用于将物质,特别是分子库组合合成用单体涂布于支持物的设备和方法

本发明涉及用于将物质，特别是分子库组合合成用单体，涂布于 支持物的设备和方法，用于对结合于支持物上的分子的光学属性，更 为特别的是发光反应和折射行为的检测。

此处的术语“分子库”代表结合于支持物确定位置上的多种各不 相同的分子的总和，其中各个各不相同的分子以尽可能紧凑的方式排 列。因此，本发明涉及的分子库更为特别的是通过有限数量单体的组 合合成而形成的。组合合成的原理在图1中以图解的形式进行了解 释。

术语“高度复杂”代表了具有103以上不同的典型个体的分子库， 然而，更为特别的代表了具有105以上不同典型个体的分子库。

该复杂分子库能够被特别方便地涂布于二维支持物，藉此，分子 库的每一个成员都可以被定位于支持物上的一个定址精确的位置上。 这意味着一个定址精确的反应，例如染色反应，允许对支持物所结合 的反应配偶体得到一个精确和唯一的结论。涂布了确定的该分子库成 员的定址精确的位置也被称为点(spot)，二维支持物上的分子库的全 部也被称为阵列。

二维阵列可以具有一个光滑的表面，而且该表面基本上不被所用 的溶剂渗透。不过，与上述结构相比，它也可以显示出一个多孔结构， 使得其对所用溶剂和要偶联的物质来说呈现三维状态。这种类型的支 持物是尤其必须的，如果信号强度与具有光滑表面的支持物相比需要 被增强。特别是，例如，在一个肽阵列要被用病人血清进行染色，而 且相对较弱浓度的抗体反应性的结合信号也需要被检测的情况下。

随后的同义术语“二维支持物”或“阵列”既表示不同分子基本 上仅以二维形式排列的支持物，也表示不同分子存在于一个附加的第 三维度上的多孔支持物，因此不再是真实意义上的(基本上二维的) 阵列。

术语“固态聚集态”也包括过冷的液体。

术语“属性”应该从最广义的角度进行理解，而且不仅应当包括 特定分子的属性特征，例如它们的质谱，还应当包括，例如主要仅通 过某一特定的反应的出现未展示的性能，使得本发明从而也涉及这样 的方法和设备，对它们来说，通过特定的光学反应最初仅仅能够断定 某物质的存在，而不能推断出其类型(物质的类型通过例如其在支持 物上的位置进行确定)。

术语“生物的”分子在此引入代表所有类型的分子，特别是在生 物学、药剂学和医学中相关的分子，因而，例如肽、D-肽、L-肽及其 混合物，天然存在的寡聚核苷酸、其镜象异构体及其混合物，人工衍 生的寡聚核苷酸，如那些用于构建aptamer的寡聚核苷酸，寡糖和这 些分子的修饰产物。更为特别的，自然界不存在的模式构建的寡聚物 可能具有特殊的药理学相关性。在这方面，特别应当提到的是在化学 组合分析的辅助下产生的可以用作生物分子配基的非天然物质，更为 特别的是有机化合物，类固醇衍生物等。从许多的这类分子中，可以 分离出特定的结合物分子，用于天然存在的分子以修饰该分子的活 性。不过，既然这些结合物分子通常不能从天然存在的消化酶中分离， 因此它们特别适合用作治疗方法。

已经知道各种不同的用于合成高度复杂分子库的方法，但它们都 有某些缺点。已知的方法的实施需要昂贵的特殊装备，而且在发光信 号的读出速度上相对较慢。特别的，如随后解释的具有优势的不同原 因，如果非常多的不同分子基团要被排列在共同的支持物上然后分别 进行研究，就需要非常昂贵的机械用于激活每一个分子基团，这样不 仅费用昂贵且易受干扰，而且在极其精密的操作中会显示出制造误 差，其大小比足以用于进行研究的分子团的最低限度要大几个数量 级。因此，对于已知的方法和设备来说，支持物所能容纳的分子或分 子基团的最大数量量是有限的，在数量级上大约为105分子基团。然 而，特别是对于某些血清和DNA分析来说，如果约108到109个分子能 够被容纳和研究于一个支持物上，将是令人满意的。

图2显示了用于在目前，特别是平板印刷合成方法中作为读出装 置的共聚焦激光显微镜的原理。可以看出，在该读出装置的工作原理 中，阵列每一个单独的点都需要在所有的三个维度上进行搜索，而该 过程即消耗时间又降低了精确性。

已经知道平版印刷方法(Lithographische Methode)可以将分 子涂布到合适的支持物上，特别是被称为“诊断芯片”的支持物(图3)， 不过，如在后来的研究中发现的，在非常精确地定位分子以及可重复 性有目的激活的支持物位置方面存在的困难限制了可以涂布的分子的 最大数量，因为无法在具有可重复的精确性条件下知道哪个分子定位 于支持物的哪个位置上，就不足以在支持物上非常紧密的安排大量的 不同分子。特别地，在已知的方法和设备中，在一个合理的时间内读 出支持物上的非常多的发光反应并且同时要求相当准确是一个问题。 在使用与我们有关的方法和设备进行的方便的染色研究中，所要研究 的材料被涂布到固定有不同分子的支持物上，应该能够得到关于待测 材料中各种物质的检测结论，例如，对于血清中的特定抗体，固定于 支持物上的材料分子或其组份和该抗体形成了结合键，因此就应该非 常准确的知道哪一个分子位于支持物的什么位置上。

另外，所有已知的平版印刷方法(和其它一些方法，例如，通过 可控制的带电单体的排斥或吸引实现局部的精确合成)还有其它的基 本缺陷：对每一种不同的单体，几乎整个的偶联循环都必须分别进行， 即，每一种类型的单体都要被涂布、偶联以及洗去过量单体，然后再 进行下一种类型单体的相同步骤，因此，例如在组合合成层中，每一 种情况下每个肽都必须进行20个偶联循环。该缺点在图4中进行了简 要图示。因此，对于一个五肽分子库，上述方法需要进行100个偶联 循环，藉此，专家可以马上理解在科技发展的现阶段，这对产生的分 子库将会导致严重的质量问题，因为每一个偶联循环中都会产生假 象，用这种方法所产生的五肽文库实际上是不可用的。

这也是为什么平版印刷方法至今几乎专门用于寡肽阵列合成的原 因，因为在这种情况下，只需要将4种不同的单体偶联到支持物上。

平版印刷方法的另一个副作用是相对较低的收率，因为对每一个 偶联反应都需要将整个支持物用反应单体进行均一的覆盖。

除了平版印刷方法，还有许多可用于进行组合合成的印刷方法(图 5、IIa和IIb)。然而到目前为止，这些方法中还没有一种能达到平 版印刷方法的高分辨率。这主要是由于溶液中相对较小的单体具有的 高扩散率。既然单体和支持物的偶联反应以及单体涂布到支持物的准 确位置都需要一定时间，因此高渗透率就限制了通过组合合成产生的 分子库的紧密度及其复杂程度。

通过与普通彩色喷墨打印机的比较可以清楚的说明上述观点(图 6)：彩色喷墨打印机的色彩鲜明度是通过将不同彩色颗粒的扩散作用 控制的尽可能小而实现的。该过程是通过彩色颗粒相对于前述单体的 巨大体积，以及含有快速挥发性物质的打印调色剂流体导致彩色颗粒 迅速沉淀而实现的。另外，所用的打印纸具有高度吸收性的非常光滑 的表面。

这种纸通常具有复杂的结构，因而通常不适合于作分子库的支持 物，而且还有两点也与将分子库尽可能紧密的偶联到支持物上的要求 不一致：

1.用于组合合成的单体相对于彩色喷墨打印机通常所用的彩 色生色团来说是非常小的，这种情况单独作用就大大提高扩散率。

2.不仅被打印的单体不能够溶于高挥发性的溶剂。甚至几乎不 可能找到一种在所需要的毫微升级范围内蒸发足够慢的溶剂，否则的 话偶联配偶体会的浓度就会以不合希望的方式发生改变，因为偶联到 支持物的偶联反应(以及将单体涂布到支持物准确位置的过程)需要 一定的时间。

这也是为什么所有目前所用的点方法在小尺度范围涂布中容易产 生误差而且非常昂贵的原因。在这种尺度下，总是会冒着所涂布的点 跑得太远，单体扩散太远或溶剂部分或全部挥发的危险。

在这个基础上，对本发明的提出的问题是提供一套方法和设备， 通过它们可以克服在支持物分子库合成中的缺点。

为了解决上述问题提出了一种高度复杂分子库并行合成的方法， 其特征在于组合合成所用的单体在转印到支持物上之前或之后溶解于 第一种溶剂中，该溶剂在-5℃以下，优选的在20℃以下以固态聚集态 状态存在，而且其汽化点高于100℃，优选的高于150℃。该方法的另 一特征是该固态聚集态状态可以通过在单体与支持物实际的偶联反应 中提供能量或提供第二种溶剂，在很短时间内优选的被转换成液态， 优选的是凝胶态聚集态。

结果是：

1.单体的扩散被显著抑制，而且

2.所用的第一种溶剂在单体的涂布过程或偶联反应过程中被 防止发生部分或全部蒸发。

这在如果不同单体涂布到支持物的精确位置的过程需要相当长时 间，的情况下是尤其重要的，这种情况下包括，例如，当高度复杂的 多肽库是通过不同氨基酸衍生物的组合合成方法在喷墨打印机的辅助 下产生时。

本方法可以非常方便的被实施使得在一个反复性过程中所述的颗 粒或物质被反复涂布到支持物的精确位置上，在每一种情况下，接着 进行上述的被固定物质的活动化(Beweglich-machen)，偶联物质到 支持物，洗去未偶联的物质以及去掉临时性的保护基团。如果使用一 个经过改进的彩色激光打印机或彩色激光复印机，支持物在整个重复 性过程中如果相对于打印机或复印机的支承辊或传墨辊固定不动将是 非常方便的。

一个包含许多可有目的控制的光源(gezielt ansteuerbaren Lichtquelle)的阵列，特别是一个微激光阵列，也可以被方便的使用， 以代替单激光。作为电磁波作用于颗粒或支持物的结果，它们被在精 确的位置上被带上静电荷或被加热，这样就会导致颗粒被定址精确转 印或定址精确固定。

如果颗粒含有可用于组合合成单体，双体或三体的前体，那么偶 联到支持物上的分子可以被另外的单体、双体或三体加长，该过程通 过偶联反应的一个或几个进一步循环完成。同样也可以通过非必要相 同反应的一个或几个循环来修饰偶联到支持物上的分子。经过成功的 合成以后，保护基可以被从合成的寡聚物上分离下来，而合成的分子 仍然结合在支持物上。

颗粒和/或固定的物质可以通过另外的物质被融化或溶解或者变 成一种凝胶状态。

通过电磁波，特别是激光，或通过施加电压或提供热能或提供溶 剂以活动化该被固定的物质将是非常有利的。从而使固定物质的活动 化过程可以被限制在特定的区域内。没有被活动化或偶联的物质可以 用一种溶剂、优选的是加热的溶剂从支持物上洗脱、或用机械方法， 特别是在气流的辅助下从支持物上被去掉。

不同的材料可以用于作为支持物。特别的，聚苯乙烯薄膜、纸、 CDs、MODs、DVDs或FMDs都可以被使用。

根据本发明制造的支持物可以被用于科学研究、特别是医学研究 的各种不同的方面。为此目的，支持物通常被用于与待测流体相接触。 该流体可以是，例如、血液、血清、尿液、排泄物、淋巴液、唾液、 羊水、胃液、呕吐物、汗液、精液、乳汁、泪液、含有抗体的流体或 者上述流体的提取物。如果待测流体是血清，可以被方便和一种特定 的免疫球蛋白检测试剂相接触，特别是检测IgE、IgM、IgG或IgA类 免疫球蛋白的试剂。同样也可以将支持物和待测DNA相接触。如果检 测DNA或含有免疫球蛋白的流体，在与支持物接触之前或之后，待测 流体或待测DNA和一种可以与免疫球蛋白或DNA反应，特别是形成键 的材料相接触将是非常有利的。在与待测流体或待测DNA接触之前， 可以和免疫球蛋白或DNA反应的材料可以用一种可被激活发光的材料 进行染色/或偶联到另外一种可发光的材料上，特别是用酶或发光材料 的前体。上述的其他材料可以方便的是酶，特别是辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶或荧光素酶、 或各种酶的结合。

作为可激活发光的材料，更为合适的是使用一种可以被电磁波辐 射，特别是激光或发光二极光发射的光波激发荧光的染料。

这样的研究结果可以有利于病理样品的系统分类和分节段 (segmentation)，特别是有利于确定诊断性标记物，该标记物用于对 测试人群的检验方法的实施以及确定实验结果中对正常分布的偏离 量。

例如，可以从每个测试者体内采样取得血清样品，然后用上述的 方法之一检测这些样品。相对于正常分布的偏移量可以，例如，对那 些在取样前或取样后患有癌症、特别是特殊类型的癌症、帕金森氏症、 多发性硬化症、阿尔茨海默病、传染性疾病、自身免疫病、特别是Crohn 氏病、或患有心力衰竭或中风或者曾患过敏症或将有变应性疾病的测 试者进行确定。

以这种方式得到的实验结果可以被自动分类以确定信号以何种诊 断模式被用于确定与分子库中相应分子的结构参数的关系，可以发现 其相关性，尤其是使获得对未知样品模式诊断性评估成为可能的相关 性。同样也可以寻找可用于确定已发现的分子的结构特征的相关性。 如此定义的所发现分子的结构特征可以被用作指导性结构用于发展其 它功能性同源的分子，特别是可用于治疗的分子。因此，一个以重叠 肽形式覆盖了已知人类基因产物的肽阵列可以被有利的使用。

在一个附加的方法中，用于组合合成的单体以0.2μm到200μm， 优选的2μm到40μm大小的单体调色剂(Toner)颗粒形式被采用，其 在室温下呈现固态聚集态。术语“室温”描述了一个介于-10℃到80 ℃的温度范围，优选的介于0℃到40℃。这些颗粒的另外一个特征是 使用上述第一种溶剂时它们含有一种相对于偶联反应来说是惰性的组 份，其聚集体状态可以通过上述的方法改变。优选的该颗粒还含有磁 性组分或偶联到含有磁性组分的颗粒上。在图7中上述的单体调色剂 颗粒和普通的发色团调色剂颗粒进行了图示比较。

颗粒定址精确地转印到支持物的过程，使用市售激光打印机 (laserdruker)(图8)或激光复印机来完成，更为特别的是彩色激光 打印机(图9)或彩色激光复印机，其中负责转印颗粒的激光，特别 是在使用激光复印机时，可以被被一维或二维微激光阵列所替代。

然后，涂布于精确位置的单体，如上所述被从固态聚集态转换成 液态聚集态，优选的是凝胶状态，藉此，一个定址精确的偶联反应就 开始进行了。

通过这种方法，与现有技术相比，在组合合成方法的辅助下，十 分简便地、分子十分紧密地排列在支构物上从而产生了高度复杂的、 相对无假象的分子库。

激光打印机的技术特征将进一步阐明该理论：

市售激光打印机Ep具有600dpi(点/英寸，dot per inch)的打 印分辨率。这相当于每个打印像素的直径为约40μm，或者说这样的激 光打印机在普通的打印过程中可以在DIN A4纸上(约20×30cm)输 出约4500×7000个点。这相应于约3千万个点/DIN A4纸(图10)。

图11显示了这样的高分辨率在普通打印过程中使用普通调色剂 可以几乎无误差和可重复地“收获”。实际上，图11在最大放大率状 态下也没有显示出一个错误设置的像素。

因此上百万的点可以容纳在一张DINA4的纸上，而且可以被分辨 开。不过，这肯定远远不到一个明显处于快速发展阶段的技术的终点。 目前市售具有2,400dpi分辨率的激光打印机可以在DIN A4纸上输出 约5亿个像素，因此可以在一张DIN A4纸上独立容纳更多的点。

因此，市售激光打印机正照着使具有所有可能代表的五肽或六肽 分子库的合成成为可能的数量级方向发展。相对数量如图12所示。

在一个可选的附加方法中，用于组合合成的单体被以流体聚集态 形式以本领域标准技术涂布于支持物的精确位置上，例如，在一种主 要市售喷墨打印机或其它打印方法的辅助下。

为了此目的，一种溶剂混合物被制备出来，在该混合物中除了用 于组合合成的单体和上述第一种溶剂(例如，二苯基甲酰胺)外，至 少还加入有第二种溶剂(例如，N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、二甲基 甲酰胺、甲醇或异丙醇)，该溶剂在室温下将该组份从固态聚集态转 变为液态聚集态(即，将其溶解)。该室温条件描述了介于-10℃到 80℃的温度范围，优选的介于0℃到40℃。

该溶剂混合物的另一个特征是在室温条件下上述第二种溶剂与第 一种相比是高度挥发性的，即，两种溶剂的汽化点差大于80℃。

因而上述第二种溶剂的部分蒸发会产生如下效果：第一种溶剂和 溶于其中的单体首先被浓缩用于组合合成，然后从液态聚集态状态转 变回固态或凝胶态聚集态，而不会使单体由于扩散从最初的涂布位置 移开太远。支持物最好保持在比盛有该溶剂混合物的保存容器的温度 低10℃以上的条件下。几乎不挥发的溶剂部分可以在该混合物被涂布 于精确位置之前完全或部分涂布于支持物。所用的溶剂对偶联反应应 呈惰性。

然后，在特定位置涂布的单体被由固态聚集态状态转变为如上所 述的液态聚集态，优选的是凝胶状态，藉此，局部特异性确定的偶联 反应开始进行。

通过这种方法，一个在组合合成方法的辅助下产生的更为紧密的 分子排列得以在支持物上实现，从而产生了与现有技术相比，高度复 杂的、相对无假象的分子库。

本发明包括将单体涂布于精确位置所需要的设备，该单体是用于 支持物结合的分子库的组合合成，特别是肽或寡核苷酸率。涂布单体 的各个层的偶联按如上所述之方法完成。

该单体被联结于如下所述的颗粒。

该颗粒的定址精确转印到支持物上是通过一台基本上基于市售激 光打印机或激光复印机，特别是彩色激光打印机或彩色激光复印机的 设备(图13和14)完成的。负责转印颗粒的激光，特别是在使用激 光复印机的情况下，可以被一维或二维的微激光阵列所替代。

如下的改变使该设备和市售激光打印机或激光复印机相区别：

1.含有所述单体的颗粒，而不是普通的调色剂颗粒，按下面的 所述被使用。

2.不仅仅是一层单体颗粒被涂布，而是几层含有该单体的颗粒 层被层叠打印。

3.在每一种情况下，在涂布所述的几个颗粒层之间，所述的单 体被偶联到支持物上，未偶联的单体被从支持物上除去，以及临时性 保护基团被从支持物偶联的单体上分离掉。

4.在涂布最后一层单体之前，支持物相对于负责转印颗粒的激 光保持一种精确的空间关系，其中只要该空间关系是可重复的就可以 了。通过这种方法，层间和层内各种单体颗粒可以重叠或并列被置于 精确位置上。该空间关系可以通过反馈装置(图14)和/或支承辊或 转印单位和激光离子化辊(von dem Laser ionisierbaren Walze)之 间的精确机械偶联(图13)而产生。这两种方法也可以自然的结合起 来使用。

例如，一个位置标记网格(Rastster)(图14，38)可以被设置于 支持物或支承辊(35)，然后用扫描器(图14，37)读取再和存贮的 网格(图14，39)进行对比。打印机内存中像素对于测量到的偏差值 的电偏移(图14，40)是上述反馈机制的组成部分。

本发明包括根据本发明产生的材料。这些材料包括可以通过所述 的设备被涂布于支持物精确位置上的单体调色剂颗粒，该设备是基于 主要市售的激光打印机或激光复印机的。这些单体调色剂颗粒与市售 调色剂颗粒具有以下不同：

1.单体调色剂颗粒含有合适的用于组合合成单体或其衍生 物，更为特别的也包括预激活单体，而不含有发色团。

2.不含有或除了含有可熔性塑料组份(例如聚苯乙烯)外，单 体调色剂颗粒含有对单体及支持物的偶联反应为惰性的溶剂(例如， 二甲基甲酰胺)，其在室温下处于固态聚集态状态。术语“室温”描 述了一个介于-10℃到80℃的温度范围，优选的介于0℃到40℃。

该单体调色剂颗粒的其它特征是：

3.其大小介于直径0.2μm到200μm，优选的介于直径2μm到 40μm之间。

4.该单体调色剂颗粒在室温下呈现固态聚集态状态。术语“室 温”描述了一个介于-10℃到80℃的温度范围，优选的介于0℃到40 ℃。

5.该单体调色剂颗粒的另一个特征是它们含有磁性组分或与 含有磁性组分的颗粒结合。

根据本发明产生的其它材料包括单体调色剂流体，该流体通过使 用主要市售喷墨打印机或彩色喷墨打印机可以被涂布于支持物的精确 位置上。

这些单体调色剂流体与市售调色剂流体相比具有以下区别：

1.这些单体调色剂流体含有适用于组合合成的单体或其衍生 物，更为特别的也包括预激活单体，而不是发色团。

2.除了含有第一种在室温下是流体的溶剂组分(例如，异丙 醇、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷)外，该单体调色剂 流体至少含有一个第二种对单体与支持物的偶联反应为惰性的溶剂 (例如，二甲基甲酰胺)，其在室温下处于固态聚集态状态。术语“室 温”描述了一个介于-10℃到80℃的温度范围，优选的介于0℃到40 ℃。因此该第二种溶剂在室温条件下是溶解于第一种溶剂中的。

第一种溶剂的一个特征是其熔点和汽化点与第二种流体的相应熔 点和汽化点相比到要比后者低超过40℃，优选的是超过70℃。

第一种溶剂的一个特征是在低于-80℃条件下，优选的是低于- 20℃条件下，该流体变成固态聚集态状态，而且其具有一个大于40℃， 优选的大于70℃的汽化点。

第二种溶剂的一个特征是在低于-5℃条件下，优选的是低于20 ℃条件下，该流体呈现固态聚集态状态，而且其具有一个大于200℃， 优选的大于250℃的汽化点。

至少上述两种溶剂和溶解在其中的单体组成的混合物的一个特征 是在低于-20℃条件下，优选的低于0℃条件下，该混合物呈现固态 或凝胶态聚集态。

根据本发明产生的其它材料包括用该方法、材料或设备产生的分 子库，特别是肽分子库或寡肽分子库。这些分子库的特征是：

1.它们是通过有限数量的单体的组合合成而产生的，

2.它们以二维阵列的形式存在于合适的衍生载体上，藉此，分 子库的各个单独组份可以被定址精确的排列。载体的衍生按本领域技 术人员熟知的技术完成。

作为分子的支持物，特别是生物分子的支持物，更为特别的是在 上述方法之一中使用的支持物，可以使用根据本发明的装有积分位置 标记的细孔网栅(engmaschiges Netz von integrierten Positionsmarkierung)的支持物，使得通过传统机械方法涂布到支 持物的一个待测区域的位置可以用检测器监控。优选的位置标记的构 建应该使得其能够被光电子扫描系统所检测。

因而本发明建立全新的诊断可行性，特别是提高了发现诊断性标 记物和疗法的机会。例如，如果将一个完全的6基体肽分子库被用于 和相当大量的病人血清接触，而且，例如，利用染色反应方法进行检 测以确定对于哪种肽分子血清组分会发生沉淀，从而可以获得疾病和 被染色肽分子之间的相关性。这是因为每个人在其血清中都具有一个 极度复杂的个体抗体反应性模式，该模式特别的反应了其免疫系统和 急性、慢性或隐蔽性疾病或已经克服的疾病之间的冲突。很大比例的 抗体反应性可以通过对五肽或六肽的特异性结合而确定，藉此，通过 对与完全五肽或六肽分子库的结合反应性进行分析，前述的个体抗体 反应性模式可以作为尚未了解的复杂性进行确定。

所称的完全肽分子库在图15中进行了解释。该完全肽分子库的阵 列中每一个定址精确的点代表了一种肽分子混合物，其确定序列仅在 以N表示的位点处有一不同。使用这种肽分子混合物的原因是在一个 抗体-肽抗原反应中，被识别的肽抗原需要一定的体积才能被抗体特 异性识别。不过，既然在科技发展的现阶段还不可能产生一个具有2010 个成员的完全的十肽分子库，所以才使用该混合物。

该阵列的一个方便的用途在图16(也见例(1.))中进行了图示 说明。一个高度复杂的肽阵列用对照血清和病人血清得到的差异性染 色情况一方面产生可以被两种血清识别的反应配偶体(以及肽序列) (图16，42)，另一方面产生被病人血清特异性识别的肽分子(图 16，43)。这使得鉴定病人特异性着色模式成为可能。在所给的例子中 (图16及例1)，与引起胃溃疡的幽门螺杆菌表达的基因产物对应的 肽被鉴定出来。这说明该疾病和肽分子模式之间可以在上述阵列辅助 下建立相关性。

除了确定的单克隆抗体的表位，该完全肽分子库也适合于通过血 清特征和被诊断疾病的相关性来追踪诊断性标记，例如，自身免疫性 疾病或过敏症(例如，风湿病、花粉病、哮喘、食物过敏症、红斑狼 疮、青少年性糖尿病等)、传染性疾病(例如，流感、流感样感染、 AIDS、肝炎、麻疹、流行性腮腺炎、脑膜炎、胃溃疡、疟疾、南美洲 锥虫病等)、癌症(例如肺癌、肝癌、肠癌、肾癌、乳腺癌、前列腺 癌、胶质母细胞瘤、淋巴癌等)、和迄今未知或病因可疑的特殊性疾 病(如，心脏病、中风、帕金森氏病、多发性硬化症、阿尔茨海默病、 克罗恩病、克-雅病等)。

另外，本方法并不局限于单一疾病，非常多的疾病可以并行诊断， 或者目前尚未知道的病因的疾病可以利用被鉴定的肽进行追踪。

该阵列也适合用于寻找相互作用配偶体，例如，在这种情况下该 完全分子库染色可以用于人类或病毒基因产物的相互作用配偶体。例 如，用纯化的病毒粒子进行染色，一个或多个结合基序可以被快速的 鉴定出来，而且通过将相应序列与数据库中的人类肽序列进行比较， 可以鉴定出病毒进入人类细胞的入口位点。

更长的结合基序，特别是那些经常发生的具有螺旋结构结合基 序，可以通过特定的分子库被查明，在该分子库中并不是每个氨基酸 都是随机的，而是只有位于来源于该结构特定位置的氨基酸是随机 的。通过这种方法，新的诊断性标记物和目前未知的相关性可以在疾 病和特定抗体反应性之间被找到，包括例如，用于肿瘤疾病、心血管 疾病如心肌梗塞的标记物，用于多发性硬化症和帕金森氏病的标记 物，用于所有类型的自身免疫性疾病和过敏症的标记物和用于所有类 型的传染性疾病的标记物。

获得的标记物的特征可以一方面通过与特定临床症状的相关性进 行诊断性预测。但最新发现的标记物也可以被单独涂布到支持物上以 进行进一步的研究。

同样的也适用于称为单基因产物阵列的涂布。人类具有平均编码 约500种氨基酸的约100,000个基因。在几年内这些基因中超过90％ 都会被人们所了解。如果每一个基因产物被平均100个重叠15肽分子 所覆盖，而其中每一个肽分子彼此之间被替换掉5个氨基酸，那么就 需要约1千万种不同的肽分子以覆盖人类所有的基因产物。这样的阵 列在图17中进行了图示。

中等目标也可以采用每个肽覆盖人类基因产物的一部分的表达阵 列的形式，例如，“致癌基因阵列”、“免疫基因阵列”等。

如上面对完全肽文库所描述的，这些阵列特别适合用于分析自身 免疫疾病病人的血清抗体特征(见上)。预期可以得到特别清晰的信 号，因为这里使用了个体确定性和相对较长的肽的阵列。

这些阵列也特别适合用于分析病因不明病人的血清。这些阵列可 以，例如，回答关于多发性硬化症或帕金森氏病或不同癌症是否具有 自身免疫成分的问题。的，这些阵列特别适合作为这些疾病的诊断工 具。

如上面所描述的，该阵列也可以用于寻找相互作用配偶体，从而， 例如，有助于回答关于哪种人类基因产物是特定病毒的入口位点的问 题。

类似的，也进行了疾病和与其它分子文库例如D-肽文库或寡糖 文库的结合模式相关性的尝试。该方法不局限于人类疾病，也适合于 检查法医学和兽医学问题以及分析从植物提取液到微生物提取液的其 它流体。

在另外一个用途中，感兴趣的潜在治疗性分子，例如，不能被人 消化性酶类所降解的D-肽类被排列在支持物上，然后与医学相关分 子，特别是病原体特异性蛋白或其混合物相接触。这样就允许对这些 医学相关分子对应的结合配偶体进行特异性而且快速的搜寻。类似 的，也可以用于寻找酶配基、酶底物类似物酶式抑制因子。

最后，与医学相关分子的结合也可以用，例如，生物素酰化或荧 光标记的方法进行检测，从而使得与病原体至少部分结合的D-肽类或 aptamer可以被鉴定。然后这些D-肽类或aptamers可以被一个接一 个的测试以确定它们是否抑制该病原体。例如，如果病原体的一种酶 类(例如，HIV蛋白酶、逆转录酶等)以适当的量存在，这种酶就可 以被荧光标记(直接标记或在抗体辅助下标记，或被一个可用单抗染 色的小肽标记物的重组表达所标记)。从而就可以确定它结合了哪种 D-肽类。然后由酶活性引起的其它染色反应被进行。例如，HIV蛋白 酶的切割作用可以沉淀一种可被检测的荧光多肽。因此我们获得了不 仅结合酶而且同时抑制该酶的D-肽类。

这样阵列的方便用途在图18中进行了图示。这使得酶类可以通过 两种方法检测。

1.结合该酶(图18，44)但不阻断其活性的肽类的鉴定和，

2.结合该酶同时阻断其活性的肽类的差异性鉴定。后者的D- 肽类分子组件尤其适合用作潜在疗法的组成部件。

在下一个步骤中，具有抑制效应的结合组件可以通过其它的单体 或彼此结合而被延长，然后再进行对抑制作用的其它检测。

为了确定分子被添加到哪一个结合在支持物上分子上，在支持物 与血清或DNA接触之前或之后，可以将血清或DNA和一种可以与该血 清或DNA反应，特别是可以形成偶联键，的物质相接触。更为合适的， 在与血清或DNA接触前，和血清或DNA反应的物质先用一种可以被激 发光的物质，特别是一种可以被激光激发发射荧光的物质对其进行染 色。这样的染料在市场上可以买到，例如，名称为“Cy3”、“Cy5”、 “FITC”或“TRITC”的染料，目前整个系列的这种抗体的结合物已经 可以方便的得到(例如，结合Cy5羊抗人抗体)。

如果待测血清和一种对IgE特异性的检测试剂相接触，那么很有 可能可以确定病人体内存在的过敏性反应，因为IgE在体内负责如哮 喘或花粉热之类的过敏反应。非过敏患者的血清内几乎没有IgE，而 过敏患者的血清内则有不同数量的IgE，数量的差异可以揭示不同的 变态反应原。最后，本发明使得寻找来源于高度复杂分子库的一个目 标分子的特定结合配偶体成为可能，而且通过同步的鉴定许多(具有 不同结合能力)的结合配偶体使得，寻找负责将配基结合到目标分子 的结构参数成为可能。用这种方法，指导结构的路径就被大大简化了。 例如，用上述方法获得的信号模式可以被自动的与所用文库中已鉴定 配基的结构参数或结构模型相关联。

上述方便的涂布绝不仅限于肽阵列或对血清的检查。此外，在总 是可以方便的检测大量的用于结合的结合配偶体的情况下，还会有丰 富的其它可能的涂布。这特别适用于两个分子库的组合，其中一个分 子库代表该阵列，而血清只是第二个文库可用的许多对象之一例子。 结合配偶体基于其在阵列中的位置在该阵列中被鉴定，而其他方便的 检测方法，例如质谱可以被用于鉴定第二个结合配偶体。

随后，与根据本发明的方法的实施以及根据本发明的设备的使用 相关的一些例子参考附图进行了描述。

附图如下所述：

图1：组合合成

I.  适合于组合合成的物质(2)被涂布于支持物(1)

II. 各种不同的物质(2)被偶联到(11)支持物(1)

III.未发生偶联的物质(2)被洗去

IV. 保护基(14)被分离

V.  更多物质(2)被涂布于支持物(1)，开始下一个循环。

图2：共聚焦激光显微镜作为阵列的读出器原则

如果阵列用共聚焦显微镜进行评估，那么所有三个维度空间都必 须被搜索直到所需信号可以被唯一确定为止。与此相比，例如，一个 扫描器，要快得多：

1.它不只有一个可用激光，而是与一个一维发光二极管阵列 并行使用。

2.既然发光二极管的光几乎平行透射支持物，那么用扫描器 时第三个维度上的搜索就不再必要了。

图3：用于组合合成的平版印刷方法。

在传统的平版印刷合成方法中，通过光能(图3，I.)作用或光 能敏感保护基团断裂(图3.II.)作用，使活化的单体可以接近合成 位点，藉此，可能进行位点可确定的链增长反应。这两种方法的的一 个优点是它们都具有高分辨率。而它们的一个缺点是整个合成循环是 在牺牲质量的代价下对每种单体一轮一轮的进行。

Ia.经过光能(16)作用后，一个光敏保护层被定址精确地(18) 上被除去。

Ib.用这种方法，用于组合合成的单体(2)可以被被定址精确 地(18)偶联(11)到支持物(1)。

IIa.经过光能(16)作用后，光敏保护基团(16)被被定址精确 地(18)分离下来。

IIb.用这种方法，用于组合合成的单体(2)可以被定址精确地 (18)偶联(11)到支持物(1)。

图4：用于合成的平版印刷方法的缺点

在所有的印刷方法中，整层的不同单体(2)通常都被涂布于支持 物(1)上，它们都是在下一层单体被印上之前通过一个偶联循环完成 的。在图3所示的用于合成的平版印刷方法中，每一种单体(2)都必 须被分别按顺序涂布、偶联(11)以及洗去过量单体。这意味着对于 相同的寡聚物阵列的合成，平版印刷合成方法必须比打印过程多进行 Nx个偶联循环。数字N在这里代表不同的单体(2)数量，即，对于 寡肽阵列合成，平版印刷合成法与打印方法相比需要多20x个偶联循 环。

图5：用于组合合成的打印方法(Druckverfahren)

Ia.含有适合于组合合成的物质(2)的调色剂颗粒或转印单元 (19)被定址精确地(18)涂布于合适的衍生载体(1)的上。

Ib.然后，用于组合合成的单体(2)被从调色剂颗粒或转印单 元(19)中释放出来，接着定址精确地(18)偶联(11)到支持物(1) 上。

IIa.含有适合于组合合成的物质(2)的流体被定址精确地(18) 涂布于合适的衍生载体(1)上。

IIb.然后，用于组合合成的单体(2)被寻址精确地(18)偶联 到支持物(1)上。

IIa和IIb描述了标准技术的用于组合合成的打印方法。Ia和Ib 描述了本发明的新的方法。它结合了打印方法和平版印刷方法的优 势。这里，如在平版印刷方法中一样，激光的高分辨率也被用来获得 密集的分子库。另一方面，如同在其他的打印方法中，整层的不同单 体可以被并行的涂布到支持物上。

图6：单体定点的缺点

当纸用染料打印时，被打印的发色团必须尽可能少的扩散，因为 这会干扰被打印图片的鲜明度。这可以通过使所涂布的发色团非常快 速的固定于打印点上来实现，快速固定是在调色剂流体中使用高挥发 性组分的结果。此外，所用的发色团相对较大，也相当程度上限制了 其扩散速率。另外，使用了特殊的具有高吸收性的高度光滑的纸张。

然而，所涂布的单体(用于组合合成)会发生很大程度的扩散， 因为用于合成的溶剂具有非常低的挥发性而且需要较多时间偶联反应 配偶体。所用的单体相对也较小，这也会大大提高其扩散速率。特殊 纸张一般不适合用作分子库的支持物。

图7：普通调色剂(46、47、48)和“氨基酸调色剂”(46、 49、2、50)的颗粒图示比较：

-室温下普通调色剂中的固体聚苯乙烯小球(47)的对应物在 这种情况下是熔点约为71℃的二苯基甲酰胺(50)。

-两种情况下的磁性组分(46)由磁性颗粒控制。

-氨基酸调色剂含有活化的氨基酸(49、2)而不是发色团， 该活化氨基酸在N-末端有保护基。

图8：激光打印机的运行方式：

由含有磁性组分的聚苯乙烯小珠组成的调色剂颗粒(19)由于磁 性组分的作用而附着到磁力辊(21)上。在那里它们被带上静电荷， 然后作为带电的结果跳跃到一个激光可记录的滚筒(22)的定址精确 区域上。这些区域是通过激光而确定的，激光通过开关的打开和关闭 而记录下特定区域。作为电荷吸引力的结果，调色剂颗粒(19)从磁 力辊(21)跳跃到被激光所记录的滚筒(25)特定区域上。从这里调 色剂颗粒再次跳跃到支持物(24)(例如，纸或复印膜)上并且被一 个加热压光辊(25)所熔化或在用氨基酸调色剂颗粒的情况下，吸收 的物质被活动化(26)。

图9：彩色激光打印机的运行方式：

与黑白打印机(图8)类似，对于彩色激光打印机调色剂颗粒也 是由聚苯乙烯和磁性组分所组成。它们由于磁性组分的作用而附着到 一个磁力辊(21)上。在那里它们被带上静电荷，作为带电的结果跳 跃到一个激光可记录的滚筒(22)的定址精确区域上。这些区域是通 过激光而确定的，激光通过开关的打开和关闭而记录下特定区域。作 为电荷吸引力的结果，调色剂颗粒(19)从磁力辊(21)跳跃到被激 光所记录的滚筒(25)特定区域上。从这里调色剂颗粒在跳跃到支持 物(24)(例如，纸或复印膜)上并且被一个加热压光辊(25)所熔 化或在氨基酸调色剂颗粒的情况下，吸收的物质被活动化(26)。

与黑白激光打印机不同(图8)，彩色激光打印机必须不仅打印 一种调色剂(20)颗粒，而且是以精确的彼此紧挨的方式打印4种不 同的彩色调色剂(31、32、33、34)颗粒(20)。

解决此问题的方法之一在图9中进行了图示：

-所用的激光可记录滚筒(22)比黑白激光打印机所用的(图8) 要大得多

-按这种方式激光可以在滚筒上记录一整张纸的内容

-激光用第一种颜色在激光可记录滚筒(22)上进行记录

-磁力辊(21)将第一种颜色的调色剂(21、31)转印到可记录 滚筒(22)上

-在那里调色剂颗粒(21、31)跳跃到已记录的可记录滚筒(22) 上

-可记录滚筒(22)以机械方式非常紧密的和同样大的第二个滚 筒(35)结合在一起

-在这个滚筒(35)上支持物(1)被涂布并固定

-两个滚筒(22和35)以相反方向转动

-从而使第一种调色剂(27)被转印到固定于滚筒(35)的支持 物(1)上

-激光用第二种颜色在可记录滚筒(22)上进行记录

-然后另外交变的磁力辊(21、32、33、34)移向可记录滚筒(22)

-从而将其它的颜色(28、29、30)转印到可记录滚筒(22)上

-在那里其它的颜色(28、29、30)被转印到支持物(1)上

-只有到整个打印过程完成后，支持物才会被释放

一个被称为转印单元的装置可以被用来代替支承辊(35)，该转 印单元以反馈机制不断的相对于可记录滚筒而进行调整。

图10：市售激光打印机具有600dpi的分辨率，即，被该装置打 印的每个点具有约40μm的直径。

图11：一个可买到的具有600dpi分辨率打印机的打印图像用一 个可买到的具有600dpi分辨率的扫描仪进行扫描。这里被扫描的激光 打印图像的扫描结果有代表性的显示了在更高放大率下也没有错置的 点。

图12：组合肽文库的复杂性。

图13：用于组合合成的装置。

不像图9中所描述的彩色激光打印机，在这个装置中热辊筒(25) 被一个可以将气态或液态的偶联反应物或清洗溶液带到旋转支承辊 (35)，并使之接触的设备(36)所代替。气态物质(也包括热空气) 在一个宽喷嘴的辅助下进行供给，而流体与固定于支承辊(35)上的 分子库的支持物(1)相接触则是通过，例如使用无极皮带进行(36)。 一行红外光源(36)也可以被用来激活物质(2)。具有四种不同颜色 调色剂(31，32，33，34)的交变磁力辊(Wechselmagnetwalze)(21)被 替换为具有20种不同氨基酸调色剂(2，19)的交变磁力辊。

图14：用于组合合成的具有内置反馈机制的装置

扫描单元(37)扫描涂布于支持物(1)或支承辊(35)的模式(38)， 然后将其和以前保存的相同的模式(39)进行比较。如果与预期值产 生了偏差，则加载到打印机内存中的图像，将电偏移该偏差(40)。通 过这种方法转印单元(19)或其中含有的物质(2)可以被可重复地定 址准确地并列或重叠印刷。

图15：完全的肽分子库

所示的十聚体混合物的阵列可以在上述的方法的辅助下合成到支 持物上。以N表示的所有可能的氨基酸组合都被该阵列所覆盖。

图16：疾病与肽分子模式的相关性

用对照血清和病人血清对高度复杂的肽阵列的差异性染色一方面 产生可以被两种血清(42)识别的肽(和肽序列)，另一方面产生被 病人血清(43)特异性识别的肽。这使得鉴定病人特异性染色模式成 为可能。在所给的例子中，与表达的幽门螺旋杆菌基因产物对应的肽 被鉴定出来(43)，该细菌会引起胃溃疡。

本方法并不局限于单一疾病，可以用于同时诊断几种疾病，或者 利用被鉴定的肽分子对目前未知的病因进行的追踪。

图17：基因产物阵列，单基因产物阵列

约100,000个人类基因(即，基因组)中每个基因编码了平均略 少于500个氨基酸。几年内这些基因中的大部分将被了解。每一种相 应的基因产物可以被平均100个重叠的15基体的多肽分子所代表，这 些多肽之间相互被有5个氨基酸的偏差。因而总体上需要约1千万种 不同的多肽分子以覆盖全部100,000种人类的基因产物(即其 proteom)。

图18：搜索酶抑制因子

两种不同的检测酶的方法可以被使用：

a.鉴定和酶(44)结合但不阻断其活性的多肽。

b.差异性鉴定与酶结合同时阻断其酶活的多肽(45)。后者D- 多肽的组件适合作为潜在治疗方法的组成部件。

图19：普通商业性调色剂和各种“氨基酸调色剂”打印质量的比 较：

各种调色剂被加载到调色剂盒中，然后用激光打印机在普通纸上 打印。氨基酸调色剂用其中含有的磁性颗粒进行着色。

图20：赖氨酸和其后的天冬氨酸被成功的均匀偶联到衍生纸的 游离氨基基团上。然后两种不同肽分子以棋盘方式被合成于衍生纸的 支持物上。用这种方法产生了与图20所示的氨基酸1到10对应的氨 基酸调色剂。在图20中标记的氨基酸1到5被以常规的椭圆型模式 11进行打印，而标记的氨基酸6到9则以第二种常规的矩形模式12 被打印。两种模式以棋盘方式互相结合。在最后一个步骤中，N-末端 氨基酸天冬氨酸均匀的与支持物再次偶联，然后分离保护基。

在(A)中所示的多肽合成位点与(B)中可见的灰色椭圆或矩形 对应。条形纸用奶粉在PBS溶液中进行封闭，然后和抗-FLAG M1抗体 或抗生物素抗体一起温育。结合的第一种抗体用过氧化物酶偶联的羊 抗鼠抗体(底物13)或碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠抗体(底物14)进行 检测。

图21：将具有DMTr保护基的核苷在5`羟基末端偶联到固定于固 体底物的NH2基团上。

图22：在寡聚物合成中常用的保护基(用于碱基和磷酸基团)。

图23：未反应5`羟基末端的“加盖”。

图24：三价磷酸基团的氧化。

图25：根据权利要求1的方法的图示说明。

a)彩色激光打印机到寡聚体合成机的转变(图13)

将市售彩色激光打印机的程序控制在如下方面进行修改：

-偶联到支承辊(或转印滚筒)的支持物(特别是用于肽分子 合成或寡肽分子合成的主要由聚苯乙烯组成的衍生拷贝膜或用于肽分 子合成或寡肽分子合成的衍生纸)保持固定于支承辊(或转印滚筒) 的状态，直到外部信号终止其对支承辊的固定状态。

-用24个不同的附有调色剂容器的交变磁力辊代替4个不同 的附有调色剂容器的交变磁力辊，在可记录滚筒附近起控制作用。

可选的，转印单元也可以顺次用于6台改装的彩色激光打印机 中，其每一个含有4个不同的调色剂容器。因此，一层中总共24种不 同的调色剂颗粒被涂布于转印单元。根据设备的不同，在事先测量激 光定位，在打印过程中予以考虑。

另外，一台由如下部分组成的外部设备被构建：

-一个加热单元，特别是使用红外光能或热空气鼓风机(heiβ luftfon)进行加热

-一个旋转滚筒，利用它各种不同的流体能够以时间程控的方 式被转印到固定于支承辊或转印单元上的支持物上

-一个旋转滚筒，利用它各种不同的流体能够以时间程控的方 式被从固定于支承辊的支持物上导出

b)另一台彩色激光打印机到寡聚体合成机的转变(图14)

支持物被固定于可买到的彩色激光打印机转印滚筒的无极皮带 上。在支持物上，特别是在转印单元上，装有可以被光电扫描仪单元 所识别的结构，该结构允许转印单元的位置以及固定于其上的支持物 的位置相对于负责以反馈机制转印调色剂颗粒的激光的位置进行调 整。

另外，一台由以下部分组成的外部设备被构建：

-一个加热单元，特别是使用红外光能或热空气鼓风机进行加 热

-一个槽，利用它各种不同的流体能够以时间程控的方式被转 印到固定于转印单元的支持物上

-一个旋转滚筒，利用它各种不同的流体能够以时间程控的方 式被从固定于支承辊的支持物上导出。

所述的具有固定于其上的支持物的转印单元可以在每偶联循环之 间被从所述的其它彩色激光打印机中移去，然后装入到所述的其它外 部设备中。在各种不同的流体被导入和导出后，使用光电扫描仪单元， 将转印单元相对于转印调色剂颗粒的激光的位置进行精确重调。

c)氨基酸调色剂的制备

用保护基，特别是fMoc保护基保护的各种氨基酸，特别是其相应 的酸酐和磁性颗粒一起在75℃条件下被溶解于二苯基甲酰胺中，骤然 冷冻然后充分磨碎，以产生尽可能均一的颗粒，该颗粒直径约1- 200μm，特别是5-40μm。这些颗粒被装填到调色剂盒中然后打印到纸 上。图19比较了普通调色剂和各种氨基酸调色剂的打印质量。

d)亚磷酰胺调色剂颗粒的制备

不同的具有保护基的亚磷酰胺和磁性颗粒一起在25℃条件下被溶 解于二苯基甲酰胺/乙腈中，骤然冷冻然后将可溶性组分在低温下升 华。将得到的产物进行充分研磨以产生尽可能均一的颗粒，该颗粒直 径约为1-200μm，特别是2-40μm。这些颗粒被装填到调色剂盒中然 后打印到纸上。

e)用激光打印机合成多肽阵列

在例(c)中描述的氨基酸(也见于图19)被用于合成以棋盘方 式相互啮合的两种肽模式(Peptidmustern)。首先将纸按照标准方 法用游离氨基基团进行衍生。然后将另外两种氨基酸按照标准方法均 一的结合到纸上。使用例(c)中描述的分别的氨基酸调色剂，一个棋 盘模式的椭圆和更换调色剂盒后一个互相啮合模式的矩形被打印到衍 生纸上。总共5层氨基酸被打印，每一层打印后都接着进行包含于氨 基酸调色剂中的具有保护基团的氨基酸的偶联反应以及N-末端保护 基团的去除。在另一个步骤中，最后一个N-末端氨基酸按照标准方 法被均一的偶联，然后按照标准方法进行位于多肽链侧链上的保护基 的去除。在该方法中，两种以棋盘方式互相啮合的多肽(N-末端)- DYKDDDDK-(支持物)和(N-末端)-DDEETTDK-(支持物)被合 成。

f)按照标准方法用激光打印机合成的多肽模式的检测

例(e)中所描述的偶联有两种棋盘啮合多肽模式的衍生纸被切成 小片，然后，首先用合适的水相溶液，例如2％的奶粉PBS溶液对非 特异性偶联进行封闭。将两种不同的单克隆抗体(来源于鼠)也用同 样的缓冲液稀释。然后，将不同的纸片用两种单抗中的一种通过轻微 振荡60分钟进行着色，然后洗涤三次。偶联到酶上的羊抗鼠抗体被稀 释于2％奶粉PBS溶液中；将支持物用得到的溶液通过轻微振荡60分 钟弄湿，然后洗涤三次。图20显示了用不同的酶底物对纸片的染色结 果：单克隆鼠抗体FLAG M1(Sigma)特异性识别用激光打印机产生的 矩形棋盘多肽模式的多肽(N-末端)-DYKDDDDK-(支持物)。

g)利用改装的彩色激光打印机合成完全5肽分子库

将一个合适的平面支持物按照标准方法用游离氨基酸基团进行衍 生。纸或基本上由聚苯乙烯组成的拷贝膜特别适合于此方法。利用为 专家所熟悉的标准的无水条件下fMoc多肽合成方法，一个合适的间隔 子，特别是2-3个氨基酸长度的间隔子，首先被合成于支持物的游离 氨基基团上。随意的2或3个其它的被偶联的氨基酸层，优选的是19 或20种不同氨基酸(即，任选地不含半胱氨酸)混合物，可以按照标 准方法被加到该间隔子上。然后，衍生的支持物被固定到例(a)或例 (b)中所描述的经过改进的彩色激光打印机的支承辊或转印单元上。

在例(a)或(b)中所描述的经过改进的彩色激光打印机的调色 剂容器含有如例(5)所述的各种氨基酸调色剂。

然后打印过程被起始，使得特别是19或20种氨基酸调色剂基本 上按照普通彩色激光打印机的运行原理被并列打印到精确位置上。从 而使支持物被分为19或20个分离的、定址准确的区域。接着被打印 于精确位置的活化氨基酸，特别是氨基酸酸酐的偶联反应在约65℃条 件下进行5-30分钟。在该过程中具有牢固固定于其上的衍生支持物 的支承辊(或转印滚筒)在一行红外灯照射下匀速转动，这些红外灯 在例(a)或例(b)中被描述为加热单元。

然后，在例(a)或例(b)中描述的未转化的氨基酸调色剂被洗 掉，fMoc保护基团被按照标准方法分离去掉，再次洗涤后，用例(a) 或例(b)中描述的加热单元将支持物烘干。在这段时间中支持物保持 牢固固定于支承辊(或转印滚筒)的状态，该滚筒在整段时间内都在 匀速转动。

然后打印过程被再次起始，使得19或20种不同的氨基酸调色剂 也再次以并列或重叠方式被打印到精确位置上。这次支持物被优选的 分为192或202个定址精确的区域。如刚才所述的，活化的氨基酸被偶 联到支持物上，未转化的氨基酸调色剂被洗去，以及fMoc保护基团被 去除。

再进行3次类似的打印过程，从而将支持物优选的分为195或205 个定址精确的区域。任意的2或3层被偶联的氨基酸，优选的是19或 20种不同氨基酸(即，半胱氨酸可以任选省略)混合物，可以被加到 游离的氨基末端。

最后，所有的保护基，包括那些侧链上的保护基被用10％硅烷三 氟乙酸溶液分离除去，支持物用DMF和甲醇进行洗涤和干燥，使得具 有，例如，205＝3,200,000个不同区域的支持物产生于最后的作用中， 其中每一个不同的区域代表了所有可能天然存在的C-末端偶联的五 肽之一。

h)利用改进的彩色激光打印机在支持物上合成完全的12聚体 的寡聚核苷酸库

如例(d)中所描述的，产生4种不同的亚磷酰胺调色剂颗粒，优 选的含有用于寡聚核苷酸合成的4种不同的活化单体。这些调色剂被 加载到调色剂容器中，然后被用一台改进的彩色激光打印机打印到如 例(a)或例(b)中所描述的载体上。

如例5中对完全5肽分子库合成进行的描述，一种按照标准方法 生产的具有游离氨基基团(或羟基基团)的合适的支持物被使用。如 果没有作为第一步反应的结果而存在，一种合适的接头在被专家所熟 悉的无水条件下按照标准合成方法被合成到游离氨基基团(或羟基基 团)上，它可以再次将游离氨基基团(或羟基基团)固定于支持物上， 不过这次这些基团距离平面约有22个原子远。

如例5中对完全5肽分子库合成进行的描述，位于四种不同的亚 磷酰胺调色剂颗粒中的单体在被四唑活化后通过加热单元的作用被活 动化。然后它们偶联到支持物2-10分钟。

在标准条件下的用于寡聚核苷酸合成的活化亚磷酰胺(具有保护 基)偶联到固体支持物上，保护基的去除和洗涤步骤为专家所熟悉。

如例(g)中所描述的，未转化的亚磷酰胺调色剂按照例(a)或 (b)中的描述被洗去，DMTr保护基按照标准方法从亚磷酰胺的5`末 端被分离掉，再次洗涤，然后如例(a)或(b)中的描述用加热单元 干燥支持物。在这段时间里，支持物保持牢固固定于支承辊的状态。

所用的保护基的例子有：

-用于亚磷酰胺5`末端保护的4`，4`-二甲氧三苯甲游基氯 (DMTr)(图21)

-用于腺嘌呤和胞嘧啶碱基保护的苯甲酰基(图22)

-用于鸟嘌呤碱基保护的异丁酰基(图22)

-用于磷酸基团保护的加氧基或β氰乙基(图22)

在单体被偶联到支持物以后，在每一步骤中保留下来的所有游离 5`羟基被“加盖”使得它们不能够参与以后的反应(图23)。三价磷 酸基团被氧化的最后步骤结束了合成循环(图24)。

在DMTr保护基从亚磷酰胺的5`末端被分离后，支持物在下个步 骤中如例(g)中所描述的被再次打印，使得支持物这次被分为42个 独立的区域。16种可能的二聚体核苷酸存在于每一个这样的独立区域 中，这些核苷酸通过间隔子以3`末端偶联到支持物上，其5`末端具有 一个游离的羟基基团。

该过程总共被重复10x次，每次都使用，例如，全部四种活化的 亚磷酰胺，使得上述的16个独立的区域被分为总共412个定址精确的 区域，在每个合成步骤中，按如上所述对保留的游离5`羟基末端“加 帽”后，进行三价磷酸基团的氧化以及用TCA去除DMTr保护基。

上面描述的合成方法与专家所熟悉的标准寡聚核苷酸合成方法一 致。不象所熟悉的标准合成方法，寡聚核苷酸被固定在固体支持物上， 使得在最后保护基被全部分离后，它们不会被从支持物上被分离掉， 而是保持偶联于支持物的状态。

最后，所有保护基被用二氯甲烷和三氯乙酸分离掉，支持物用乙 腈洗涤过后进行干燥，从而在最后的作用中具有412＝16,777,216种 不同区域的支持物被产生出来，每一个区域代表了所有的通过3`末端 偶联的12基体寡聚核苷酸之一。

i)用喷墨打印机合成肽阵列

各种不同的具有保护基团，特别是具有fMoc保护基团的氨基酸， 及相应的酸酐和异丙醇或NMP和二苯基甲酰胺一起进行溶解。该流体 被倒入多色调色剂盒内，放入一台基本上可买到的彩色喷墨打印机 内，然后按照例(g)中描述的方法打印到纸上。

所述的喷墨打印机事先被按照例(a)或例(b)中描述的彩色激 光打印机类似的方法进行改进，使得支持物在重复的打印循环中相对 与打印头(Druckkopf)保持固定，藉此，优选的使用一个旋转的支承 辊。如例(a)或例(b)中所描述的，一台外部设备被构建并由以下 部分组成：

-一个加热单元，特别是使用红外光能或热空气鼓风机进行加 热

-一个旋转滚筒，利用它各种不同的流体能够以时间程控的方 式被转印到固定于支承辊的支持物上

-一个旋转滚筒，利用它各种不同的流体能够以时间程控的方 式被从固定于支承辊的支持物上导出

将一个合适的平面支持物按照标准方法用游离氨基基团进行衍 生。纸或基本上由聚苯乙烯组成的拷贝膜特别适合于此方法。利用为 专家所熟悉的标准的无水条件下的fMoc多肽合成方法，一个合适的间 隔子，特别是2-3个氨基酸长度的间隔子，首先被合成于支持物的自 由氨基基团上。任意的2或3个其它的被偶联的氨基酸层，优选的是 19或20种不同氨基酸(即，可以任意的省略半胱氨酸)混合物，可 以按照标准方法加到该间隔子上。

然后支持物可以任意的被二氯甲烷和二苯基甲酰胺的混合物所浸 泡。二氯甲烷在转印过程中被蒸发，藉此，衍生纸被固定于支持物上， 该支持物可以相对于上述改进的彩色喷墨打印机的打印单元而被移 动。

然后打印过程被起始，使得特别是19或20种不同的氨基酸调色 剂基本上按照普通喷墨打印机的操作原理被并行地定址精确地打印。 这样，该支持物被划分为19或20个相互独立的，定址精确的区域。 接着被打印于精确位置的活化氨基酸的偶联反应在约65℃条件下进行 5-30分钟。在该过程中具有牢固固定于其上的衍生支持物的支承辊 在一行红外灯照射下匀速转动，这些红外灯在例(a)或例(b)中被 描述为加热单元。

然后，未转化的氨基酸调色剂在上述滚筒的辅助下被洗掉，fMoc 保护基团被按照标准方法分离去掉，用上述的加热单元将支持物烘 干。在这段时间中支持物保持牢固固定于支承辊的状态，该辊在整段 时间内都在匀速转动。

然后打印过程被再次起始，使得19或20种不同的氨基酸调色剂 再次以并列或层叠的方式被打印到精确位置上。通过这种方法使得这 次支持物被优选的分为192或202个定址精确的区域。如刚才所述的， 活化的氨基酸被偶联到支持物上，未转化的氨基酸调色剂被洗去，以 及fMoc保护基团被去除。

再进行3次类似的打印过程，从而将支持物优选的分为195或205 个定址精确的区域。任意的2或3层其它偶联的氨基酸，优选的是19 或20种不同氨基酸(即，半胱氨酸可以随意省略)混合物，可以按照 标准方法被加到该阵列的游离的氨基末端。

最后，所有的保护基，包括那些侧链上的保护基被用10％硅烷三 氟乙酸溶液分离除去，支持物用DMF和甲醇进行洗涤和干燥，使得具 有，例如，205＝3,200,000个不同区域的支持物产生于最后的作用中， 其中每一个不同的区域代表了所有可能天然存在的C-末端偶联的五 肽之一。

j)用具有固定于其上的肽分子库的支持物检测血清

在例(g)中描述的完全肽分子库被用病人血清进行着色，其中非 特异性偶联反应首先用合适的水相溶剂，例如2％的奶粉PBS溶液进 行封闭，然后将血清用相同的缓冲液稀释。接着将支持物用血清通过 轻微摇动60分钟弄湿，然后洗涤3次。

来源于血清的结合的人类抗体被通过标准方法进行检测。羊抗人 抗体或抗体结合蛋白，如蛋白质G或蛋白质A被用于此目的。这些检 测试剂被偶联到诸如过氧化物酶或磷酸酶的酶类或染料或如Cy5或碘 131的放射活性物质上。

检测试剂被稀释于2％的奶粉PBS溶液中，支持物用该溶液通过 轻微摇动60分钟弄湿，然后洗涤3次。酶的作用可以产生一种有色的 沉淀物，它可以通过可买到的扫描仪被读出。对结合放射活性或荧光 的定址精确检测通过市售磷成像仪(phosphoimager)来实现。

信号被分为总共10种不同的信号阶段，每阶段都分派给肽阵列的 不同的5肽。

k)用具有固定于其上的肽分子库的支持物鉴定血清中疾病特 异性的反应活性

例(g)中描述的五肽分子库被用如例(j)中描述的来源于50个 胃溃疡病人的血清进行染色。这里几个病人的血清可以被混合在一起 使用或者每一份血清染色一个阵列。然后阵列中每一种肽分子的来源 于几个染色反应的平均信号强度被确定。

然后用50份对照血清再进行相同的步骤。这里每一种肽分子的来 源于几个染色反应的平均信号强度也同样被确定。

通过比较得到的平均值可以鉴定出一些与相应的对照血清相比， 被病人血清显著染色的肽分子。结果在图16中进行了图示。利用这些 肽分子序列进行的数据库检索在这些肽分子和胃幽门螺旋杆菌的基因 产物之间建立了相关性。

l)用固定于支持物上的12基体寡聚核苷酸分子库检测病人DNA

在例(h)中描述的具有固定于其上的完全寡聚核苷酸分子库的支 持物被用病人DNA进行染色。采用了专家所熟悉的标准方法。非特异 性的偶联用，例如，来源于鲱鱼精子的DNA进行饱和。

一份肿瘤组织样品和一份健康组织样品被同时从病人体内取出， 其中含有的基因组DNA在肿瘤特异性聚合酶链式反应引物(对例如 p53、p16、ras、c-myc、n-myc基因具有特异性)中的一对或几对的 帮助下进行扩增。肿瘤样品用例如fluorescein-12-dUTP进行标记， 而普通样品用例如四甲基-若丹明-5-dUTP进行标记。样品被混合在一 起然后在支持物上进行杂交。

结合荧光活性(或放射活性)的定址精确检测是通过使用如例(j) 中描述的可买到的磷成像仪而实现的。这里绿色荧光对红色荧光的比 值，即或产生的混合颜色作为例子被确定。每一种信号被分派给阵列 中的不同12基体寡聚核苷酸。

这样，对肿瘤疾病的预后非常重要的基因点突变就可以被诊断出 来。与市售其他系统相比，多个基因可以用完全12基体寡聚核苷酸库 同时进行分析。

在一种可选的方法中，取自病人的DNA被用作称为Alu引物扩增 的模板，该引物可以和基因组中频繁出现的Alu重复序列的边缘发生 杂交并且扩增两个Alu重复序列之间的非重复DNA。肿瘤样品再次用 例如fluorescein-12-dUTP进行标记，而四甲基-若丹明-5-dUTP则被 普通样品吸收。样品被如上混合在一起然后在支持物上进行杂交。

荧光信号按如上所述的方法读出。在这种方法中，基因组的很大 一部分都被扫描用于寻找普通组织和肿瘤组织之间的差异，因此新的 肿瘤演进产生重要的信息的诊断性标记物可以被发现。

术语列表

1支持物

2物质

3基质

4第一种溶剂

5转印单元

6朝支持物(1)方向的移动

7固态或凝胶态聚集态

8改进的物理环境

9活动化的物质

10朝支持物平面(1)方向的移动

11共价偶联于支持物(1)的物质(2)

12第二种溶剂

13液态

14保护基

15被光分解的保护基

16电磁波，光

17光敏保护层

18在支持物(1)或阵列上的定址精确的区域

19调色剂颗粒，转印单元

20调色剂存贮器

21磁力辊

22激光可记录的滚筒

23带电的调色剂颗粒跳跃到可记录滚筒(22)上

24载体(1)上的调色剂颗粒

25加热压光辊

26熔化的或活动化的调色剂颗粒

27打印于纸上的第一种颜色

28打印于纸上的第二种颜色

29打印于纸上的第三种颜色

30打印于纸上的第四种颜色

31含有第一种颜色的调色剂颗粒(19)的调色剂存贮器

32含有第二种颜色的调色剂颗粒(19)的调色剂存贮器

33含有第三种颜色的调色剂颗粒(19)的调色剂存贮器

34含有第四种颜色的调色剂颗粒(19)的调色剂存贮器

35彩色激光打印机的支承辊或转印单元

36偶联反应物、洗涤溶液或气态物质的供给

37扫描单元

38涂布于支持物(1)的模式

39用扫描单元测量得到的模式和相同的以前保存的模式的比 较

40打印机内存中的图像电偏移预期值的偏差

41未使用的

42被病人血清和对照血清所识别的肽分子

43被病人血清特异性识别的肽分子

44可结合酶的阵列中的D-肽类

45结合酶并同时使酶失活的阵列中的D-肽类

46磁性组分

47可熔性塑料组分

48发色团

49用于组合合成物质(2)的单体

50以固态聚集态存在的溶剂