44。

1-棕榈基-3-三苯甲基甘油(21b)：按照通用方法引入3-三苯甲基。TLC：Rf＝0.11(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.87(t，J＝7.2，3H)；1.27(br，26H)；1.55(m，2H)；2.42(br，1H)；3.18(m，2H)；3.32-3.53(m，4H).3.94(m，1H)；7.22(m，9H)；7.42(m，6H)。为C38H55O3+计算的MALDI-MS[M+H]+559.42，实测559.40。

1-肉豆蔻基-3-三苯甲基甘油(21c)：按照通用方法引入3-三苯甲基。TLC：Rf＝0.11(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.87(t，J＝7.2，3H)；1.27(br，22H)；1.55(m，2H)；2.41(br，1H)；3.14(m，2H)；3.34-3.53(m，4H).3.94(m，1H)；7.27(m，9H)；7.44(m，6H)。为C36H51O3+计算的MALDI-MS[M+H]+531.39，实测531.38。

1-油基-3-三苯甲基甘油(21d)：按照通用方法引入3-三苯甲基。TLC：Rf＝0.11(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.88(t，J＝7.2，3H)；1.28(br，22H)；1.56(m，2H)；2.0(m，4H)；2.42(br，1H)；3.20(m，2H)；3.36-3.54(m，4H)；3.96(m，1H)；5.35(m，2H)；7.25(m，9H)；7.45(m，6H)。为C40H57O3+计算的MALDI-MS[M+H]+585.43，实测585.44。

1-硬脂酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-3-三苯甲基甘油(22a)：室温下，向21a(2.4g，4mmol)和DMAP(0.6g)的干燥无乙醇氯仿(10mL)溶液中滴加氯甲酸胆固醇酯(2.2g，4.8mmol)的氯仿(5mL)溶液。室温下搅拌反应混合物过夜。然后将CHCl3/MeOH/H2O(40mL/20mL/30mL)混合溶剂加入该反应混合物。硫酸钠干燥有机层，过滤并蒸发。粗产物经HPFC纯化(0-10％乙酸乙酯-己烷)。TLC：Rf＝0.43(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，68H)；1.79-2.02(m，5H)；2.42(m，2H)；3.25(m，2H)；3.38(m，2H)；3.60(m，2H)；4.48(m，1H)；5.04(m，1H)；5.39(d，J＝4.4，1H)；7.27(m，9H)；7.43(m，6H)。为C68H103O5+计算的MALDI-MS[M+H]+999.78，实测999.75。

1-棕榈基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-3-三苯甲基甘油(22b)：按照22a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.43(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，64H)；1.79-2.02(m，5H)；2.42(m，2H)；3.24(m，2H)；3.37(m，2H)；3.61(m，2H)；4.48(m，1H)；5.04(m，1H)；5.39(d，J＝4.4，1H)；7.27(m，9H)；7.43(m，6H)。为C66H99O5+计算的MALDI-MS[M+H]+971.75，实测971.78。

1-肉豆蔻基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-3-三苯甲基甘油(22c)：按照22a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.43(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，60H)；1.79-2.02(m，5H)；2.42(m，2H)；3.23(m，2H)；3.37(m，2H)；3.61(m，2H)；4.48(m，1H)；5.04(m，1H)；5.39(d，J＝4.4，1H)；7.27(m，9H)；7.43(m，6H)。为C64H95O5+计算的MALDI-MS[M+H]+943.72，实测943.71。

1-油基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-3-三苯甲基甘油(22d)：按照22a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.43(洗脱剂E)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，60H)；1.79-2.02(m，9H)；2.40(m，2H)；3.23(m，2H)；3.37(m，2H)；3.61(m，2H)；4.48(m，1H)；5.04(m，1H)；5.33-5.39(m，3H)；7.27(m，9H)；7.44(m，6H)。为C68H101O5+计算的MALDI-MS[M+H]+997.77，实测997.74。

1-硬脂酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)甘油(23a)：按照除去三苯甲基的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.63(洗脱剂D)。

1-棕榈基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)甘油(23b)：按照除去三苯甲基的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.63(洗脱剂D)。

1-肉豆蔻基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)甘油(23c)：按照除去三苯甲基的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.63(洗脱剂D)。

1-油基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)甘油(23d)：按照除去三苯甲基的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.63(洗脱剂D)。

1-硬脂酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(24a)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.57(洗脱剂C)。

1-棕榈基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(24b)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.57(洗脱剂C)。

1-肉豆蔻基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(24c)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.57(洗脱剂C)。

1-油基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸酯(24d)：按照磷酸化的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.57(洗脱剂C)。

1-硬脂酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML4a，SeChcPC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：RF＝0.53(洗脱剂A)。1H NMR(CDCl3)，δ0.68(s，3H)；0.85-1.65(m，66H)；1.84-2.05(m，5H)；2.36(m，2H)；3.39(s，9H)；3.44(m，2H)；3.61(m，2H)；3.83(m，2H)；4.01(m，2H)；4.35(m，2H)；4.44(m，1H)；4.98(m，1H)；5.39(d，J＝4.4，1H)。为C54H101NO8P+计算的[M+H]+922.73，实测922.73。

1-棕榈基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML4b，PeChcPC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.53(洗脱剂A)。1H NMR(CDCl3)，δ0.68(s，3H)；0.85-1.65(m，62H)；1.84-2.05(m，5H)；2.36(m，2H)；3.38(s，9H)；3.45(m，2H)；3.61(m，2H)；3.82(m，2H)；4.02(m，2H)；4.35(m，2H)；4.44(m，1H)；4.98(m，1H)；5.39(d，J＝4.4，1H)。为C52H97NO8P+计算的MALDI-MS[M+H]+894.69，实测894.68。

1-肉豆蔻基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML4c，MeChcPC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.53(洗脱剂A)。1H NMR(CDCl3)，δ0.68(s，3H)；0.85-1.65(m，58H)；1.84-2.05(m，5H)；2.37(m，2H)；3.39(s，9H)；3.44(m，2H)；3.61(m，2H)；3.83(m，2H)；4.02(m，2H)；4.35(m，2H)；4.44(m，1H)；4.98(m，1H)；5.39(d，J＝4.4，1H)。为C50H93NO8P+计算的MALDI-MS[M+H]+866.66，实测866.64。

1-油基-2-胆固醇基羰基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML4d，OeChcPC)：按照磷酸胆碱合成的通用方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.53(洗脱剂A)。1H NMR(CDCl3)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，58H)；1.84-2.05(m，9H)；2.37(m，2H)；3.38(s，9H)；3.45(m，2H)；3.62(m，2H)；3.84(m，2H)；4.02(m，2H)；4.35(m，2H)；4.45(m，1H)；4.98(m，1H)；5.35-5.39(m，3H)。为C54H99NO8P+计算的MALDI-MS[M+H]+920.71，实测920.71。

实施例5制备脂质SML5A-5D

合成脂质SML5a、SML5b、SML5c和SML5d(统称为SML5a-d)的合成方案如流程5所示。以下合成脂质SML5a-d的详述示例了该流程。

流程5.合成aSML5a-d

SML5a：R＝C17H35；SML5b：R＝C15H31

SML5c：R＝C13H27；SML5d：R＝Cl7H33

a试剂和条件.(A)氯甲酸胆固醇酯(2.3当量)、DMAP(4当量)、CHCl3，室温，16小时。“Chol-OH”＝胆固醇。

1-硬脂酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML5a，SChcPC)：室温下，向1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基-磷酸胆碱(1g，1.91mmol)和DMAP(1g)的无乙醇干燥氯仿(50mL)溶液滴加氯甲酸胆固醇酯(2g，4.45mmol)的氯仿溶液(10mL)。室温下反应16小时后，蒸发溶剂，残留物经HPFC纯化(CHCl3到CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4)。TLC：Rf＝0.54(洗脱剂C)。1H NMR(CDCl3/MeOH-d4/吡啶-d5，10∶2∶1)，δ0.68(s，3H)；0.85-1.65(m，66H)；1.84-2.05(m，5H)；2.33(t，J＝7.6Hz，2H)；2.39(m，2H)；3.28(s，9H)；3.67(m，2H)；4.10(m，2H)；4.24(m，1H)；4.32(m，2H)；4.47(m，2H)；5.11(m，1H)；5.41(d，J＝4.4，1H)。为C54H99NO9P+计算的MALDI-MS[M+H]+937.61，实测937.67。

1-棕榈酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML5b，PChcPC)：按照5a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.54(洗脱剂C)。1H NMR(CDCl3/MeOH-d4/吡啶-d5，10∶2∶1)，δ0.68(s，3H)；0.85-1.65(m，62H)；1.84-2.05(m，5H)；2.31(t，J＝7.6，2H)；2.36(m，2H)；3.27(s，9H)；3.66(m，2H)；4.08(m，2H)；4.23(m，1H)；4.30(m，2H)；4.44(m，2H)；5.08(m，1H)；5.40(d，J＝4.4，1H)。为C52H95NO9P+计算的MALDI-MS[M+H]+908.67，实测908.67。

1-肉豆蔻酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML5c，MChcPC)：按照5a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.54(洗脱剂C)。1H NMR(CDCl3/MeOH-d4/吡啶-d5，10∶2∶1)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，58H)；1.84-2.05(m，5H)；2.33(t，J＝7.6，2H)；2.39(m，2H)；3.27(s，9H)；3.67(m，2H)；4.09(m，2H)；4.24(m，1H)；4.31(m，2H)；4.45(m，2H)；5.09(m，1H)；5.40(d，J＝4.4，1H)。为C52H95NO9P+计算的MALDI-MS[M+H]+908.67，实测908.67。

1-油酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML5d，OChcPC)：按照5a相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.54(洗脱剂C)。1H NMR(CDCl3/MeOH-d4/吡啶-d5，10∶2∶1)，δ0.69(s，3H)；0.85-1.65(m，58H)；1.84-2.06(m，9H)；2.33(t，J＝7.6，2H)；2.39(m，2H)；3.28(s，9H)；3.68(m，2H)；4.10(m，2H)；4.24(m，1H)；4.32(m，2H)；4.47(m，2H)；5.10(m，1H)；5.36(m，2H)；5.40(d，J＝4.4，1H)。为C54H97NO9P+计算的MALDI-MS[M+H]+934.69，实测934.68。

实施例6制备脂质SML6a-d

合成脂质SML6a、SML6b、SML6c和SML6d(统称为SML6a-d)的合成方案如流程6所示。以下合成脂质SML6a-d的详述示例了该流程。

流程6.合成aSML6a-d

SML6a：RH＝胆固醇

SML6b：RH＝胆固醇

SML6c：RH＝豆固醇

SML6d：RH ＝β-谷固醇

1，2-二胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML6a，DChcPC)：将甘油磷酸胆碱(0.514g，2mmol)和四苯基硼酸钠(0.719g，1.05当量)溶解于15mL甲醇。蒸发溶剂，用甲苯共沸干燥残留物。然后将干燥的固体溶解于无水吡啶(60mL)，随后加入4，4-二甲基氨基吡啶(0.732g，6mmol)。室温下，将氯甲酸胆固醇酯(2.70，6mmol)分部分加入该反应混合物并剧烈搅拌。然后用氮气吹扫反应烧瓶，避光维持3天。挥发物经旋转蒸发。将粗产物溶解于氯仿-甲醇(2∶1，150mL)，用50mL蒸馏水洗涤。无水硫酸钠干燥有机层，过滤并蒸发。残留物应用HPFC作进一步纯化(CHCl3到CHCl3/MeOH/H2O(65/25/4))。产量，0.38g(17.7％)。TLC：Rf＝0.4(洗脱剂A)。1H NMR(CDCl3)，δ0.68(s，6H)；0.85-1.65(m，66H)；1.81-2.06(m，10H)；2.37(m，4H)；3.42(s，9H)；3.89(m，2H)；4.06(m，2H)，4.26(m，2H)；4.36(m，2H)；4.44(m，2H)；5.04(m，1H)；5.38(d，J＝4.4，2H)。为C64H109NO10P+计算的MALDI-MS[M+H]+1082.79，实测1082.73。

1，2-二胆固醇基半琥珀酰基(hemisuccinoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML6b，DCHEMSPC)：将甘油磷酸胆碱(1.03g，4mmol)和四苯基硼酸钠(1.33g，1当量)溶解于30mL甲醇。蒸发溶剂，用甲苯共沸干燥残留物。然后将干燥的固体溶解于无水吡啶(120mL)，随后加入4，4-二甲基氨基吡啶(0.9g)和半琥珀酸胆固醇酯(4.86g，10mmol)。将混合物温和升温以完全溶解固体。冷却至室温后，将二环己基碳二亚胺(2.32g，11mmol)加入反应混合物。室温下，在氮气气氛中搅拌该混合物3天。挥发物经旋转蒸发，将残留物溶解于氯仿-甲醇(2∶1，300mL)，用80mL蒸馏水洗涤。无水硫酸钠干燥有机层，过滤，蒸发并应用HPFC作进一步纯化(CHCl3到CHCl3/MeOH/H2O(65/25/4))。产量，2.3g(48％)。TLC：Rf＝0.42(洗脱剂A)。1H NMR(CDCl3)，δ0.68(s，6H)；0.85-1.65(m，66H)；1.81-2.06(m，10H)；2.30(m，4H)；2.60(m，8H)；3.39(s，9H)；3.85(m，2H)；3.99(m，2H)，4.23(m，2H)；4.35(m，2H)；4.58(m，2H)；5.22(m，1H)；5.37(d，J＝4.4，2H)。为C70H116NO12P+计算的MALDI-MS[M+H]+1194.84，实测1194.79。

1，2-二豆固醇基半琥珀酰基(hemisuccinoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML6c，DStigHSPC)：按照SML6b相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.36(洗脱剂A)。通过NMR和MALDI-MS证实结构。

1，2-二谷固醇基半琥珀酰基(hemisuccinoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML6d，DSitoHSPC)：按照SML6b相同的方法合成该化合物。TLC：Rf＝0.40(洗脱剂A)。通过NMR和MALDI-MS证实结构。

实施例7制备前药脂质SML7A-B

按照实施例3的类似合成路线合成视黄酸前药SML7a和SML7b(统称为SML7a-b)。合成SML7a-b的简明合成路线示于流程7。以下合成脂质SML7a-b的描述示例了该流程。

流程7.合成aSML7a-b

ML7a：RCO2H＝全反式视黄酸

SML7b：RCO2H＝13-顺式视黄酸

Chol-OH＝胆固醇；″Tr″＝三苯甲基

按照以上实施例3所述相同的方法合成选择性保护的胆固醇基甘油中间体。然后将视黄酸经酯键偶联于sn-2羟基，然后从3-羟基除去三苯甲基(Tr)。然后按照实施例的通用方案所述的标准方法将中间体立即转化为相应的磷酸胆碱。终产物经HPFC纯化，通过TLC、NMR和MALDI-MS证实结构。

实施例8：制备脂质SML8A-F

合成脂质SML8a、SML8b、SML8c、SML8d、SML8e和SML8f(统称为SML8a-f)的合成方案如流程8所示。以下合成脂质SML8a-f的详述示例了该流程。

流程8.合成aSML6a-f

SML8d：R2H＝胆固醇基羰基

SML8e：R2H＝胆固醇基

SML8f：R2H＝胆固醇基氧基氧丙基

按照流程8所示的合成路径合成固醇-溶血鞘磷脂偶联物(SML8a-c)。首先，通过DCC，用N-羟基琥珀酰亚胺活化固醇的半琥珀酸酯。然后，将固醇的活化酯偶联于溶-鞘磷脂的氨基。终产物经HPFC进一步纯化。

溶-鞘磷脂分别与氯甲酸胆固醇酯、甲苯磺酸胆固醇酯和丙烯酸胆固醇酯合成SML8d-f。

胆固醇基氧基-4-氧代丁酰胺基-3-羟基十八碳-4-烯基2-(三甲铵基(trimethylammonio))乙基磷酸酯(SML8a)：室温下，向溶-鞘磷脂(25mg，53μmol)的无乙醇干燥氯仿(6mL)溶液加入琥珀酰亚胺基胆固醇基琥珀酸酯(62mg，106μmol)和DMAP(10mg)。室温下，搅拌该反应混合物24小时。蒸发溶剂。残留物应用HPFC纯化(CHCl3到CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4)。TLC：Rf＝0.33(洗脱剂C)。1H NMR(CDCl3)，δ0.68(s，3H)；0.85-0.92(m，14H)；1.00-1.15(m，10H)；1.25(br，28H)；1.42-1.62(m，6H)；1.84-2.05(m，7H)；2.29(m，2H)；2.51(m，4H)；2.68(br，1H)；3.28(s，9H)；3.72(m，1H)；4.01(m，4H)；4.28(m，2H)；4.58(m，2H)；5.34(m，1H)；5.44(d，J＝4.2，1H)；5.68(m，1H)；7.51(br，1H)。为C54H98N2O8P+计算的MALDI-MS[M+H]+933.72，实测933.68。

2-胆固醇基氧基羰基氨基-3-羟基十八碳-4-烯基2-(三甲铵基)乙基磷酸酯(SML8d)：室温下，向溶-鞘磷脂(25mg，53μmol)和DMAP(20mg)的无乙醇干燥氯仿(4mL)溶液中加入2mL干燥无乙醇氯仿配制的氯甲酸胆固醇酯(48mg，106μmol)。室温下搅拌24小时后，蒸发溶剂。残留物应用HPFC纯化(CHCl3到CHCl3-MeOH-H2O65/25/4)。TLC：Rf＝0.41(洗脱剂C)。1H NMR(CDCl3)，δ0.68(s，3H)；0.85-0.92(m，14H)；1.00-1.15(m，10H)；1.25(br，28H)；1.47-1.528(m，6H)；1.84-2.05(m，7H)；2.29(m，2H)；2.65(br，1H)；3.3(s，9H)；3.61(m，1H)；3.89(m，4H)；4.28(m，4H)；5.34(m，1H)；5.48(d，J＝4.4，1H)；5.73(m，1H)；6.16(br，1H)。为C51H94N2O7P+计算的MALDI-MS[M+H]+877.69，实测877.76。

实施例9.制备脂质SML9A-C

合成脂质SML8a-c的具体合成方案如流程9所示。以下合成脂质SML9a-c的详述示例了该流程。

流程9.合成aSML9a-c

SML9a：RH＝胆固醇

SNL9b：RH＝豆固醇

SML9c：RH＝b-谷固醇

可按照流程9所示的合成路线合成可聚合的SML脂质(SML9a-c)。首先，可将固醇的半琥珀酸酯选择性偶联于甘油磷酸胆碱的sn-1位置。然后，将10，12-二十三碳二炔酸偶联于sn-2位置从而得到终产物。粗产物可经HPFC纯化。

实施例10：制备分支脂质SML10A-F

合成脂质SML10a-f的具体合成方案如流程10所示。以下合成脂质SML10a-f的详述示例了该流程。

流程10.合成aSML10a-f

SML10a：R1OH＝异-硬脂酸，R2OH＝半琥珀酸胆固醇酯

SML10b：R1OH＝异-硬脂酸，R2OH＝半琥珀酸豆固醇酯

SML10c：R1OH＝异-硬脂酸，R2OH＝半琥珀酸谷固醇酯

SML10d：R1OH＝异-硬脂酸N，R2OH＝半琥珀酸胆固醇酯

SML10e：R1OH＝异-硬脂酸N，R2OH＝半琥珀酸豆固醇酯

SML10f：R1OH＝异-硬脂酸N，R2OH＝半琥珀酸谷固醇酯

采用实施例6所述SML6b的相似合成方法将该分支的异-硬脂酸偶联于甘油磷酸胆碱(glycerophocholine)的sn-1位置，但起始材料的摩尔比例不同。然后通过HPFC分离单-异-硬脂酰基磷酸胆碱，并经二环己基碳二亚胺偶联于固醇的半琥珀酸酯。终产物经HPFC纯化。

实施例11：制备分支脂质SML11A-F

合成脂质SML11a-f的具体合成方案如流程11所示。以下合成脂质SML11a-f的详述示例了该流程。

流程11.合成aSML11a-f

SML11a：R1＝C17H35，R2OH＝胆固醇

SML11b：R1＝C17H35，R2OH＝豆固醇

SML11c：R1＝C17H35，R2OH＝谷固醇

SML11d：R1＝C15H31，R2OH＝胆固醇

SML11e：R1＝C15H31，R2OH＝豆固醇

SML11f：R1＝C15H31，R2OH＝谷固醇

可利用肉碱作为起始材料，两步合成靶SML脂质SML11a-f。首先，将活化的脂族酸经酯键偶联于羟基。然后，将固醇也经酯键连接于羧基。终产物可经HPFC纯化。

实施例12：制备具有酪氨酸的SML，SML12A-F

合成脂质SML12a-f的具体合成方案如流程12所示。以下合成脂质SML12a-f的详述示例了该流程。

流程12.合成aSML11a-f

SML12a：R1＝C18H37，R2OH＝胆固醇

SML12b：R1＝C18H37，R2OH＝豆固醇

SML12c：R1＝C18H37，R2OH＝谷固醇

SML12d：R1＝C18H33，R2OH＝胆固醇

SML12e：R1＝C18H33，R2OH＝豆固醇

SML12f：R1＝C18H33，R2OH＝谷固醇

可按照流程12所示合成路线合成固醇修饰的两亲脂质SML12a-f。首先，将脂族醇偶联于选择性保护的酪氨酸的羧基，然后用哌啶除去Fmoc基团。然后将半琥珀酸固醇酯偶联于氨基。除去叔丁基后，硫酸化酚基。还可将酚基转化成磷酸酯基、膦酸酯基、磺酸酯基、硼酸酯基或腙。该途径提供基于其它氨基酸的固醇修饰脂质的合成路线，其中适当保护的氨基酸用作分支核心。

实施例13：制备还原-敏感性SML13A-H

将还原-敏感性SML脂质设计成该分子具有可在还原性生物学条件下，例如在细胞胞质溶胶中可选择性切割的还原键。这会使得脂质颗粒去稳定并有助于选择性释放药物。可将二硫键置于分子的不同部分，例如侧链(SML13a-h)或首基(SML13i-k)。脂质SML13a-k的合成示于流程13.1、流程13.2和流程13.3。以下合成脂质SML13a-k的详述示例了该流程。

流程13.1合成SML13a-d

SML13a：R＝C18H37；SML13b：R＝C16H33

SML13c：R＝C14H29；SML13d：R＝C18H35

流程13.2合成SML13e-h

SML13e：R＝C17H35；SML13f：R＝C15H31

SML13g：R＝C13H27；SML13h：R＝C17H33

流程13.3合成SML13i-k

SML131：R1H＝胆固醇，R2＝C17H35

SML13i：R1H＝胆固醇，R2＝C15H31

SML13k：R1H＝豆固醇，R2＝C17H35

可通过以上实施例4所述SML4a-d的相似方法合成SML13a-d。将2-胆固醇基双硫烷基乙酸(cholesteryldisulfanyl acetic acid)，而非氯甲酸胆固醇酯偶联于sn-2羟基。可按照SML5a-d的相同方法，用2-胆固醇基双硫烷基乙酸替代氯甲酸胆固醇酯合成SML13e-h。合成SML13i-k时，首先将2-硫代吡啶活化的二硫键部分连接于氨基。然后，将该固醇偶联于伯醇，再将脂肪酸连接于仲醇。最后，通过二硫键交换反应引入阳离子首基。SML13i-k是还原-敏感性阳离子SML化合物。它们对于基因和siRNA递送可能十分有用。

实施例14.制备在首基末端具有叠氮化物的SML，SML14A-F

靶向脂质体的设计在很大程度上取决于良好控制的生物偶联反应的开发，该反应在大多数情况中涉及将配体偶联于携带功能化脂质锚定部分的预先形成囊泡的表面。在许多可用的偶联方法中，最常用的包括含巯基配体与携带巯基反应活性官能团，例如马来酰亚胺、溴乙酰基或2-吡啶二巯基连接键的锚定物反应，从而产生硫醚或二硫键，或叠氮基，通过“冲压-化学方法(click-chemistry)”与炔环化。优选利用末端-功能化的SML作为靶向配体或表面标记物的锚定物。SML化合物SML14a-f是在首基末端具有叠氮基的一些模型化合物，所述叠氮基可通过“冲压-化学方法”用于连接配体或生物标记。可采用相似方式引入其它官能团，例如炔丙基。合成脂质SML14a-f的具体合成方案如流程14所示。以下合成脂质SML14a-f的详述示例了该流程。

流程14.合成SML14a-f

SML14a：R1H＝胆固醇，R2＝C17H35

SML14b：R1H＝豆固醇，R2＝C17H35

SML14c：R1H＝谷固醇，R2＝C17H35

SML14d：R1H＝胆固醇，R2＝C15H31

SML14e：R1H＝豆固醇，R2＝C15H31

SML14f：R1H＝谷固醇，R2＝C15H31

SML14a-f的合成简单。首先，将叠氮基功能化的聚氧化乙烯连接于更具反应活性的胺。然后，将半琥珀酸固醇酯偶联于伯醇。在最后一步中，将脂肪酸连接于反应活性最低的仲醇。由于官能团的反应活性不同，无需保护基团。

实施例15：所选SML的示差扫描量热法

利用特定SML作为模型化合物来研究SML化合物的特性。相特性(phasebehavior)是脂双层的最重要特性之一，其与细胞膜的各种生物学功能有关。将游离胆固醇加入磷脂双层会因游离胆固醇与甘油脂和鞘脂的混合以及游离胆固醇的异戊二烯尾部影响填充在双层中的酰基链而改变该双层的相特性。采用示差扫描量热法显示SML对填充在合成脂质构成的双层中的酰基链的影响与游离胆固醇相似。因此，选择含有C-16链与各种连接键的SML(SML1b-5b)和含不同链的一组的SML(SML5a-5d)以供DSC研究。

利用配有三个的可重复使用哈司特样品安瓿(Hastelloy sample ampoule)和一个参比安瓿的升级高温MC-DSC 4100量热计(犹他州林顿市量热科学公司(Calorimetry Sciences Corp.，Lindon，UT))进行示差扫描量热法(DSC)研究。通常以0.5℃/分钟的速度收集5-85℃范围的数据，利用水作为参比。利用CSC的CpCalc 2.1软件包将原始数据转换成摩尔热容(MHC)。然后将数据传输至Origin 6.0(马萨诸赛州北安普敦的微卡公司(Microcal，Northampton，MA))作进一步加工和计算。65℃，在氩气气氛中将脂质薄膜(10μmol)在水(200μL)中水合并作间歇涡流振荡来制备用于DSC检测的脂质体。然后将样品冷却至室温，脱气并用气密性注射器(每份样品100μL)加载入样品安瓿。通过加热-冷却-加热循环扫描样品，第二次加热扫描数据用于分析。

在游离胆固醇和二酰基磷脂的常规脂质混合物中，根据下式计算总脂质中胆固醇(Chol)的摩尔百分比：

Chol％＝nchol/(nchol+n二酰基)×100，式中：

nchol指胆固醇的摩尔数，

n二酰基指二酰基脂质的摩尔数。

当m-SML(单固醇SML)与二酰基磷脂混合时，计算二酰基脂质总摩尔数时包括m-SML中的额外酰基链。按照常规脂质混合物的方法，采用下式计算m-SML和二酰基脂质的混合物中当量固醇摩尔百分比：

固醇％＝nm-SML/(1.5×nm-SML+n二酰基)×100，式中：

nm-SML指m-SML的摩尔数，

n二酰基指二酰基脂质的摩尔数。

例如，纯的m-SML具有一个固醇和一个酰基链，因此当量游离固醇百分比是1/1.5×100＝67。在m-SML和二酰基脂质的1∶1摩尔混合物中，当量游离固醇百分比是1/(1.5+1)×100＝40。同一计算方法适用于所有其它m-SML制剂。DSC结果示于图1和图2。

在图1中，当量胆固醇(Chol)的百分比数值指摩尔百分比。DSPC指二硬脂酰基磷脂酰胆碱；SChcPC指具有一个固醇的SML，特别是1-硬脂酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML5a)。

在图2中，含各种摩尔百分比的游离胆固醇的SML/二酰基脂质混合物的转变温度和焓。将SML与相同链长的二酰基脂质。在图2中检验的SML如下所示：

·1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-棕榈基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML 1b，ChcPaPC)

·1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-棕榈基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML2b，ChcPePC)

·1-胆固醇基-2-棕榈酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML3b，ChePPC)

·1-棕榈基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML4b，PeChcPC)

·1-硬脂酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML5a，SChcPC)

·1-棕榈酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML5b，PChcPC)

·1-肉豆蔻酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML5c，MChcPC)

·1-油酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML5d，OChcPC)。

SChcPC及其与DSPC的混合物的DSC热分析图(图1)是测试的大多数SML的典型结果。将主要转变温度(Tm)和焓(ΔH)对脂质混合物中胆固醇的百分比作图(图2)。无论何种SML的化学结构，测试的所有SML在10-80℃温度范围内没有可检测的相转变。因此，如果胆固醇和脂族链彼此靠近，可以获得高胆固醇浓度(约67％)的均匀液体有序双层。在活细胞中，如果膜蛋白对于脂质链和胆固醇具有强烈亲和力，则可在质膜上形成类似的结构域。

与加入游离胆固醇一样，将SML加入相应的二酰基脂质加宽了转变峰(transition peak)，降低了转变温度和焓。该效应是浓度依赖性的，最终当胆固醇达到某种浓度时，导致相转变的消除。

虽然不同连接键的SML的凝聚作用(condensing effect)不同，但特别是作为同种型的ChcPePC和PeChcPC之间的Tm和ΔH没有明显差别。ChcPePC能快速降低Tm和ΔH，并在30％当量胆固醇时完全消除相转变，而具有相同链长的其它SML需要至少35％的当量胆固醇。通过比较ChcPePC与ChcPaPC和PeChcPC，看来是ChcPePC的2-醚连接键导致该差异。还应注意，当胆固醇未高于20％时，将OChcPC加入DSPC导致极宽的转变峰。这明显不同于SChcPC对DSPC的影响(图1)，可能导致不饱和的油酰基链与饱和的硬脂酰基链之间的链错配。

实施例16：将钙黄绿素有效负载包封在脂质体中

加入50％氢氧化钠(695μL，13.2mmol)后，将荧光染料钙黄绿素(2.49g，4mmol)溶解于Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.5，6mL)。然后将该储备液加载于Sephadex LH-20柱(2.5cm×40cm)，用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 7.5)洗脱。通过检测pH 9时稀释样品的吸光度(494nm)来测定合并的钙黄绿素部分的浓度。然后将纯化的钙黄绿素(56mM)包封入脂质体以供渗漏试验。60℃，在氩气气氛中，在1mL含钙黄绿素的缓冲液中将给定配方的干燥脂质薄膜(10μmol)水合15分钟，并作间歇涡流振荡。然后在60℃将样品经聚碳酸酯膜挤出11次，再用相应的等渗洗脱剂流过Sephadex G-50柱。然后分析合并的脂质体组分以测定钙黄绿素浓度，并稀释至线形荧光范围以供下述的渗漏研究。

实施例17：渗透应力诱导渗漏

含SML的脂质体的一个优选特性是耐受脂质体的脂质体内含物(例如，药物)渗漏。在脂双层中包含SML通常使得脂质体在体外不易渗漏。已证明检验脂质体在渗透压下的渗漏是评估脂质膜的弹性变形和致命缺陷的有效方法。当脂质体经历高渗透压时，该膜会肿胀并在临界点破裂从而快速释放内含物。然后一旦有足够的内含物排出，囊泡会重新密封成机械稳定的结构。因此，渗透渗漏特性依据人工渗透梯度下的快速平衡。

按照上述方法(实施例11)制备本项研究所用的含高浓度内含物(56mM钙黄绿素，10mM Tris，711mM NaCl)的脂质体，经100nm膜挤出，并用等渗缓冲液(50mM HEPES，775mM NaCl)洗脱。单独1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-磷酸胆碱(DMPC)和DMPC及胆固醇(1∶1摩尔比)的脂质体在SML化合物ChcMaPC(1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-肉豆蔻基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；SML1c)脂质体的渗漏研究中用作阳性对照。通过混合不含钙黄绿素的等渗缓冲液(1600mOsm)和50mOsm稀释缓冲液(50mM HEPES)制备各种渗透浓度的溶液。然后在37℃，通过混合10μL脂质体与990μL测试缓冲液而使得脂质体接触各种渗透浓度的溶液。平衡5分钟后，利用QuantechTM荧光计(衣阿华州杜布克的B/T公司(Barnstead/Thermolyne，Dubuque，IA))读取517nm的荧光强度(ext.：494nm)。然后加入100μL10％Triton X-100来连接脂质体，从而完全释放钙黄绿素。检测总钙黄绿素的荧光，用作100％信号(F100％)。裂解前，保留在脂质体中的钙黄绿素部分定义为1-(F信号-F空白)/(F100％-F空白)，其中F信号是样品的荧光强度，F空白是等渗缓冲液中脂质体的荧光强度。结果如图3所示。

37℃，监测渗透压梯度下ChcMaPC和DMPC/胆固醇(1∶1)的渗漏(图3)。与DMPC脂质体相比，两种脂质体均显示相似的渗透渗漏特征和良好的稳定性。其它SML显示的渗透渗漏特征与ChcMaPC的相似。因此，SML脂质体在所测试的渗透梯度下保留它们的内含物至少与相应的胆固醇/二酰基脂质混合物一样好。

实施例18：评估含SML的脂质体在30％胎牛血清中的渗漏情况

生理环境是体内脂质体药物递送的另一难点，即，血清蛋白质和生物膜易从脂质体双层中提取游离胆固醇，从而导致渗漏。用PEG(聚乙二醇)屏蔽脂质体表面可极大降低这种相互作用。测试了SML脂质体的稳定性和耐受性。

可通过上述方法将钙黄绿素包封入脂质体。经200nm膜挤出脂质体，利用HEPES缓冲液(10mM HEPES，140mM NaCl，pH7.4)作为等渗洗脱剂使脂质体流过Sephadex G-50柱。含有40％胆固醇(摩尔百分比)的常规脂质体制剂用作长期渗漏试验中的对照。用30％胎牛血清将等份脂质体样品(20-50μL)稀释至总体积为2mL。然后将样品密封在玻璃试管中，37℃温育。在不同数据点监测样品的荧光强度，通过渗透应力诱导渗漏的相似方法测定保留在脂质体中的钙黄绿素部分。测试的SML包括：

○1-胆固醇基羰基(carbonoyl)-2-肉豆蔻基氨甲酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML1c，ChcMaPC)

○1-硬脂酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SML5a，SChcPC)

○1-胆固醇基-2-肉豆蔻酰基-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱(SML3c，CheMPC)

○1-肉豆蔻酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML5c，MChcPC)

DSPC与游离胆固醇(DSPC/Chol)和DMPC与游离胆固醇(DMPC/Chol)的脂质体用作对照。

如图4中结果所示，ChcMaPC脂质体保留完好，而DSPC/胆固醇脂质体的内含物在随后4周内逐渐释放。由2∶1摩尔比的ChcSaPC和胆固醇构成的脂质体显示的渗漏特征与ChcMaPC的相似。由于ChcSaPC/胆固醇(2∶1)和DSPC/胆固醇(1∶1)的脂质体具有相同比例的胆固醇(50％)和链长(C-18)，它们的渗漏特征差异主要源于胆固醇掺入双层的方式。

明显观察到ChcMaPC脂质体保持完好，而DSPC/胆固醇脂质体的内含物在所测试的4周内逐渐释放。由2∶1摩尔比的ChcSaPC和胆固醇构成的脂质体显示的渗漏特征与ChcMaPC的相似。由于ChcSaPC/胆固醇(2∶1)和DSPC/胆固醇(1∶1)的脂质体具有相同比例的胆固醇(50％)和链长(C-18)，它们的渗漏特征差异主要源于胆固醇掺入双层的方式。SML中的共价键足够强，从而能防止血清蛋白质以任何非共价亲和力从双层提取胆固醇。

这些结果表明与常规脂质体相比，本文公开的通式I所示化合物形成更稳定的脂质体。

实施例19：分析胆固醇交换

通过挤出方法制备单层脂质体。供体脂质体由40％胆固醇(或SML的摩尔当量)、10％带负电荷的1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DPPG)和50％1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)(或SML的摩尔当量)构成。具体地说，采用以下摩尔比配制三种供体脂质体：1)PChcPC/DPPC/DPPG(50/40/10)，2)DChcPC/DPPC/DPPG(25/65/10)，3)Chol/DPPC/DPPG(40/50/10)。中性1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)脂质体用作接受体。挤出后，供体脂质体的直径约为100nm，接受体脂质体的为140nm。

对于交换实验，首先在37℃温暖1mL供体脂质体(10mM)和1mL接受体脂质体(100mM，10fold)，然后混合并在37℃温育。在给定时间点取得混合物的试样(250μL)，施加于小(约1cm长)阴离子交换柱(Q-Sepharose XL)。加载交换样品之前，用0.1mL 10mM POPC预处理柱以减少中性脂质体的非特异性结合。用1mL 10mM NaCl，10mM HEPES pH7.4缓冲液洗脱柱。冻干洗脱液，通过胆固醇试样分析以定量测定胆固醇的交换量。

如图5所示，含有DChcPC或PChcPC的脂质体的胆固醇交换极少或者检测不到，特别是与Chol/DPPC/DPPG的对照脂质体相比。这些数据说明SML化合物中共价相连的胆固醇未以显著量移出双层，而就胆固醇交换而言，常规脂质体中游离胆固醇的半衰期约为2小时。

因此，胆固醇交换实验的结果进一步证实通式I所示化合物中共价相连的胆固醇未以显著或可检测水平移出双层，而就胆固醇交换而言，常规脂质体中游离胆固醇的半衰期约为2小时。

实施例20：细胞毒性评估

采用标准MTT(3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)试验方法评估SML脂质的细胞毒性。简言之，37℃，将C26细胞与各种浓度的脂质温育一定时期。然后将培养基替换为MTT工作试剂，细胞再温育2小时。然后小心除去诸试剂。将转化染料溶解于酸性异丙醇。在570nm检测染料的吸光度，本底扣除为650nm。然后通过比较处理细胞和未处理细胞的结果获得细胞活力数据。所选SML脂质的结果总结于图6。大多数SML在高达1mM的浓度下未显示明显细胞毒性。含有氨基甲酸酯连接键的一些SML显示一定细胞毒性，例如ChcPaPC和ChcSaPC。因此，可能通过改变通式I所示化合物的R1、R2的组合以及连接类型来调整SML的毒性。

实施例21：利用磷脂酶A2的药物释放

视黄酸用作研究酶触发药物释放的模型药物。用包括牛、莫桑比克射毒眼镜蛇(naja mossambica)和紫红链霉菌(streptomyces vialaceoruber)的各种来源的磷脂酶A2(PLA2)评估SML7a(1-胆固醇基-2-全反式-视黄酰基(retinoyl)-sn-甘油磷酸胆碱)的全反式视黄酸的释放。所有PLA2购自阿尔德里奇-西格玛公司(Aldrich-Sigma)。利用旋转蒸发仪在50mL圆底烧瓶中蒸发SML7a(50μmol)的氯仿溶液。将该烧瓶置于高真空下过夜。脂质薄膜在含有20mMTriton X-100、10mM CaCl2、10mM HEPES和50mM KCl的10mL pH8.8缓冲液中水合。室温下，10分钟间歇涡流振荡后获得清澈的溶液。37℃，温育溶液的试样(250μL)10分钟，然后用于PLA2试验。37℃预温育PLA2溶液(25单位，10mM HEPES和50mM KCl的250μL pH8.8缓冲液配制)10分钟，与SML7a的预温热溶液试样混合。在不同时间点，通过TLC分析水解样品，用比重计定量测定。结果示于图7。虽然所有三种PLA2酶能从SML7a完全释放全反式视黄酸，但莫桑比克射毒眼镜蛇的PLA2显示活性最高。

实施例22在接种C26结肠癌肿瘤的BALB/C小鼠中比较包封入各种 组成的脂质体的阿霉素对肿瘤进展和动物存活的影响

为证明含SML的脂质体作为药物运载体的普遍适用性，将抗癌症药物包封在含有各种固醇基磷脂(steroylphospholipid)的许多脂质体组合物中。在接种了C26结肠癌的Balb/C小鼠中比较这些制剂与非包封阿霉素或DoxilTM(美国食品与药品管理局批准的市售阿霉素脂质体制剂)对肿瘤进展和动物存活的影响(图8和9，表3)。

在该模型中，用不含药物的载体PBS治疗的模型动物的中值存活时间是22天，没有动物活过60天(表3)。用最高耐受剂量的非包封阿霉素(10毫克/千克体重)治疗的动物的中值存活时间是26天，没有动物活过60天。用15毫克/千克的DoxilTM治疗的动物的中值存活时间大于60天，80％的动物活过60天。用含双固醇的制剂，DCHEMSPC-DSPC-PEGDSPE2000-αT(33∶61.8∶5.0∶0.2)中的阿霉素，以15mg/kg治疗的动物的中值存活时间大于60天，100％的动物活过60天(表3)。在C26结肠癌模型中，包封在含各种固醇基脂质的制剂中的阿霉素提供显著的疗效，与批准的不含固醇脂质的脂质制剂一样好或者更好(表3，图8和9)。

所有的合成磷脂购自阿拉巴马州伯明翰的阿凡提极性脂质公司。如上所述合成SML磷脂。胆固醇(Chol)购自密苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。道威克斯(Dowex)50WX4树脂购自威斯康星州密尔沃基的阿尔德里奇公司(Aldrich，Milwaukee，WI)。阿霉素(DOX)购自俄亥俄州贝德福德的贝德福德实验室(Bedford Laboratories，Bedford，OH)。从UCSF细胞培养机构(UCSF Cell Culture Facility)获得培养基(MEM，含厄尔氏平衡盐溶液(EBSS)的Eagle)。所有其它试剂是分析级的。将溶液经0.2微米无菌膜过滤入无菌容器中。所有的溶液是无菌和无热原的。

通过本领域熟知和，例如(Liposomes：2nd edition(脂质体：第二版)，牛津大学出版社，2003，V.Torchilin和V.Weissig编)所述的方法制备大学确定的加载有药物的脂质体。室温下利用旋转蒸发仪减压干燥玻璃试管中溶解于氯仿的10微摩尔脂质混合物，然后维持高真空过夜来制备脂质薄膜。在螺旋盖玻璃试管中，在该脂质的转变温度以上用250mM无菌硫酸铵溶液再水合脂质薄膜，然后于60℃，在水浴型超声仪中超声处理10分钟来制备脂质体。然后将脂质体制品经0.1微米聚碳酸酯膜挤出。4℃，用100-倍体积的5％葡萄糖进行透析(24小时更换一次)以除去未包封的硫酸铵。60℃，将溶解于5％葡萄糖的阿霉素溶液与含硫酸铵的脂质体温育2小时来包封阿霉素。将该制品流过含道威克斯50WX4的柱从脂质体中除去未包封的阿霉素。包封效率通常大于70％，其中药物∶磷脂比例约为100微克/微摩尔总脂质。采用多峰模块程序，通过动态光扫描检测的平均囊泡制剂为85-140nm，伴有单分散性粒度分布(马尔文仪器公司(Malvern Instruments)，英国)。脂质体包封阿霉素制品经0.2微米膜过滤入无菌的15mL无菌锥形离心管中，4℃储存直至注射入动物。

根据加利福尼亚州旧金山分校的动物研究委员会批准的方案，进行的所有动物实验符合NIH动物研究指南。对于所有化疗实验，在第0天，在Balb/c小鼠的右肋皮下注射C26肿瘤细胞(每只小鼠4×105个细胞)，然后随机分组(每组5只)并编号。实验期间每日称重小鼠并监测肿瘤大小。用卡尺检测3个正交直径(a，b和c)来评估肿瘤体积；该体积计算为(a×b×c)×0.5cm3。刚可触知的肿瘤规定为1mm×1mm×1mm。在各实验中，监测小鼠最长至接种后60天，或者直至符合以下安乐死的条件：1)它们的体重降低至原始体重的15％以下；2)它们的肿瘤在横穿任何维度上均大于2.0cm；3)它们变得昏睡或呕吐且不能进食；或者4)发现它们死亡。在第60天，所有存活的小鼠施以安乐死；然而，如果在第60天任何存活小鼠具有可触知的肿瘤，则监测实验中剩余的所有小鼠直至第90天，此时对小鼠施以安乐死。活过60天的所有小鼠存活至第90天。

表3：在各种组成的脂质体中递送的阿霉素对接种C26结肠癌的Balb/C小鼠存活的影响

  制剂   阿霉素的剂量  浓度(mg/kg)   中值存活时间   第60天时存活动  物的数量(n＝5)   磷酸缓冲盐水   0   22   0   游离Dox   10   26   0   DoxilTM   15   ＞60   4   DCHEMSPC-DSPC-PEGDSPE-αT，  33∶61.8∶5.0∶0.2   15   ＞60   5   PChcPC-PEGDSPE-αT，94.8∶5.0∶0.2   15   ＞60   4   DCHEMSPC-PEGDSPE-αT，94.8∶5.0∶0.2   15   ＞60   4   SeChc/PC/PEGDSPE/αT，94.8∶5.0∶0.2   15   ＞60   3   SeChc/PC/PEGDSPE/αT，94.8∶5.0∶0.2   10   26   2   SeChc/PC/PEGDSPE/αT，94.8∶5.0∶0.2   6   24   1

  SeChc/PC/PEGDSPE/αT，94.8∶5.0∶0.2   2   24   0   DChcPC/DSPC/PEGDSPE/αT，  33∶61.8∶5.0∶0.2   10   ＞60   3   DChcPC/DSPC/PEGDSPE/αT，  33∶61.8∶5.0∶0.2   6   34   1   DChcPC/DSPC/PEGDSPE/αT，  33∶61.8∶5.0∶0.2   2   26   0

各制剂下标出了制剂组分的摩尔比例。DCHEMSPC＝SML6b；DSPC＝二硬脂酰基磷脂酰胆碱；PEGDSPE＝1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇-胺-N-[聚-(乙二醇)-2000]；αT＝α-生育酚；SeCHcPC＝1-硬脂酰基-2-胆固醇基羰基(carbonoyl)-外消旋-甘油基-3-磷酸胆碱。

实施例23包封两性霉素B的脂质体

评估所选SML对两性霉素B的包封作用。用相应的二酰基PC(相同链长)配制SML来以各种比例包封两性霉素B。首先，蒸发给定比例的SML/二酰基PC脂质混合物的氯仿溶液，将脂质薄膜置于高真空下过夜。然后将给定量的两性霉素B DMSO溶液(20mg/mL)加入脂质薄膜，随后加入pH 7.4PBS。60℃，在氩气气氛中超声处理该混合物1小时。然后用pH7.4PBS透析该混合物。得到的黄色溶液经220nm膜过滤除菌。4℃储存产物以供进一步研究。当用SML适当配制两性霉素B，例如SML∶PC∶AmB＝2∶2∶1(摩尔)时，大多数制剂在4℃能稳定一年以上，例如含有PeChcPC、MeChcPC、SChcPC和PChcPC的制剂。这些结果显示可利用SML获得优化的制剂以便包封两性霉素B。

实施例24用于蛋白质递送的脂质体

某些治疗性蛋白质可结合脂质体表面。当脂质体蛋白质复合体注射入动物时，这能稳定蛋白质并导致更长的循环时间。例如，重组FVIII非共价，但以高亲和力结合脂质体外表面。已利用合成的PEG化脂质体重建因子VIII来延长因子VIII的循环时间和降低临床前模型和动物的出血，所述脂质体是将97∶3摩尔比的90％(重量/重量)棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)和1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇-胺-N-[聚-(乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)悬浮在50-mM柠檬酸钠缓冲液(9％重量/体积溶液)中构成的。该制剂不是最佳的，因为没有胆固醇存在下，其从循环中清除太快。

说明蛋白质递送的稳定SML脂质体制剂如下所示。如实施例3所述合成的SML3d和DSPE-PEG2000(阿凡提极性脂质)构成的SML脂质体制剂如阿霉素实施例所述制备，除了将100微摩尔脂质混合物悬浮在50mM柠檬酸钠pH7.0中。将1毫升单层SML3d-DSPE-PEG2000脂质体与100IU单位的重组因子VIII，Kogenate FS(伯克利的拜耳保健药物公司(Bayer HealthCare Pharmaceuticals，Berkeley))混合。与缺乏胆固醇的制剂，例如棕榈酰基油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)和1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇-胺-N-[聚-(乙二醇)-2000](DSPE-PEG 2000)，97∶3摩尔比相比，该SML3d-DSPE-PEG2000脂质体制剂提供更稳定的脂质体以供配制因子VIII。可利用SML3d-DSPE-PEG2000脂质体以增强因子VIII的体内活性。

蛋白质可与SML脂质体形成稳定颗粒而不丧失活性。将含多聚组氨酸标签的蛋白质通过脂质-三-次氨基三乙酸，例如Bioconj.Chem.2006，17，1592-1600所述的DOD-tri-NTA锚定在SML脂质体上。典型的制剂包含5％DOD-tri-NTA、50％二酰基磷酸胆碱和45％m-SML。将蛋白质通过NTA-Ni-组氨酸相互作用掺在脂质体上。通过流过尺寸排阻柱纯化加载蛋白质的脂质体。然后用合适的方法评估制剂稳定性和蛋白质活性。

实施例25SML对高胆固醇血症的应用

已知植物固醇，例如β-谷固醇和β-豆固醇能抑制胆固醇吸收并降低人的血浆胆固醇水平。含有β-谷固醇的SML可用于治疗高胆固醇血症。

将含有β-谷固醇的SML配制成食品添加剂，或配制成注射剂以帮助降低血液胆固醇食品。例如，将SML双固醇脂质SML6d以30mg/mL浓度溶解于叔丁醇，然后经0.1微米玻璃滤器除菌。-70℃冷冻无菌脂质溶液，然后用冻干机冻干24小时以完全干燥。将干燥的脂质粉末(150mg)与30mg果胶、42mg钙(如磷酸二钙)、26mg磷(如磷酸二钙)和微晶纤维素混合。将干燥的粉末填充入明胶胶囊以提供150mg二谷固醇磷脂酰胆碱的剂量。当恰在进食前口服摄入时，该谷固醇衍生物能用于抑制胆固醇吸收。

实施例26利用SML制备微泡

微泡是通过单层脂质稳定的填充有气体的气泡。过去，用不含胆固醇的合成磷脂混合物制备微泡。这是因为当微泡与生物膜和脂蛋白接触时，胆固醇快速离开单层：从而导致微泡不稳定。

SML可用于配制微泡。从SML制备的脂质体在有血清存在下更能保留内含物(实施例18)。从十氟丁烷(decafluorobutane)气体制备微泡，用90∶10摩尔比的SML4a(实施例4)和PEG-DSPE-2000(阿凡提极性脂质公司，阿拉巴斯特，阿拉巴马州)的混合物构成的单层稳定。将氯仿配制的适当量的SML4a、PEG-DSPE-2000(90∶10，摩尔比)加入玻璃试管。在N2气氛下除去氯仿，然后真空蒸发至少2小时。将100mM Tris(pH7.4)∶甘油∶丙二醇(80∶10∶10，体积比)组成的气泡稀释剂加入干燥的脂质以产生1mM(1mg/mL)的脂质浓度。在脂质的相转变温度(60℃)以上充分混合脂质悬液以形成多层囊泡的乳状溶液。利用水浴超声仪(20kHz，100W，10分钟)超声处理悬液至透明。将终浓度为1mg/mL的脂质体溶液以1mL等份加入2-mL小瓶。然后将10cm3十氟丁烷气体(美国田纳西州纽波特的弗鲁拉公司(Flura，Newport，TN，USA))经橡胶帽缓慢注射入小瓶，利用针头(20G1，短斜面(short Bevel)，B-D公司(Becton-Dickinson))作为出气口交换空气。利用橡胶帽上的铝封条给小瓶迅速加帽。可在4℃储存含有脂质体溶液(上方是十氟丁烷)的密封小瓶待用。可利用生物珠摇床(Biobead shaker)，通过机械搅拌含脂质体溶液的小瓶来形成微泡。振荡小瓶45秒后，该溶液呈乳状，将其抽入3-mL注射器，利用10mM磷酸缓冲盐水(PBS，pH7.4)将其稀释至3mL的最终体积。可通过300×g浮选3分钟除去溶液中的脂质体(未掺入微泡的)和亚微米大小的气泡。

然后可注射从含有化合物SML4a的组合物形成的微泡以便采用超声破碎在动物的指定部位显像或递送分子。有具有各种物理化学特性的SML可用能配制特性精确受控的微泡。

实施例27利用从化合物SML9a制备的聚丁二炔囊泡或单层的诊断试验 平台

有人提出在双层囊泡中形成聚丁二炔的脂质体比色试验可用于诊断试验，因为分析物与掺入聚合囊泡表面的受体结合后聚丁二炔的吸收光谱漂移大。该试验的灵敏度取决于聚丁二炔聚合物的长度及其取向。通常用于该应用的组合物由混合的合成磷脂，例如二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和10，12-二十三碳二炔酸(TRCDA)构成。利用二氯甲烷制备6/4摩尔比的TRCDA和DMPC的储备溶液。随后利用254nm的便携式UV灯使从该组合物制备的脂质体聚合。这些组合物不适用于许多生物学液体中，因为该液体的蛋白质与脂质体表面相互作用并导致颜色产生非特异性改变。将游离胆固醇包含入这些混合物以降低蛋白质吸附的尝试不令人满意，因为TRCDA聚合后，胆固醇相分离，从而脂质体对分析物起反应的能力受损。可用SML2c替代以上组合物中的DMPC以提供更稳定的TRCDA组合物。

另一方法是利用含有实施例9所述的SML化合物SML9a以增强稳定性。SML9a含有连接于胆固醇的可聚合二十三碳二炔酸，所述胆固醇含有磷脂酰胆碱首基。在脂质体双层中，TRCDA最好根据毗连的胆固醇定向以便于聚合。聚合时，胆固醇不能相分离，因为其与磷脂相连。SML9a脂质连同97/3摩尔比的氯仿溶液中的脂质连接受体，例如神经节苷脂GM1一起在玻璃试管的侧面上干燥，蒸发溶剂。将磷酸缓冲盐水加入干燥的脂质混合物(终浓度，1mM总脂质)并进行水浴超声处理。超声处理期间将样品加热至45℃以确保脂质在主要相转变温度以上。由于SML中有共价相连的胆固醇存在，可在低温制备脂质体；这对于可包含在试验中的许多生物学靶标(例如，受体)的稳定性至关重要。

趁热经0.8微米聚碳酸酯膜过滤SML脂质体制品，4℃储存过夜。将样品升温至室温，利用254nm光的便携式UV灯聚合从而产生聚合囊泡的暗蓝色/灰色溶液。可利用该聚合的单固醇SML脂质体组合物检测生物学液体中大肠杆菌内毒素是否存在，因为内毒素结合GM1。SML中共价相连的胆固醇部分使得聚合的脂质体稳定以免生物相中发现的蛋白质插入，从而不会如游离胆固醇那样从脂质体转移入生物膜。因此，SML使得诊断系统的应用更灵敏、更稳定。

实施例28单固醇SML对于再生型头发调理剂的应用

磷脂和胆固醇是人体的主要组分，还是滋养、润湿、清洁和调理皮肤和头发的个人护理产品的典型成分。单固醇和双固醇SML甘油脂和SML鞘脂在一个分子中组合了这两种主要的组分。它们还以生物可降解或生物稳定的形式提供。

在本实施例中，用以下成分(以重量百分比加入)制备头发调理组合物：水86.6％，羟乙基纤维素0.7％，二硬脂酸甘油酯0.7％，鲸蜡醇2.0％，SML化合物SML4d(实施例4)10％。为制备该混合物，在高速恒定搅拌和加热至60℃的条件下，将羟乙基纤维素加入水中。其余成分在持续搅拌下加入并升温至70℃。此时可加入着色剂、芳香剂和抗微生物剂。搅拌混合物直至诸组分形成具有理想稠度的光滑液体。将该组合物冷却至室温。将该头发调理剂应用于头发赋予其健康和理想的外观。用于该领域的中醚连接单固醇SML的储存期长，制剂中各种组分混合充分。

实施例29利用单固醇和双固醇SML形成的纳米乳液

纳米乳液或亚微米乳液是平均液滴直径为50-1000nm的水包油乳液。液滴的平均大小通常在100-500nm。纳米乳液通常含有用0.5-2％鸡蛋或达到卵磷脂稳定的10-20％油。本实施例所述的SML是理想的乳化剂，其不会让固醇组分如游离胆固醇那样与两亲首基发生相分离。

在本实施例中，SML纳米乳液的制备采用高压匀浆化和SML化合物SML5d。形成的颗粒显示通过磷脂的单分子层与环绕的水相分开的液体状亲脂性核心。这种卵磷脂稳定油滴的结构与乳糜微粒相当。因此，纳米乳液不同于脂质体，其中磷脂双层将水性核心与疏水性外相隔开。或者，用过量磷脂制备的纳米乳液可同时形成脂质体。

可用生物可降解的SML配制用于皮肤护理目的的纳米乳液。例如，SML5d因SML水解而产生胆固醇和油酸，因此可用于皮肤护理产品。下表4说明了SML纳米乳液皮肤护理组合物。

以上皮肤护理制剂的一种改变形式是上述制剂(表4)中1重量％的SML5d脂质(实施例5)替换成1％的SML7a(实施例7)。SML7a脂质提供的皮肤护理组合物具有缓释形式的反式-视黄酸。可利用后一种皮肤护理制剂使皮肤恢复年轻并除去皱纹。

实施例30从同一脂质体包封和递送两种或更多种药物

药物联用是临床癌症治疗中广为接受的方案。虽然可以在体外系统地研究不同药物比例的药物相互作用，但这些比例来不能简单地应用于体内，因为不同药物的不同药代动力学特征。将两种药物共包封入脂质体可以使药物的分布“同步”，如果药物可以稳定地包埋于其内的话。理论上，这能将体外结果更直接地应用于体内。然而，如果物质的稳定性差并且从帮助脂质体中渗漏，包封的药物可以不同速度释放，从而难以预测有效的游离药物浓度。

在本实施例中，利用稳定的SML脂质体受控、同步释放各种药物组合。如上所述，在体外条件下，DMPC/游离胆固醇组合物和从基于SML的磷脂SML1c制备的脂质体(ChcMaPC)之间模型化合物的渗透诱导释放没有差异。然而，在模拟体外条件的条件下，有30％胎牛血清存在下钙黄绿素的释放有实质性差异，7天从DMPC/游离胆固醇组合物中约有80％渗漏，相比之下基于SML的SML1c脂质体在28天中的渗漏小于1％(图4)。因此，将磷脂药物共包封在SML构成的脂质体中可极大降低体外释放和体内释放的差异，包括更好地从体外数据预测体内释放。

以下两种药物组合的稳定共包封作用使得它们在体内从SML制备的脂质体中同步递送：依立替康/氟脱氧尿苷(fluoxuridine)、柔红霉素/阿糖胞苷、顺铂/柔红霉素、顺铂/阿霉素、长春瑞滨/顺铂、蛋白质激酶抑制剂/阿霉素、光神霉素/氮芥、紫杉醇/托泊替康、7-羟基星形孢菌素/喜树碱、亚叶酸/5-氟尿嘧啶、亚叶酸/氟乳清酸、巯基嘌呤/阿糖胞苷、长春瑞滨/紫杉醇、长春瑞滨/阿霉素、阿糖胞苷/顺铂、白藜芦醇(reversatrol)/阿糖胞苷、碳铂/吉西他滨(gemcitobine)、托泊替康/顺铂或来自药物与siRNA或气体寡核苷酸的组合。按照已知的体内有效剂量共包封药物，利用尺寸排阻柱通过分开包封药物与释放的药物来体外测定它们的释放特征。

实施例31用于肺部药物递送的SML构成的脂质体

数十年来，肺部药物递送系统已用于递送治疗呼吸道疾病，例如哮喘、肺气肿、革兰氏阴性细菌感染和真菌感染的药物。将氨基糖苷类，例如妥布拉霉素递送给患有囊性纤维化的患者已经是CF患者中抗细菌治疗的主要手段。技术进步口服了吞噬作用、粒度优化和降解等难题，从而能利用肺部的表面积大来递送药物进入血液循环。肺部据信是诸如蛋白质等药物(例如胰岛素)避开胃肠道的最佳选择。

尽管需求很大，但没有脂质体包封的药物被批准用于递送入肺部。没有利用脂质体的肺部药物递送的原因在于肺部充满了可破坏目前用合成脂质制备的脂质体的表面活性剂。游离胆固醇不能用于稳定目前的脂质体，因为脂质体中的游离胆固醇与肺部表面活性剂快速交换。

本文所述的SML化合物避免了肺部表面活性剂破坏脂质体的问题，同时还有助于药物从脂质体控释进入肺部。

在本实施例中，根据本领域熟知的方法，从SML和实施例23所述的二酰基磷脂的混合物制备含有两性霉素B的SML脂质体，所述方法描述于，例如(Liposomes：2nd edition(脂质体：第二版)，牛津大学出版社，2003，V.Torchilin和V.Weissig编)。两性霉素B加载的SML脂质体在测试动物或患者的肺中雾化作为真菌感染，例如曲霉病的治疗。在另一例子中，将按照实施例23所述制剂制备的两性霉素B加载的SML脂质体冻干并作为干燥粉末递送入肺部。在是尤其有利的，因为其代表了对患者更方便的剂型和更稳定的剂型。

在另一例子中，实施例6所述双固醇SML脂质用于制备在有肺部表面活性剂存在下稳定的抗生素加载脂质体。诸如妥布拉霉素或环丙沙星等抗生素可用于该目的。从纯的SML6b或从SML6b和各种合成二酰基磷脂，例如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-PEG2000(PEG-DSPE-2000)的组合制备脂质体。通过本领域熟知的方法制备大小确定的脂质体，所述方法描述于，例如(Liposomes：2nd edition(脂质体：第二版)，牛津大学出版社，2003，V.Torchilin和V.Weissig编)。室温下利用旋转蒸发仪减压干燥玻璃试管中溶解于氯仿的100微摩尔脂质混合物，然后维持高真空过夜来制备脂质薄膜。具体的组合物是95微摩尔SML6b和5微摩尔DSPE-PEG或40微摩尔SML6b、55微摩尔DSPC和5微摩尔PEG-DSPE-2000或SML2a和5微摩尔PEG-DSPE-2000。在螺旋盖玻璃试管中，在该脂质的转变温度以上用200mg/mL无菌妥布拉霉素溶液再水合该脂质薄膜，然后于60℃，在水浴型超声仪中超声处理10分钟来制备脂质体。然后将脂质体制品经0.1微米聚碳酸酯膜挤出。4℃，用100-倍体积的50mM tris/HCL，pH7.4(24小时更换一次)以除去未包封的妥布拉霉素。包封效率通常大于10％，其中药物∶磷脂比例约为200微克/微摩尔总脂质。根据所选的制剂，通过动态光扫描检测的平均囊泡直径为100-150nm。(马尔文仪器公司，英国)。脂质体包封的妥布拉霉素制品经0.2微米膜过滤入无菌的15mL无菌锥形离心管中，4℃储存直至在测试动物中雾化。该组合物的药学上可接受的制剂可在患者中雾化。

在还有另一例子中，从基于肉碱的SML化合物(实施例11)制备的阳离子脂质制剂用于和阴离子寡核苷酸，例如siRNA或多核苷酸，例如DNA形成复合体。室温下利用旋转蒸发仪减压干燥玻璃试管中溶解于氯仿的100微摩尔脂质混合物，然后维持高真空过夜来制备脂质薄膜。具体的组合物是30微摩尔SML6a和70微摩尔1，2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(DOTAP)。在螺旋盖玻璃试管中，在该脂质的转变温度以上用无菌的10mM tris/HCl pH7.0再水合该脂质薄膜，然后于25℃，在水浴型超声仪中超声处理10分钟来制备脂质体。然后将脂质体制品经0.1微米聚碳酸酯膜挤出。将待递送的核酸与脂质体制品以三甲铵基团与核酸磷酸基团为3/1的摩尔比混合。在这些条件下，所有核酸与脂质颗粒结合。根据所选的制剂，通过动态光扫描检测的平均粒径为100-200nm。(马尔文仪器公司，英国)。脂质体结合的核酸制品经0.4微米无菌膜过滤入无菌的15mL无菌锥形离心管中，4℃储存直至在测试动物中雾化。该制剂或其在药学上可接受的制剂适于将多核苷酸或siRNA转移入测试动物的肺中。

实施例32用于抗原递送以诱导疫苗的SML和SML与非-SML脂质混合 物构成的脂质体和脂质颗粒

SML化合物在生物学液体中具有出乎意料的稳定性，同时能维持高度流动性。这些特征使得它们成为递送抗原的良好候选对象。

在一个例子中，从以1/1摩尔比混合的SML8a(实施例8)和1，2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(DOTAP)制备疫苗应用的SML制剂。在另一例子中，基于肉碱的阳离子SML(SML11a)取代DOTAP。室温下利用旋转蒸发仪减压干燥玻璃试管中溶解于氯仿的100微摩尔脂质混合物，然后维持高真空过夜来制备脂质薄膜。在螺旋盖玻璃试管中，在该脂质的转变温度以上用无菌的10mM tris/HCl pH7.0再水合该脂质薄膜，然后于25℃，在水浴型超声仪中超声处理10分钟来制备脂质体。然后将脂质体制品经0.1微米聚碳酸酯膜挤出。将蛋白质或肽表位(称为抗原)与脂质体制品以各种重量比(30/1脂质/抗原到1/1脂质/抗原)混合。如果抗原带净负电荷(取决于抗原的等电点)，抗原与构成阳离子SML制剂的脂质颗粒结合。根据所选的制剂，通过动态光扫描检测的平均粒径为100-300nm。(马尔文仪器公司，英国)。SML脂质体结合的抗原制品经0.4微米无菌膜过滤入无菌的15mL无菌锥形离心管中，4℃储存直至给予测试动物。通过真皮内、肌肉内、皮下、鼻内、口服、肺部或胃肠外途径给予适于该给药途径和动物种类的剂量的该制剂。可将该组合物的药学上可接受的制剂给予患者。

在另一例子中，利用混合的SML化合物SML8a和二硬脂酰基磷脂酰胆碱(9/1摩尔比)制备阴离子SML脂质体制剂。此外，如上所述制备25微克对1毫克脂质的单磷酸脂质A(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis，Mo))。为增加该阴离子SML脂质体制剂的免疫应答，将肽或蛋白质抗原以每毫克脂质25-100微克抗原的比例连接于脂质体双层。该连接可以是共价的或通过非共价方式，例如通过电荷相互作用或利用脂质体表面螯合的金属与抗原上的组氨酸标签(“His-Tag”)之间的金属螯合相互作用。通过真皮内、肌肉内、皮下、鼻内、口服、肺部或胃肠外途径给予适于该给药途径和动物种类的剂量的该制剂。可将该组合物的药学上可接受的制剂给予患者。

在其它例子中，制备固体核心SML脂质乳液以供抗原递送。25℃，从含有硬脂酰基或棕榈酰基链的甘油三酯制备固体核心SML颗粒。如上所述，从以1/1摩尔比混合的SML8a(实施例8)和1，2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(DOTAP)制备合适的SML疫苗制剂。

实施例33：含有SML的脂质复合体以供核酸递送

可利用阳离子脂质系统将核酸，例如RNA、DNA、寡核苷酸、siRNA或其它寡聚和多核苷酸递送入培养的细胞和动物或患者的细胞。文献中已描述了含有阳离子脂质的大量阳离子脂质和系统。所有这些的体内核酸运送效率有限，因为这些颗粒在体内不稳定。例如，缺乏稳定性可能是因为当注射入动物或患者时，缺乏胆固醇的阳离子系统被蛋白质快速覆盖这一事实。当体内给予时，含有游离胆固醇以图稳定脂质系统的那些丧失游离胆固醇，其进入细胞膜。含有SML化合物的脂质复合体(lipoplex)组合物没有该问题。

将如上所述制备的基于阳离子SML的脂质体或基于阳离子SML的胶束与阴离子核酸混合，从而通过核酸上的负电荷与基于阳离子SML的脂质颗粒上的正电荷之间的电荷相互作用形成复合体。这些复合体称为脂质复合体或SML脂质复合体。当DNA是与基于阳离子的脂质体或基于阳离子的胶束形成复合体的多核苷酸时，该SML制剂可用于递送DNA(例如，“基因转移”)。当寡核苷酸，例如siRNA与基于阳离子SML的脂质体或基于阳离子SML的胶束形成复合体时，该SML制剂可用于递送siRNA或修饰的siRNA(例如，“基因沉默”)。

在一个例子中，将双固醇SML，例如化合物SML6a构成的脂质混合物与1，2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(DOTAP)以1/4：SML/DOTAP的摩尔比在氯仿溶液中混合。室温下利用旋转蒸发仪减压干燥玻璃试管中溶解于氯仿的100微摩尔脂质混合物，然后维持高真空过夜来制备脂质薄膜。在螺旋盖玻璃试管中，在该脂质的转变温度以上用无菌的10mM tris/HCl pH7.0再水合该脂质薄膜，然后于25℃，在水浴型超声仪中超声处理10分钟来制备脂质体。然后将脂质体制品经0.2微米聚碳酸酯膜挤出。随后将溶解于10mM tris/HCl pH8.0中的核酸加入阳离子SML脂质体，从而阳离子脂质正电荷与核酸负电荷为3/1，其称为SML脂质复合体。然后将该SML脂质复合体加入培养的细胞或通过各种途径，例如通过注射给予测试动物。

脂质SML6a为脂质复合体提供的胆固醇形式不易经水相转移入生物膜。因此，脂质复合体在生物相中远比用游离胆固醇形成的稳定。此外，当胆固醇与脂质之比上升到约30摩尔％胆固醇之上时，脂质SML6a能诱导新相形成。这体现在图10的DSC曲线中，其中当当量游离胆固醇摩尔百分比为30摩尔％时，在约20℃观察到新的过渡。从该脂质混合物制备的脂质复合体是良好的多核苷酸转移试剂。本实施例中的阳离子脂质是DOTAP，但任何单阳离子或多阳离子性的阳离子脂质可用于替代DOTAP。

在另一例子中，基于肉碱的SML化合物(实施例11)用作单一物质以形成阳离子SML颗粒并与核酸，例如siRNA相互作用。根据固醇部分和脂族部分的连接位置以及脂族链长、脂族链的不饱和或分支程度来调节这种阳离子SML颗粒的特性。将10mM tris/HCl pH8.0中的核酸以3/1的阳离子与阳离子电荷比加入10mM tris/HCl pH7.0中的预形成阳离子颗粒，从而在基于阳离子SML的脂质体和核酸之间形成复合体。如此形成的SML脂质复合体是细胞培养和体内的有效核酸递送载体。从单一SML化合物和核酸形成基于SML的脂质复合体的另一优点在于它们易于冻干并能快速再水合成核酸转移活性脂质复合体。

因此，如本实施例所述，不难形成各种单价和多价SML化合物作为脂质复合体组合物以便用作核酸递送载体。

实施例34：含有可还原SML的纳米脂质颗粒组合物以供核酸药物递送

为获得能将核酸体内递送至指定靶位的长循环纳米颗粒，必需除去或有效屏蔽纳米颗粒表面的阳离子电荷。过去有人试图通过利用在pH7.4不质子化的可滴定阳离子基团，通过在纳米颗粒形成后使阳离子基团反应从而形成阴离子或中性基团来除去阳离子基团，或通过二硫键交换反应将阳离子基团与阴离子或中性基团交换来实现。另一方法是避免使用阳离子物质并用在pH7.4时不是阳离子的氢键取代静电相互作用。尽管作出了这些尝试，纳米脂质颗粒在体内依然缺乏稳定性，特别是与血浆蛋白及血液和其它体液中发现的脂蛋白的破坏性相互作用。可利用本文所述的SML化合物，通过提供不可交换的固醇以及除去或有效屏蔽纳米颗粒表面上的阳离子电荷而增加纳米脂质颗粒的稳定性。

在一个例子中，制备利用二硫键作为可切割连接键的SML纳米颗粒以便体内递送生物反应性多核苷酸。接头的体内切割取决于氧化胞外间隙和还原胞内环境之间的高氧化还原电位差。例如，含有二硫键连接的阳离子功能化脂质的阳离子SML纳米颗粒在胞外基质中稳定，但在细胞质的还原性环境中从锚定脂质上切割下来。从脂质上切下阳离子部分从纳米颗粒上释放了带电荷的凝聚DNA，从而DNA迁移入核。在本实施例中，透析方法与含有SML化合物SML13i(实施例13)的阳离子二硫化物用于将质粒DNA包封入PEG-屏蔽的纳米脂质颗粒(图11)。然后分别通过与半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)的二硫键转换反应将表面正电荷转换成中性或负电荷。因此，该方法可用于产生具有中性。两性或非离子性表面的颗粒。此外，目前用SML稳定非阳离子SML纳米颗粒。可通过掺入靶向配体，例如对细胞表面分子有反应活性的抗体来进一步修饰非阳离子纳米颗粒，从而将该纳米颗粒结合于细胞表面。

在具体例子中，将质粒DNA加入28mM辛基葡糖苷中摩尔比为1/5/5的PEG-脂质/SML5d/阳离子二硫化物SML13i脂质混合物，用20mM Hepes pH8.5透析除去辛基葡糖苷。在5mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH8.5)配制的1.47ml 28mM正辛基-β-D-吡喃型葡萄糖(OG)中水合总干燥脂质2.5微摩尔(PEG-脂质/SML5d/SML13i的摩尔比例为1/5/5)，0.5小时。将相同体积的洗涤剂缓冲液配制的DNA脂质(137.3μg)加入脂质溶液，轻柔涡流振荡30秒。然后将该溶液转移至Slide-A-LyzerTM透析盒(MWCO 10K，伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce，Rockford，IL))，用1升20mM HEPES缓冲液(pH7.4)在4℃透析2天，更换透析缓冲液四次。

为修饰颗粒的表面电荷，将GSH或Cys(摩尔比例比用于颗粒形成的SML13i用量高10倍)加入SML纳米脂质颗粒溶液，温育溶液5分钟，然后置于透析盒中，迅速用1升20mM HEPES缓冲液(pH7.4)在4℃透析以除去还原剂。

得到的SML纳米颗粒的粒径基本上小于(约100nm直径)相同电荷比例的脂质复合体制剂(170-360nm)。可通过分别短期混合SML纳米脂质颗粒与过量的还原剂：GSH和Cys来进一步修饰颗粒表面。通过透析除去SML纳米脂质混合物中未反应的还原剂。得到的SML纳米脂质颗粒的粒径通常增加约40nm。与阳离子脂质复合体中86％的包封数值相比，表面修饰后约50％的包封DNA质粒保留在颗粒内。用GSH或Cys处理的阳离子SML纳米脂质颗粒的表面电荷分别转化成阴离子或中性电荷。表面电荷的这种改变是因为阳离子首基与带负电荷的GSH或两性离子Cys交换。这些SML纳米脂质颗粒还适用于体内多核苷酸或siRNA递送，可通过将脂质连接的靶向配体掺入用于制备靶向SML纳米脂质颗粒的脂质混合物作进一步修饰。

实施例35：制备脂质SML15a-j

合成脂质SML15a、SML15b、SML15c、SML15d、SML15e、SML15f、SML15g、SML15h、SML15i和SML15j(统称为SML15a-j)的具体合成方案如流程15所示。以下合成脂质SML15f的详述示例了该流程。

流程15.合成SML15a-j

SML15a：R1＝C5H11，R2H＝胆固醇

SML15b：R1＝C7H15，R2H＝胆固醇

SML15c：R1＝C9H19，R2H＝胆固醇

SML15d：R1＝C11H23，R2H＝胆固醇

SML15e：R1＝C13H27，R2H＝胆固醇

SML15f：R1＝C15H31，R2H＝胆固醇

SML15g：R1＝C17H35，R2H＝胆固醇

SML15h：R1＝C17H33，R2H＝胆固醇

SML15i：R1＝C19H39，R2H＝胆固醇

SML15j：R1＝C21H43，R2H＝胆固醇

SML15k：R1＝C23H47，R2H＝胆固醇

1-棕榈酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML15f，PChemsPC)：室温下，向1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-磷酸胆碱(0.95g，1.91mmol)和半琥珀酸胆固醇酯(1.86g，3.82mmol)的无乙醇干燥氯仿(50mL)溶液中加入DMAP(0.24g，1.91mmol)和DCC(0.79g，3.82mmol)。室温下搅拌反应混合物24小时。过滤混合物，通过旋转蒸发浓缩滤液。残留物应用HPFC纯化(CHCl3到CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4)。TLC：Rf＝0.54(洗脱剂C)。1H NMR(CDCl3)，δ0.68(s，3H)；0.85-1.65(m，62H)；1.84-2.05(m，5H)；2.29-2.31(m，4H)；2.55-2.62(m，4H)；3.31(s，9H)；3.78(m，2H)；4.04(m，2H)；4.24(m，1H)；4.41(m，3H)；4.55(m，1H)；5.21(m，1H)；5.40(d，J＝4.4，1H)。为C55H99NO10P+计算的MALDI-MS[M+H]+964.71，实测964.68。

实施例36制备脂质SML16A-M

SML16的合成示于流程16。代表性过程如下所述。

流程16.合成SML16a-m

SML16a：R＝C5H11

SML16b：R＝C7H15

SML16c：R＝C9H19

SML16d：R＝C11H23

SML16e：R＝C13H27

SML16f：R＝C15H31

SML16g：R＝C17H35

SML16h：R＝C17H33

SML16i：R＝C19H39

SML16j：R＝C21H43

SML16k：R＝C23H47

SML16l：R＝C15D31

SML16m：R＝CH3(OCH2CH2)8

1-胆固醇基半琥珀酰基-2-羟基1-3-甘油基-磷酸胆碱是合成SML6B(参见实施例6)的副产物，其用作合成SML 16a-m的起始材料。

1-胆固醇基半琥珀酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML16f，ChemsPPC)：室温下，向1-胆固醇基半琥珀酰基-2-羟基1-3-甘油基-磷酸胆碱(206mg，0.28mmol)和棕榈酸(87.3mg，0.34mmol)的无乙醇干燥氯仿(6mL)溶液中加入DMAP(35mg，0.28mmol)和DCC(70.2mg，0.34mmol)。室温下(r.t.)搅拌反应混合物48小时。过滤该混合物，通过旋转蒸发浓缩滤液。残留物应用HPFC纯化(CHCl3到CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4)。TLC：Rf＝0.34(洗脱剂C)。1H NMR(CDCl3)，δ0.67(s，3H)；0.85-1.65(m，62H)；1.84-2.05(m，5H)；2.20(t，J＝9，4H)；2.50(m，4H)；3.31(s，9H)；3.78(m，2H)；3.88(m，2H)；4.09(m，1H)；4.28(m，3H)；4.50(m，1H)；5.10(m，1H)；5.27(d，J＝4.2，1H)。为C55H99NO10P+计算的MALDI-MS[M+H]+964.71，实测964.73。

1-胆固醇基半琥珀酰基-2-(2，5，8，11，14，17，20，23-八氧代二十六烷-26-酰基)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML16m，ChemsPEO8PC)：室温下，向1-胆固醇基半琥珀酰基-2-羟基1-3-甘油基-磷酸胆碱(140mg，0.193mmol)和2，5，8，11，14，17，20，23-八氧代二十六-26-烷酸(100m g，0.242mmol)的无乙醇干燥氯仿(6mL)溶液中加入DMAP(20mg)和DCC(60mg，0.29mmol)。室温下搅拌该反应混合物48小时。过滤该混合物，通过旋转蒸发浓缩滤液。残留物应用HPFC纯化(CHCl3到CHCl3-MeOH-H2O 65/25/4)。TLC：Rf＝0.47(洗脱剂C)。1H NMR(CDCl3)，δ0.67(s，3H)；0.85-1.65(m，33H)；1.84-2.05(m，5H)；2.29-2.31(m，2H)；2.55-2.62(m，6H)；3.31(s，9H)；3.37(s，3H)；3.54-3.69(m，30H)；3.81(m，2H)；3.98(m，2H)；4.16(m，1H)；4.35(m，3H)；4.58(m，1H)；5.21(m，1H)；5.35(d，J＝4.4，1H)。为C57H103NO18P+计算的MALDI-MS[M+H]+1120.70，实测1120.64。

实施例37：SML16M的应用

通过用两亲聚(乙二醇)链替代疏水性脂质链将SML16m设计成表面积大于常规磷脂。SML16m易溶于水。浓度为10mM时，SML16m在水中不形成可检测的颗粒。与常规两亲分子不同，SML16m溶液在搅拌时不起泡，而是沿着玻璃壁在溶液表面上形成薄膜。SML16m可以1∶1或更高的摩尔比有效溶解两性霉素B从而获得5mg/mL的浓度。还可用其它脂质配制SML16m，从而获得小脂质体。例如，当加入20摩尔％SML16m时，DPPC的多层囊泡的粒径显著降低。

实施例38：在30％胎牛血清中5-羧基荧光素从含SML的脂质体中控释

药物从脂质体中释放的速度受脂双层的刚性和渗透性的控制。烷基链程度和不饱和程度在脂质体制剂中起着至关重要的作用。在HEPES缓冲盐水(10mM HEPES，140mM NaCl，pH 7.4)(HBS)和30％胎牛血清(FBS)中评估5-羧基荧光素(CF)从SML脂质体中的释放。

通过实施例16所述相似的方法将CF包封在脂质体内。脂质体经200nm聚碳酸酯膜挤出，用HBS作为等渗洗脱剂洗脱加载在新泽西州皮斯卡塔韦的GE保健公司(GE Healthcare，Piscataway，NJ)的PD-10柱上的脂质体来除去游离CF。在96-孔板中，用HBS或FBS将等份脂质体样品(10μL)稀释至含有0.02％叠氮钠，总体积为200μL。然后用透明的塑料薄膜密封该平板，37℃温育。在不同时间点监测样品的荧光强度，通过下式测定从脂质体释放的CF百分比。

CF％＝(Ft-F0)/(Fa-F0)*100％

式中

F0＝背景荧光信号

Fa＝总荧光信号

Ft＝检测时的荧光信号

测试的SML包括：

○1-己酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML15a)

○1-癸酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML15c)

○1-十二烷酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML15d)

○1-十四烷酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML15e)

○1-十六烷酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML15f)

○1-十八烷酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML15g)

○1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML15h)

○1-二十烷酰基(Icosanoyl)-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML15i)

○1-二十二烷酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML15j)

○1，2-二胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SML6b)

四类脂质体制剂用于CF释放测试：

(1)SML6b和含有45摩尔％当量胆固醇的二酰基磷脂的脂质体，如图12中F1所示；

(2)相同链长的1-酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-磷酸胆碱和二酰基磷脂的脂质体，如图12中F2所示；

(3)胆固醇和含有45摩尔％胆固醇的二酰基磷脂的脂质体，如图12中F3所示；和

(4)纯1-酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-磷酸胆碱(SML15系列)的脂质体，如图12中F4所示。

如图12显示的结果所示，含有长链脂质的所有制剂显示良好的稳定性和渗漏耐受性。纯1-酰基2-胆固醇基半琥珀酰基-PC的脂质体在最低从C10开始的各种链长范围显示稳定性，CF释放小于30％。然而，与二酰基脂质混合使得曲线向更长的烷基链急剧漂移。二酰基/SML6b脂质体要求烷基链略长于常规二酰基/胆固醇脂质体以减少CF的释放。不可能从二酰基链长短于12的二酰基/胆固醇混合物制备稳定的脂质体。这是SML制剂F4的另一优点。二酰基/SML6b的完全释放特征示于图13。综合来看，三种SML制剂为以所需速度控释药物提供更广泛的选择。

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年11月14日提交的美国临时申请序列号60/988,038的优先权，该申请通过引用全文纳入本文。

政府权利

本申请在美国国立卫生研究院授予的基金号R01-GM061851的政府支持下作出。美国政府对本发明享有一定权利。
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